（临床医学专业论文）急性冠脉综合征的遗传及行为因素分析.pdf

山东大学硕士学位论文 原创性声明 l i i l i i l i i 1 11 1 1 1 11 111 1 11q l l l y 17 9 110 1 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独 立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不 包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研 究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明 的法律责任由本人承担。 论文作者签名：盔签 日 期：趁f 望：! 旦 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解山东大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学 校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论 文被查阅和借阅；本人授权山东大学可以将本学位论文的全部或部分 内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段 保存论文和汇编本学位论文。 ( 保密论文在解密后应遵守此规定) 论文作者签名：室签导师签名 山东大学硕士学位论文 目录 中文摘要1 英文摘要3 符号说明5 论文正文“6 前言6 日u 舌。 对象与方法一9 结果1 6 讨论2 2 结论2 8 参考文献2 9 文献综述”3 4 参考文献3 9 附录4 4 致谢4 5 攻读学位期间发表的学术论文4 6 2 c o n t e n t c h i n e s ea b s t r a c t 1 e n g l i s ha b s t r a c t 3 a b b r e v i a t i o n “5 t e x t 6 p r e f a c e 6 s u 场e c t sa n dm e t h o d s 9 r e s u h s 1 6 d i s c u s s i o n 2 2 c o n c l u s i o n 2 8 r e f e r e n c e s 2 9 i 沁v i e w 3 4 r e f e r e n c e s 3 9 a p p e n d i x 4 3 a c k l l o w l e d g e m e n t 4 5 r e a r c hp 印e r sp u b l i s h e dd u r i n gg r a d u a t es t u d y 4 6 3 山东大学硕士学位论文 急性冠脉综合征的遗传及行为因素分析 研究生：崔芬 导师：杨志寅教授 高东升教授 中文摘要 【目的】揭示急性冠脉综合征( a c u t ec o r o n a r ys y n d r o m e ) 发病的行为因素及探 究c f hy 4 0 2 h 基因多态性与中国北方汉族人群急性冠脉综合征发病易感性的关 系，并初步分析行为与基因的交互作用对急性冠脉综合征发病的影响。 【方法】2 0 0 9 年6 月- 2 0 0 9 年8 月在济宁医学院附属医院心血管内科病房住 院患者1 3 4 例，患者均行选择性冠状动脉造影或冠状动脉c t 。其中急性冠脉综合 征组8 4 例，选择性冠状动脉造影或冠脉c t 结果至少有1 支冠脉直径减少 5 0 ，且符合a c c a h a 制定的诊断标准，非冠心病对照组5 0 例。详细记录 所有患者组和对照组的一般情况、现病史、既往史及行为因素资料。由上海生物 工程技术服务有限公司提供血液基因组d n a 小量抽提试剂盒，抽提受试者外周血 中基因组d n a ，2 0 。c 保存；引物由上海生物工程技术服务有限公司设计合成，扩 增特异性p c r 片断，用限制型片断长度多态性( r f l p ) 方法检测c f hy 4 0 2 h 多态 性。酶切产物经溴化乙锭( e b ) 染色在2 的琼脂糖凝胶上6 0 v 电压下电泳6 0 r a i n ， 成像于紫外灯下，观察结果以确定基因型。上述电泳结果均用全自动凝胶成像系 统照相后保存结果。用s p s s l 3 0 统计软件包进行r 王a r d y w e i n b e r g 平衡定律检验各 组是否来自同一蒙德尔群体，比较两组间c f hy 4 0 2 h 基因型和等位基因频率分布 差异，并进行单因素和多因素l o g i s t i c 回归分析。 【结果】单因素l o g i s t i c 回归分析显示：吸烟史( 尸= o 0 0 0 ，o r = 4 8 9 4 ，o r 9 5 c 1 ：2 5 3 7 9 4 41 ) 、饮酒史( 尸= 0 0 0 8 ，d r = 2 8 7 9 ，l ：7 r9 5 c z ：1 4 9 9 - - - 5 5 2 8 ) 、 高血压病史( 卢0 0 0 0 ，o r = 4 2 2 2 ，o r9 5 c i - 2 1 9 5 - - 一8 1 2 3 ) 、健身活动( 尸= o 0 0 2 ， 山东大学硕士学位论文 o r = o 3 3 3 ，d 贝9 5 c y ：0 1 8 8 0 5 8 9 ) 、盐摄入( 尸：= o ，0 0 6 ，o r = o 4 5 7 ，c 飧9 5 c 0 2 8 7 、一0 7 2 7 ) 、性格( 尸- o 0 0 0 ，o r = o 3 8 5 ，o r9 5 c i ：0 2 4 7 0 6 0 0 ) 、职业紧 张( 卢o 0 1 5 ，锨= 2 1 1 8 ，o r9 5 c i 1 2 7 8 - - 一3 5 1 1 ) 与中国北方汉族人急性冠脉 综合征有关。多因素l o g i s t i c 回归分析显示：吸烟史( 仁0 0 1 0 ，o r = 6 0 8 4 ，o r 9 5 c i ：1 5 4 3 2 3 。9 8 8 ) 、高血压病史( p = o 0 2 4 ，o r = 2 8 2 1 ，o r9 5 c i ：1 1 4 3 6 5 9 5 ) 、健身活动( 尸b o 0 0 4 ，o r = o 2 9 7 ，o r 舛凹：o 1 3 0 0 6 7 8 ) 、性格( 仁o 0 1 1 ， o r = o 4 3 5 ，o r9 5 c i ：0 2 2 9 - - 一0 8 2 9 ) 与急性冠脉综合征发病有显著相关性。 【结论】有吸烟史、高血压病史、性格急躁是中国北方汉族人群急性冠 脉综合征发病的危险因素，而健身活动则是保护因素。c f hy 4 0 2 h 、有饮酒 史、冠心病家族史、体质指数( b m i ) 、职业、教育程度、人均月收入、工 作劳动强度、盐摄入、饮食、工作时间、睡眠时间、生活压力、社会支持、 职业紧张、近一年不良事件发生可能不是中国北方汉族人群急性冠脉综合征 的易感因素。 【关键词】急性冠脉综合征；行为因素；补体因子h ；基因多态性 2 山东大学硕士学位论文 a n a l y s i so fg e n e t i ca n d b e h a v i a lf a c t o r so nt h eo c c u r r e n c eo fa c u t e c o r o n a r ys y n d r o m e m a s t e r p o s t g r a d u a t e ： c u i f e n t u t o r ：p r o f e s s o r y a n g z h i y i n p r o f e s s o r g a o d o n g s h e n g a b s t r a c t 【o b j e c t i v e 】t oe x p l o r et h ep o s s i b l eb e h a v i a lf a c t o r so fa c u t ec o r o n a r ys y n d r o m e a n dr e l a t i o n s h i pb e t w e e nc f hy 4 0 2 hp o l y m o r p h i s mo fn o r t h e mc h i n e s eh a n p o p u l a t i o na n ds u s c e p t i b i l i t yt oa c u t ec o r o n a r ys y n d r o m e ，a n df u r t h e rt oe x p l o r et h e i n t e r a c t i o nw i t he n v i r o n m e n t a lf a c t o r st oa c u t ec o r o n a r ys y n d r o m e 【m e t h o d s 】t h i ss t u d yc o n s i s t e do f15 1 s u b j e c t sb e t w e e nj u n e2 0 0 9a n da u g u s t 2 0 0 9f r o ma f f i l i a t e dh o s p i t a lo fj i n i n gm e d i c a lc o l l e g e ，a l ls u b je c t su n d e r w e n t e d s e l e c t i v ec o r o n a r ya n g i o g r a p h yo rc o r o n a r ya r t e r yc t c o r o n a r ya r t e r yd i s e a s eb a s e do n t h er e s u l t so fc o r o n a r ya n g i o g r a p h yo rc o r o n a r ya r t e r yc tt h a ta tl e a s to n ec o r o n a r y a r t e r yd i a m e t e rr e d u c t i o no fm o r et h a n50 a n df u l f i l l e dt h ed i a g n o s t i cc r i t e r i ao f a c c a h a 8 4p a t i e m sw i t ha c u t ec o r o n a r ys y n d r o m ea n d5 0c o n t r o l s ，a n dg e n e r a l i n f o r m a t i o n s ，c u r r e n td i s e a s eh i s t o r y ，p a s tm e d i c a lh i s t o r y , r e l a t e db e h a v i a lf a c t o r sw e r e c o l l e c t e d g e n o m i cd e o x y r i b o n u c l e i ca c i d ( d n a ) w a se x t r a c t e df r o ma c u t ec o r o n a r y s y n d r o m ep a t i e n t sa n dh e a l t h yc o n t r o ls u b j e c t s ，s t o r e di n 一2 0 0 c t h eg e n o t y p eo fc f h y 4 0 2 hw a sd e t e c t e db yp o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o na n dr e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t h p o l y m o r p h i s m ( p c r r f l p ) m e t h o d si na c u t ec o r o n a r ys y n d r o m ep a t i e n t sa n dc o n t r o l s p c ra m p l i f i c a t i o np r o d u c t sw a sv e r i f i c a t e db ye l e c t r o p h o r e s i so na g a r o s eg e l d e v i a t i o no fg e n o t y p ed i s t r i b u t i o nf o r mh a r d y w e i n b e r ge q u i l i b r i u mw a sa s s e s s e d u s i n g 乏t e s ti ne a c hg r o u p u n i v a r i a t ea n dm u l t i v a r i a t e c o n d i t i o n a ll o g i s t i ca n a l y s e s w e r ec o n d u c t e di n t h ee n d 【r e s u l t s 】s m o k i n gh i s t o r y ( p = 0 0 0 0 ，o r = 4 8 9 4 ，o r9 5 c i ：2 5 3 7 9 4 4 1 ) ， a l c o h o ld r i n k i n gh i s t o r y ( p = o 0 0 8 ，o r = 2 8 7 9 ，o r9 5 c i ：1 4 9 9 5 5 2 8 ) ， h y p e r t e n s i o n ( 尸= o 0 0 0 ，锹= 4 2 2 2 ，o r9 5 c i ：2 1 9 5 8 1 2 3 ) ，s p o r t s a c t i v i t i e s 3 山东大学硕士学位论文 ( p = 0 0 0 2 ，o r = 0 3 3 3 ，o r9 5 c - 0 18 8 o 5 8 9 ) 。s a l ti n t a k e ( 尸= o 0 0 6 ，o r = 0 4 5 7 ， o r9 5 c i - 0 2 8 7 0 7 2 7 ) ，c h a r a c t e r ( 尸= o 0 0 0 ，o r = 0 3 8 5 ，o r9 5 c i ：0 2 4 7 一 o 6 0 0 ) s t r e s so f o c c u p a t i o n s ( 尸= 0 0 1 5 ，o r = 2 1 1 8 ，o r9 5 c i 1 2 7 8 3 5 1 1 ) w e r e a s s o c i a t e dw i t ha c u t ec o r o n a r ys y n d r o m eo fn o r t h e r nc h i n e s eh a np o p u l a t i o n s m o k i n gh i s t o r y ( 仁0 0 1 0 ，o r = 6 0 8 4 ，o r9 5 c i 1 5 4 3 - 一2 3 9 8 8 ) ，h y p e r t e n s i o n ( 卢o 0 2 4 ，o r = 2 8 2 1 ，o r9 5 c h1 1 4 3 - - - 6 5 9 5 ) ，s p o r t sa c t i v i t i e s ( 仁0 0 0 4 ， o r = o 2 9 7 ，o r9 5 c h0 13 0 0 6 7 8 ) ，p e r s o n a l i t y ( p = 0 011 ，o r = o 4 3 5 ，o r9 5 c h 0 2 2 9 0 8 2 9 ) w e r es i g n i f i c a n t l ya s s o c i a t e dw i n la c u t e c o r o n a r ys y n d r o m ei n m u l t i v a r i a t ec o n d i t i o n a ll o g i s t i ca n a l y s e sa f t e ra d j u s t i n go t h e rf a c t o r s 【c o n c l u s i o n s 】s m o k i n gh i s t o r y , h y p e r t e n s i o n ，p e r s o n a l i t ya r er i s kf a c t o r so fa c u t e c o r o n a r ys y n d r o m eo fn o r t h e mc h i n e s eh a np o p u l a t i o n b u ts p o r t sa c t i v i t i e s i s p r o t e c t i v ef a c t o r s c f hy 4 0 2 h ，a l c o h o ld r i n k i n g ，f a m i l yh i s t o r y , b m i ，o c c u p a t i o n ， e d u c a t i o n a lb a c k g r o u n d ，a v e r a g ef a m i l yi n c o m ep e rm o n t h ，e d u c a t i o n a lb a c k g r o u n d ， h j g hs a l ti n t a k e ，d i e t ，w o r k i n gh o u r s ，h o u r so fs l e e p ，s t r e s so fl i f e ，s o c i a ls u p p o a ，s t r e s s o fo c c u p a t i o n ，t h eo c c u r r e n c eo fa d v e r s ee v e n t so v e rt h ep a s ty e a rm a yb en o t a s s o c i a t e dw i t ha c u t ec o r o n a r ys y n d r o m e 【k e yw o r d s 】c o r o n a r ya r t e r yd i s e a s e ；b e h a v i a lf a c t o r s ；c o m p l e m e n t f a c t o rh ； g e n e t i cp o l y m o r p h i s m 4 山东大学硕士学位论文 符号说明 5 山东大学硕士学位论文 l - j - 刖舌 目前，心血管疾病已成为发达国家首要的死亡原因，并迅速成为发展中 国家的第一杀手l l 】。随着我国经济水平的发展，人民生活水平的提高，饮食 结构的改变及人口迅速老龄化，心血管病的发病率和死亡率呈上升趋势，是 全球上升较快的国家。 冠状动脉性心脏病( c o r o n a r yh e a r td i s e a s e ，c h d ) ，简称冠心病，是最 常见的动脉粥样硬化类型。1 9 7 9 年w h o 将冠心病分为5 型：无症状性心肌 缺血、心绞痛( 包括稳定性心绞痛和不稳定性心绞痛) 、心肌梗死、缺血性 心肌病、猝死。冠心病是多因素复杂性疾病，年龄、性别、血脂异常、高血 压、吸烟、糖尿病和糖耐量异常是冠心病确认的传统危险因素，新近有研究 发现，高半胱氨酸血症、高尿酸血症、高胆红素血症、脂蛋白a 、血浆纤维 蛋白原增高、炎症因子等也与冠心病的发病有关。冠心病家族史同样是促发 冠心病重要的因素，有阳性家族史的个体患c h d 的危险性比无阳性家族史 的高2 1 2 倍。学者对冠心病遗传基因进行大量的研究，目前研究较多的有 载脂蛋白e 、纤溶酶原激活物抑制物( p a l 1 ) 、血浆凝血因子v i i 的基因多 态性。有少量的文献报道环境因素对冠心病存在影响，环境因素分为自然环 境和社会环境，自然环境因素包括季节变化、大气污染、噪音污染、化学药 品对水和食品的污染；社会因素主要包括职业紧张、职业的环境条件和社会 经济地位。随着医学模式向生物一心理一社会医学模式的转变，生活、行为方 式得到越来越多的关注。研究表明，除生物、社会和自然因素外，不良的心 理、行为因素亦是致病的重要因素，人类4 6 7 的疾病均与自身生活习惯、 行为方式等密切相关【2 】。在我国，占前三位死因顺位的心血管疾病、脑血管 疾病和肿瘤的病因中，人类的生活方式和行为因素已超过生物因素、环境因 素而成为第一位与死亡有关的重要因素 3 1 。吸烟、过度饮酒、缺少体育活动、 不良饮食习惯、a 型性格等均囊括其中。研究人的行为与健康和疾病的关系， 以更好的揭示健康与疾病的本质、规律，探索诊断、治疗和预防疾病方法。 6 山东大学硕士学位论文 每年，全世界有超过1 9 0 0 万人经历突发的心血管事件，包括不稳定心 绞痛、心肌梗死和脑血管意外，且这些人大部分无任何前期征状。冠状动脉 粥样硬化病变基础上易损斑块出现裂缝、糜烂、破裂，导致局部继发血小板 聚集、血栓形成，从而引起冠状动脉完全性或不完全性闭塞是急性冠脉综合 征发病的主要病理学基础。几项尸检和临床解剖研究提示：冠心病血栓形成 导致的死亡和急性冠脉综合征( a c u t ec o r o n a r ys y n d r o m e ，a c s ) 患者中的斑 块7 0 为破裂斑块，3 0 岁b 非破裂斑块【4 1 。n a g h a v i 等【4 5 1 归纳了易损斑块的 相关特征，主要特征有：活动性炎征。对斑块的病理形态观察发现，有大 量的巨噬细胞浸润；薄纤维帽和大的脂核。纤维帽的厚度 4 0 为易损斑块的重要特征；内皮脱落伴表面血小板聚集或纤维 蛋白原沉积；斑块有裂隙或受损；严重狭窄。管腔严重狭窄，斑块表面 剪切力增加，可导致血栓形成或突然闭塞。次要特征有：表面有钙化结节。 钙化结节在位置上与纤维帽极为接近，即使较轻的钙化也可造成斑块破裂； 黄色斑块。此种斑块提示含有巨大的脂核和更薄的纤维帽，但缺少特异性； 斑块内出血；内皮功能障碍：血管正性重构。其中主要特征较次要特 征提示斑块易损性的可能性更大。易损斑块的发生发展除与斑块本身的组织 结构有关外，还受多种因素的影响。高脂血症、高血压、糖尿病、吸烟，肥 胖、炎征不仅是动脉粥样硬化的危险因素，而且可促使易损斑块的形成、发 展。紧张、焦虑、抑郁等心理行为因素同样能促发斑块破裂，继而伴发血栓 形成，导致急性心血管事件的发生。 补体因子h ( c o m p l e m e n tf a c t o rhg e n e ，c f h ) 是存在于正常血清中的补 体调节蛋白之一，它可以抑制旁路途径活化和级联效应，保护宿主细胞和组 织免受损伤，在补体激活中起着重要的调节作用，从而阻止动脉粥样硬化的 进程【6 - 7 1 。在人类动脉粥样病变中能观察到c f h 的存在【8 】。c f h 位于染色体 l q 31 ，其外显子9 的核苷酸1 2 7 7 碱基存在t - c 的突变，即为c f hy 4 0 2 h 多 态性。目前，国外有关c f hy 4 0 2 h 基因多态性的研究主要集中在其与年龄 相关性黄斑变性( a g e r e l a t e dm a c u l a rd e g e n e r a t i o n ，a m d ) 的关系 9 - 1 0 。随后 有c f hy 4 0 2 h 多态性对c h d 的影响的少量研究，但结果并未统一【6 ，1 1 1 。本 文利用基因工程技术对中国北方汉族人急性冠脉综合征患者c f hy 4 0 2 h 多 山东大学硕士学位论文 态性进行检测，同时调查其生活行为习惯，目的在于寻找和确认急性冠脉综 合征的分子遗传学标志和行为因素，筛选出早发冠心病的高危人群，以便对 冠心病高危个体进行早期干预，提高冠心病的防治水平。 山东大学硕士学位论文 对象与方法 一、研究对象 13 4 例为2 0 0 9 年6 月至2 0 0 9 年8 月在济宁医学院附属医院心血管内科 病房病例，患者均行选择性冠状动脉造影或冠脉c t 。a c s 患者8 4 例，男性 5 0 例，女性3 4 例，年龄6 0 18 1 0 3 6 岁，冠脉造影或冠脉c t 结果至少有 1 支冠脉直径减少 5 0 ，且符合a c c a h a 制定的诊断标准。 急性冠脉综合征包括：不稳定型心绞痛、非s t 抬高心肌梗死( n s t e m i ) 及s t 段抬高型心肌梗死( s t e m i ) 。 急性心肌梗死诊断标准：必须至少具备下列3 条中的2 条：缺血性胸痛 临床病史：持续性胸痛3 0 分钟以上，含服硝酸甘油不能缓解。心电特征性 改变及动态演变。心肌坏死的血清标志物( 肌红蛋白、肌钙、肌酸肌酶同 工酶c k m b ) 达到正常值上限的2 倍以上并有动态改变。 不稳定性心绞痛包括除稳定性心绞痛外的所有心绞痛即：初发型心绞 痛、恶化劳累型心绞痛、自发型心绞痛、变异型心绞痛、梗死后心绞痛、动 脉成形术后及冠状动脉旁路移植术后出现的心绞痛。 不稳定心绞痛的诊断标准：入院前4 8 小时内出现1 次或1 次以上的心绞 痛发作，心电图有缺血性的s t - t 改变，心肌酶正常或轻度增高但不超过正 常值上限的2 倍。 非冠心病对照组5 0 例，男2 3 例，女2 7 例，年龄5 7 2 6 6 7 8 岁。对照 组均行选择性冠状动脉造影或冠脉c t ，冠状动脉未见明显动脉粥样硬化， 排除冠心病。 所有研究对象之间无血缘关系，均排除合并严重心衰、心律失常、肝、 肾、内分泌系统疾病、肿瘤和近期感染者。详细记录两组生活行为习惯，是 否有冠心病家族史、全身情况等。两组在年龄、性别、文化程度的差异无统 计学意义。 9 山东大学硕士学位论文 二、调查内容与方法 在全面大量查阅冠心病危险因素的基础上并参阅行为医学量表手册、 中国成人血脂异常防治指南f 1 2 】，根据研究目的，设计冠心病危险因素调 查表。采用统一的调查表，由专人以相同的询问方式和态度进行询问调查， 对不明白的选项可进行提示，避免引导或提示。所有条目均使用客观指标， 并有明确定义。 ，调查表包括以下内容： 1 一般情况，包括：年龄、性别、民族、婚姻、文化程度、。户籍所在 地、身高和体重。 2 家族史：冠心病家族史、高血压病家族史。 3 生活方式：吸烟史、饮酒史、饮食习惯、睡眠时间、健身活动。 4 社会经济地位：教育程度、职业、劳动强度、经济收入。 5 心理影响因素：性格、职业紧张、生活压力、社会支持、近一年不 良生活事件的发生情况。 各调查项目规定如下： 1 体质指数( b o d y m a s s i n d e x ，b m i ) ：b m i = 体重( k g ) 身高2 ( m 2 ) 。 2 吸烟史：每天吸烟至少1 支，连续半年以。 3 饮酒史：平均每月饮酒2 次及以上。 4 健身活动：高强度或强度不高但持续2 0 分钟或更多时间的体育运 动。 5 劳动强度：轻度指从事办公室或文秘工作、工厂流水线工作等，中 度指安装工或修理工等，重度指从事炼钢、农业、铸造、伐木等工作。 三、临床资料 清晨空腹采血，同时测定血清总胆固醇( t c ) 、甘油三酷( t g ) 、高密度脂 蛋白( h d l ) 、低密度脂蛋白( l d l ) 、尿酸( u a ) 及总胆红素( t b i l ) 等指标。 t g 用乙酞丙酮法，t c 用单酶试剂比色法，h d l c 、l d l c 、t b i l 用酶法 1 0 山东大学硕士学位论文 测定，u a 用酶一过氧化物酶偶联法测定。以上各指标由济宁医学院附属医院 检验科统一完成。 四、实验方法 1 主要仪器 9 7 0 0 型p c r 反应扩增仪( 美国a b i 公司) ； s w c j 2 f 双人双面净化工作台( 苏州净化设备有限公司) ； s b h w i v 型电热恒温水温箱( 北京市医疗设备厂) ； d y y - 8 c 型稳压稳流电泳仪( 北京六一仪器厂) ： m i c r o f u g e 2 2 r 低温高速离心机( b e c a m a nc o u l t e r 公司) ； d y c p 31 d n 型水平电泳槽( 北京六一仪器厂) ； u v 4 型紫外透视仪( 上海康禾光电仪器公司) ； 凝胶成像系统( g e n eg e n i n u s 公司) ； u v - 7 5 0 2 紫外光分光光度计( 上海民仪电子有限公司) ； 微量移液器( e p p e n d d o r f ) ； 4 c 、2 0 冰箱( s i e m e n s 公司) 和8 0 超低温冰箱( 日本s a n y o 公司) ； m i n i s p i n 台式高速离心机( 德国e p p e n d o r f 公司) ； 8 0 2 3 c t u 型微波炉( 上海精密仪器仪表公司) ； 2 主要试剂 血液基因组d n a 小量抽提试剂盒上海生物工程技术服务有限公司 限制性内切酶h i n li i富酶泰斯生物技术( 深圳) 有限公 司 内切酶识别位点为5 c a t g v 3 3 g t a c 5 d n am a r k上海生物工程技术服务有限公司 p c r 引物上海生物工程技术服务有限公司 上游引物： 5 c t t t t t g t g c a a a cc t t t g t t a g t 3 下游引物： 5 一t g g a a g a g c g t a g c c a g g a 一3 山东大学硕士学位论文 琼脂糖上海生物工程技术服务有限公司 5 0 t a e 电泳缓冲液上海生物工程技术服务有限公司 溴化乙锭( 1 0 m g m l )上海生物工程技术服务有限公司 3 人基因组d n a 样品的抽提 ( 1 ) 标本搜集：受试者禁食1 2 小时后，于次日清晨采周围静脉血2 m l ， 枸椽酸钠抗凝，置于2 0 冰箱，待d n a 提取，备用。 ( 2 )模板d n a 提取：由上海生物工程技术服务有限公司提供血液基因 组d n a 小量抽提试剂盒抽提取受试者外周血中基因组d n a ，8 0 保存。 试剂盒组成： 名称规格与数量 e z 1 0c o l u m n t b pb u f f e r t b mb u f f e r ( 8 ) t e ( p h8 0 ) p r o t e i n a s ek ( b ) w a s hs o l u t i o n ( 。) e 1 u t i o nb u f f e r ( d ) 20 1 t 1 1c o l l e c t i o nt 1 】b e 在首次使用前，在w a s hs o l u t i o n 瓶中加入4 倍体积的无水乙醇，充分混 匀后使用；p r o t e i n a s ek 使用前，加入3 0 0 u l 无菌水混匀，2 0 保存备用。 按以下步骤提取基因组d n a 取o 5 m l 外周静脉血置于2 0 m l 的c o l l e c t i o nt u b e 中，3 0 0 0 转 分离心3 分钟，弃上清液。 在c o l l e c t i o nt u b e 中加入0 8 m lt b pb u f f e r ，用1 m l t i p 头轻轻吹 打，使其彻底混匀，3 0 0 0 转分离心3 分钟，弃上清液。 重复步骤2 ，当沉淀为无色或淡红色后用2 0 0 u l t e 悬浮即可。 c o l l e c t i o nt u b e 中加入0 5 m l t b mb u f f e r ，混匀；再加入3 u l p r o t e i n a s ek ，混匀，5 5 温浴3 0 分钟。 5 0 0 0 转分离心2 分钟，收集上清液，然后加入2 6 0 u l 无水乙醇。 1 2 2n l 1 g 1 l o m m m m m m 0 o 2 o o o 4 o o 1 1 5 3 1 2 1 1 山东大学硕士学位论文 用l m lt i p 头将样品全部转移到套放于2 m l 离心管的e z 一1 0 柱中， 8 0 0 0 转分，离心1 分钟。取下e z 10 柱，弃去c o l l e c t i o nt u b e 中的废液 加入5 0 0 u lw a s hs o l u t i o n ，然后8 0 0 0 转分离心1 分钟，重复步 骤7 一次。 取下e z 1 0 柱，弃去c o l l e c t i o nt u b e 中的全部废液。8 0 0 0 转分， 离心1 5 秒，以除去残留的w a s hs o l u t i o n 。 将e z 10 柱放入新的无菌的1 5 m l 离心管中，在柱膜中央加入4 0 u l e l u t i o nb u f f e r ，5 0 温浴2 分钟。 10 0 0 0 转分，离心1 分钟。离心管中的液体即为基因组d n a 。 ( 3 ) 紫外分光光度计测定d n a 浓度和纯度 取1 0 0 1 1 1d h 2 0 加入比色杯内，分光光度计校零；取2 斗l 基因组d n a 样本，加d h 2 0 至l o o u l 混匀，移至比色杯中检测2 6 0 n m 和2 8 0 n m 光密度值， a 2 6 0 a 2 8 0 比值应该大于1 8 。 4 p c r 扩增目的d n a 由上海生物工程技术服务有限公司设计合成引物，上游引物 5 c t t t t t g t g c a a a c c t t t g t t a g t - 3 ，下游引物5 t g g a a g a g c g t a g c c a g g a 3 。 ( 1 ) 每小e p 管加入10 u lp c r 反应混和液 p c r 反应体系 t e m p l a t e 0 3p l 1 0 x t a qb u f f e r1 o b t l d n t p 0 5 肛l r s l 0 6 1 1 7 0 一f ( 5 0 p m o l ! a 1 ) 0 1 肛l r s l 0 6 1 1 7 0 一r ( 5 0 p m o l t 1 ) 0 1 斗l d r e a mt a q ( 5 u i t 1 ) 0 0 6j - t l d h 2 08 0 l t o t a l 1 0 “l ( 2 ) 将e p 管放入p c r 仪中进行扩增反应 p c r 反应条件： 9 5 预变性 5 m i n ， 1 3 山东大学硕士学位论文 以下开始循环9 5 变性 3 0 s ， 6 0 0 c 退火4 5 s ， 7 2 0 c 延伸6 0 s ， 共4 0 个循环， 最后7 2 0 c 延伸8 m i n 。 p c r 产物长度为2 8 0 b p ( 3 ) 将p c r 扩增体系产物在2 琼脂糖凝胶上电泳。 称取1 o g 琼脂糖，置于2 0 0 m l 锥形瓶中，加入5 0 m l 的1 x t a e 稀释缓冲 液混匀，放入微波炉中加热至琼脂糖全部溶化、液胶透明，加入2 5 9 le b ( 溴 化乙锭1 0 m g m 1 ) t g 匀。倒入已封好的有机玻璃胶槽中，插入样品梳，室温放 置，待凝胶完全凝固后小心拔出梳子拿出胶块。 上样：将制胶板放入水平电泳槽中，向槽内加入缓冲液至液面恰好没过 胶板上表面。用移液器向每个胶孔中分别加入p c r 产物，在最边上的胶孔 中加入d n am a r k e r 。 电泳：上样端接负极，6 0 v 电压，约6 0 m i n ，恒压电泳，根据指示剂判 断何时终止电泳。 然后将凝胶放在紫外灯下观察结果，如果3 0 0 b p 处出现特异荧光条带， 则产物为目的基因片段，拍照。 5 限制型片断长度多态性( r f l p ) 方法检测p c r 产物 由富酶泰斯生物技术( 深圳) 有限公司提供限制性内切酶h i n l l i ( 1 ) 配制酶切反应混合液，内含1 0 x b u f f e rr 、d h 2 0 ，保证各反应管间 扩增条件的一致性。 ( 2 ) 每个小e p 管中加入p c r 产物及酶切反应混合液。 h i n l i i 反应体系： p c r 产物 1 0 x b u f f e rr h i n l l i ( 1 0 u i ，t 1 ) d h 2 0 10 斗l 1 5 p 1 0 1 p l 3 5 肛1 1 4 山东大学硕士学位论文 总体系 15 9 l ( 3 ) 将e p 管放入3 7 水浴中酶切，过夜。 ( 4 ) 酶切产物经溴化乙锭染色，用2 的琼脂糖凝胶在6 0 伏电压下电泳 6 0 m i n ，紫外灯下观察结果以确定基因型，自动凝胶成像分析系统成像和分 析。结果：电泳条带有两种：只出现2 8 0 b p 一种条带的是t t 型，出现6 2 b p 、 2 1 8 b p 和2 8 0 b p 三种条带的是t c 型。 五、统计学方法 应用s p s s1 3 0 统计软件包对数据进行统计学分析。所有计量资料采用 均数士标准差( a z q - s ) 。计算c f hy 4 0 2 h 基因型和等位基因频率，h a r d y w e i n b e r g 平衡定律检验两组是否来自同一蒙德尔群体。利用单因素条件l o g i s t i c 回归 分析行为因素及基因多态性与急性冠脉综合征发病的关系，将有统计学意义 的因素纳入多因素条件l o g i s t i c 回归模型。以p o 0 5 说明群 体基因遗传平衡，数据来自同一蒙德尔群体( 见表1 ) 。 表1 两组h a r d y w e i n b e 平衡定律检验 三、p c r 反应结果 c f hy 4 0 2 h 扩增出一条2 8 0 b p 条带，与d n am a r k e r 比较显示与引物 设计所应扩出p c r 产物长度吻合( 见图1 ) 。 2 8 0b p 1 6 山东大学硕士学位论文 四、 限制型片断长度多态性( r f l p ) 检测结果 扩增出2 8 0 b p 产物经h i n li i 酶切结果( 见图2 ) ， t t 基因型： 一条条带2 8 0 b p ，t c 基因型：三条带2 8 0 b p 2 18 b p 6 2 b p 。 2 8 0b d 2 1 8b b 6 2b p _ 五、两组生化资料的比较 与对照组相比，a c s 组总胆固醇( t c ) 、甘油三脂( t g ) 、高密度脂蛋 白( h d l c ) 、低密度脂蛋白( l d l c ) 、极低密度脂蛋白胆固醇( v l d l c ) 、 尿酸( u a ) 、总胆红素( t b t l ) 差异无统计学意义( 尸 0 0 5 ) ( 见表2 ) 。 表2两组的临床资料比较 六、主要研究因素的变量及赋值 变量赋值祥见表3 。 1 7 山东大学硕士学位论文 婚姻 职业 文化程度 b m l 人均月收入 健身活动 劳动强度 + 吸烟史 饮酒史 近一周吃肉 吃肉的种类 近一周吃鸡蛋数量 近一周吃煎炸食品数量 近一周吃奶油糕点和巧克力次数 盐摄入量 每天工作时间 每天睡眠时间 性格 已婚= 1 ，离婚丧偶= 2 ，再婚= 3 无业= 1 ，司职员= 2 ，服务行业= 3 ，工人：4 ， 农民= 5 ，科教文卫、机关人员= 6 ，其他= 7 婚姻、职业为多分类变量，无明确证据认为 它们之间各个等级的o r 值是成倍上升的， 但本研究例数较少，所以未采用哑变量进 行分析 文盲= 1 ，小学= 2 ，初中= 3 ，高中中专一4 ， 大专= 5 ，大学本科及以上= 6 2 8 k g m 2 = 2 5 0 0 元月= 2