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浙江人学顾l ：学位论文 中文摘要 海马重组激活基因1 对大鼠空间学习记忆的影响 浙江大学医学院 2 0 0 7 级硕士研究生 导师 人体解剖与组织胚胎学 陈浩浩 凌树才教授 中文摘要 重组激活基因1 ( r a 9 1 ) 在淋巴细胞的发育成熟过程中起关键作用，并与免 疫记忆功能有关，实验证明，敲除动物的r a g l 会导致免疫记忆功能缺陷。研究 发现r a g l 并非只存在于免疫系统中，在哺乳动物、两栖动物和硬骨鱼类的神经 系统中也都存在，并且其转录产物主要分布在与记忆功能有关的脑区，如海马、 小脑。本实验中我们构建了3 对针对大鼠r a g l 的r n a 干扰重组表达载体及l 对 无关序列的载体( n e g a t i v e ) ，采用慢病毒载体系统分别包装4 个载体，而后分别 感染体外培养的大鼠原代海马神经元细胞，通过w e s t e r n 免疫印迹和荧光定量p c r 检测r a g l 蛋白及m r n a 的表达，从而选取最佳干扰效果的慢病毒载体。构建的 慢病毒载体通过脑立体定位仪，注射入大鼠海马c a 3 区，利用r t p c r 检测7 天、1 4 天、2 8 天慢病毒干扰r a g lm r n a 表达的效果，并通过免疫荧光观察g f p 表达以及尼氏染色观察海马结构形态变化。我们选取了注射后2 8 天的大鼠进行 m o r r i s 水迷宫的定位航行与空间探索实验，结果显示注射干扰病 至 t ( e x p e r i m e n t a l ) 与正常组( c o n t r 0 1 ) 以及注射无干扰效果病毒组( n e g a t i v e ) 相比没有显著性差异。 对e x p e r i m e n t a l 组大鼠进行离体海- 6 脑片长时程增强( l t p ) 的研究显示与c o n t r o l 组比较没有显著性差异。由此我们得出这样的结论：在成年大鼠海马中，r a g l 表 达产物的减少可能不影响大鼠的空间学习记忆能力。 关键词重组激活基因1 ；s h r n a ；海马；r t - p c r ；m o r r i s 水迷宫；长时程增强 i v 浙江人学顾i ：学位论文 英义摘要 e f f e c to fr e c o m b i n a t i o na c t i v a t i n gg e n e1o nh i p p o c a m p u s i nr a t s p a t i a ll e a r n i n ga n dm e m o r y m e d i c a lc o l l e g eo f z h e j i a n gu n i v e r s i t y h u m a n a n a t o m ya n dh i s t o l o g ya n de m b r y o l o g y p o s t g r a d u a t e ： c h e nh a o h a o s u p e r v i s o r ：l i n gs h u c a i a b s t r a c t r e c o m b i n a t i o na c t i v a t i n gg e n e l ( r a 9 1 ) p l a y sac r i t i c a lr o l ei nt h ed e v e l o p m e n ta n d m a t u r a t i o no fl y m p h o c y t e s ，a n di ti sr e l a t e dt oi m m u n e m e m o r yf u n c t i o n s i th a db e e n p r o v e dt h a td e l e t i o no fr a g lr e s u l t e di nal a c ko fm a t u r ef u n c t i o n a lba n dt l y m p h o c y t e s r e s e a r c h e r sf o u n dt h a tr a g le x i t e dn o to n l yi ni m m u n es y s t e m ，b u ta l s o i nn e r v o u ss y s t e mo fm a m m a l ，a m p h i b i a na n i m a l sa n do s t e i c h t h y e s t h er a g l t r a n s c r i p t i o n sw e r em o s t l ya p p a r e n ti nr e g i o n so ft h ep o s t n a t a lb r a i nw i t hah i g h n e u r o n a lc e l ld e n s i t y ：t h ec e r e b e l l u ma n dt h eh i p p o c a m p a lf o r m a t i o n ，w h i c hw e r e r e l e v a n tt ol e a r n i n ga n dm e m o r yf u n c t i o n i nt h i sr e s e a r c h ，w ec o n s t r u c t e dt h r e ep a i r s s h r n at a r g e t i n gr a g la n do n e - p a i ri n d e p e n d e n ts e q u e n c e ( n e g a t i v e ) ，p a c k a g e dw i t h l e n t i v i r a lv e c t o rs y s t e m ，a n dt r a n s f e r r e di n t ot h ec u l t u r e dr a th i p p o c a m p a ln e u r o nc e l l s i nv i t r or e s p e c t i v e l y w eo b s e r v e db yi m m u n o f l u o r e s c e n c e ，a s s a y e df o re x p r e s s i o no f r a g lb yr e a lt i m ep c ra n dw e s t e r nb l o t l e n t i v i r u sw a sr e j e c t e di n t oc a 3o ft h e h i p p o c a m p u si nt h er a tb r a i ns t e r e o t a x i ca p p a r a t u s t h ee x p r e s s i o n so fr a g lm r n a w e r ed e t e c t e db yr t - p c ro n7d ，14da n d2 8da f t e ri n j e c t i o n w eo b s e r v e dt h eg f p e x p r e s s i o nb yi m m u n o f l u o r e s c e n c e ，a n dh i p p o c a m p a lf o r m a t i o nb yn i s s l ss t a i n i n g t h e nw ec h o s et h e2 8dg r o u pr a t sf o rm o r r i sw a t e rm a z e ，w eu s e dt h ep l a c e n a v i g a t i o na n ds p a c ee x p l o r a t i o n w ed i d n tf o u n de x p e r i m e n t a lg r o u ph a dr e m a r k a b l y d i s p a r i t yc o m p a r e dw i t ht h ec o n t r o la n dn e g a t i v eg r o u p s i nl o n g - t e r mp o t e n t i a t i o n ( l t p ) r e s e a r c h ，e x p e r i m e n t a lg r o u ph a dn or e m a r k a b l yd i s p a r i t yc o m p a r e dw i t ht h e c o n t r o lg r o u p t h u sw eg e tt h ec o n c l u s i o nt h a tt h ed e c r e a s eo fr a g le x p r e s s i o ni n h i p p o c a m p u sm a y n o ta f f e c tr a t s s p a t i a ll e a r n i n ga n d m e m o r ya b i l i t y k e yw o r d sr e c o m b i n a t i o na c t i v a t i n gg e n e l ，s h r n a ，h i p p o c a m p u s ，r t - p c r ，m o r r i s w a t e rm a z e ，l o n g - t e r mp o t e n t i a t i o n v 浙江人学硕1 ：学位论文缩写表 缩写、符号清单、术语表 v i 浙江大学研究生学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得迸姿态堂或其他教育机构的学位或 证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文 中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：阮伟 签字同期： 少f 口年? 月年日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解逝姿盘堂有权保留并向国家有关部门或机构 送交本论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权逝垄盘堂可 以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索和传播，可以采用影印、 缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：1 氮汽院 导师签名： 签字日期：妒fo 年2 月争日 簇勿予彳 撼a 签字日期：w 7 。年弓月年日 浙江人学顾i ：学位论文致谢 致谢 本课题是在尊敬的凌树才教授的悉心指导和严格要求下完成的。从科研的选题 到课题的设计，从科研方法的选择、研究指标的确定到论文的写作，无不渗透着 导师的心血。导师对我在实验过程中出现的问题耐心地分析指导，及时与我沟通 和讨论，使我能把握好实验的方向、提高工作效率。导师踏实的工作作风、严谨 的治学态度、缜密的科研思维使我终身受益，在学 - - j 和工作上的谆谆教诲，日常 生活中无微不至的关怀使我终身难忘，有了导师的辛勤的付出，才有了学生的春 华秋实，在此谨向凌老师致以衷心的感谢! 感谢周苏娅老师在神经电生理实验上对我的帮助，感谢实验室的各位老师和同 学在学习、工作、生活诸多方面的帮助和关心。 感谢尊敬的答辩委员会专家及评审专家! 因为璞玉成为美玉全靠艺术家的选择 和雕琢。 最后尤其感谢我的家人，多年来对我学 - - j 的支持、理解和鼓励。 在即将毕业之际，谨向所有关心、帮助和支持过我的师长、同学和朋友致以最 诚挚的谢意! i i 浙江人学颀l ：学位论文序高 青专 学习和记忆是人类和高等动物最具特色的高级神经活动之一。开展学习和记忆 方面的研究，对于探索脑的奥秘，开发脑的功能，以及临床治疗学习记忆障碍和 脑的疾病等方面具有重要的意义。重组激活基因l ( r e c o m b i n a t i o na c t i v a t i n gg e n el ， r a 9 1 ) 最早发现于免疫系统，与免疫细胞特异性的记忆活动相关。该基因除在免 疫系统中表达外，还特异性的分布于神经组织，特别是海马、边缘系统等与学习 记忆有关的脑区。但迄今为止，人们依然未能明确r a g l 在神经系统中的分布是 否与大脑的学习和记忆功能存在某种必然的联系。本课题构建了特异性抑制海马 神经细胞r a g l 表达的慢病毒载体，并通过脑立体定位注射入大鼠海马，通过神 经行为学和电生理方法，研究海马区r a g l 基因表达被抑制后大鼠空间学习记忆 能力的变化，以及离体海马脑片的突触传递效能的长时程增强( l t p ) 变化，从 而探讨海马区r a g l 的表达与空间学习记忆之间是否存在一定的关联。本课题得 到了国家自然科学基金项目( n o 3 0 5 7 0 5 8 6 ) 的资助，在海马脑片l t p 实验中， 得到了浙江大学医学院神经生物研究所周苏娅副教授的真诚协助。 i i i 浙江人学硕l 学位论文绪论 海马重组激活基因1 对大鼠学习记忆的影响 浙江大学医学院 2 0 0 7 级硕士研究生 导师 人体解剖与组织胚胎学 陈浩浩 凌树才教授 1 绪论 重组激活基因( r e c o m b i n a t i o na c t i v a t i n gg e n e s ，r a g s ) 最早发现于免疫系统， 有r a g l 和r a 9 2 两种亚型【l 】。它们的编码产物共同构成重组酶，能特异地识别免 疫球蛋白和t 细胞受体的v 、d h 、j 基因片段两侧的重组信号序列，催化d n a 双链断裂，引起v ( d ) j 重排，因此在淋巴细胞的发育成熟过程中起关键作用，并 与免疫记忆功能有关。实验证明，敲除动物的r a g l 会导致免疫记忆功能缺陷【2 1 。 但随着研究的不断深入，人们发现r a g l 并非只存在于免疫系统中，在哺乳动物【3 1 、 两栖动物【4 1 和硬骨鱼类【5 ，6 】的神经系统中也都存在。并且发现r a g l 表达的部位主 要集中在与记忆功能有关的脑区，如海马、小脑、杏仁复合体以及新皮质。已证 明，中枢系统和免疫系统共用许多相同的基因如：共同信号分子、受体和酶【n ， 而且两个系统都具有独一无二的编码记忆的能力。c u s h m a n 等【8 】证明了r a g l 敲除 小鼠的神经行为表现发生变化，他们发现在水迷宫实验中r a g l 敲除小鼠并没有 显示空间学习异常；在可见平台测试中，r a g l 敲除小鼠的游泳路径距离和到达逃 生平台的潜伏期明显比对照组长。然而利用基因敲除技术来研究r a g l 在中枢神 经系统中的功能显然也存在一定的缺陷，实验表明某些免疫因子的缺失会影响神 经发育和引起行为学异常【9 ，1 0 1 ，如果动物从胚胎期就开始缺失r a g l 基因会造成免 疫缺陷，是否会对神经发育和行为学也产生影响，继而影响后续实验的结果也还 是未知的。慢病毒载体能感染包括神经元在内的非分裂期细胞，其感染效率较高， 容纳外源目的基因片段大、免疫反应性也低，更重要的是能在体稳定转染，与宿 主基因组发生整合从而实现长期稳定表达【1 1 】，用它来研究r a g l 在中枢神经系统 中的功能将会是一种新的思路和方法。因此本实验中我们构建了抑制r a g l 的慢 病毒载体系统，通过脑立体定位注射抑制成年大鼠海马区r a g lm r n a 的表达， 观察大鼠的学习与记忆的变化，从而研究两者之间是否存在相关性。 浙江人学硕1 ：学位论文材料和方法 2 材料和方法 2 1 弑料 2 1 1 动物和试剂材料 s d 雌性大鼠和孕1 8 天s d 孕鼠购自浙江大学医学实验动物中心。 质粒p r n a t u 6 2 l e n t i 、p r s v r e v 、p m d l g p r r e 、p m d 2 g 购自t r o n ol a b ； 人肾胚细胞2 9 3 t 细胞，宫颈癌细胞株h e l a 细胞由中科院上海细胞生物学研究所 惠赠；d h 5 a 本室保存。 大量质粒d n a 提取试剂盒和基因组d n a 纯化试剂盒购自q i a g e n ；b a m h i 、 x h o i 内切酶、逆转录试剂盒购自t a k a r a ；e c l 试剂盒购自p i e r c e ；山羊抗r a g l 抗体购自s a n t ac r u z ；兔抗n f m 抗体购自u n i t e ds t a t e sb i o l o g i c a l ；小鼠抗t u b u l i n 购自b i o m e d a ；小鼠抗g f p 抗体购自m i l l i p o r e ；h r p 标记兔抗山羊、h r p 标记 兔抗小鼠二抗购自j a c k s o n ；封片剂购自s o u t h e r nb i o t e c h ；n e u r o b a s a l 、b 2 7 、d m e m 购自g i b c o ；l g l u t a m i n e 、p o l y l y s i n e 、p o l y b r e n e 、b i c u c u l l i n e 购自s i g m a 。 t r i t c 标记山羊抗兔、f i t c 山羊抗小鼠购自上海鼎国，t r i z o l 、d e p c 、d n t p 、 t a q 酶、核酸染料购自上海生工，f c s 、小牛血清、兔血清、山羊血清、s d s p a g e 凝胶试剂盒购自武汉博士德，h o e c h s t 3 3 3 4 2 购自碧云天，青链霉素、多聚甲醛、 戊巴比妥钠、异丙醇、甲醇、乙醇、乙醚、溴酚蓝、甘氨酸、二甲苯、中性树脂、 甘油、琼脂糖、乙酸、焦油紫、n a c l 、k c l 、m g c l 2 、n a 2 h p 0 4 、k h 2 p 0 4 、n a h c 0 3 、 酚红、e d t a 、s d s 、t r i t o nx - 1 0 0 、n a v 0 4 、n a f 、t r i s 、d t t 、d g l u c o s e 、t w e e n 2 0 、 c h o l i n ec 1 、n ap y r u v a t e 、n aa s c o r b a t e 等均为国产分析纯。 2 1 2 溶液配方 1 ) 0 1m p b ( p h ：7 2 - 7 4 ) n a h 2 p 0 4 3g n a 2 h p 0 4 2 9g 加d d h 2 0 至 1 0 0 0m l 2 ) 0 0 1m p b s ( p h ：7 2 7 4 ) 2 浙江人学硕i ：学位论文材料和方法 o 1m 的p b 溶液 n a c l 加d d h 2 0 至 3 ) d h a n k s 溶液 n a c l k c l n a 2 h p 0 4 k h 2 p 0 4 n a h c 0 3 酚红 加d d h 2 0 至 4 ) 蛋白裂解液 n a c l k h 2 p 0 4 k c l e d t a n a 2 h p 0 4 s d s t r i t o n x 10 0 n a v 0 4 n a f 5 ) 1 0 t b s lm 碱s h c i ( p h7 5 ) n a c l 加d d h 2 0 至 6 ) 5 xs d s l o a d i n gb u f f e r 0 5mt r i s - h c l ( p h6 8 ) 1 0 0 m l 9g 1 0 0 0 m l 8g 0 4g 0 1 3 4g 0 0 6g 0 3 5g 0 0 2g 1 0 0 0 m l 1 3 7m m 1 4 m m 1 7 m m 5 0m m 4 3m m o 1 1 1m m 5 0m m 1 0 0m l 8 8g 1 0 0 0 m l 2 5m l 3 浙江人学顾l j 学位论文材料和方法 d 1 l l 。 溴酚蓝 甘油 7 ) 5 0 x t a e t r i s 乙酸 0 5me d t a ( p h 8 0 ) 加d d h 2 0 至 8 ) 6 x l o a d i n gb u f f e r 溴酚蓝 二甲苯腈蓝f f 甘油 e d t a 9 ) 抗体稀释液 二抗种属来源血清 b s a t r i t o nx 1 0 0 加o 0 1mp b s 至 1 0 ) 抗体封闭液 二抗种属来源血清 b s a t r i t o nx 1 0 0 加o o lmp b s 至 1 1 ) 人工脑脊液( p h7 4 ) n a c l k c l c a c l 2 2 h 2 0 4 0 3 9g 0 0 2 5g 2 5m l 2 4 2g 5 7 1m l 1 0 0 m 1 1 0 0 0m l o 0 5 0 0 5 3 6 3 0m m 5 5 0m g o 1 1 0m l 1 0 5 0m g 0 1 1 0m l 1 1 9m m 2 5m m 2 5m m 浙江人学硕l 学位论文 材料和方法 m g s 0 4 7 h 2 0 n a i l 2p 0 4 2 h 2 0 n a h c 0 3 d - g l u c o s e 1 2 ) 切片液( p h7 4 ) c h o l i n ec l k c l c a c l 2 。2 h 2 0 m g c l 2 4 h 2 0 n a i l 2p 0 4 2 h 2 0 n aa s c o r b a t e n ap y r u v a t e n a h c 0 3 d g l u c o s e 2 2 慢病毒载体的构建与鉴定 1 3m m 1m m 2 6 2m m 1 1m m 1 1 0 m m 2 5m m o 5m m 7m m 1 3m m 1 3m m 0 6 m m 2 5m m 2 0m m 2 2 1 慢病毒载体的构建 设计合成三对针对r a g l 的s h r n a ，分别命名为s h r n a l 、s h r n a 2 、s h r n a 3 ， 同时设计阴性n e g a t i v e ( 表1 ) 序列。合成的序列经退火- 9b a m hi 和x h oi 双酶 切的p r n a t u 6 2 l e n t i 连接，转化感受态大肠杆菌d h 5 0 t ，挑选阳性克隆摇菌， 抽取质粒，测序鉴定后，通过慢病毒载体系统进行包装。 用胰蛋白酶消化对数生长期的2 9 3 t 细胞，计数，当细胞密度为0 5 x 1 0 9 个l 时，重新接种于4 个2 5m 1 的1 5c n l 细胞培养皿中，3 7 、5 c 0 2 培养箱内培养 直至细胞密度达6 0 7 0 。每个培养皿中加入2 0p gp r n a t - u 6 2 l e n t i 、1 0g g p r s v r e v 、1 5l x gp m d l g p r r e 、7 51 t gp m d 2 g ，混合，并用无菌水定容至1 8m 1 ， 轻轻震荡。各培养皿中加入2 0 0m 2 5mc a c l 2 ，混匀，加入2m l0 0 2 mp b s ，室 温放置2 0 3 0m i n 。将d n a 磷酸钙混合液转移至含单层细胞的培养液中，混匀， 培养1 2h 。弃含有转染混合物的培养液，加入1 5m l0 0 1 mp b s ，轻摇后弃去，重 5 浙江人学顾 j 学位论文材料和方法 复3 次。每个培养皿中加入1 5m l 含1 0 0i u m l 青链霉素、1 0 f c s 的d m e m 培 养基，3 7 、5 c 0 2 培养箱培养7 2h 。收集培养细胞，4 40 0 0r m i n 离心 1 0m i n ，吸取上清，用0 4 5i x m 滤器过滤，将过滤的病毒上清液4 2 50 0 0r m i n 离心2 0m i n ，弃上清。用预冷的p b s 重悬沉淀，4 过夜。次日，以1 0 斗l 每管 分装，8 0 冰箱冻存备用。在含有81 t g m lp o l y b r e n e 的2 4 孔平板中用1 0 倍梯 度稀释的病毒转导5 x 1 0 4 个孑lh e l a 细胞。7 2h 后，用基因组d n a 纯化试剂盒提 取病毒转导的h e l a 细胞的基因组d n a ，采用r t - p c r 测定病毒转导单位滴度【1 2 , 1 3 1 。 表1 设计的s h r n a 靶序列及位点 2 2 2 原代海马神经元的培养与慢病毒感染 取孕1 8 天的s d 大鼠，o 5 戊巴比妥钠麻醉，打开腹腔，取出胎鼠，取脑， 剔除脑膜和血管，在预冷d h a n k s 液中分离出海马。用洁净玻璃试管研磨组织并 通过2 0 0 目的滤网，收集细胞悬液，4 l0 0 0r m i n 离心1 0m i n ，弃去上清液， 用含1 0 f c s 、1 青链霉素、1 l - g l u t a m i n e 的d m e m 培养液重悬，3 7 、5 c 0 2 培养箱中培养3h 。收集细胞悬液，4 10 0 0r m i n 离心1 0 m i n ，弃去上清液， 用含2 b 2 7 、1 青链霉素、1 l g l u t a m i n e 的n e u r o b a s a l 培养液重悬。接种于 1 x p o l y l y s i n e 包被的6 孔培养板以及有小圆玻片的2 4 孔培养板中，3 7 、5 c 0 2 培养箱中培养。细胞接种2 4h 后换全液，以后每隔2 天换半液，待细胞长到第7 天后，移除全部培养液，将含有病毒的培养液加入到培养板中，置于5 c 0 2 培 养箱中3 7 过夜培养。2 4h 后用新鲜的完全培养液取代含有病毒的旧液，仍然置 于5 c 0 2 培养箱中3 7 培养，9 6h 后收集细胞。 2 2 3 免疫荧光 吸干小圆玻片的2 4 孔培养板中的培养液，加入4 多聚甲醛，4 过夜；0 0 1 m 6 浙江人学硕l ：学位论文材料和方法 p b s 洗3 次，每次1 0m i n ；含二抗种属血清抗体封闭液，3 7 隔水式烤箱封闭 1 5h ；吸干封闭液，入兔抗n f m 抗体( 1 ：10 0 0 ) 4 过夜；p b s 洗3 次，每次 1 0m i n ；t r i t c 标记山羊抗兔二抗( 1 ：5 0 ) 3 7 温育1h ；p b s 洗3 次，每次1 0m i n ； 小鼠抗g f p 抗体( 1 ：5 0 0 ) 4 过夜；p b s 洗3 次，每次1 0m i n ；f i t c 标记山羊 抗小鼠二抗( 1 ：5 0 ) 3 7 温育1h ；p b s 洗3 次，每次1 0m i n ；用含1 h o e c h s t 3 3 3 4 2 的封片剂封片观察。 2 2 4 荧光定量p c r 2 2 4 1r n a 的提取 吸干6 孔培养板中的培养液，4 生理盐水洗1 次，吸干后每3 孔加入lm l t r i z o l ，将混合液转移至1 5m l 离心管中；加入o 2m l 氯仿，振荡1 5s ，静置2 m i n ； 4 1 2 0 0 0r m 离心1 5m i n ，取上清；加入o 5m l 异丙醇，将管中液体轻轻混匀， 室温静置1 0m i n ，4 1 2 0 0 0r p m 离心1 0m i n ；弃上清加入1m l7 5 乙醇，轻轻 洗涤沉淀4 7 5 0 0r m 离心5m i n ；弃上清晾干，加入d e p ch 2 04 0 “l 溶解，酶 标仪测定浓度。 2 2 4 2m r n a 的逆转录 在m i c r o t u b e 管中加入1p l1 0m md n t pm i x t u r e 、1 肛l2 5l x mo l i gd tp r i m e r 、 t e m p l a t e r n a 2 8p l ( 达到1 肛g 的r n a 量) ；在p c r 仪上进行变性、退火反应： 6 5 5 m i n ，4 ；离心数秒后，在m i c r o t u b e 管中加入4p l5 p r i m e s c r i p t t m b u f f e r , 0 5l x lr n a s e i n h i b i t o r 、0 5 肛1p r i m e s c r i p t t mr t a s e 、5p lr n a s ef r e ed d h 2 0 ，在p c r 仪上进行逆转录反应：4 2 3 0 r a i n ，9 5 5m i n ，4 。 2 2 4 3p c r 反应 取反转录得到的c d n a 各2 5 肛1 作为模板，分别以r a g lp r i m e rf r a g lp r i m e r r 、夕一a c t i np r i m e rf f l - a c t i np r i m e rr 为引物，引物由上海生工合成，序列如下： r a g lp r i m e rf ：5 一t t t c c g a a a g a a g g aa a a a a g a g t c - 3 ： r a g lp r i m e rr ：5 一g a c g g t g t g t g g g g g t g 3 ： f l - a c t i np r i m e rf ：5 - g a g a g g g a a a t c g t g c g t g a c 一3 ； p - a c a np r i m e rr ：5 c a t c t g c t g g a a g g t g g a c a 3 7 浙江人学硕，f ：学位论文材料和方法 模板( c d n a ) 2xs y b rg r e e nm i x p r i m e r f p r i m e r r d d h 2 0 总体积 p c r 条件如下： 5 0 9 5 2 5 肛l 2 5 肛l 1 0 9 l 1 0 p l 2 0 5 “l 5 0 “l 2m i n 1 0 m i n 9 5 1 5s 、 j 5 5 3 0s 蛆。个循环 7 2 3 0s j 反应结束后，对r n a 产物进行解离曲线分析，排除双峰解离曲线或异常扩 增曲线的可能性，然后从各组样品荧光定量p c r 动力学曲线中得出c t 值，与标 准曲线进行比较，计算出各组待测样品的r a g l 拷贝数来检测r a g lm r n a 水平。 2 2 5 免疫印迹 吸干6 孔培养板中的培养液，4 生理盐水洗1 次，吸干后每孔加入蛋白裂 解液1 0 0 “l ，裂解1 0m i n ，吸取裂解悬液，4 1 2 0 0 0r m 离心2 0m i n ，取上清， b r a d f o r d 比色法测定蛋白质浓度。取等量蛋白，加5 x s d sl o a d i n gb u f f e r 沸水浴变 性5m i n ，后进行s d s p a g e 电泳，9 0v ，2 0m i n ，直至所有样品压成一线，1 2 0v 1 0 0 m i n 。冰盒转膜，1 0 0 v ，1 2 0 m i n 。5 脱脂奶粉室温封闭6 0 m i n ；山羊抗r a g l ( 1 ：2 0 0 ) 、小鼠抗t u b u l i n ( 1 ：2 0 0 ) 4 温育过夜；t b s t 洗3 次，每次1 0 m i n ； h r p 标记兔抗山羊( 1 ：3 0 0 0 ，j a c k s o n ) 、h r p 标记兔抗小鼠( 1 ：3 0 0 0 ) 3 7 温育2 h ；t b s t 洗3 次，每次1 0m i n ；e c l a 液b 液，5m i n ；显影液3r a i n ；定影液3m i n ； 拍照。 2 3 在体干扰模型的建立 8 2 3 1 慢病毒载体的脑立体定位注射 采用戊巴比妥钠5 0m g k g 的剂量对大鼠进行腹腔注射麻醉，将大鼠固定于 脑立体定位仪上，切开头皮，暴露前囱，根据p a x i n o sa n dw a t s o n 大鼠脑图谱在 b r e g m a ( - 43 ，2 5 ，3 0 ) 位置双侧打孔( 图1 ) ，然后将重组慢病毒载体用微量注 射器各注射1 , t t l ，对照组各注射i , u l 将不合干扰片段的病毒载体，并留针1 0m i n 。 后缓慢逗出进样针，缝合头皮，手术完毕后给予保温措施直至动物能够自主行动。 盖蛔j 璺病毒鼗体窄镝爵蕴体 ii l 渤韵 唼验组 对 i 【组 圉i 慢病毒载体注射图 2 3 2 组织固定、取材与切片 对大鼠进行腹腔注射麻醉，打开胸腔自左心室插入静脉套管至升主动脉，切 开右心耳，快速灌注4 生理盐水3 0 0 m l 左右，待流出的血液变清时，换用4 多 聚甲醛约5 0 0 m l 先快后慢灌注固定约3 0 m i n ，而后取完整大脑组织。大脑取出后 入4 0 0 4 ；聚甲醛4 过夜，后秽入3 0 蔗糖溶液，4 放置待组织块下沉。修整脑 块，o c t 包埋，冰冻连续切片，片厚2 0p m 。 2 3 3 免疫组化 冰冻切片3 7 烘烤3 0 m i n ；o0 1 mp b s 洗3 次；封片剂封片，显微镜观察。 当g f p 表达强度不够时，进行g f p 抗体免疫荧光增强发光。冰冻切片3 7 烘烤 3 0 m i n ；p b s 洗3 次，每次5 m i n ；含z - 抗种属血清抗体封闭液，4 封闭过夜； 浙江大学顾i ：学位论文材料和方法 小鼠抗g f p 抗体( 1 ：5 0 0 ) 4 7 2h ；0 0 1mp b s 洗3 次，每次5m i n ；f i t c 标记 山羊抗小鼠( 1 ：5 0 ) ；p b s 洗3 次，每次5 m i n ；封片剂封片，显微镜观察。 2 3 4 尼氏染色 冰冻切片3 7 烘烤3 0m i n ，1 0 0 l 醇3m i n ，9 5 乙醇3m i n ，7 0 乙醇3m i n ， 超纯水清洗3 次，o 1 焦油紫( p h3 0 ) 3 7 浸染染色5m i n ；超纯水洗涤3 次；7 0 乙醇6 0s ；9 5 l 醇6 0s ，1 0 0 l 醇6 0s ，分色液( 同比例的乙醇+ 乙醚+ 氯仿) 中分色 2 0s ；1 0 0 乙醇5m i n3 次，二甲苯5m i n3 次，中性树胶封片。镜检尼氏体呈紫色， 细胞核呈淡紫色，胶质细胞呈淡紫色。 2 3 5r t _ p c r 分别取3 只注射病毒后7d 、1 4d 、2 8d 的大鼠脱颈处死，快速取出海马，并 切取注射病毒区域范围组织，液氮冷冻。将组织在液氮中研磨直至成粉末状，加 入1m lt r i z o l 。t r i z o l 法提取r n a 和逆转录同方法2 2 4 1 和2 2 4 2 。 2 3 5 1p c r 反应 取反转录得到的c d n a 各2p 1 作为模板，分别以r a g lp r i m e rf r a g lp r i m e r r 、f l - a c t i np r i m e rf f l - a c t i np r i m e rr 为引物。 p c r 反应体系如下 模板( c d n a ) 10 x b u f f e r m g c l 2 t a q ( 2 5 u i x l ) d n t pm i x t u r e ( 2 5 m m ) p r i m e r f p r i m e r r d d h 2 0 2 0 i x l 2 0i x l 1 0 “l 0 5 “l 0 5 “l 0 5p l 0 5i x l 1 3 肛l 总体积 p c r 条件如下： 1 0 2 0u l 浙江人学顾 ：学位论文材料和方法 9 4 9 4 5 5 7 2 7 2 4 2 3 5 2 琼脂糖凝胶电泳检测 称取琼脂糖4 5 0m g 溶入3 0m l 的t a e 缓冲液，微波炉加热煮沸，待冷却至 6 0 时加入核酸染料，制成1 5 的胶。后将2l x l6 x l o a d i n gb u f f e r 和p c r 产物 l op l 混匀后上样，1 0 0 v3 0m i n ，凝胶成像系统紫外光下观察拍照。r a g l 长度约 为2 1 0b p ，f l - a c t i n 长度约为4 5 2b p 。 2 4 水迷宫与场电位 2 4 1m o r r i s 水迷官 实验分c o n t r o l 组、n e g a t i v e 组、e x p e r i m e n t a l 组，每组各l o 只。本实验所 用的m o r r i s 水迷宫图像采集和数据分析采用a n y - m a z ev i d e ot r a c k i n gs y s t e m 。 大鼠训练：第1d ，拿去平台，让每只大鼠自由游泳1 2 0s ，再放回平台，让每只 大鼠在平台上3 0s 。定位航行试验：历时4d ，第2 5d ，将大鼠头朝迷宫壁放入 水中，同时开始计时，当大鼠找到平台，爬上平台时，停止计时，若大鼠在1 2 0 s 内未找到平台，需将其引导至平台，该次潜伏期自动计为1 2 0s ，每天各训练4 个 象限。空间搜索试验：第6d ，在定位航行试验后去除平台，然后任选一个入水 点将大鼠头朝迷宫壁放入水池中，记录其在6 0s 内穿台次数，考察大鼠对原平台 的记忆。 2 4 2 离体脑片l 1 m 检测 2 4 2 1 脑片的制备 对大鼠进行腹腔注射麻醉，用4 的人工脑脊液( a c s f ) 进行心脏匀速灌流， 带流出血液变清时，快速取出大脑，放入冰冻切片液中，根据海马所在位置对脑 块进行分割。振动切片机切成4 0 0l x r n 厚的脑片，2 6 。c a c s f 进行孵育1 5 2h 。 浙江人学硕 ：学位论文材料和方法 2 4 2 2 场电位记录 将孵育好的脑片转移到记录槽中，并用铂金丝网压住，置于o l y m p u sb x 5 0 显微镜载物台上。在2 0 水镜下通过c c d 进行观察，并挑选神经元胞体饱满均 匀、边界清晰、树突纹理清晰的脑片。在循环灌流的a c s f 中加入lm l1 0i x m b i c u c u l l i n e 以阻断抑制性突触传递。刺激电极置于辐射层中距c a l 区胞体层约1 0 0 l a m 处，记录电极放在放射层的树突区，离胞体5 0 1 0 0 肛m 。记录前，试探在相同 的刺激强度下( 2 0 3 0 “a ) 找到能记录到的最大的反应，然后调节刺激强度，使 场电位大小为最大反应的2 0 3 0 ，固定刺激强度，进行记录。所采用的放大器为 a x o p a t c h7 0 0 b ，数据采集接口为d i g i d a t a l 3 2 0 a ，记录软件为p c l a m p 8 2 ，外部刺 激由m a s t e r - 8 刺激器输出，经过隔离器传至刺激电极。 2 5 统计学分析 数值以均数4 - 标准差( 蔗姆) 表示，多组之间采用s p s s l 6 0 统计软件进行单 因素方差分析，两组间比较采用t 检验。 1 2 m 学硕i 学位论女# * 3 结果 3 1 慢病毒载体的构建与鉴定结果 3 1 1 重组质粒$ 4 序结果 剥序结果( 图2 ) 显示，n e g a t i v e 、s h r n a 、s h r n a 2 、s h r n a 3 均为鉴定正确 的阳性克隆。 b 山蝴舭舳抵 l iwmi 02 i o o c - _ 三坚三丛三l 坐三坐上u 上丛三坐三坚三三坐坐 d 圉24 对慢病毒质粒的剥序