（临床检验诊断学专业论文）xiap及其相关因子xaf1在慢性粒细胞白血病中的表达研究.pdf

一、摘要 中文论著摘要“ 英文论著摘要一 二、英文缩略语 三、论文 1 j _ 刖舌“ 材料与方法” 结果” 讨论” 结论“ 四、本研究创新性的自我评价” 五、参考文献“ 六、附录 综述” 在学期间科研成绩一 致谢“ 个人简介“ 中文论著摘要 x i a p 及其相关因子x a f l 在慢性粒细胞白血病中的表 达研究 目的 慢性粒细胞白血病( c h r o n i cm y e l o g e n o u sl e u k e m i a , c m l ) 是慢性骨髓增生性疾 病中最常见的一种，属于造血干细胞恶性增殖性疾病。x 连锁调亡抑制蛋白 1 i n k e di n h i b i t o ro f a p o p t o s i sp r o t e i n ，x l 钟) 是i a p 家族的重要成员，与细胞的生 长、分化与凋亡密切相关。既往研究表明x i a p 的高表达是肿瘤预后不良的标志， 而x a f l 作为x i a p 抑制性调节因子，在肿瘤细胞中低表达或不表达，剂量依赖性 拮抗x i a p 的活性，减少x a f l 的表达可能是恶性肿瘤细胞对凋亡耐受而存活的关 键原因。 本研究通过实时荧光定量p c r 方法观察凋亡抑制蛋白a p 及x a f l 在c m l 中 的表达情况，在国内外文献中未见报道，本研究将进一步评估二者在c m l 诊断、疾 病进展及预后分析中的应用价值。 方法 一、选取研究对象 c m l 患者4 2 例，其中慢性期2 4 例( c m l 慢性期组) ，进展期18 例( c m l 进展 期组，其中加速期7 例及急变期1 l 例) ，非恶性血液病患者2 1 例，急性白血病患者 2 4 例。 二、实时荧光定量p c r 收集患者骨髓单个核细胞，提取总r n a ，按试剂盒说明书配置逆转录反应体 系合成c d n a , 引物由t a k a r a 公司设计合成，采用s y b r g r e e ni 实时定量荧光p c r 方法，以g a p d h 为内参照，进行s y r bg r e e ni 实时荧光定量p c r ，检测x l 廿及 x a f l 的表达水平。 三、结果判断 根据实时荧光定量p c r 得至t j c t 值，通过标准曲线计算得出x i a p 、x a f l 及 g a p d h 基因的拷贝数，通过x i a p 、x a f l 与内参基因g a p d h 的拷贝数比值算出 x i a p 与x a f l 的相对表达水平。 四、统计学分析 采用s p s s1 6 0 软件进行分析，实验结果应用秩和检验分析，p 0 9 9 8 ，斜率在3 3 至3 5 之间，反映定量准确，扩增效率良好。 扩增后溶解曲线显示锐利的单一锋，无其他非特异性锋，说明扩增产物均一，无 非特异扩增及引物二聚体。琼脂糖凝胶电泳进一步验证扩增片段的均一性及长度。 二、x i a p 及x a f l 的表达 c m l 进展期组患者骨髓中x i a p 表达水平高于c m l 慢性期组( p o 0 5 ) 和非恶 性血液病组( p 0 0 5 ) ；而c m l 进展期患者骨髓中x a f l 表达水平低于c m l 慢性期 ( p o 0 5 ) 和非恶性血液病组( p 0 0 5 ) ；化疗后获得骨髓缓解的c m l 患者骨髓中x 工a p 的表达水平显著低于化疗前，而x a f l 的表达水平显著高于化疗前( p 0 0 5 ) 。应用 s p e a r m a n 相关分析，c m l 患者x i a p 和x a f l 的表达水平之间呈负相关( 产一0 3 3 5 ， p = 0 0 3 0 ) 结论 x i a p 在慢性粒细胞白血病中表达水平明显升高，且进展期患者显著性高于慢 2 性期患者：而x a f l 表达水平明显减少，且进展期患者显著性低于慢性期患者；表 明x i a p 及x a f l 对c m l 的发生、发展起着重要作用：且x i a p 及x a f l 存在明显负 相关，表明c m l 患者x i a p 及x a f l 的联合检测及动态观察可作为c m l 临床辅助诊 断、分期及预后判断的指标之一。 关键词 x i a p ：x a f l ；慢性粒细胞白血病，细胞凋亡；反转录聚合酶链反应 3 英文论著摘要 e x p r e s s i o na n d c l i n i c a ls i g n i f i c a n c eo fx i a pa n d x i a pa s s o c i a t e df a c t o r li nc h r o n i cm y e l o g e n o u s l e u k e m i a o b j e c t i v e c k o m cm y e l o g e n o u sl e u k e m i a ( c m l ) i saf r e q u e n td i s e a s eo fb o n em a r r o w h y p e r p l a s i a , a n di ti sac l o n a lm y e l o p r o l i f e r a t i v ed i s o r d e ro ft h eh e m a t o p o i e t i cs t e mc e l l x - l i n k e di n h i b i t o ro fa p o p t o s i sp r o t e i n ( x i a p ) ，am e m b e ro fi a pf a m i l yp r o t e i n ，i t c o r e l a t e sw i t hg r o w t h , d i f f e r e n t i a t i o na n da p o p t o s i so fc e l l s i n c es t u d i e si n d i c a t et h a t o v e r e x p r e s s i o no fx i a pi sa nu n f a v o r a b l ep r o g n o s i sm a r k e r x a f l ，a sx l a pa s s o c i a t e d f a c t o r l ，i sh y p o e x p r e s s i o no rn oe x p r e s s i o ni nm a l i g n 锄tc e l l s ，d o s ed e p e n d e n t 嘶mt h e a c t i v i t yo fx i a p ，t h ed e c r e a s eo fx a f 1 e x p r e s s i o nm a y b eak e yr e a s o no fa p o p t o s i s t o r l e r a n c ei nm a l i g n a n tc e l l s t oo b s e r v et h ee x p r e s s i o n so fx - l i n k e di n h i b i t o ro fa p o p t o s i s p r o t e i na n d x i a p a s s o c i a t e df a c t o r li nb o n em a r r o ww i t hc m l ，a n di ti sn o tr e p o r t e di ne x t e r i o r a n di n t e r i o rd o c u m e n t s ，i nt h i ss t u d yw ew i l la s s e s st h ec o r r e l a t i o no fx l a pa n dx i a p w i t hp o t e n t i a ld i a g n o s i sa n d p r o g n o s i sv a l u ei nc m l m e t h o d s 1 p a t i e n t s t h ec o h o r tc o m p r i s e d p a t i e n t s w i t l lc m li n c l u d i n g2 4c a s e si nc h r o n i c s t a g e ( c m l - c p ) 、7c a s e si na c c e l e r a t i o ns t a g ec m l ( c m l a p ) a n d1 1c a s e si na c u t e t r a n s f o r m a t i o ns t a g ec m l ( c m l b p ) ，2 1c a s e si nn o n m a l i g n 柚th e m o t o l o g i cd i s o r d e r c a s e sa n d2 4a c u t el e u k e m i ac a s e s 2 r e a l t i m eq u a n t i t a t i v ef l u o r e s c e n tp c r c o l l e c tm o n o n u c l e a r c e l l si nb o n em a l t o w , e x t r a c t e dt o t a lr n a ，r e a c t i o ns y s t e m w a sd i s p o s e da s2 0 此t os y n t h e s i z ec d n a ；p r i m e r sw e r ed e s i g n e da n ds y n t h e s i z e db y t a k a r ac o m p a n y , s y b rg r e e nif l u o r e s c e n tr e a l - t i m eq u a n t i t a t i v ep c rm e t h o dw a s 4 a p p l i e dt od e t e c te x p r e s s i o nl e v e l so fx i a pa n dx a f 1 3 r e s u l t sd e t e r m i n a t i o n s t a n d a r dc u r v ew a sd r a wb ye a c hc tv a l u eo fa m p l i f i c a t i o nc u r v e s s a m p l e sc o p y n u m b e rw a so b t a i n e da c c o r d i n gt os t a n d a r dc h iv e g a p d hw a sd e t e c t e da si n n e r r e f e r e n c e ，w h i l ex i a pa n dx a f lw e r ed e t e c t e da so b j e c t i v eg e n e s r e l a t i v e q u a n t i t a t i v ec o m p a r i s o n sa m o n gd i f f e r e n ts a m p l e sw e r et a k e na c c o r d i n gt ot h ec o p y n u m b e rr a t i oo f o b j e c t i v eg e n ea n di n n e rr e f e r e n c eg e n e 4 s t a t i s t i c a la n a l y s i s a l l t h ed a t aw a sa n a l y s e dw i n ls p s s16 0s t a t i s t i c a l s o f t w a r e u s i n g m a n n w h i t n e yum e t h o d s ，p 0 0 5w a sc o n s i d e r e ds t a t i s t i c a l l ys i g n i f i c a n t r e s u l t s 1 r e l i a b i l i t ya n da c c u r a c yo fm e t h o d ( 1 ) p u r i t ya n dq u a l i t ya n a l y s i so f r n a d e t e c t i n ge x t r a c t e dt o t a lr n ab yu l t r a v i o l e ts p e c t r o p h o t o m e t e r , t h er a t i o sw e r e b e t w e e n1 8a n d2 0 f u r t h e ri d e n t i f i c a t i o nw a sd o n eb ya g a r o s eg e le l e c t r o p h o r e s i s ， b a n d sw e r ec l e a r l y , w h i c hs h o w sn oo b v i o u s l yd e g r a d a t i o n ( 2 ) s p e c i f i c i t yo fa m p l i f i c a t i o na n da c c u r a t i o no fq u a n t i t a t i o n s t a n d a r ds a m p l e su n d e r t o o kp c rr e a c t i o n sa f t e rg r a d i e n td i l u t i o n , w h i c hw a s a i m e dt om a k es t a n d a r dc u r v e s a l lt h ec o r r e l a t i o nc o e f f i c i e n t sw e r em o r et h a n0 9 9 8 ， s l o p e sw e r eb e t w e e n - 3 3a n d - 3 5o fs t a n d a r dc u r v e s ，i n d i c a t i n gq u a n t i t a t i v ea c c u r a t i o n a n dg o o da m p l i f i e de f f e c t s d i s s o c i a t i o nc u r v e ss h o wt h ei d e n t i c a lt mv a l u ef o ra l l s a m p l e s ，a n dt h es h a r ps o l ep e a ke n s u r e dt h es p e c i f i ca m p l i f i c a t i o no ft a r g e t s e q u e n c e w i t h o u tp r i m e rd i m e r 2 t h ee x p r e s s i o nl e v e l so f a pa n d 脚1 t h el e v e lo fx i a pi nt h eb o n em a r r o wo fd i a g n o s e dc m li na d v a n c e ds t a g e p a t i e n t sw a sh i g h e rt h a nt h a ti nc h r o n i cs t a g ep a t i e n t sa n dn o n - m a l i g n a n th e m o t o l o g i c d i s o r d e rp a t i e n t s ( p 0 0 5 ) t h el e v e lo fx i a pp r o t e i ni nc h r o n i cs t a g ew a sh i g h e rt h a nt h a ti n n o n m a l i g n a n th e m o t o l o g i cd i s o r d e r ( p 0 0 5 ) a f t e rc h e m o t h e r a p y ，t h el e v e l so fx i a p i nc m l p a t i e n t sa c h i e v i n gb o n em a r o wr e m i s s i o n ( b m r ) w e r er e m a r k a b l yd e c r e a s e d ， 5 a n dt h el e v e l so fx a fii nc m l p a t i e n t sa f t e rc h e m o t h e r a p ya c h i e v i n gb m r w e r e r e m a r k a b l y i n c r e a s e d t h ex i a pa n dx a f1 e x p r e s s i o n i nc m lw e r ea s s u r e d s i g n i f i c a n t l yr e v e r s ec o r r e l a t i o n c o n c l u s i o n t h ee x p r e s s i o nl e v e lo fx i a pw a ss i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e di nc m l ，a n dt h e e x p r e s s i o nl e v e lo fx i a pi n c m la d v a n c e ds t a g ei ss i g n i f i c a n t l yh i g h e rt h a nt h a ti n c m lc h r o n i cs t a g e ；b u tt h ee x p r e s s i o nl e v e lo fx a f lw a ss i g n i f i c a n t l yd e c r e a s e d ，a n d t h ee x p r e s s i o nl e v e lo fx a f 1i n c m la d v a n c e ds t a g ei ss i g n i f i c a n t l yl o w e rt h a nt h a ti n c m lc h r o n i cs t a g e ；t h ex i a pa n dx a f1 e x p r e s s i o ni nc m lw e r es i g n i f i c a n t l y r e v e r s ec o r r e l a t i o n t h e ys u g g e s tt h a tt h ed y n a m i ce x a m i n a t i o no fx i a pa n dx a f1 m a y b eu s e da sc l i n i c a la u x i l i a r yd i a g n o s i s 、c l i n i c a ls t a t u sa n dp r o g n o s i so fc m l k e vw o r d s x - l i n k e di n h i b i t o ro fa p o p t o s i sp r o t e i n ；x i a p a s s o c i a t e d f a c t o r l ；c h r o n i c m y e l o g e n o u sl e u k e m i a ；a p o p t o s i s ；r e v e r s et r a n s c r i p t a s ep o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n 6 英文缩略语 7 x i a p 的活性，减少x a f l 的表达可能是恶性肿瘤细胞对凋亡耐受而存活的关键原 因。x i a p 相关因子1 ( x a f l ) 是个新近发现的可以拮抗x i a p 抗凋亡作用的蛋白， 可以逆转x i a p 对细胞的保护作用，x a f l 对x i a p 蛋白因子的拮抗作用使其可能 成为一个新的、潜在的肿瘤抑制因子【l 】。本研究采用反转录聚合酶链反应( r t - p c r ) 检测x i a p 及x a f l ，观察其在慢性粒细胞白血病( c m l ) 患者的骨髓中表达情 况，探讨两者表达的相关性及其与c m l 诊断、预后的关系。 材料与方法 一、研究对象 选择2 0 0 8 年l 户j - - 2 0 0 9 年1 2 月在我院就诊的4 2 例初治c m l 患者为研究对象，其 中男2 2 例，女2 0 例；年龄9 7 8 岁，中位年龄4 0 5 岁；其中进展期1 8 例( c m l 进展 期组，包括加速期7 例及急变期1 1 例) ，慢性期2 4 例( c m l 慢性期组) ；c m l 患者 均根据临床表现、血象和骨髓象，同时参照法、美、英( f a b ) 协作组的c m l 诊 断标准确诊。非恶性血液病患者2 1 例( 3 例骨髓供者，1 8 例感染患者) ，男1 2 例， 女9 例；3 7 8 岁，中位年龄3 9 岁。初治急性白血病( a c u t el e u k e m i a ，a l ) 患者2 8 8 例( a l 组) ，男1 1 例，女1 7 f f l j ；年龄5 8 2 岁，中位年龄2 8 5 岁；其中髓系白血病1 7 例( m ll 例、m 2 6 例、m 35 例、m 43 例、m 5 2 例) ，急性淋巴细胞白血病1 1 例( l 1 2 例、l 2 9 例) ；经过骨髓细胞形态学、细胞化学、免疫学、分子生物学等检查确诊， 均符合f a b 诊断标准。初治c m l 患者化疗1 个疗程后复查骨麓象判断是否完全缓解 ( c r ) ，c r 的判断标准参照张之南主编的血液病诊断及疗效标准。 二、方法 l 、标本准备及核酸制备 采集骨髓标本2 “，用e d t a k 2 抗凝，将骨髓标本沿管壁缓慢加到f i c o l l 淋 巴细胞分离液上层，两者比例为1 ：1 ，18 0 0 r m i n ，离心1 5m i n ，吸取中间单个 核细胞层计数后，收集约l o 个细胞沉淀，按照t r i z o l ( i n v i t r o g e n 公司) 说明书抽 提总r n a 。所提取的总r n a 采用紫外分光光度计( b e c k m a n 公司产品) 测定2 6 0 n m 和2 8 0n n l 处的吸光度( a ) 值，a 2 6 0 ：a 2 8 0 比值在1 8 0 以上者用于定量r t - p c r 。 2 、反转录 反应体系为2 0p l 。5 反转录反应缓冲液4 山，细胞总r n a3t t l ，m m l v 反转 录酶( 2 0 0u r t l , p r o m e g a 公司产品) 1 山，d n t p ( 各2 5m m ，t a k a l a 公司产品) 2 0 m ，随机引物( o 5 一山，t a k a l a 公司产品) 1 5g l ，r n a s i n ( 5 0u 9 1 ) 0 5g l ，d e p c 水补足至2 0 山，3 7 反应6 0m i n ，9 5 反应5m i n 灭活反转录酶。 3 、s y b rg r e e ni 荧光定量p c r 方法检测x i a p 、x a f l 及g a p d h 三种基因的m r n a 表达 采用s y b rg r e e ni 实时荧光定量p c r 检测方法，以g a p d h 为内参照，x i a p 与x a f l 为目的基因，与相应标准品一起进行扩增。引物序列见表l 。根据荧光 定量p c r 说明书设置反应参数，a b l 7 5 0 0 全自动荧光定量p c r 仪检测，通过溶 解曲线确定p c r 产物的特异性。 9 表1 ，靶基因引物序列 4 、标准曲线的制定 对定性方法检测到的阳性标本进行5 倍系列稀释，分别作为模板进行扩增， 由定量分析软件分别制作目的基因和内参照的标准曲线。 三、结果判定标准 采用实时荧光定量p c r 方法检测，实验中以g a p d h 作为内参照，以x i a p 与x a f l 作为目的基因。由梯度稀释的样本扩增得到的c t 值制作标准曲线，从而 得到样本的拷贝数。通过目的基因和内参基因拷贝数的比值进行样本间相对定量 的比较。 四、统计分析 采用s p s s1 6 0 软件进行分析，实验结果应用m a n n - w h i t n e yu 秩和检验分析， p o 9 9 8 ，斜率在3 3 至3 5 之间，反映定量准确，扩增效率良好。扩增 1 0 后进入溶解程序生成溶解曲线，溶解曲线显示锐利的单一锋，无其他非特异性锋， 说明扩增产物均一，无非特异扩增及引物二聚体。琼脂糖凝胶电泳进一步验证扩 增片段的均一性及长度。 二、a p 在c m l 患者组及对照组中的表达 c m l 进展期组患者x i a pm r n a 表达水平高于非恶性血液病组( z 一4 4 1 8 ， p = 0 0 0 0 ) 及c m l 慢性期组( z = 2 6 0 7 ，p = 0 0 0 9 ) ，差异均有统计学意义；c m l 进展期组患者x i a pm r n a 表达水平与a l 组患者比较，差异无统计学意义 ( z = 0 4 1 7 ，p = 0 6 7 7 ) 。c m l 慢性期组x i a pm r n a 表达水平明显高于非恶性血 液病组( z = - 3 1 6 9 ，p = 0 0 0 2 ) ，而显著性低于a l 患者x i a pm r n a 表达水平( z = 3 4 0 8 ，p = 0 0 0 1 ) 。 表2 ，各组x l 廿m r n a 的相对表达水平 三、x a f l 在c m l 患者组及对照组中的表达 c m l 进展期组患者x a f lm r n a 表达率为7 7 7 8 。c m l 进展期组患者x a f l m r n a 表达水平低于非恶性血液病组( z = 4 1 18 ，p = 0 0 0 0 ) 及c m l 慢性期组( z = - 2 0 5 4 ，p ：0 0 4 0 ) ，差异有统计学意义；c m l 进展期组患者x a f lm r n a 表达水 平与a l 患者比较，差异无统计学意义( z = 1 1 0 2 ，p = 0 2 7 1 ) ；c m l 慢性期组x a f l m r n a 表达水平明显低于非恶性血液病组( z 一2 6 7 1 ，p = 0 0 0 8 ) ，而显著性高于 a l 患者x a f lm r n a 表达水平( z 一2 9 5 4 ，p = 0 0 0 3 ) 。 表3 ，各组x a f lm r n a 的相对表达水平 四、c m l 患者组化疗前后a pm r n a 和魁蟠1m r n a 表达 4 2 例c m l 患者中2 2 例进行化疗后检测，可进行疗效评价，其中化疗后获得 骨髓缓解的c m l 患者( 2 2 例) x i a pm r n a 的表达水平显著低于化疗前( z = - 3 1 1 0 ，p = o 0 0 2 ) ，但未获缓解的c m l 患者( 1 2 例) x i a p m r n a 的表达的水平 与化疗前比较差异无统计学意义( z = 1 9 5 5 ，p = 0 0 5 1 ) 。化疗后获得骨髓缓解的 c m l 患者x a f lm r n a 的表达水平显著高于化疗前( z = 3 1 8 0 ，p = 0 0 0 1 ) ，但 未获缓解的c m l 患者x a f lm r n a 的表达水平与化疗前比较差异无统计学意义z = - 1 8 3 6 ，p = 0 0 6 6 ) 。 表4 ，c m l 患者组化疗前、后x i a p 和x a f l 相对表达水平 五、x i a pm r n a 和x a f lm r n a 表达的相关性 应用p e a r s o n 相关分析，c m l 患者x i a p 和x a f l 的表达水平之间呈负相关 ( 产- - - o 3 3 5 ，p = 0 0 3 0 ) 。 1 2 讨论 一、细胞凋亡 细胞凋亡是基因控制的细胞自我消亡过程，对组织的生长发育及维持机体平 衡状态有重要的作用。细胞凋亡受抑与增殖失控和分化障碍一样在肿瘤的发生、 发展中起重要作用，凋亡受抑是肿瘤发生、发展及治疗失败的主要原因。 二、x l p 与c m l x i a p 又名b i r c 4 ，1 9 9 6 年由d u c k e r 等鉴定出来。研究发现，属于l a p 家族 成员的x i a p 基因可通过抑制半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶( c a s p a s e ) 激活而阻止凋亡 的发生，是凋亡抑制蛋白家族中作用最强的一种，在多种肿瘤组织和细胞中高表 达，与肿瘤的发生、发展密切相关。体外研究发现x i a p 对内源性和外源性凋亡 途径均有明显的抑制作用，x i a p 是体内抑制c a s p a s e s 活性最强的蛋白，主要通过 抑制c a s p a s e 3 、c a s p a s e 一7 和c a s p a s e - 9 而产生抑制凋亡作用，体内x l a p 抑制 c a s p a s e s 活性至少受x a f l 、h t r a 2 和s m a c3 个蛋白负调控。 t a m m 等【2 1 对6 0 个人类癌细胞系的研究表明x i a p 在多数癌细胞系中表达，且 x i a pm r n a 在急性白血病中过量表达也已得到证实p - 4 1 ，并与肿瘤的发生、进展、 分期和预后等密切相关。本研究结果表明初治c m l 患者进展期及慢性期患者骨髓 中x i a pm r n a 表达水平均显著高于非恶性血液病患者，而且c m l 慢性期患者骨髓 中x i a pm r n a 表达水平显著低于进展期患者，另外缓解期患者x i a pm r n a 表达 水平较初冶时明显降低，而未缓解患者x i a pm r n a 表达水平与化疗前无明显差 异，提示x i a pm r n a 与c m l 的发生、发展及预后有一定的关系。 三、x a f l 与c m l x a f i 在所有胚胎组织及成人正常组织中广泛表达，x a f l 的作用机制是通 过直接结合并抑制x i a p 对c a s p a s e 3 的抑制作用从而发挥诱导凋亡作用【5 1 ，可 引起x l a p 重新从细胞质移位到细胞核，拮抗x i a p 对c a s p a s e s 3 的抑制效应。x a f l 的低表达或不表达还与肿瘤的分期、分级密切相关：肿瘤恶性程度越高，分化越 低，m r n a 表达就越低，甚至不表达，x a f l 可独立诱导细胞凋亡【6 】，故x a f l 是一个潜在的肿瘤抑制基因【7 1 。本研究发现非恶性血液病患者骨髓标本均表达 1 3 x a f l m r n a ，初治c m l 患者进展期及慢性期患者骨髓中x a f lm r n a 表达水平 均显著低于非恶性血液病患者，而且进展期组c m l 的x i a p 表达水平显著性低于 c m l 慢性期患者组，提示x a f l 与c m l 的发生发展有一定的相关性。化疗后完 全缓解的c m l 患者x a f lm r n a 表达明显升高，而未缓解的c m l 患者化疗后 x a f lm r n a 表达与化疗前相比无明显差异，提示x a f lm r n a 表达减低或缺失 可能是c m l 预后的高危因素之一。基于x a f l 具有拮抗x i a p 凋亡抑制作用和肿 瘤抑制基因的特性，因此，恢复x a f l 的表达和功能，有可能成为恶性肿瘤基因 治疗新的靶标。 四、x i a p 及1 相关性 c m l 患者骨髓中x i a pm r n a 和x a f im r n a 的表达水平呈负相关，且与疾 病分期密切相关，表明检测骨髓中x i a pm r n a 和x a f im r n a 表达水平可为c m l 临床分期及预后判断提供更多的实验室依据。 结论二日匕 x i a p 在慢性粒细胞白血病中表达水平明显升高，且进展期患者显著性高于慢 性期患者；而x a f l 表达水平明显减少，且进展期患者显著性低于慢性期患者；表 明x i a p 及x a f l 对c m l 的发生、发展起着重要作用；研究表明x i a p 及x a f l 存在 明显负相关，提示c m l 患者x i a p 及x a f l 的联合检测及动态观察可作为c m l 临床 辅助诊断、分期及预后判断的指标之一。 针对x i a p 及x a f l 表达做进一步的研究，明确二者的分子作用机制，以便针 对二基因为靶点开发治疗药物具有重要的意义。 1 4 本研究创新性的自我评价 国内外已有大量关于x i a p 表达水平及作用的研究，但是对于慢性粒细胞白 血病中的表达情况和作用机制尚未有学者进行过充分的探讨，而x a f l 相关报道 研究就更少了，本研究通过检测x i a p 及x a f l 在慢性粒细胞白血病中的表达情 况，将c m l 分为进展期及慢性期两组，分别与非恶性血液病组及急性白血病组应 用m a n n w h i t n e yu 秩和检验进行组间比较， 从而得出随着c m l 疾病的进展 x i a p 表达水平增加，而x a f l 表达水平降低，说明x i a p 及x a f l 与c m l 发生 发展有关，而且通过对c m l 患者化疗后的研究，得出x i a p 高表达及x a f l 的低 表达是c m l 预后不良的分子标志。因此在c m l 患者骨髓细胞中研究x i a p 及 x a f l 的表达，为进一步研究x i a p 及x a f l 在血液肿瘤的作用机制提供了理论依 据，也对以后针对x i a p 及x a f l 为靶点开发治疗药物具有重要的意义。 1 5 2 3 ( x i a p ) i sa l li n d e p e n d e n tu n f a v o r a b l ep r o g n o s t i cf a c t o ri nc h i l d h o o dd en o v oa c u t em y e l o i d l e u k e m i a j jk o r e a nm e ds c i ，2 0 0 9 ，2 4 ( 4 ) ：6 0 5 - 613 4 d e s p l a n q u e sg , g i u l i a n in ，d e l s i g n o r e 心e ta 1 i m p a c to fx i a pp r o t e i nl e v e l so nt h es u r v i v a lo f m y e l o m ac e l l s j h a e m a t o l o g i c a , 2 0 0 9 ，9 4 ( 1 ) ：8 7 - 9 3 5l i s t o np ，f o n gw g ，k e l l yn l ，e ta 1 i d e n t i f i c a t i o no fx a f 1a sa l la n t a g o n i s to fx i a p a n t i - c a s p a s ea c t i v i t y j n a tc e l lb i o l ，2 0 0 1 ，3 ：1 2 8 1 3 3 6p l e n c h e t t es ，c h e u n gh h ，f o n gw g ，e ta 1 t h er o l eo fx a fii nc a n c e r j c u r to p i ni n v e s t i g d r u g s ，2 0 0 7 ，8 ( 6 ) ：4 6 9 - 4 7 6 7 b y u nd s ，c h ol ( r y ub k ，e ta 1 h y p e r m e t h y l a t i o no fx l a p - a s s o c i a t e df a c t o r l ，ap u t a t i v e t u m o rs u p p r e s s o rg e n ef r o mt h e 1 7 p 1 3 2l o c u s ，i nh u m a ng a s t r i ca d e n o c a r c i n o m a s j c a n c e r r e s ，2 0 0 3 ，6 3 ( 2 ) ：7 0 6 8 7 0 7 5 综述 x i a p 及x a f l 肿瘤研究中的现状及进展 肿瘤的形成是一个多因素多步骤的复杂过程，细胞凋亡程度的降低是肿瘤发 生的主要机制，凋亡异常，则会导致机体发生免疫系统疾病和或肿瘤【l l 。本文针对 x 连锁调亡抑制蛋白( x i a p ) 及x i a p 相关因子( 盯1 ) 在恶性肿瘤( 包括实体 肿瘤和血液肿瘤) 中的研究现状及进展进行了阐述。 关键词恶性肿瘤；x i a p ；x a f l ；细胞凋亡 研究背景 一、x i a p 凋亡抑制蛋t 兰t ( i n h i b i t o ro f a p o p t o s i sp r o t e i n ，i a p s ) 是一类在结构上具有同源性 的细胞内源性凋亡抑制蛋白家族。目前为止在人类已经发现的i h v s 至少有8 种。它 们能够对抗各种凋亡诱导因素，抵抗细胞凋亡。x 一连锁调亡抑制蛋白( ) ( 1 i n k e d i n h i b i t o ro f a p o p t o s i sp r o t e i n ，x i a p ) 是i a p 家族的重要成员，与细胞凋亡和信号转导 f 2 j 密切相关，已成为近年来生命科学研究热点【3 ，4 1 。 人类l a p s 的主要成员有x i a p 、c l a p l 、c l a p 2 、生存素s u r v i v i n 、l i v i n 、神经元 凋亡抑制蛋白n i a p 等。x i a p 是l a p 家族中最有效力的c a s p a s e 抑制物，也是分子结 构研究得最清楚的i a p 家族成员。1 9 9 6 年，x i a p 、c i a p 1 和c i a p 2 同被鉴定出来， 并在体外研究中发现其对f a s 和c a s p a s e s 诱发的内源、外源细胞凋亡过程有明显的 抑制效应【。随后的研究发现x i a p 的生物学功能多样，对肿瘤发生、发展及预后 有多方面的影响，学者们对x i a p 在肿瘤发病机制中的作用和靶向治疗中的应用等 研究正逐步深入。 1 、x i a p 的基因定位、分子结构和组织分布 x i a p 基因定位于x q 2 5 ，m r n a 全长为9k b ，编码区由7 个外显子组成，含4 9 7 个氨基酸，x i a p 分子量5 7k d ，主要由3 个杆状病毒i a p 重复序列区( b a c u l o v i r a l i n h i b i t o ro f a p o p t o s i sr e p e a t ，b i r ) 和一个r i n g 锌指结构域( r i n gz nf i n g e rd o m a i n ) 1 7 组成。x i a p 的n 端有3 个b i r 结构域：b i r l 、b i r 2 和b i r 3 5 , 8 , 9 , 1 1 】。b i r 结构域是l a p 家族分子抑制c a s p a s e 活性，发挥凋亡抑制作用不可缺少的结构。x i a p 的c 端有1 个r i n g 锌指结构域，具有泛素连接酶e 活性【1 2 】，也是i a p 家族分子抗凋亡的重要 结构。x i a p 在成年人、婴幼儿体内除外周血淋巴细胞以外的所有组织中广泛表达。 2 、x i a p 生物学功能 ( 1 ) x i a p 的抗凋亡作用 a p 是l a p 家族中最有效力的c a s p a s e 抑制物9 ，1 0 1 。c a s p a s e 是一组天门冬氨酸特 异性的半胱氨酸蛋白酶，目前在哺乳动物中已发现1 4 种c 硒p a s e 。大量的研究已证 实c a s p a s e 家族能介导细胞凋亡，其q b c a s p a s e 3 是凋亡的真正执行者，是凋亡级联 反应的必经之路【1 3 ，1 4 15 1 。x i a p 分子n 端的3 个b i r 结构域可以结合并抑制 c a s