（临床检验诊断学专业论文）hil15sa双功能融合蛋白中试工艺研究.pdf

目录 中文摘要1 英文摘要3 前言6 第一部分：h i l - 1 5 - s h 融合蛋白的表达与发酵 材料与方法8 结果1 4 讨论17 第二部分：h i l - 1 5 - s a g 蟹k 合蛋白纯化，复性研究 材料与方法19 结果25 分析与讨论3 0 第三部分：h i l - 1 5 - s a g 明k 合蛋白体外活性分析 材料与方法3 3 结果3 6 讨论3 7 总结3 8 参考文献3 9 致谢4 l 综述42 英文缩略词53 学位论文独创性声明55 6635m 47川1y 温州医学院硕士学位论文 hil - 15 - s a 融合蛋白中试工艺研究 中文摘要 目的 本文在已成功克隆、表达及实验室小规模制备h i l 1 5 一s a 的基础上，采用发 酵罐发酵生产，镍柱亲和层析及阴离子交换层析纯化，研究h i l 1 5 一s a 中试制各 工艺，为进一步工业化生产奠定了基础。 方法 1 诱导表达h 几1 5 - s a 融合蛋白 用c a c l 2 方法制备r o s e t t a 感受态细胞，从大肠杆菌d h 5 a 中提取质粒 p e t 2 1 a - h 几1 5 s a ( 由本室保存) ，将质粒转化入感受态细胞中进行活化，i p t g 诱导表达，超声破菌，包涵体洗涤。应用s d s p a g e 分析检测表达产物。 2 h l l 15 - s a 融合蛋白发酵条件优化 根据r o s e t t a 细菌的性质以及载体的特性将发酵培养基成分( 蛋白胨，酵母 抽提物，硫酸铵，硫酸镁，甘油) 进行优化分析，并分别对培养基的p h 值，i p t g 诱导浓度，接种量进行优化。并通过b 1 0 - f l o 发酵系统对整个发酵过程( 溶氧 度，p h ，温度等) 进行监控。 3 包涵体洗涤，纯化复性 收集工程菌，通过细胞压力破碎仪破菌收得包涵体后，计算包涵体得率，包 涵体经过洗涤后用8 m 尿素溶解进行二步纯化( 镍柱亲和层析，离子交换层析) 得到融合蛋白，通过银氨染色，凝胶成像扫描方法检测其纯度，并将融合蛋白进 行透析复性。 4 细胞增殖实验和细胞锚定实验 将复性的l l i l 1 5 s a 融合蛋白调整不同浓度体外检测是否对淋巴细胞有增 殖效应，并应用流式细胞仪检测h i l 1 5 s a 对前列腺癌细胞r m l 的锚定率，初 步评价经中试研究后h i l 1 5 s a 融合蛋白的生物学活性。 结果 1 诱导表达h i l 1 5 s a 融合蛋白 将质粒p e t 2 1 a h i l 1 5 s a 导入大肠杆菌中在带有氯霉素和氨苄霉素抗性的 平板中，经过1 6 0 c ，1 8 h 孵育后生长出单克隆菌落，并在菌落活化时间为5 h ， 3 7 0 c ，2 2 0 r p m ，o 3 r a mi p t g 条件下诱导表达。经s d s p a g e 鉴定蛋白出现约 温州医学院硕士学位论文 3 4 k d 大小位置。 2 h l l 1 5 一s a 融合蛋白发酵条件优化 通过发酵条件的优化，在3 的接种量，p h 值为7 2 ，发酵培养基为2 0 e e l 蛋 白胨，4 0 e l l 酵母抽提物，4 9 l 磷酸二氢钠，1 2 e e l 磷酸氢二钠，3 9 l 硫酸铵， 2 e e l 硫酸镁，4 m l l 甘油发酵条件下一次性可得到湿菌4 7 9 l 和包涵体2 1 1 5 e g l 。 3 包涵体洗涤，纯化复性 洗涤液洗后的包涵体用8 m 尿素溶解后分别经镍柱层析和阴离子交换柱层 析，纯化后的目的条带经s d s p a g e 和免疫印迹分析鉴定。条带经银氨染色及 经凝胶扫描仪分析纯度为9 7 ，二次纯化后目的条带峰值最高浓度为1 3 m g m l 。 纯化后的融合蛋白通过梯度尿素透析复性的方法检测体外生物学活性。 4 细胞增殖实验和细胞锚定实验 取小鼠脾细胞，体外m t t 法检测发现不同浓度的h l l 1 5 s a 与淋巴细胞成 剂量依赖效应，流式细胞仪检测h l l 15 一s a 融合蛋白与经生物素化的r m l 肿瘤 细胞锚定率达到9 9 7 。 结论 本文成功的将p e t 2 1 a - h l l 1 5 一s a 质粒导入大肠杆菌中并进行发酵获得大 量工程菌和包涵体，通过二次纯化获得高浓度和高纯度的融合蛋白，并在体外细 胞增殖实验和细胞锚定实验中初步检测了经发酵过的h l l 一1 5 s a 双功能融合蛋 白具有生物学活性。进一步为后续的体内生物学作用以及工业化生产奠定基础。 关键词 白细胞介素1 5 ；链亲和素；融合蛋白；中试工艺 2 温州医学院硕士学位论文 p i l o ts c a l ep r o d u c t i o na n dc h a r a c t e r i z a t i o no ft h ef u s i o n p r o t e i nh i l - 15 - - s ae x p r e s s e di ne s c h e r i c h i ac o l i a bs t r a c t o b je c t i v e t oa c q u i r eh i g hq u a n t i t ya n dp u r i t yb i f u n c t i o n a lf u s i o n p r o t e i nh l l 15 一s a ，w e a t t e m p t e dt oc a r r yo u tf e r m e n t a t i o nh l l - 15 - - s ai na nf e r m e n t o ra n dp u r i f i e dt h e r e c o m b i n a n tf u s i o np r o t e i nt h r o u g ht h em e t a la f f i n i t y c h r o m a t o g r a p h ya n da n i o n e x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h y , w h i c hw i l la l l o wu st op e r f o r mf u r t h e rs t u d i e si nv i v o m e t h o d s 1 e x p r e s s i o no ft h ef u s i o np r o t e i nh l l 一15 - s a p r e p a r ef o rt h er o s e t t ac o m p e t e n tc e l lw i t hc a c l 2 ，p l a s m i dp e t 2 1 a h l l 一1 5 - s a e x t r a c t e df r o me c o l id h 5 a t h e n ，e s c h e r i c h i ac o l ib l 2 1 ( d e 3 ) w a st r a n s f o r m e db y p l a s m i d p e t 2 1 a h l l - 1 5 一s a - 6 h i s p r o t e i ne x p r e s s i o n w a si n d u c e dw i t h i s o p r o p y l 一b - d - t h i o g a l a c t o s i d e ( i p t g ) ，t h ec e l l sw e r ed i s r u p t e du n d e rt h ep r e s s u r eo f 10 0 0p aw i t ht h eh i g hp r e s s u r eh o m o g e n i z e r s ，w a s ht h ei n c l u t i o nb o d i e s t h e nu s e s d s p a g ea n dw e s t e r nb lo tt oa n a l y s ist h e e x p r e s s i o n 2 o p t i m i z e df e r m e n t a t i o no ft h ef u s i o np r o t e i nh l l 一15 一s a t oa c h i e v et h eh i g h e ry i e l do fh l l - 15 - s a ，t h eb a s a ls a l t sm e d i u mw e r es t u d i e db y o r t h o g o n a la n a l y s i sa c c o r d i n gt ot h ec h a r a c t e r is t i c so ft h ec e l la n dv e c t o e o p t i m i z e t h ep hv a l u eo ft h em e d i u m ，i n d u c t i o nt i m e ，c o n c e n t r a t i o na n di n o c u l u ms i z e u s i n g t h eb i o f l of e r m e n t a t i o n s y s t e m t om o n i t o ra n d o p t i m i z e t h ef e r m e n t a t i o n c o n d i t i o n s 3 w a s ho f t h ei n c l u t i o nb o d i e s ，p u r i f i c a t i o na n dr e f o l d i n go f h l l 1 5 s a w a s ht h ei n c l u t i o nb o d i e sa n dd i s s o l v ei nt h es o l u t i o ni n c l u d i n g8m u r e a , 2 0m m t r i s - h c l ，5m m1 3 - m e ( p h 8 4 ，a n ds t i r r e da t4 0 co v e r n i g h t t h ef u s i o np r o t e i nw a s p u r i f i e db ya f f i n i t yc h r o m a t o g r a p h ya n da n i o ne x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h y u s es i l v e r s t a i n i n gt od e t e c tt h ep u r l t yo fh i l 一15 一s a t h e n ，t h ep u r i f i e da n dd e n a t u r e df u s i o n p r o t e i nh l l 15 - s aw a s t h e nd i a l y s i s e db yt h er e f o l d i n gb u f f e r 4 c e l lp r o l i f e r a t i o na n dm o d i f i e da s s a y f i r s t ，a d j u s t m e n to fd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n s t h e n ，t h eb i o l o g i c a la c t i v i t yo ft h e r e c o m b i n a n tf u s i o np r o t e i nh l l - 15 s aw a sa n a l y z e db ytc e l lp r o l i f e r a t i o na s s a ya n d m o d i f i e dt h ei 泓1c a n c e rc e l l s r e s u l t s 1 e x p r e s s i o no ff u s i o np r o t e i nh l l 15 s a g l y c e r i n e - p r e s e r v i n gp l a s m i dh a r b o r i n gp e t 21a h l l 15 s aw a st r a n s f o r m e di n t o e c o l ib l 2 1 ( d e 3 ) a n dg r o w no nl ba g a rp l a t e sw i t h5 0u g m la m p i c i l l i na n d5 0 u g m lc h l o r o m y c e t i nf o r18 h as i n g l ec o l o n yf r o mt h ep l a t ew a si n o c u l a t e di n5m l l bm e d i u m ，s h a k e da t3 7 0 c ，2 2 0 r p mf o r5 h p r o t e i ne x p r e s s i o nw a si n d u c e dw i t h i p t ga t0 5m m t h et a r g e tp r o t e i nw a ss h o w e da t3 4 k do ns d s 。p a g e 2 o v t i m i z e df e r m e n t a t i o no f t h ef u s i o np r o t e i nh i l 15 - s a t h r o u g ht h eo p t i m i z a t i o no ff e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n s ，w ef o u n dt h ep hv a l u ew a s s e tt o7 2a n dw h e nt h ei n o c u l a t e dw a s3 w e r eg o o df o rc e l l sg r o w t h 4 7g lw e t c e l l sa n d21 15g li n c l u s i o nb o d i e sw e r ec o l l e c t e dw h e nt h ef e r m e n t a t i o nm e d i u m w a s2 0 9 lt r y p t o n e , 4 0 9 ly e a s t e x t r a c t , 4 e e lk h 2 p 0 4 ，12 9 lk 2 h p 0 4 ，3 9 t ( n h 4 h s 0 4 ，2 9 lm g s 0 4 ，4 m l lg l y c e r i n e 3 w a s ho f t h ei n c l u t i o nb o d i e s ，p u r i f i c a t i o na n dr e f o l d i n go f h l 1 5 s a t h ef u s i o np r o t e i nw a ss u b je c t e dt on i c k e li o nm e t a la f f i n i t y c h r o m a t o g r a p h y a f t e rt w o p u r i f i c a t i o n a n di d e n t i f i e d b yi m m u n o b l o t ，1 3 m g m lm o n o s o m i c h l l - 15 一s aw e r eo b t a i n e da n dt h ep u r i t yw a sa t 9 7 f i n a l l y a n ds t a n d a r ds i l v e r n i t r a t es t a i n i n gr e s u l t e di nac l e a rb a n do ns d s - p a g e 4 c e l lp r o l i f e r a t i o na n dm o d i f i e da s s a y t h eb i o a c t i v i t yo fb i f u n c t i o nh i l 一1 5 s ac o n s i s t e do fi l 1 5 ( c e l lp r o l i f e r a t i o n a s s a y ) a n ds a ( m o d i f i e dt h eb i o t i n y l a t e dt u m o rc e l l s ) c e l lg r o w t hw a sd e t e c t e db y m t t a s s a y , a n da st h ec o n c e n t r a t i o ni n c r e a s e s ，t h er e s u l t ss h o w e dt h a tag o o db o o s t c e l lp r o l i f e r a t i o no fm o u s e s p l e e nc e l l s f l o wc y t o m e t r i ca n a l y s i sr e v e a l e dt h a ts a t a g g e dh i l 一15w a se f f i c i e n t l ya n dd u r a b l yd i s p l a y e do nt h es u n c a c o so fb i o t i n y l a t e d r m lp r o s t a t ec a n c e rc e l l s ，a n dt h em o d i f i e dr a t er e a c h e da t9 9 7 c o n c l u s i o n i nc o n c l u s i o n ，o u rr e s u l t ss h o w e dan o v e la n dh i g h l ye f f i c i e n tw a yo f p r o d u c i n g t h ec h a r a c t e r i s t i cl a r g eq u a n t i t i e sa n dh i g hp u r i t yb i o a c t i v i t yf u s i o np r o t e i n ，w h i c h a l l o wu st o p e r f o r mf u r t h e rs t u d i e so na n i m a le x p e r i m e n t sa n dt h ef i e l do f p h a r m a c e u t i c a l 4 温州医学院硕士学位论文 k e y w o r d s i n t e r l e u k i n 一15 ；s t r e p t a v i d i n ；f u s i o np r o t e i n ；p i l o ts c a l e 5 温州医学院硕士学位论文 一：f l 瘤是一类严重危害人民身体健康、影响社会劳动生产力的疾病，所带 1 - 乏对患者和亲属产生的心理压力也是巨大的。随着肿瘤发生率及死 j 似及肼一瘤发生发展分子机制的深入研究和生物技术的发展，肿瘤 ：为手术、化疗和放疗三大常规治疗模式的有益补充，已成为肿瘤综 一：萌圳f 种模式，肿瘤治疗的手段不断改进和完善，采用疫苗治疗的方法 一 ：的新途径，在个体体内注射肿瘤疫苗，可以达到有效减轻患者病 。- ：0 ，个体癌症复发的效果，并且肿瘤疫苗在治疗过程中无明显的毒副作 + ：。：s ； a 等人应用g m c s f 融合蛋白和自体肿瘤细胞作为疫苗治疗间皮 自“肿瘤相关抗原 的提出，人类对肿瘤细胞的生理状态下的认识以 77 r ：羔系统之间的相互关系，发现t 、b 细胞，自然杀伤n k 细胞在恶性 o ，起着重要的作用l 舶1 。 ：；蔓渤素一1 5 ( i l 一1 5 ) 首次于1 9 9 4 年被g r a b s t e i n 从猿的肾上皮细胞株 f 。、。；j j 清液发现，是一种新的可溶性细胞因子，生物学效应与几2 相似 _j ：l 细l 胞生长因子1 7 1 ，i l 2 r a 与i l 1 5 r a 在结构上相似的蛋白，都包含有 短“一二，：域，以及前细胞外部分其中包括p r o t h r 区域以及蛋白结合位点【8 】。 i l 一1 _ ：i ，o 能刺激t 、b 、n k 细胞增殖，t 细胞具有趋化，刺激免疫球蛋白的分 泌，jj _ 坫异性抗原的产生作用。但由于两种细胞因子及其受体在体内组织中分 布的+ ，f ，。1 5 除了能调控c d 8 + t 细胞的增殖，还能有效刺激记忆性t 细胞增殖， 而i ! ，4 ；_ jj 。1 细胞调控的维持i 圳。人几1 5 由1 1 4 个氨基残基构成，分子量为 1 4 j ij ii ) ；幔螺旋组合而成，能激发记忆性的c d 8 + t 细胞以及特殊的c d 4 细胞反 应：一：i 埔0 内存持久型c d 8 + t 细胞表达1 1 0 】。同时，重组人白细胞介素1 5 通过 c d 0 ：! ：i 抑制细胞凋亡对粘附性自然杀伤细胞( a - n k ) 起着强刺激作用【l l ，1 2 】。 此外，纯15 还可以刺激鼠特异性抗原t 细胞 包括辅助t 细胞( t h ) 和细胞毒t 细 胞( ( ：儿) 】的克隆，对同种抗原特性c t l 具有诱导作用。研究发现，m 1 5 还能 协同刺黟和作用于其它细胞因子的家族成员1 1 3 , 1 4 。 销+ ：，：亲和素( s a ) 是一种从链霉菌中分离出来的可溶性的蛋白，是一种碱性 糖蛋白，分子量6 6 0 0 0k d ，由1 2 5 - - , 1 2 7 氨基酸残基组成【1 5 , 1 6 】，与生物素有非常 强的亲矗力，链亲和素与生物素间的亲和力( k a = 1 0 。1 晰) 至少要比抗原抗体间 的结合力：1 南百万倍1 17 ，1 8 】。研究发现链亲和素由4 个相同的亚基构成，亲和素与生 物素的多“、i 主要是通过两种机制：一是亲和素上的亲水性氨基酸形成的氢键与生 物素的结合，二是疏水基团之间的作用。这种高亲和力使得生物素亲和素系统 在生物技术中的应用更为广泛【1 9 。2 2 1 。g m c s f 通过链亲和素生物素系统锚定 6 温州医学院硕士学位论文 b 1 6 f 1 0 黑色素瘤细胞证实由链亲和素标记的活性融合蛋白为肿瘤疫苗的制备提 供了一种快速，安全，有效的平台1 2 3 1 。 我们利用i l 1 5 的抗肿瘤效应与链亲和素相连，与生物素化的肿瘤细胞结合 后，能有效刺激肿瘤细胞周边以及全身免疫系统以达到消除肿瘤细胞作用。在本 试验前期研究中，己完成质粒p e t 2 1 a - h i l 1 5 s a 的制备，并进行初步表达了该 融合蛋白。但由于小量的制备使包涵体以及融合蛋白纯化的量都较少，纯度不高 等问题，很难开展后续的体外动物测活试验，基于此，本研究主要将其导入大肠 杆菌中并在发酵罐中进行发酵生产，收集工程菌得到包涵体，并将包涵体进行镍 柱亲和层析和阴离子交换层析，得到高浓度，高纯度的融合蛋白，同时，经过体 外细胞测活和细胞锚定实验证实由发酵获得的融合蛋白亦存在活性。为进一步开 展体外动物实验以及工业化生产奠定了基础。 7 温州医学院硕士学位论文 第一部分：h il - 15 - s a 融合蛋白的表达与发酵 材料与方法 一、材料： 1 菌种与质粒 菌种e s c h e r i c h i ac o i lb l 21 ( d e 3 ) 、d h 5 a 由本室保存，质粒p e t 21a h l l 一15 s a 由本实验室提供。 2 主要试剂与材料 i p t g ，氨苄霉素，氯霉素，免疫印迹试剂盒，m t t 检测试剂盒，b r a d f o r d 蛋白浓度监测试剂盒均购自碧云天生物研究所。t e m e d 购自q i a g e n 公司，n t a 填料( 1 0 0 m 1 ) ，阴离子交换层析填料( 5 0 m i ) 及层析柱购自g e 公司( 美国) ，小 分子量蛋白标准品购自t a k a r a 公司( 中国大连) 。氧j z 还原谷胱甘肽对购自上 海生工，h i s 单克隆抗体，小鼠抗培g 单克隆抗体，f i t c 标记的小鼠抗i g g 单 克隆抗体菌购自i n v i t r o g e n 公司( 美国) 。 3 主要培养基与溶液的配制 常用培养基： 1 l b 培养液及培养基： 成分量 胰蛋白胨 酵母提取物 氯化钠 1 0 克 5 克 5 克 加双蒸水至9 5 0m l ，用2m n a o h 调p h 值至7 o 7 2 ，1 2 1 高压灭菌2 0 - 3 0 m i n ，置4 储存备用。 2 l b 固体培养基：在每升l b 液体中加入1 5g 琼脂粉即为固体l b 培养基，高 压灭菌，倒入培养皿备用。 常用抗生素 8 o ) 质粒提取溶液( 碱裂解法) l g t e 缓冲液：5 0m m 葡萄糖，2 5m mt r i s h c i ( p h 8 0 ) ，1 0m me d t a ( p h 2 n a o h s d s 溶液：0 2m m o l ln a o h ，1 s d s 蛋白电泳缓冲液 8 1 2 配方l om l d dh 2 0 3 0 聚丙烯酰胺 1 5 mt r i s - h c i ( p h 8 8 ) 1 0 s d s 1 0 过硫酸铵 t e 住! d 1 6m l 2 om l 1 3m l o 0 5m l o 0 5m l 0 0 0 2m l 用h c i 调 h c i 调p h 至6 8 助 入6 0 0m l 浓缩胶5 配方2i i l l d dh 2 01 4m l 3 0 聚丙烯酰胺0 3 3m l 1 0 mt r i s - h c l ( p h 6 8 ) o 2 5m l l o s d s0 0 2m l 1 0 过硫酸铵 o 0 2m l t e m e d0 0 0 2m l 6 5 t s g l y c i n e 电泳缓冲液1l ：称取t r i s1 5 1g ，甘氨酸9 4g ，s d s5 0 g 加入8 0 0m l 水溶解定容至ll ，室温保存。 9 温州医学院硕士学位论文 7 ) 5 s d s 上样缓冲液5m l ：取1 0mt r i s h c i ( p h 6 8 ) 1 2 5m l ，s d so 5 9 ， b p b2 5m g ，甘油2 5m l 加去离子水溶解后定容至5m l ，小份分装，使用前每升 中加入5 0 山b 一琉基乙醇。 8 考马斯亮蓝染色液1l ：异丙醇2 5 0m l ，冰乙酸1 0 0m l ，水6 5 0m l ，考 马斯亮蓝r 2 5 01g ，过滤备用。 9 考马斯亮蓝脱色液1l ：无水乙醇5 0m l ，冰乙酸1 0 0m l ，水8 5 0m l 。 主要仪器： a i rt e c h 超净工作台( 苏净集团安泰公司) m i c r o f a g e2 2 r 型低温高速离心机( 美国b e c k m a n ) d e l t a 3 2 0 型p h 计( 梅特勒托利多( 上海) 仪器公司) 蛋白电泳及膜转移系统( 美国b i o g a d 公司) h z q x 1 0 0 振荡培养箱( 哈尔滨东联电子技术开发有限公司) j y 9 2 2 d 型超声波细胞粉碎机( 宁波新芝生物科技股份有限公司) 高压细胞破碎仪n s l 0 01 l2 k( 意大利g e an i r os o a v i 公司) 优普超纯水机( 优普公司) b i o f l o4 1 0 发酵罐 ( 美国b i o f l o4 5 0 0 ，n b c ) a v a n t i - j 2 0x p 亚超速离心机( 美国b e c k m a nc o i t e r ) 多波段核酸蛋白检测仪( 美国b i o - t e ki n s t r u m e n t 公司) 8 0 s a n y o 低温生物医学冷柜( 日本s a n y o 公司) 二：方法 ( 一) 质粒提取碱裂解法 1 从大肠杆菌d h 5 a ( 含质粒p e t 2 1 a h l l 1 5 s a ) 中取5 0 山于5m l 高压的l b 中，在振荡培养箱中以2 2 0r p m ，3 7 过夜培养。 2 取1 5m l 过夜菌8 0 0 0r p m ，1m i n 离心集菌。 3 弃上清，倒置吸干。 4 加1 0 0o lg t e 缓冲液，用移液器轻轻吹打，使菌体重新悬浮，室温放置5 m i n 。 5 加入2 0 0 山n a o h s d s 溶液，颠倒混匀l o 次( 轻轻振荡) ，然后置冰浴5 m i n 。 6 加入1 5 0 山预冷的乙酸钾溶液，充分混匀，置冰浴5m i n 。 7 加等体积酚，氯仿抽提一次，1 2 0 0 0r p m ，5m i n 离心，取上层水相至另一 新e p 管中。加等体积氯仿抽提一次，1 2 0 0 0r p m ，5m i n 离心，取上层水相至另一 新e p 管中。 8 加0 6 倍体积异丙醇，置冰浴3 0m i n ，1 2 0 0 0r p m ，离一t 二, 1 0m i n ，弃上清。 l o 温州医学院硕士学位论文 9 沉淀用7 0 乙醇0 5m l 洗一次，弃上清，用3 0 出t e 溶液溶解沉淀d n a ， 置4 。c 保存。 ( 二) 转化1 a c l 2 法 1 感受态制备： 1 ) 从本实验室中8 0 4 c 保存的r o s e t t a 菌取5 0 山于5m l 高压的l b 培养基中， 于3 7 ，2 0 0r p m 振荡培养4h 左右。 2 ) 0 1mc a c l 2 溶液置于冰上预冷。 以下步骤需在超净工作台和冰上操作 3 ) 吸取1 5m l 培养好的菌液至1 5m l 离心管中，在冰上冷却1 0m i n ； 4 ) 4 下4 0 0 0 r p m 冷冻离心5m i n ； 5 ) 弃上清，加入1m l 预冷0 1mc a c l 2 溶液，用移液枪轻轻上下吹打均匀， 使细胞重新悬浮，在冰放置1 0m i n ； 6 ) 4 c 下4 0 0 0r p m 冷冻离心1 0m i n ； 7 ) 弃去上清，加入6 0 山预冷0 1mc a c l 2 溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀， 使细胞重新悬浮； 8 ) 细胞悬浮液可立即用于转化实验或15 一2 0 甘油后超低温冷冻贮备用 ( 8 0 ) 。 2 连接产物转化e c o l i 感受态细胞( 超净工作台和冰上操作) 1 ) 用冷却的无菌吸头从感受态细胞悬液中吸取2 0 0 山转移到e p p e n d o r f 管 中，将连接产物加入到感受态细胞中，轻轻旋转以混匀内容物，在冰中放置3 0 m i n 。 2 ) 将管放到4 2 的水浴中，9 0 秒，不要摇动试管。 3 ) 迅速将管转移到冰浴中，使细胞冷却1 2m i n 。 4 ) 管中加入8 0 0l a ll b 培养基。水浴将培养基加温至3 7 。c ，然后将管转移到 3 7 。c 摇床上，温育4 5m i n 使细菌复苏，并且表达质粒编码的抗生素抗性基因。 5 ) 将适当体积( 每个9 0m m 平板可达2 0 0 山) 已转化的感受态细胞转移到含 有( a m p + 和c l + ) l b 固体平板。 6 ) 将平板置于室温直至液体被吸收，倒置平皿，3 7 c 培养箱中培养1 2 1 8 h 置菌落长出。 ( 三) 大肠杆菌表达的预实验 1 大肠杆菌表达 1 ) 挑取一重组单菌落接种于5m ll b 培养基中( a m p ：5 0l a g m l ，氯霉素： 5 0g g m 1 ) ，3 7 。c 振摇培养过夜。 2 ) 将过夜菌按l ：1 0 0 e l 例转接至j j 5 0 m ll b 培养液中( 可不加抗性) ，3 7 0 ( 2 剧烈 温州医学院硕士学位论文 振摇培养至o d 6 0 0 约为0 4 至l j 0 6 。 3 ) 取出1m l 样品，1 2 0 0 0r p m ，离心3m i n ，吸出上清液。于一2 0 冻存细胞， 此为零点样品( 即诱导前的样品) 。 4 ) 加i p t g 至终浓度0 3m m ，继续培养细胞生长。 5 ) 继续培养5 小时后，取出lm l 样品离心，吸出上清液，细胞沉淀于2 0 c 冻存或进行下一步。 6 ) 取诱导后样品lm l ，8 0 0 0r p m ，8m i n 离心收集沉淀，用去离子水重悬。 7 ) ) j n 5xs d s p a g e 样品缓冲液。然后于1 2 浓度分离胶的s d s p a g e 凝胶 电泳上进行检查。 2 s d s p a g e 电泳分析 1 ) 将玻璃板、样品梳、电泳槽用洗涤剂洗净，用d d h 2 0 冲洗数次，再用乙 醇擦拭，晾干； 2 ) 装好玻璃板，配制1 2 分离胶1 0m l ，混匀； 3 ) 向玻璃板间灌制分离胶，立即覆一层重蒸水，大约2 0m i n 后胶即可聚合； 4 ) 配n 5 浓缩胶2 0m l ，混匀； 5 ) 滤纸吸干，灌制浓缩胶，插入样品梳； 6 ) 装好电泳系统，加入电极缓冲液，上样2 0 山； 7 ) 稳压8 0v ，溴酚蓝刚跑到分离胶时，停止电泳，约需2 0m i n ； 8 ) 更换电压1 2 0v ，至溴酚蓝刚跑出分离胶位置，停止电泳，约需5 0m i n ； 9 ) 卸下胶板，剥离胶放入染色液中，室温染色l 2h ；加入脱色液，置于 脱色摇床上，每2 0m i n 更换一次脱色液至完全脱净。 ( 四) h i l 1 5 s a 融合蛋白发酵 1 大肠杆菌摇瓶小量表达优化 从平板上挑取单克隆菌落于5 m ll b 培养基( 含5 0p g m la m p + 和5 0p g m l c l + ) 中，于3 7 ，2 2 0r p m 振荡培养过夜，次日以1 ：1 0 0 l l 例接种于1 0 0 m l 培养 基中以3 7 ，2 2 0r p m 振荡培养进行优化扩菌后，加入i p t g 进行诱导表达。期 间每隔lh 测其细菌的o d 6 0 0 值并绘成生长曲线图。小量摇瓶发酵结束后，取样 进行电泳分析，8 0 0 0r p m ，4m i n 离心收菌，称量湿菌重量。超声破碎仪破碎细 胞，1 2 0 0 0r p m ，2 0m i n 离心收集包涵体。 发酵工艺研究( 以下采用单一因素) 1 1 发酵培养基成分优化 对半合成培养基成分( 蛋白胨，酵母抽提物，硫酸铵，硫酸镁，甘油) 进行 优化设计。将种子液接种于1 0 0m l 发酵培养基中，接种量3 ，3 7 ，2 2 0r m i n 振荡培养6h 后，加入0 3m mi p t g 进行诱导，l l h 后并离心收菌称重，检测不同 1 2 温州医学院硕士学位论文 组别方案对细菌o d 6 0 0 生长的影响和蛋白质浓度。 1 2 接种量的优化 将过夜培养好的大肠杆菌分别以1 、3 、5 、7 的接种量接种于3 0 0m ll b 液体培养基中，3 7 * ( 2 ，2 2 0r m i n 振荡培养，定时取样测o d 6 0 0 。 1 3 发酵p h 值的优化 分别设定发酵培养基p h 值为6 2 、6 7 、7 2 、8 0 ，3 7 。c ，2 2 0r m i n 培养6h 后，n k o 3m mi p t g 进行诱导，1 lh 后并离心收菌检测p h 值对h 也1 5 s a 表 达量的影响。 1 4 诱导剂浓度的优化 对选好的培养基以及确定好细菌活化时间条件下，加入i p t g 进行诱导表达， 浓度选择在0 2 ，0 3 ，o 4 ，o 5 ，0 6 ，0 7 ，1 0m m 。取样进行s d s p a g e 电泳分 析选择最佳诱导浓度。 1 5 检测方法 ( 1 ) 细菌密度o d 6 0 0 ：发酵液经稀释适当倍数后，用可见分光光度计在6 0 0 n m 处测其吸光度。 ( 2 ) h l l 一1 5 s a 蛋白含量测定：工程菌发酵结束后，从摇瓶发酵液中取1m l 置于1 5m le p p e n d o r f 离心管中，4 ，1 0 0 0 0r m i n 高速离心4m i n ，弃上清得菌 体。将菌体重悬于5 0 0 山蒸馏水中，取4 0 山加入l o 山5 x 蛋白上样缓冲液，煮沸 1 0m i n ，进行s d s p a g e 电泳，经考马斯亮蓝染色后，采用b a n d s c a n 软件扫描 s d s p a g e 电泳图，分析出每条泳道h l l 1 5 s a 蛋白占菌体总蛋白的百分含量， 再根据菌体总蛋白量与h l l 1 5 - s a 的百分含量计算出h l l 1 5 s a 蛋白含量。 2 工程菌发酵培养 2 1 种子液的制备 1 ) 菌种活化：取菌种划线于l b 平板，3 7 c 倒置培养1 6 d , 时。 2 ) 一级种子液：从l b 固体培养基上挑取单菌落，接入5 m ll b 液体培养基3 7 ，2 2 0r p m 下振荡培养1 6 d , 时。 3 ) 二级种子液：将一级种子液以1 ：1 0 0 1 ：l 例接种于发酵培养基中，3 7 ，2 2 0 r m i n 过夜培养制备成二级种子液。 2 2 发酵罐培养 将发酵培养基倒入发酵罐中进行高压灭菌，再加入氨苄霉素和氯霉素至终浓 度为5 0g g m l ，将制备好的种子培养液以3 的接种量接种于发酵罐中，通过0 1m n h 3 h 2 0 和0 1mh c i 控制发酵过程的p h 值在7 2 左右，溶氧量3 0 ，通气量调 至6 - 8l m i n 。在3 7 0 c ，5 0 0r p m 条件下发酵生产，应用消泡剂消除发酵罐内气泡 的生成对细菌生长产生的影响。每个1h 留样测其o d 6 0 0 值，至值达到1 5 左右时， 图lh i l 1 5 一s a 融合蛋白的表达 f i g 1e x p r e s s i o no f t h ef u s i o np r o t e i nh l l l5 一s as d s - p a g e l a n em ：p r o t e i nm o l e c u l a rm a r k e r s ；l a n e1 ：c r u d ee x t r a c to fb l21 ( d e3 ) p e t 2 1a h i ll5 - s an o n i n d u c e dw i t hi p t g ；l a n e2 ：c r u d ee x t r a c to fb l21 ( d e3 ) p e t 2 1a - h l l15 一s ai n d u c e dw i t hi p t g 2 小量摇瓶发酵条件优化 2 1 接种量的优化 不同接种量接种至1 3 0 0 m l 发酵培养基中进行扩菌时不同时间段细菌生长的 o d 6 0 0 值，从图表中可以看出以3 的接种量时细菌生长最为迅速，为最佳接种量。 234567 8 t i m e ( h ) 1 4 温州医学院硕士学位论文 图2 接种量对细菌生长的影响 f i g 2 e f f e c to fi n o c u l a t i o nv d u m eo nt h eg r o w t ho fc e l l 2 2p h 值的优化 从表1 可以看出过酸或过碱的条件下均不适于细菌生长。培养1 1h 后，以 p h 值为7 2 时细菌量和目的蛋白量最高，分别为3 0g l ，目的蛋白表达率为 1 3 4 ；p h 值为6 7 蛋白表达量与8 0 时相当；p h 值为6 2 时蛋白表达量最低。 表1p h 值对蛋白表达量的影响( x s d ) t a b 1 e f f