（临床医学专业论文）malditofms联合磁珠技术对乳腺癌肿瘤标记物的筛选和鉴定.pdf

l i | | | 0 7 5 3 4 5 7 9 实验材料与方法一1 4 实验材料1 4 实验方法1 7 实验结果2 1 实验材料与方法二4 3 实验材料4 3 实验方法4 6 实验结果5 2 讨论6 2 结论6 8 综述7 2 致谢8 4 北京协和医学院临床医学专业毕业论文 缩略词表 英文缩略词英文全称中文全称 b cb r e a s tc a n c e r 乳腺癌 m a l d i t o f m sm a t r i x - a s s i s t e dl a s e r 基质辅助激光解析电离 d e s o 印t i o n i o n i z a t i o n t i m e - 0 f l i 曲t 飞行时间质谱 m a s ss p e c t r o m e t r y s e l d i - t o f - m s s u 渤c e - e n h a i l c e dl a s e r 表面增强激光解析电离 d e s o r p t i o 洲0 n i z a t i o n 飞行时间质谱 t i m e o f - f l i 曲t i g i m m u n eg i o b u i i n 免疫球蛋白 n i s tn a t i o n a l i n s t i t u t eo fs t a n d a r d s 美国国家标准技术研究 a n d i e c h n o l o g y院 e s i e l e c t r o s p r a yi o ni z a t i o n电喷雾电离 c t a pc o n n e c t i v et i s u ea c t i v a t i n g 结缔组织活性多肽i i i p c d t i d ci i i m 亿 m a s s c h a r g er a t i o质荷比 p ii s o e i e c t r i cp o i n t s等电点 d a d a l t o n 道尔顿( 分子量的单位) p m f p e p t i d em a s sf i n g e r p r i n t i n g 肽质量指纹图谱 f t l c r m sf o u r i e rt r a n s f o r n li o nc y c l o t r o n傅里叶变换离子回旋共 r e s o n a n c e - m a s ss p e c t m m e t r y 振质谱法 3 北京协和医学院临床医学专业毕业论文 中文摘要 目的：应用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱( m a t r i x 丛s i s t e dl 罄e r d e s o 叩t i o n i o n i z a t i o nt i m e o f n i 曲tm a s ss p e c t r o m e t 巧，m a l d i t o f - m s ) 联合磁珠技 术建立乳腺癌诊断模型，发现乳腺癌特异性肿瘤标志物并鉴定蛋白和验证。 方法：收集3 2 例乳腺癌患者和5 9 例正常人的血清，高速离心后8 0 冰箱保存。 样本在一个冻融周期内同批进行m a l d i t o f m s 联合磁珠分析，应用b i o m a r k e r w i z a r d 软件识别蛋白峰信息，用s p s s1 3 0 软件对数据进行统计学分析，然后应用 b i o m a r k e rp a n e m s 软件建立乳腺癌诊断模型并确定目标蛋白。应用磁珠纯化蛋白后 用t r i c i n e s d s p a g e 电泳分离蛋白，然后用肽质量指纹图谱对目标蛋白进行鉴定， 最后用免疫沉淀法对已鉴定蛋白进行验证。 结果：通过软件分析找到1 3 6 个符合条件的差异蛋白峰，并用其中的三个，即 m 1 1 6 9 2 4 ，m 1 5 1 1 1 4 和m 1 5 9 0 9 8 建立了乳腺癌的诊断模型，敏感性达到9 6 8 7 5 ， 特异性达到9 8 3 0 5 。磁珠纯化后的蛋白浓度达到8 3 3 u g u 1 ，达到电泳上样量的标 准。应用t f i c i n e s d s p a g e 电泳成功分离目标蛋白，并成功鉴定三个目标蛋白，分 别为人血红蛋白q 和b 链以及人血清淀粉样蛋白a ( s 从) ，最后用免疫沉淀方法成 功验证了人血红蛋白d 链和s 从。 结论：本研究建立的树形分类模型能够以高敏感性和特异性鉴别乳腺癌患者 和正常对照者，可以做为乳腺癌早期诊断方法。成功分离鉴定出了用于建模的三个 蛋白质，并得到验证，可以将这三个蛋白用于乳腺癌的诊断和病情监测。 关键词乳腺癌m a l d i t o f m s 电泳磁珠肿瘤标志物 4 s e l e c t e d ，锄dt h eb i o m a r k e r ss p e c i f i cf 0 rb r e a s tc a n c e rw 嬲d e t e 咖l n e da l s o a r e r p u r i f i c a t i o nb ym a g n e t i cb e a d st e c h n 0 1 0 9 ya n ds e p e r a t i o nb yt h et r i c i n e - s d s - p a g e1d e l e c n o p h o r e s i s ，t h es e r u mp m t e i nb i o m a r k e r ss p e c i f i cf o r b r e a s tc a n c e rw i l lb ei d e n t i f i e d b yp m f ，a tl a s tt h eb i o m a r k e r sw i l lb ep r o v e db yi m m u n o p r e c i p i t a t i r 懿u 13 6p r o t e i np e a l ( so fs i 印i f i c a n td i f 佗r e n c ew e r ef o u n da n d3d i s c r i m i n a t i v e p e a k sw e r eg e n e r a t e dh yb i o m a r k e rp a t t e m ss o f h v a r et oe s t a b l i s ht h ed i a g n o s i sm o d e l f o rb r e a s tc a n c e r t h em o d l ew a sw i t h9 6 8 7 5 o ft h es e n s i t j v i t ya n d9 8 3 0 5 o ft h e s p e c i f i c i t y t h ef o l i o w i n gt h r e ep e a l ( sw e r eh i g h l i g h t e d ：m z v a l u e so f1 1 6 9 2 4 d a l5l l1 4 d aa n dl5 9 0 9 8 d a b yt h ec o n c e n t r a t i o no f8 3 3 u u l ，w h i c hw a se n o u 曲f o rt h e e l e c t r o p h o r e s i s ，t h et h r e eb i o m a r k e r sf o rb r e a s tc a n c e rw a sf i n a l l yi d e n t i f i e d ，锄dt h e y a i eh u m a nh e m o g l o b i nq 、bc h a i na n dh u m a ns e r u ma m y l o i dap r o t e i n ( s a a ) ，t h e h e m 0 9 1 0 b i nqc h a i na n ds a aw e r ep r o v e ds u c c e s s f u l l yb yi m m u n o p r e c i p i t a t i o n 5 一 一 6 4 0 的早期乳癌患者和大多数年轻女性的乳腺肿瘤。血清抗原，如癌胚抗原， c a l 5 3 ，组织型纤溶酶原激活物，c a 5 0 等，但是没有一种抗原经证明是乳腺癌的 特异标记物噙引。因此在乳腺癌临床治疗中，急需发展新型的高效诊断技术。 大多数肿瘤早期没有明显症状，对于没有出现临床症状和影像学异常的早期肿 瘤而言，血清筛查成为重要的手段。 不仅如此，在术前对乳腺癌患者是否有血清微转移也没有合适的检测方法，术 后也无法评价手术疗效。通过在手术前后测定患者自身血清蛋白含量的变化不仅能 够用于手术预后分析，还能进行治疗监测，评价治疗效果及预后。 蛋白质组学是后基因组时代的一门新兴学科，由基因组学在逻辑上发展而来， 指基因组表达的全部蛋白质及其存在；但与基因组的稳定性相比，蛋白质组则具有 可变、多样的特点，列于同机体的各种细胞，其基因组是稳定的，而蛋白质组则各 不相同，即使同一细胞，在不同生理或病理环境中，其蛋白表达也是不同的。蛋白 质组的这种特点，恰恰为差异蛋白质组的出现与兴起奠定了逻辑基础。蛋白质组学 的主要内容是从细胞整体水平对蛋白质特性的研究，并由此获得对疾病发生过程、 细胞生理、生化特性以及调控网络的广泛而完整的认识【s 】。 差异蛋白质组是蛋白质组学研究的一个主要内容，其核心在于寻找某种特定因 素引起样本之间蛋白质组的差异，提示并验证蛋白质组在生理或病理过程中的变化。 许多疾病在出现临床表现甚至是病理变化之前，细胞内的某些蛋白质在成分和数量 上就已经产生了相应的变化，并可以通过血清中蛋白质的水平反映出来。因此，比 较不同疾病人群血清中差异蛋白质的表达对于临床上疾病的早期诊断、药物靶标寻 7 北京协和医学院临床医学专业毕业论文 找、治疗监测、细胞调控分子的鉴别有着极大的实际意义。 蛋白质组学( p r o t e o m i c s ) 的基本方法主要包括组织芯片( t i s s u em i c r o a n a y s ， n 雌s ) ，蛋白质芯片( p r o t e i nm i c r o a m y s ) ，质谱技术( m a s ss p e c n 0 m e t 巧) 。磁珠 ( m a g n e t i cb e a d s ) 表面带有羧基，在p h 4 0 的环境中带负电，可特异性吸附带有正电 荷的蛋白质( 相当于蛋白质芯片的弱阳离子芯片) 。 基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱( m a _ t r i xa s s i s t e dl a s e rd e s o r p t i o n i o n i z a t i o nt i m eo ff 1 i 曲tm a s ss p e c 仃0 m e t 】m a l d i - t o f m s ) 是近年来发展起来的 一种蛋白质组学研究技术，它将蛋白质芯片( 或磁珠) 技术与质谱技术相结合，通过 引入基质分子，使待测分子不产生碎片，解决了非挥发性和热不稳定性生物大分子 解吸离子化的问题，具有所需标本量少、高通量、高敏感性、快速检测等特点，可 在短时间内利用0 5 4 0 0 u l 样本得到f m o l ( 1 0 q 5 m 0 1 ) 数量级的质荷比在 5 0 0 一5 0 0 0 0 0 m z 的蛋白质肽质量指纹图谱( p e p t i d em a s sf i n g e 甲r i n t ，p m f ) ，已成为检 测和鉴定多肽、蛋白质、多糖、核苷酸、糖蛋白、高聚物以及多种合成聚合物的强 有力工具【6 。 通过质谱技术得到疾病相关的差异蛋白峰可以利用b p s ( b i o m a r k e rp a t t e r n s s o f t w a r e ) 软件建立疾病的特异性诊断模型，近年来被广泛应用于各种肿瘤及许多自 身免疫相关疾病如系统性红斑狼疮、自身免疫性胆汁性肝硬化的血清学诊断模型的 建立；而利用磁珠纯化、电泳分离及质谱分析技术则成为了筛选疾病的生物学标记 物( 特别是血清学标记物) 的主要技术手段m 1 。 m a l d i t o f m s 技术适用于混合物及生物大分子的测定，通过质谱仪检测蛋白质 样品，经过计算机软件分析，取得蛋白质的一级结构信息，筛选建立模型，辅助寻 找目标蛋白n 引。m a l d i t o f m s 具有灵敏度高、准确度高及分辨率高等特点，已成为 新兴肿瘤目标蛋白检测的重要实验技术瑚。 本课题分为两部分，第_ 部分旨在通过m a l d i 1 o f m s 结合磁珠技术检测乳腺 癌患者及正常体检人群的血清样本，寻找有意义的差异蛋白质谱峰，建立乳腺癌的 血清蛋白指纹图谱模型，并将模型节点处蛋白设为目标蛋白；第二部分利用样本结 合磁珠纯化后在s d s 电泳的分子量大小不同进行蛋白质分离和固定，将分离的特定 胶条带进行酶解，应用质谱仪进行检测，查询蛋白质数据库，鉴定出相应蛋白质或 8 北京协和医学院临床医学专业毕业论文 者肽段。将目标蛋白质或肽段采用特异性抗原抗体结合免疫沉淀等方法进行验证， 从而筛选出乳腺癌的血清学标记物。 第一部分：应用m a l d 卜t o f m s 联合磁珠技术建立乳腺癌的蛋 白质组诊断模型 实验原理 m a l d i t o f m s 联合磁珠技术由五部分组成：w c x 2 磁珠、基质、不锈钢芯 片及t o f m s 和质谱分析。读取器通过蛋白质的飞行时间能检测和精确计算出分子 量小于1 0 0 0 d a 或到5 0 0 i ( d a 或更大的蛋白质分子和多肽。处理仪很小，却可以进行 高通量检测，便于研究者能直接对复杂的生物样品进行精确的分析，得到重要的 蛋白。 1 血清蛋白的处理： ( 1 ) 用含有尿素的蛋白裂解液对血清进行处理：其作用是破坏所有非共价结合 蛋白质复合物和积聚体，同时去除对分析有干扰的盐，脂，多糖，核酸等成分，且 使蛋白质在分离过程中保持可溶性。对蛋白的处理过程中没有使用蛋白酶，因此所 有蛋白肽链都保持完整。 ( 2 ) 用p h 4 0 的醋酸钠溶液对蛋白质进行酸化：蛋白质属两性电解质，各种蛋白 质具有不同的等电点，其带电情况与所处环境的p h 值有关。当外界p h 值等于蛋白等 电点( i s o e l e c t r i cp o i n t s ，p i ) 时，蛋白不带电；当外界p h 值大于蛋白p i 时，蛋白带 负电；当外界p h 值小于蛋白p i 时，蛋白带正电。血清中绝大部分的蛋白等电点值都 大于4 ，因此用p h 4 o 的醋酸钠处理血清后，每一个蛋白分子就带一个正电荷。 2 w c x 2 磁珠： 磁珠的主要原料为铁氧体。铁氧体是一种立方晶格结构的亚铁磁性材料。其活 9 北京协和医学院临床医学专业毕业论文 性表面由弱羧基阴离子构成，可以和表面带有正电荷的物质结合，如赖氨酸、精氨 酸和组氨酸。能够用来分析表面带有正电荷的蛋白质分子，是弱阳离子磁珠。活性 表面w c x 2 磁珠以盐的形式进行运输，其表面存在钠离子作为反向离子。 w c ) ( 2 磁珠的应用包括：( 1 ) 选择性分析低等电点的蛋白。( 2 ) 寻找生物标记分子。 弱阳离子磁珠的处理： ( 1 ) 用p h 4 o 的醋酸钠溶液对弱阳离子磁珠进行活化处理，使磁珠表面带一个负电的 醋酸根基团。 ( 2 ) 将带正电的血清蛋白同带负电的磁珠共同孵育，两者依靠电荷作用相互结合。 ( 3 ) 利用磁珠分离富集血清蛋白后，用1 三氟乙酸( t r i f l u o r o a c e 啦a c i d ，t f a ) 改 变环境p h 值，将蛋白从磁珠上洗脱下来。 - 懈删n 。a 啪s e q 酬 b 剐吨 弋9 l 图1 1 1 ) ( 2 磁珠预处理的原理 自删懒b o nb 氓可蕾甜f 一，峻 一t f ， ， 蹿算p ，拶o 喊- 州州 - ， 2 3 s ：，、w _ m 白( 鞴f h 封i el d i l e i t e d v l f ：a s h3 啊拥e 霉a d de l h t 沁n8 u f i 酶r w 醍h 掰n d 确g ，v 妇s hb u f f e nw 酏琢n d i 日gv 妇s h a n dm i x 袖b e 8 d sa n dl n c h b a t e8 掰f e r 撕n e m o v e 1 0m i na lr t日a d s o r b e dp e p t 谄e s 哟 c o i l 8 c te i u a t e 3 点样：将基质物质( s p a ) 同富集的蛋白液混合，点样于不锈钢芯片( s t e e l 芯 片) 上，自然风干，形成共结晶。 图1 2 不锈钢芯片 洳l l y 口謦a t e d 。镩嘲譬 知蚓b 翻糖 不锈钢芯片是一个有8 个位点的不锈钢板，共结晶能牢牢得结合在这些位点上， 再送入t o f m s 中检测。 4 t o f m s 及质谱分析 质谱仪由三部分组成：离子源，质量分析器，检测器，整个工作系统处于真空 状态。在离子源产生的高能激光轰击下，基质将能量传递给共结晶中的蛋白分子， 1 l 飞行。每个带电 空场内的加速电 “z = k t 2 ( 最后质荷比只与粒子到达检测器的时间有关) 故质谱仪通过记录每个带电离子到达检测器的时间，得到每个离子的质荷比。 由此绘制出一张质谱。因其峰突出象手指样又称指纹图。据m a i ，d i t o f m s 联合磁 珠的原理，其具有灵敏度高、准确度高、分辨率高、图谱简明、质量范围广及速度 快等特点，在操作上制样简便、可微量化、大规模、并行化和高度自动化处理待检 生物样品。 图1 3 1m a l d 卜t o f 一孵工作原理示意图。 上世纪8 0 年代末出现的m a l d i 和电喷雾电离( e l e c 臼- 0 s p r a yi o n i z a t i o n ，e s i ) 技术被称 为软电离技术，在离子化过程中不会( 最多部分) 破坏分子结构。 一 圈团刚吲圈雕圈团e 北京协和医学院l 临床医学专业毕业论文 图1 3 2 质谱分析原理示意图 l ；坎； a j 8o 盛茎 ! ：c q 一茎二 ，、? h 嗷e i | 撕 d 盆 玎镰v 舞o fo h o 5 数据处理 ( 1 ) 对数据进行预处理： 根据整体波形特点，剔除不合格图谱；对低分子量区间波峰分子量进行校正： 低分子量区间范围：1 0 0 0 一5 0 0 0 0 d a ( 2 ) 对图谱进行标准化： 为了平衡样品间总蛋白水平的差异，利用“总离子电流”( b il o nc u 鹏n t ， t i c ) 波谱下面积的方式进行标准化。对波谱进行标准化是基于两个假设：第一， 假设经标准化后，各样本中表达的蛋白平均数是一致的；第二，假设相对于附着于 表面的所有蛋白而言，表达水平发生变化的蛋白数量是相对少数。 对数据进行标准化的步骤如下： a 计算t i c = 在标准化范围内所有数据点的总和 b 计算平均离子电流= t i c 数据点的数目 c 计算标准化辅助系数= 根据上一步骤计算出的所有选择波谱的平均结果 d 计算每一个峰的标准化因子= 标准化辅助因子每个峰的平均离子电流 e 将每个数据点乘以其标准化因子 ( 3 ) 用b i o m a r k e rw i z a r d t m 和b i o m a r k e rp a t t e r n s t ms o f t w a r e 软件进行数据分析， 在整个质谱图中定量标定出代表每种蛋白的波峰。 识别信噪比大 白峰出现就可 m e t h o d ) 。数 进行分析。该 方法是应用最为广泛的学习运算方法之一，并且已经有研究者将其用于已往的 s e l d i t o f m s 研究中。决策树是一个树形的分类模型，其中每一个内结点都代表 一种检测，将m z 值同某个阈值进行比较，进行比较后得到的两种结果( 例如，大于 或小于) 将被分别分入两支下级“树枝”中，每一个终结点都会有最后分类的标识。 建立决策树的过程是人工智能进行“学习”的过程。即将分类已知的两组或多组 本输入数据库，人工智能即寻找出识别不同分组的最佳标志及其排列顺序，建立 个树形分类模型。用该模型对一个新的未知样本进行分类时，根据该样本的波谱 征对各个内结点的检验产生不同应答，新样本在树形模型中通过内结点的划分被 入不同路径逐级下降，最终会到达一个终结点，即完成分类。 材料与方法 实验材料 一、病例来源及入选标准 1 血清样本来源：本研究得到北京协和医院伦理委员会批准，乳腺癌组样本来自 京协和医院西院乳腺外科病房住院病人( 2 0 0 9 年1 2 月至2 0 1 0 年3 月) ，所有患者均为 1 4 北京协和医学院i 临床医学专业毕业论文 后病理证实为乳腺浸润性导管癌( b c ) ；正常对照组( n ) 来自北京协和医院体检中心 查体健康人群( 2 0 1 0 年4 月) 。所有人群均签署知情同意书。 2 入选标准： ( 1 ) 乳腺癌组： 纳入标准 1 北京协和医院西院乳腺外科住院术前病人： 2 未接受原发性乳腺癌手术治疗( 改良根治术、保乳根治术、单纯乳房切除术、局 部扩大切除术) ； 3 病理证实为乳腺浸润性导管癌； 4 血生化符合以下标准：1 ) 血红蛋白 l o o g l ，白细胞 4 1 0 札，血小板 1 0 0 1 0 9 l ： 2 ) c r 、b u n 1 5 倍正常值上限。 排除标准： 1 t c 或t g 大于1 5 倍正常值 2 h b s a g ，h c v ，r p r 任一阳性者 3 a s t 或a l t 大于1 5 倍正常值 4 重大传染病史者 5 血清样本溶血者 ( 2 ) 健康人群对照组： 纳入标准 1 北京协和医院体检中心健康查体人群； 2 年龄在3 0 一7 0 岁； 排除标准： 年龄大于7 0 岁或小于1 5 岁者； 被明确诊断有其他自身免疫性疾病者 3 血清样本溶血者 二、主要仪器和软件 t i p sp 2 0 ，p 2 0 0 ，p l 0 0 0 5 0 m l 离心管 0 5m l 。1 5m l 微形离心管 p r o t e i n c h i ps o 胁a r e3 2 b i o m a r k e rp a n e m ss o f t w a r c s p s s l 6 0 三、主要试剂 w c x 2 磁珠 乙腈( c a n ) ，h p l c 级 三氟乙酸( t f a ) 无水醋酸钠( n a a c ) 3 一f 3 一( 胆酰氨丙基) 二甲铵基 丙磺酸内盐( c h a p s ) t r i s 碱 氯化氢( h c l ) 水，h p l c 级 尿素( u r e a ) s p a 氢氧化钠( n a o h ) 羟乙基哌嗪乙磺酸( h e p e s ) 二硫基苏糖醇( d t t ) 1 6 美国 中国 日本 中国 德国 日本 中国 a x y g e n 公司，美国 c o r n 小i g 公司，美国 a x y g e n 公司，美国 b i o r a d 公司，美国 b i o r a d 公司，美国 s p s s 公司，美国 赛尔迪公司，美国 s i 舯a 公司，美国 s i 舯a 公司，美国 s i g m a 公司，美国 s i g m a 公司，美国 s i g m a 公司，美国 s i g m a 公司，美国 s i g m a 公司，美国 s i g m a 公司，美国 s i 舯a 公司，美国 s i g m a 公司，美国 s i g m a 公司，美国 s i g m a 公司，美国 书。 5 所有血清样本直至进行m a l d i t o f m s 前进行解冻，在进行质谱分析时保存时 间不超过6 个月，均在一个冻融周期内完成。 二、溶液配置 1 裂解液u 9 ：( 5 m l9 mu r e a ，2 c h a p s ，5 0 m m t r i s - h c l ，p h 9 0 ) 称取2 7 0 9u r e a ( m w6 0 0 6 ，终浓度为9 m ) ，加入3 m lh p l ch 2 0 和2 5 0 u l lm t r i s h c ip h 9 o 允分溶解( 注意：加温不能超过3 7 ，如果难溶，添加少量h p l c h 2 0 ) ； 一 在上述溶液中加入0 1gc h a p s 充分溶解。冉片j h p l ch 2 0 定容至4 5 m 1 调p h 至9 0 ，加入0 0 5 9d t t ，定容至5 m l ； 分装：分装入5 0 0 u l 离心管，每管1 0 0u l ，用封口膜封口，放入8 0 保存( 防止反 复冻融) 。 2 w c x 2 缓冲液的配置一2 0 0 m l ：( 5 0 m mn a a c ，p h 4 0 ) 称取无水n a a c ( m w8 2 0 3 ，最终浓度为5 0 m m ) 0 8 2 9 ，溶入l 8 0 m lh p l c h 2 0 中； 用h c l 调p h 至4 0 ； 用h p l ch 2 0 定容至2 0 0m l ，4 保存。 3 s p a 饱和溶液：5 0 c a n + 0 5 t f a 1 7 北京协和医学院临床医学专业毕业论文 1 t f a 溶液：取1 0 p lt f a ，加入9 9 0 lh p l ch 2 0 中，混匀，密封，避光，4 保 存。使用周期不超过5 天。 a c n 分装：取l m la c n ，分装为每管l o o 脚，密封，避光，使用周期不超过1 周； s p a 溶液配制：使用s p a 溶液前，取8 0 m1 t f a 溶液和8 0 p ia c n ，同时加入s p a 分装管中，在涡旋混合器上充分混合( 约3 分钟) 静置5m i n ，以1 0 ，0 0 0 印m 离心5 m i n ，取上清后备用，每天新鲜配制。 4 洗脱液：l t f a 三、血清处理 1 从- 8 0 冰箱中取出血清样本，置于冰盒上融解。 2 准备两组e p 管( 5 0 0 u l 和2 0 0 u l ，数量与一次所要做的样本数匹配) 。 3 取配好的u 9 裂解液2 0 u l 加入到5 0 0 u l e p 管内。 4 取血清1 0 u l 加入含2 0 u lu 9 裂解液的5 0 0 u l e p 管中，充分混匀。 5 室温下静置3 0 分钟。 6 向变性后的血清标本中加入3 7 0 u i w c x 2 缓冲液( n a a c ，+ p h 4 0 ) ，尽快混匀。 7 吹打血清样品( 避免产生气泡) 。 8 样品处理完毕后静置备用： 四、s t e el 芯片的处理 1 用棉签蘸9 7 酒精擦拭芯片2 次。 2 用棉签蘸1 t f a 擦拭芯片2 次。 3 用干棉签擦拭芯片1 次。 4 待其干燥后对每一块芯片进行编号，避开点样区自然风干。 五、w c x 2 磁珠的处理 1 取1 1 0 此w c x 2 磁性微珠加入2 0 0 皿e p 管中。 2 将装有磁珠的e p 管置于磁力架上1 分钟后用加样枪小心吸弃上清1 0 0 u l ，注意不 要将磁珠吸出。 北京协和医学院临床医学专业毕业论文 3 将装有磁珠的2 0 0 u ie p 管移离磁力架，向管中加入l o o 此w c x 2 缓冲液进行磁 珠预活化，充分混匀5 分钟后，再于磁力架上小心吸弃上清1 0 0 u l 。重复本操作2 次。 4 将装有磁珠的2 0 0 u le p 管转移置于普通架上。 5 将5 0 0 u ie p 管中处理好的血清样本1 0 0 u l 加入装有磁珠的2 0 0 u le p 管中，混匀后 室温下孵育6 0 分钟。 6 将2 0 0 u le p 管置于磁力架上，待磁珠吸附完全后，吸弃上清液1 0 0 u l 。 7 向2 0 0 u le p 管中加入1 0 0 u ln a a c ，混匀，室温静置5 分钟，再于磁力架上小心吸 弃上清，重复本操作1 次( 注意最后一次吸弃尽上清) 。 8 将装有磁珠的e p 管移离磁力架，加入l o 此洗脱液( 1 t f a ) ，吹打混匀，反 应5 分钟。 9 将2 0 0 u le p 管置于磁力架上1 分钟后，小心吸取上清液1 5 此点样至s t e e l 芯片 上的点样槽。 l o 快风干的时候在s t e e l 芯片点样槽上点上1 u ls p a 饱和溶液。 1 1 自然风干后，即可上机测定。 六、质谱仪外标定 用分子量已知的纯物质对蛋白质芯片质谱仪进行外标定。以纠正分子量测量 的漂移现象。 表1 1用于m 舢i _ t o f _ m s 外标定的7 种物质 外标物名称 质荷比( m z ) 2 1 4 7 5 5 7 3 3 6 8 5 6 4 8 s o d b o v1 5 5 9 1 4 1 9 北京协和医学院临床医学专业毕业论文 图1 4 质荷比校正质谱 t - d i j - d 1 2 1 4 7 5 + h _ a 5 7 3 3 6 + h 1 8 5 6 9 6 + h 卫 l 止忌。5 + j 一眠6 + h 汕。儿1 l一oq r 霸啊 1 鲫 如图中所示，被用作外标定的物质中，测量质荷比差异最大的是c y t o c h r o i i l ec b o v 1 2 2 3 0 9 i n z 所代表的峰，但测量误差仅为0 1 0 6 ，处于允许范围0 3 之内。 七、样品测定 分析范围：l o o o 一5 0 0 0 0 激光强度：2 4 0 检测器灵敏度：8 源电压： 2 0 0 0 0 v 真空度：8 3 8 7 e 0 0 7t o r r 收集次数：1 1 2 次每点 2 0 北京协和医学院临床医学专业毕业论文 实验结果 根据上述纳入及排除标准，本实验共收集8 1 例血清样本，其中乳腺癌组( b c ) 3 2 例，正常对照( n ) 组5 9 例。各组性别及年龄情况见表1 2 ： 表1 2 各组性别年龄情况 乳腺癌组 3 2 3 0 7 44 7 2 61 3 5 2 3 正常对照组 5 93 06 9 4 0 8 59 3 4 0 选取8 1 例标本( b c 组3 2 例、n 组5 9 例) 在低质荷比范围( 1 0 0 0 一5 0 0 0 0 m z ) 进行质谱 测定，全部可识别的差异蛋白峰有2 4 9 个( 表1 3 ) 。 表1 32 4 9 个可识别的差异蛋白峰 m zm e a n c a n c e r s d c a n c e r m e a n n o r m a ls d n o r m a l 2 0 1 2 1 6 22 2 5 3 11 4 1 5 21 5 3 1 9 6 4 6 0 20 6 5 4 3 5 6 4 7 30 6 5 3 4 4 5 8 2 0 2 2 0 9 3 50 4 4 4 3 91 4 6 80 8 1 5 7 6 7 7 0 70 3 4 1 4 8 9 9 7 61 2 6 1 8 2 6 4 9 6 2 0 8 9 3 1 6 5o 3 3 4 5 6 1 6 6o 6 1 1 5 8 4 1 0 l1 2 8 0 0 2 4 41 3 7 4 9 4 0 1 8 8 2 5 4 3 5 2 8 60 3 4 1 9 2 4 5 2 60 5 5 5 0 0 0 9 5 83 4 1 9 1 0 3 9 9 82 3 3 0 5 8 6 1 4 6 2 7 4 5 3 4 8 71 4 1 8 8 2 7 5 7 71 0 7 0 8 5 6 2 7 l2 4 4 4 7 2 5 81 91 4 3 4 3 6 8 4 6 6 2 7 6 8 0 3 6 4 3 0 1 8 2 8 2 8 6 42 3 4 2 2 9 9 3 5lo 4 6 3 3 0 8 6 5 4o 6 2 4 1 4 6 1 2 7 9 1 2 2 9 4 1 3 0 9 7 5 51 4 61 1 3 1 9 6 7 8 5 1o 2 1 2 5 3 1 9 0 7o 3 2 9 0 9 2 6 0 4 2 9 5 7 9 5 6 l1 4 6 7 4 0 5 1 2 8 1 3 9 2 7 9 7 0 1 14 7 5 2 3 7 1 7 8 43 9 0 g 0 9 9 8 0 2 3 0 6 5 9 2 1 30 3 0 5 8 2 9 7 61o 4 3 8 4 4 6 1 2 71 5 2 1 51 9 3 4 72 4 0 2 4 4 7 5 4 6 3 0 8 7 6 7 6 3o 1 4 2 1 6 2 9 1 2o 3 9 0 6 7 7 9 5 72 6 7 3 8 4 3 2 7 71 7 2 4 0 8 7 1 3 5 3 1 5 9 7 7 8 50 7 0 6 3 7 8 5 20 8 0 3 6 5 3 8 6 56 0 2 1 4 4 2 1 2 13 6 4 0 2 5 1 2 2 7 3 2 1 9 3 8 2 70 2 5 3 4 3 3 2 0 2o 4 1 7 6 1 8 0 3 82 6 5 1 6 3 8 3 6 52 5 5 7 8 2 3 5 9 3 2 7 5 7 8 20 12 7 6 7 5 0 9 70 2 3 4 2 6 1 7 2 92 1 9 9 1 5 8 6 0 72 2 0 6 8 7 6 8 4 5 3 2 9 4 3 0 6 l0 2 5 6 0 4 8 91 8 0 4 3 5 1 0 1 0 4 12 0 6 5 1 1 9 8 5 81 2 7 2 7 9 1 8 1 6 3 3 1 7 7 9 4 30 71 6 7 4 6 3 7 2 0 8 4 8 7 8 7 6 2 8 7 5 5 5 3 5 5 5 8 46 5 9 8 2 0 0 8 7 4 3 3 7 3 2 6 1 1o 6 0 2 3 2 6 0 6 50 6 4 2 8 3 3 8 4 51 8 4 3 2 2 4 4 9 6 1 3 0 2 5 4 8 2 9 8 3 4 0 1 2 6 2 51 7 9 6 5 0 6 1 9 91 8 9 71 7 5 5 8 55 9 8 3 3 3 7 0 4 5 4 0 6 0 1 1 2 0 3 4 3 4 4 4 4 6 7 60 3 4 6 0 6 2 3 70 3 9 0 8 3 9 0 8 91 5 4 8 6 1 1 8 7 61 8 4 3 9 0 8 5 5 5 3 4 7 7 7 5 4 70 1 0 1 1 1 7 1 4 20 3 0 12 7 9 7 2 40 3 1 2 7 3 4 1 8 8o 7 4 6 12 3 4 8 8 3 6 8 5 7 2 4 30 4 2 9 8 0 6 5 5 70 5 0 3 8 5 9 0 8 92 7 8 6 7 7 0 9 6 51 4 0 5 1 2 0 1 7 3 8 1 6 5 4 6 10 4 8 1 2 3 9 2 5 80 7 3 0 4 4 5 2 5 34 6 8 2 5 8 6 2 2 3 2 2 2 2 5 0 5 6 6 5 北京协和医学院临床医学专业毕业论文 3 8 2 9 2 2 0 80 2 51 9 7 4 4 9 2 0 3 9 4 1 6 4 0 0 21 1 9 4 0 3 3 1 4 20 9 7 8 0 1 3 2 7 9 3 8 9 2 5 4 4 32 6 4 5 2 8 1 0 3 5 2 12 0 5 7 8 0 2 5 5 8 1 5 7 6 3 3 4 l 4 6 3 8 4 3 1 3 0 7 3 9 3 7 6 9 0 30 1 6 9 71 5 0 5 30 2 8 4 1 9 9 3 65 3 1 3 7 9 5 7 2 3 15 9 8 5 5 8 4 3 3 9 5 6 3 2 3 20 6 8 8 7 2 9 21 8o 9 9 9 0 6 2 7 0 68 3 0 2 1 6 1 7 3 44 7 6 7 0 9 5 7 7 3 9 7 2 1 4 0 80 5 2 9 5 3 9 7 5 80 6 0 2 0 8 0 2 9l1 0 7 1 8 4 7 1 9 41 2 6 9 4 8 3 9 7 7 3 9 8 8 2 3o 2 3 1 8 2 1 5 4 20 3 9 0 8 6 2 3 5 11 5 4 71 9 3 2 0 lo 9 0 7 3 0 9 3 9 6 4 0 6 8 1 6 1 7 0 3 0 0 9 8 7 5 7 6o 4 0 3 8 8 0 2 2 95 0 4 1 0 3 1 7 62 16 9 9 0 6 0 6 2 4 0 9 1 6 1 1 1o 7 6 4 2 5 3 6 6 1 0 8 8 7 8 5 0 8 1 23 3 8 6 4 3 3 9 8 21 4 5 2 0 9 9 6 1 5 4 1 1 3 8 9 8 30 10 3 8 3 7 0 2 8 0 7 8 9 5 8 6 1 0 5o 8 4 6 6 4 8 0 6 20 7 4 9 8 2 8 8 9 7 4 1 3 6 9 2 9 50 5 9 7 2 4 1 7 9 90 6 6 9 5 7 1 8 0 41 5 9 0 0 3 3 1 1 50 9 3 4 2 1 8 1 0 9 4 1 5 4 3 8 6 51 3 1 1 5 3 1 1 7 31 7 9 7 3 1 3 9 1 54 2 8 0 9 2 4 47 3 5 4 4 7 1 6 7 4 4 1 7 7 2 3 1 31 0 6 1 7 2 5 8 6 21 5 7 2 0 3 0 9 5 72 7 2 7 0 8 8 7 11 7 3 1 9 7 7 2 7 8 4 2 5 6 3 1 4 60 6 3 5 6 8 2 9 4 20 7 4 8 5 0 5 6 6 72 0 9 9 6 6 5 6 4 51 3 2 0 1 7 7 1 9 5 4 2 6 9 1 8 2 2 0 2 6 8 5 1 6 9 8 4o 3 2 0 4 3 5 6 0 40 7 9 3 9 4 9 3 0 60 9 3 7 1 8 2 4 2 4 2 8 4 3 5 9 92 0 8 1 0 0 9 6 52 2 6 4 4 3 7 8 3 9 7 0 5 8 0 7 4 67 5 3 3 2 6 5 1 2 l 4 3 0 0 9 4 30 5 5 3 91 0 4 6 1o 5 9 5 2 8 5 7 9 3 5 7 0 4 8 4 4 6 9 63 3 0 8 1 6 6 6 8 7 4 3 4 6 9 3 3 50 4 3 2 0 0 8 4 3 6o 6 1 3 4 8 0 7 2 22 6 6 4 3 7 5 9 9 81 9 4 7 4 0 8 6 9 6 4 3 6 3 9 4 1 40 3 4 5 7 4 2 5 l lo 3 1 8 0 3 0 7 0 21 4 9 5 9 6 8 8 3 60 9 3 9 0 1 8 5 1 8 4 3 8 1 7 8 50 2 8 1 3 4 0 1 6 60 3 9 5 7 7 8 0 8 33 4 1 7 1 4 4 2 8 l1 8 5 4 3 4 4 6 6 6 4 3 9 7 4 2 3 6o 1 9 5 8 3 4 2 0 90 1 9 7 6 0 9 6 4 2o 9 1 4 9 0 9 0 5 l1 0 3 0 9 1 5 5 4 l 4 4 4 5 6 3 2 8o 1 4 2 5 6 4 6 2 2d 3 7 1 5 0 3 0 9 32 0 8 8 0 3 4 7 0 63 0 8 0 5 5 3 7 0 4 4 4 7 7 2 4 3 1 5 9 9 1 5 1 2 4 24 2 3 9 0 8 6 0 8 91 0 0 6 3 3 1 6 3 44 3 6 1 8 3 8 7 9 1 4 4 9 8 2 0 6 7o 8 7 8 5 1 7 6 7 7 0 7 6 7 6 3 7 3 11 9 4 7 6 2 9 3 1 7o 9 9 4 3 4 7 9 2 9 4 5 3 2 3 2 8 1o 2 4 6 6 8 5 5 7 2 0 4 3 6 3 2 9 8 7 81