（人体解剖与组织胚胎学专业论文）铁离子脑室注射对脑损伤作用的实验研究.pdf

三、论文 前言7刖舌7 材料与方法7 实验结果1 0 讨论1 5 结论1 6 四、本研究创新性自我评价1 7 五、参考文献1 8 六、附录 综j 苤2 1 在学期间科研成绩3 0 致谢3 1 个人简介3 2 中文论著摘要 铁离子脑室注射对脑损伤作用的实验研究 刖舌 铁离了是血红蛋白的降解产物之一，牛理状态下铁离子在脑内分布广泛，在 脑内氧的运输、电了传递、神经递质和髓鞘合成等功能活动中起重要作用。脑组 织中铁离子的正常代谢丰要依赖于细胞对其有效的吸收、运转和储存的平衡。 铁离了平衡紊乱，尤其铁离了的过量蓄积，产生神经毒性作用，而触发一系 列病理反应。研究表明，多种神经退行性疾病都与铁离了的异常增高有关。在阿 尔茨海默病病人脑组织中多个区域铁离了含量明显增高，铁离予在神经细胞内的 积聚与其特征性的病理改变老年斑的形成有关；在帕金森氏症病人脑中同样出现 铁离子代谢紊乱，尤其是黑质内铁离子异常聚集，被认为是多巴胺能神经元死亡 的原因之一。 脑出血发生后，脑血肿内的红细胞溶解，血红蛋白降解，释放大量的铁离了。 离体实验证实铁离子干预体外培养的神经细胞，可以促使神经元发牛凋亡，但在 体情况下铁离了过度升高对神经组织的影响如何，研究尚不完善。鉴于脑出血后 脑组织损伤多种因素参与致病的复杂性，本实验选择单独使用铁离子侧脑室注射， 观察研究其对脑组织的损伤作用，并探讨其作用机制。 材料与方法 1 、动物模型制作及分组 c 5 7 b l 6 小鼠3 0 只，体重2 2 2 5 9 ，随机分成对照组和f e c l 3 组。分别将3 9 l 的 牛理盐水和3 9 lf e c l 3 6 h 2 0 溶液立体定向注a d , 鼠右侧侧脑室。 2 、行为学观察 分别在注射前及注射后的第1 d 、3 d 、5 d 、7 d ，按照n s s 评分方法( n e u r o l o g i c a l s e v e r i t ys c o r e ) 检测，用于小鼠神经功能评判。 3 、组织取材 成模小鼠7 天后断头取脑，5 只小鼠取右侧大脑半球，用于检n 4 , 鼠脑组织含 ，用于组织学观察。 h e 染色：光镜下观察额叶皮质的组织形态结构。 尼氏染色：小鼠海马石蜡切片1 焦油紫水染色，光镜下分别对海马c a l 和c a 3 区进行观察，并计数神经细胞。 免疫荧光双标：小鼠额叶皮质进行g f a p 、c a s p a s e 3 或n e u n 、c a s p a s e 3 免疫荧光双标，观察分析神经元和星形胶质细胞凋亡因了c a s p a s e 一3 表达情况。 实验结果 1 、小鼠神经功能损伤评分( n s s ) 显示，f e c l 3 组小鼠神经功能评分造模术后 1 天最高，以后逐渐下降，各时间点均明显高于对照组( p 0 0 1 ) 。 2 、脑组织含水量测定，对照组小鼠大脑半球含水量未见明显升高，f e c l 3 组 小鼠造模术后脑组织含水量明显高于对照组。 3 、h e 染色结果显示，f e c l 3 组小鼠额叶皮质出现水肿病理表现，脑细胞水肿， 部分神经元坏死液化。 4 、n i s s l 染色结果显示，f e c l 3 组小鼠海马c a l 和c a 3 区神经元缺失。 5 、免疫荧光双标结果显示，f e c l 3 组小鼠额叶皮质星形胶质细胞和神经元数 量明显减少，同时星形胶质细胞和神经元内凋亡因子c a s p a s e 一3 的表达明显升高。 结论 1 、过量铁离了导致小鼠神经功能减低。 2 、过量铁离子促进神经元凋亡、数量减少，导致脑组织神经功能损伤。 3 、过量铁离子促进星形胶质细胞凋亡、数甘减少，破坏血脑屏障胶质膜结构， 可能是脑水肿形成的机制之一。 关键词 脑室注射；铁离予；神经元；神经胶质细胞；c a s p a s e 3 。 2 英文论著摘要 e x p e r i m e n t a ls t u d yo n b r a i ni n j u r yo f i n t r a v e n t r i c u l a ri n je c t i o no fi r o n o b j e c t i v e i r o n ，w h i c hi so n eo ft h ed e g r a d a t i o np r o d u c t so fh e m o g l o b i n i r o n ，i sw i d e l y d i s t r i b u t e di nt h eb r a i ni np h y s i o l o g i c a lc o n d i t i o n s i tp l a y sa ni m p o r t a n tr o l ei no x y g e n t r a n s p o r t ，e l e c t r o nt r a n s f e r ，s y n t h e s i so fn e u r o t r a n s m i t t e r s ，m y e l i na n ds oo n b r a i n i r o nm e t a b o l i s mm a i n l yd e p e n d so nt h eb a l a n c eo fa b s o r p t i o n ，o p e r a t i o na n ds t o r a g eo f c e l l i r o nb a l a n c ed i s o r d e r s ，i np a r t i c u l a r ，t h ee x c e s s i v ea c c u m u l a t i o no fi r o nc a nt r i g g e r as e r i e so fp a t h o l o g i c a lr e a c t i o n sl e a d i n gt on e u r o n a ld e a t ha n dav a r i e t yo ft h ec e n t r a l n e r v o u ss y s t e md i s e a s e s s t u d i e sh a v es h o w nt h a tav a r i e t yo fn e u r o d e g e n e r a t i v e d i s e a s e sa r ea s s o c i a t e dw i ma b n o r m a li n c r e a s eo fi r o n f o re x a m p l e i nm u l t i p l ea r e a s o fa l z h e i m e r sd i s e a s ep a t i e n t s b r a i n s ，i r o nc o n t e n ti ss i g n i f i c a n t l yh i g h e rt h a nn o r m a l a n di th a sb e e nc o n f i r m e dt h a ti r o na c c u m u l a t i o ni nt h en e r v ec e l l sh a sr e l a t i o n s h i p w i t ht h ef o r m a t i o no fs e n i l ep l a q u e s ( o n eo ft h ec h a r a c t e r i s t i cp a t h o l o g i c a ls t r u c t u r eo f a l z h e i m e r sd i s e a s e ) i np a r k i n s o n sd i s e a s ep a t i e n t s b r a i n s ，t h ed i s o r d e ro fi r o n m e t a b o l i s mh a sa l s ob e e nf o u n de s p e c i a l l yt h ea b n o r m a la c c u m u l a t i o no fi r o ni n s u b s t a n t i an i g r a , a n dp e r h a p si so n eo fc a u s e so fd o p a m i n e r g i cn e u r o n s d e a t h i nt h ep a t h o g e n e s i so fc e r e b r a lh e m o r r h a g e ，l a r g ea m o u n t so fi r o na r er e l e a s e d w i t ht h ed e g r a d a t i o no fr e db l o o dc e l l sa n dh e m o g l o b i ns o l u t i o ni nt h eh e m a t o m a , a n d i r o n - m e d i a t e do x i d a t i v ed a m a g ea n da p o p t o s i sa r ei n v o l v e di ns e c o n d a r yb r a i ni n j u r y i th a sb e e nc o n f u m e dt h a tf e c l 3c a na f f e c tc u l t u r eo fn e u r o n si nv i t r oa n dp r o m o t e n e u r o n a la p o p t o s i s g i v e nm a n yf a c t o r sa r ei n v o l v e di nt h ec o m p l e x i t yo fb r a i n d a m a g e ，t h i se x p e r i m e n t u s e di r o na l o n ew i t hi n t r a c e r e b r o v e n t r i c u l a ri n j e c t i o nt o d e t e r m i n ew h e t h e ri tc a nc a u s cb r a i nd a m a g ea n da n a l y z et h em e c h a n i s mo fi t ma t e r i a l sa n dme t h o d s 1 a n i m a lm o d e l sa n dg r o u p s 3 t h i r t yc 5 7 b l 6m i c e ，w e i g h t i n g2 2 2 5 9 ，w e r er a n d o m l yd i v i d e di n t ot w o g r o u p s c o n t r o lg r o u pa n df e c l 3g r o u p ( 1 ) c o n t r o lg r o u p ：3 山s t e r e o t a c t i cs a l i n ew a si n j e c t e di n t ot h er i g h tl a t e r a lv e l l t 血1 e o f m i c e ( 2 ) f e c l sg r o u p ：3 p lf e c l s 。6 h 2 0s o l u t i o nw a s s t e r e o t a c t i c l yi n j e c t e di n t or i g h t v e n t r i c l eo ft h em i c e 2 b e h a v i o ro b s e r v a t i o n b e f o r ea n da f t e rld ，3 d ，5 d ，7 do ft h ei n j e c t i o n ，n e u r o l o g i c a l f u n c t i o nw 雒 e v a l u a t e di nm i c ea c c o r d i n gt on e u r o l o g i c a ls e v e r i t ys c o r e 3 t i s s u ed e r i v e d a f t e r7 d ，t h em i c ew e r ek i l l e da n dt h eb r a i n sw e r er e m o v e d t h e r i g h th e m i s p h e r e s o f5m i c ei ne a c hg r o u pw e r er e t a i n e dt om e a s u r eb r a i nw a t e rc o n t e n ta n dd e t e c ti t s c h a n g e t h er i g h th e m i s p h e r e so ft h er e m a i n i n g10m i c ei ne a c hg r o u pw e r em a d e p a r a f f i ns e c t i o n sa n df r o z e ns e c t i o n sf o ro b s e r v a t i o n 4 s t a i n i n g ( d h e s m i m n g m o r p h o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c so ff r o n t a lc o r t e xw e r eo b s e r v e du n d e r l i g h t m i c r o s c o p e ( 至) n i s s ls t a i n i n g p a r a f f i ns e c t i o n so fm i c ew e r es t a i n e dw i t h1 t a r p u r p l ew a t e r h i p p o c a m p a lc a l a n dc a 3w e r eo b s e r v e dw i t hl i g h tm i c r o s c o p e r e s p e c t i v e l y , a n dt h en 啪b e ro fn e u r o n s w a sc o u n t e d d o u b l ei m m u n o f l u o r e s c e n c e f r o z e ns e c t i o n so fm i c ef r o n t a lc o r t e xw e r ed o u b l es t a i n e d b yg f a p 、c a s p a s e 3o r b yn e u n 、c a s p s e - 3 a p o p t o t i cf a c t o rc a s p a s e - 3e x p r e s s i o nw a su s e dt oa s s a y n e u r o n s a n da s t r o c y t e s r e s u l t s l - n s ss h o w st h a tn e u r o l o g i c a lf u n c t i o no f m i c ei nf e c l 3g r o u pi st h eh i g h e s ti d a y a f t e rm o d e l m gt h e nd e c r e a s e dg r a d u a l l y ，b u ti tw a ss i g n i f i c a n t l yh i g h e r ( p o 0 1 ) t h a n c o n t r o lg r o u pa te a c ht i m ep o i n t 4 2 t h er i g h th e m i s p h e r ei nc o n t r o lm i c ew a sn os i g n i f i c a n ti n c r e a s ei nb r a i nt i s s u e w a t e rc o n t e n td e t e r m i n a t i o n ，b u tw a ss i g n i f i c a n t l yh i g h e ri nf e c l 3g r o u p 3 h es t a i n i n gs h o w e dt h a t ，p a t h o l o g i c a lb r a i ne d e m a , s e v e r eb r a i nd a m a g e ，a n d b r a i nc e l ls w e l l i n gw e r eo b s e r v e di nf e c l 3g r o u pm i c e i tc a no b s r e r v e dn e u r o n a l n e c r o s i sl i q u e f a c t i o ni np a r to ft h e m 4 n i s s ls t a i n i n gs h o w e dt h a tn e u r o n sw e r ea b s e n t e di nh i p p o c a m p a lc a1a n d c a 3a r e a so ff e c l 3g r o u p 5 d o u b l ei m m u n o f l u o r e s c e n c es h o w e dt h a ta s t r o c y t e sa n dt h en u m b e ro fn e u r o n s r e d u c e ds i g n i f i c a n t l yi nf e c l 3g r o u p ，a n dt h ee x p r e s s i o no fc a s p a s e 一3i n c r e a s e d s i g n i f i c a n t l y c o n c l u s i o n 1 e x c e s si r o nc a nr e d u c en e r v ef u n c t i o ni nm i c e 2 e x c e s si r o nc a l lp r o m o t en e u r o n a la p o p t o s i s ，r e d u c et h en u m b e ro fn e u r o n sa n d c a u s eb r a i nd a m a g e 3 e x c e s si r o ni o n sc a np r o m o t et h ea p o p t o s i sa n dr e d u c et h en u m b e ro f a s t r o c y t e s t h ed a m a g eo fg l i a lm e m b r a n es t r u c t u r ei nb l o o d - b r a i nb a r r i e rm a yb eo n eo ft h e m e c h a n i s m so fc e r e b r a le d e m af o r m a t i o n k e y w o r d s i n t r a c e r e b r o v e n t r i c u l a ri n j e c t i o n ；i r o ni o n s ；n e u r o n ；g l i a lc e l l s ；c a s p a s e 一3 5 英文缩略语 6 论文 铁离子脑室注射对脑损伤作用的实验研究 刖吾 牛理状态下，铁离了在脑内分布广泛，在脑内氧的运输、电子传递、神经递 质和髓鞘合成等功能活动中起重要作用【l 】，脑组织中铁离子的正常代谢主要依赖 于细胞对其有效的吸收、运转和储存的平衡。铁离了平衡紊乱，尤其铁的过量蓄 积，产生神经毒性作用，可触发一系列病理反应而导致神经元损伤、死亡以及多 种中枢神经系统疾病。 研究表明，多种神经退行性疾病都与铁离子的异常增高有关。在阿尔茨海默 病( a d ) 病人脑组织中多个区域铁离予含量明显增高，铁离子在神经细胞内的积 聚与a d 特征性病理改变老年斑的形成有关网；在帕金森氏症( p d ) 病人脑中同样 出现铁离子代谢紊乱，尤其是黑质内铁离子异常聚集，可能是多巴胺能神经元死 亡原因之一【3 4 ，5 】：同样铁离子作为血红蛋白的主要降解产物之一，在脑出血后血 肿周围聚积【6 1 。全球每年脑出血患者超过3 百万人【7 1 ，其中约三分之一的患者在发 病后l w i - 月内死亡，大部分存活者也会遗留有严重的残疾【8 ，9 1 。脑出血后血肿周围 神经组织损伤与多种因素有关，包括细胞毒性因了【10 1 、炎性介质【l l 】、基质金属蛋 白酶的产生 1 2 , 1 3 、凝血级联激活和凝血酶形成【1 4 1 、红细胞溶解和血红蛋白及其降 解产物的毒性作用 1 5 - 1 8 】以及脑实质补体级联激活 1 9 - 2 1 】等。离体实验证实f e c l 3 干预 体外培养的神经细胞，可以促使神经元凋亡【2 2 1 ，李圣山等 2 3 】应用大鼠白体血液回 输制造脑出血模型，引起脑出血继发的脑损伤，而使用铁离予螯合剂玄铁敏后症 状减轻，证实铁离子通过介导氧化损伤和细胞凋亡，参与了脑出血继发性脑损伤。 鉴于脑出血后脑组织损伤致病因素的复杂性，本实验选择单独使用铁离子侧 脑室注射，观察研究过量铁离子对脑组织的损伤作用及其作用机制，为临床脑出 血治疗探索新线索。 材料与方法 1 、实验材料 7 1 1 、实验动物 3 月龄健康c 5 7 b 啪小鼠，雌雄不拘，共3 0 只，体重为2 2 - - 一2 5 9 ，由中国医科大 学实验动物中心提供，符合国家二级实验动物标准。 1 2 、实验仪器、设备 立体定位仪安徽淮北正华生物仪器设备有限公司 微量注射器 宁波镇海玻璃仪器厂 电热恒温水浴箱上海医用分析仪器厂 光学显微镜 o l y m p u s 荧光共聚焦显微镜o l y m p u s 电子天平上海天平仪器厂 1 3 、试剂 鼠抗g f a p ( 博士得) 、鼠抗n e u n ( c h e m c o n ) 、兔抗c a s p a s e 一3 ( 博奥森) 、山羊 抗小鼠( f i t c ) 及山羊抗兔( t r ) 荧光二抗( s a n t a ) 、f e c l 3 6 h 2 0 、1 0 水合氯醛、多聚 甲醛、甲苯胺蓝( 国产分析纯) 2 、实验方法 2 1 、动物分组 将受试小鼠随机分成对照组和f e c l 3 组，每组1 5 只。对照组，右侧侧脑室注射 生理盐水；f e c l 3 组，右侧侧脑室注射f e c l 3 6 h 2 0 溶液。 2 2 、侧脑室立体定向注射 10 水合氯醛溶液( 3 5 0m e , k g i p ) 腹腔注射麻醉小鼠，固定于立体定位仪 上，前端套齿，两侧耳杆周定头部，门齿棒高于耳杆2 3m m 。颅顶部正中切开皮 肤，3 h 2 0 2 熔化骨膜，使前囱暴露清晰，根据p a x o n ( ( t h em i c eb r a i n ) ) 图谱， 选择侧脑室作为注射点( 坐标为前囱后3 5 m m ，中缝向右旁开1 5 m m ，硬膜下 2 5 m m ) ，牙钻钝性钻开颅骨相应部位，用5 9 l 微量注射器经钻孔垂直进针达班标 点处，对照组小鼠右侧侧脑室注射3 9 l 生理盐水，f e c l 3 组小鼠右侧侧脑室注射3 9 l f e c l 3 6 h 2 0 溶液( 2 0 m m 、3 1 a 1 ) ，注药速度为1 9 l m i n ，注射完毕后留针1 0m i n ，然 后缓慢拔针，以牙科材料粘合颅骨钻孔，1 活力碘消毒后缝合皮肤，放回笼中喂 养。 8 2 3 、脑组织标本处理 注药7 d 后断头取脑，2 组各取5 只小鼠右侧大脑半球，检测脑组织含水量， 另外1 0 只小鼠右侧大脑半球放入4 多聚甲醛中固定，常规制备石蜡切片、冰冻 切片，用于h e 染色、尼氏染色及免疫组织化学染色。 2 4 、小鼠神经功能评分 小鼠分别在造模前及模型建立后的1 天、3 天、5 天、7 天进行n s s 神经功能 缺损评分【2 4 】。按照( 表1 ) 对小鼠逐项试验，总成绩为小鼠n s s 分值，最高分值 1 0 分，最低分值0 分，分值越高神经功能损伤越严重。 表1 ，神经功能缺损评分( n e u r o l o g i c a ls e v e r i t ys c o r e ，n s s ) 2 5 、脑组织含水量测定 干湿法测脑组织含水量：建模后7 d 取右侧大脑半球，清除表面脑膜，放在带 滤纸的培养皿中吸干脑表面的水份，将其放在已称重的箔纸上，称湿重( w e tt i s s u e w e i g h t ) ，然后迅速放入烤箱内，1 0 0 。c 烤2 4 h ，取出称干重( d r yt i s s u ew e i g h t ) 。取 脑组织到称重的整个过程在5 m i n 内完成，按以下公式计算脑水含量：脑水含量 = ( 湿质量一干质量) 湿质量1 0 0 。 9 2 6 、h e 染色 h e 染色：小鼠额叶组织石蜡切片入二甲苯脱蜡，梯度酒精后入水，苏木素、 伊红染色后梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。光镜下观察额叶皮质形 态结构。 2 7 、n i s s l 染色 小鼠海马石蜡切片入二甲苯脱蜡，梯度酒精后入水，1 焦油紫水染色( 3 7 c 温 箱染色2 0 分钟) ，9 5 酒精分色，镜下观察至尼氏体清晰，酒精脱水，二甲苯透 明，中性树胶封片。4 0 0 倍光镜下，分别对海马c a l 和c a 3 区进行神经细胞计 数，计数时统一计数区域，尽量做到计数区域相同。每个标本取相同的3 个视野 计数阳性细胞，做为该标本的阳性细胞数，所得数据进行统计学处理。 n i s s l 染液配置：甲酚紫0 2 9 溶于1 9 8 m l 的去离子水中再加入1 的冰醋酸溶 液2 m l 配置成2 0 0m l 的n i s s l 染液。 2 8 、免疫荧光双标 免疫荧光双标：小鼠额叶皮质冰冻切片一o 0 1mp b s 冲洗5 分钟一3 h 2 0 2 孵育l o 分钟一5 山羊血清室温孵育l 小时一鼠抗g f a p ( g l i a lf i b r i l l a r ya c i d i c p r o t e i n ，特异性标记星形胶质细胞) 和兔抗c a s p a s e - 3 或鼠抗n e u n ( n e u r o n s p e c i f i c n u c l e a rp r o t e i n ，特异性标记神经元) 和兔抗c a s p a s e 3 ，4 c 共同孵育过夜一o 0 1m p b s 充分漂洗一山羊抗小鼠及山羊抗兔荧光二抗( f i t c 、t r ) 窒温共用孵育2 小时 一o 0 5 mt r i s h c i 充分漂洗一防淬灭封片剂封片一荧光显微镜下观察并采集图像 和分析。 3 、统计分析 应用s p s s l 6 0 软件，对数据进行t 检验分析，结果以均值4 - 标准差表示，p o 0 5 有显著性差异。 实验结果 l 、小鼠神经功能缺损评分( n s s ) 结果 对照组与f e c l 3 组在造模前评分均为0 分。对照组术后各时间点与术前小鼠神 经功能评分无显著差异。f e c l 3 组小鼠神经功能评分造模术后1 天最高，以后逐渐 1 0 下降，各时间点均明显高于对照组，p o 0 1 ( 表2 、图1 ) 。提示侧脑室注射铁离 子可导致小鼠出现神经功能障碍。 表2 ，各组小鼠神经功能评分比较( 均值标准差) 料p o 0 1 ，与对照组比较。 a 吼 ：l 0 0 叠 t z ： 霞 簧 - ? o r - 1矗3d 5 d 图l ，小鼠神经功能评分，f e c l 3 组小鼠神经功能缺损评分各时间点均明显高 于对照组( 料p o 0 1 ) 。 2 、小鼠脑组织水含量测定结果 对照组小鼠右侧大脑半球含水量未见明显升高。f e c l 3 组小鼠造模术后脑组织 含水量明显高于对照组( p o 0 1 ) ( 表3 ) ，提示侧脑室注射铁离了使周围脑组织水 含量增加。 表3 ，各组小鼠脑组织含水量变化( 均值4 - 标准差) 料p o 0 1 ，与对照组比较。 8 7 6 l 一4 3 2 重o 3 、h e 染色结果 h e 染色结果显示：f e c l 3 组小鼠额叶皮质神经元水肿，部分神经元坏死液化， 细胞形态不完整及数目减少，神经元散在呈三角形、核固缩( 图2 ) 。提示铁离子 诱导小鼠脑组织出现脑水肿病理表现。 对照 图2 ，皿染色左图为对照组小鼠额叶皮质，右图为f e c l 3 组小鼠额叶皮质。 f e c l 3 组小鼠脑组织可见神经元坏死液化，神经元数目减少、形态不完整，散在呈 三角形、出现核固缩。 4 、n i s s l 染色结果 光镜下观察n i s s l 染色( 甲酚紫) 的小鼠海马神经元。对照组小鼠海马各区神经 元形态正常，细胞核呈圆形，染色较淡( 图3a 、c ) ；f e c l 3 组神经元数量明显减 少，细胞萎缩，细胞核裂解消失( 图3b 、d ) 。统计结果显示：f e c l 3 组小鼠脑的海 马c a i 和c a 3 区神经元数量明显少于对照组，p 0 0 5 ，( 表4 、图4 ) 。提示铁离 子注射可诱导神经元死亡，导致神经元数量减少。 1 2 c a l c a 3 对照 季纛 ； 二 t ，、， o rj 已l ： ， ， 。 。 、： 窖 ， 。 注铁 参专霉露霉冀 、 f t 。j 勺h ， 陵鬻? 擎瀚 图3 ，n i s s l 染色小鼠海马c a l 和c a 3 区a 、c 为对照组小鼠海马，神经元 密集、细胞形态正常。b 、d 为f e c l 3 组小鼠海马，神经元数量明显减少、细胞萎 缩和细胞核裂解消失。 表4 ，海马c a i 区和c a 3 区n i s s l 染色神经元数量( 均值标准差) p 0 0 1 ，与对照组比较。 1 3 棚 籁 l r 骊 霖 裁 医 如 球 一 一 乏 c a l 区c a 3 区 图4 ，n i s s l 染色海马c a l 和c a 3 神经元数量f e c l 3 组小鼠海马c a l 和c a 3 区神经元数量明显少于对照组( i f 5 ；p o 0 1 ) 。 5 、免疫荧光双标结果 免疫荧光共聚焦显微镜下观察f e c l 3 组小鼠额叶皮质g f a p 阳性星形胶质细 胞( 图5 ) 和n e u n 阳性神经元( 图6 ) 数量明显少于对照组；g f a p 阳性星形胶质 细胞和n e u n 阳性神经元内凋亡因子c a s p a s e 3 的表达明显高于对照组( 图5 、图 6 ) 。表明侧脑室注射f ec 1 3 可诱导神经元和星形胶质细胞发生凋亡，导致神经元和 星形胶质细胞数量减少。 1 4 o o o o o o o o 踮 鲫 药 坫 | 宝 5 对照 注铁 g f a p c a s p a s e 3m e r g e 一 图5 ，免疫荧光双标g f a p 阳性表达呈绿色，c a s p a s e 一3 阳性表达呈红色。与 对照组比较，f e c l 3 组小鼠额叶皮质中g f a p 阳性的星形胶质细胞数量明显减少， c a s p a s e - 3 呈阳性表达的星形胶质细胞明显多于对照组。 n e u n c a s p a s e3m e r g e 对照组 f e c l 3 组 图6 ，免疫荧光双标n e u n 阳性表达呈绿色，c a s p a s e 一3 阳性表达呈红色。与 对照组相比，f e c l 3 组小鼠额叶皮质中n e u n 阳性的神经元数量明显减少，c a s p a s e - 3 呈阳性表达的神经元明显多于对照组。 1 5 讨论 脑水肿是脑出血的继发性神经损伤之一，脑水肿的程度及持续时间与脑出血 的预后密切相关【2 5 之7 1 ，而脑组织含水量是反映脑水肿的主要指标，其高低直接反 映脑水肿的严重程度及脑细胞的损伤程度。本实验结果，铁离子小鼠侧脑室注射 术后7 d 脑组织含水量明显高于对照组，脑组织结构呈现脑水肿的病理改变，提示 铁离子异常增多在脑水肿形成过程中起着重要作用。血脑屏障( b b b ) 的完整性 在脑出血后脑水肿及损伤病理牛理过程中发挥重要作用，b b b 通透性增加可以造 成血浆蛋白和水分外渗引起血箭源性脑水肿【2 8 。3 1 】。星形胶质细胞是血脑屏障的丰 要结构成分。本实验结果，f e c l 3 组小鼠额叶皮质中星形胶质细胞中凋亡因子 c a s p a s e 3 高表达，且星形胶质细胞数量明显少于对照组。提示f e c l 3 可能通过损伤 星形胶质细胞使血脑屏障的完整性破坏，促使脑水肿的产牛。 本实验结果，f e c l 3 组小鼠侧脑室注射铁离子后各时间点神经功能缺损评分明 显高于对照组。同时小鼠脑内神经元凋亡因子c 唧a s e 3 表达明显高于对照组，海 马c a i 币i ：i c a 3 区神经元明显丢失，细胞萎缩和细胞核裂解等与s h a r m a 等【3 2 1 在离体 实验中观察至i j f e c l 3 可促使培养的神经元发牛凋亡的结果相同。表明侧脑室注射铁 离子促使小鼠出现明显的神经功能障碍与神经组织内细胞的凋亡等相关。 综上所述，侧脑室注射铁离子可导致神经功能障碍、脑组织含水量增加、脑 水肿病理改变，神经元和星形胶质细胞数量减少及神经元和神经胶质细胞的 c 唧a u s e 3 表达升高。上述结果为脑出血病程中铁离了升高对脑组织损伤和脑水肿 的作用提供了直接的证据；也为一些与铁离子紊乱相关的神经系统疾病，如：a d 、 p d 、癫痫、不宁腿综合征等 2 , 3 , 3 2 , 3 3 】的病理变化机制提供新的证据；同时也为与铁 离子异常相关的疾病的治疗提供了新思路。 结论 1 、过量铁离子导致小鼠神经功能减低。 2 、过量铁离予促进神经元凋亡、数量减少，导致脑组织神经功能损伤。 3 、过量铁离子促进星形胶质细胞凋亡、数目减少，破坏血脑屏障胶质膜结构， 可能是脑水肿形成的机制之一。 1 6 本研究创新性的自我评价 1 、f e c l 3 侧脑室注射，研究铁离子参与了脑组织损伤的过程。 2 、通过免疫双标技术，研究铁离子诱导星形胶质细胞凋亡，从而破坏血脑屏 障，这可能是铁离子参与脑组织水肿的机制之一。 1 7 参考文献 1s t a n k i e w i c zj ，p a n t e rs s ，n e e m am ，e ta 1 i r o ni nc h r o n i cb r a i nd i s o r d e r s ：i m a g i n ga n d n e u r o t h e r a p e u t i ci m p l i c a t i o n s j n e u r o t h e r a p e u t i c s ，2 0 0 7 ，4 ( 3 ) ：3 7 1 - 3 8 4 2 l e s k o v j a na c ，k r e t l o wa ，l a n z i r o t t ia ，b a w e a1 lv o g ts ，m i l l e rl m i n c r e a s e db r a i ni r o n c o i n c i d e sw i t he a r l yp l a q u ef o r m a t i o ni nam o u s em o d e lo fa l z h e i m e r sd i s e a s e n e u r o i m a g e ， 2 0 11 ，5 5 ( 1 ) ：3 2 3 8 3 j u n p e n g ，f a n gf e n gs t e v e n s o n , m a y l i no o ，j u l i ek a n d e r s e n i r o n e n h a n c e d p a r a q u a t - m e d i a t e dd o p a m i n e r g i cc e l ld e a t hd u et oi n c r e a s e do x i d a t i v es t r e s sa s ac o n s e q u e n c e o fm i c r o g l i a la c t i v a t i o n f r e er a d i c a lb i o l o g y & m e d i c i n e ，2 0 0 9 ( 4 6 ) ：312 - 3 2 0 4 d r e c h s e l ，d a ；p a t e l ，m r o l eo fr e a c t i v eo x y g e ns p e c i e si nt h en e u r o t o x i c i t yo f e n v i r o n m e n t a l a g e n t si m p l i c a t e d i n p a r k i n s o n sd i s e a s e f r e e r a d i cb i o lm e d 2 0 0 8 4 4 ：18 7 3 18 8 6 5c a s t e l l a n ii l l ，s i e d l a ks l ，p e r r yg ，s m i t hm a s e q u e s t r a t i o no fi r o n b yl e w yb o d i e si n p a r k i n s o n sd i s e a s e a c t an e u r o p a t h 0 1 2 0 0 0 ，1 0 0 ：11l 一11 4 6w uj , h u ay ，k e e pr f ，e ta 1 i r o na n di r o n h a n d l i n gp r o t e i n si nt h eb r a i na f t e ri n t r a c e r e b r a l h e m o r r h a g e j s t r o k e 2 0 0 3 ，3 4 ( 1 2 ) ：2 9 6 4 2 9 6 9 7 q u r e s h ia i ，t u h r i ms , b r o d e r i c kj p ，e ta 1 s p o n t a n e o u si n t r a c e r e b r a lh e m o r r h a g e 【j 】ne n g lj m e d ，2 0 0 1 ，3 4 4 ：1 4 5 0 1 4 6 0 8b r o d e r i c kj p h a n d b o o ko f n e u r o e p i d e m i o l o g y n e wy o r k ：m a r c e ld e c k e ri n c ，1 9 9 4 9 c o u n s e l lc ，b o o n y a k a r n k f ls , d e n n i sm p r i m a r yi n t r a c e r e b r a lh e m o r r h a g ei nt h eo x f o r d s h i r e c o m m u n i t y 【j 】s t r o k ep r o j c t ，2 ：p r o g n o s i s c e r e b r o v a s cd i s ，1 9 9 5 ，5 ：2 6 3 4 10 w a n gj z ，x uz x ，g a oc ，e ta 1 c l i n i c a ls t u d yo f c o r r e l a t i o nb e t w e e ni n t e r l e u k i n ，s 10 0p r o t e i n i