（临床兽医学专业论文）抗草甘膦转基因豆粕pcr检测方法的建立.pdf

青岛农业人学硕士学位论文 摘要 抗草甘膦转基因豆粕p c r 检测 方法的建立 摘要 草甘膦是一种有机磷类除草剂，通过基因工程手段在常规大豆品种中导入抗除草剂 基因后获得的大豆加工而成的豆粕就是抗草甘膦转基因大豆豆粕本研究以抗草甘膦转 基因豆粕为试验材料，进行检测方法研究。目的是为制定转基因豆粕的检测规程提供依 据，为我国转基因产品管理制度的建立与实施提供可行的检测方法。本文通过对四种基 因的检测，初步建立了转基因豆粕的检测方法，获得的结果如下： 1 对转基因豆粕中的l e c t i n 基因，c a m v 3 5 s 基因，n o s 基因以及c p 4 - e p s p s 基因 进行p c r 反应，经对退火温度和d n t p 浓度条件优化，结果最佳条件下扩增出目的基因 片断，分别将它们克隆后进行序列测定，并对c a m v 3 5 s 基因和n o s 基因进行了酶切鉴 定。结果证明目的基因扩增正确。 2 根据已发表序列，将内源基因分别与c a m v 3 5 s 基因，n o s 基因和c p 4 e p s p s 基因进行多重p c r 扩增，并对它们的退火温度和引物比例进行条件优化，确定l e c t i n 与c a m v 3 3 5 s ，n o s 和c p 4 e p s p s 的多重p c r 反应退火温度和引物不对称比例分另0 分 别为6 1 ，5 8 ，5 8 和5 ：1 ，1 ：1 ，1 ：1 。结果证明多重p c r 能同时扩增出多条目 的条带，快速经济，适合大面积推广 3 在此基础上，针对c a m v 3 5 s 基因和n o s 基因设计引物和探针，对扩增产物作杂 交检测。试验结果表明：包被液e d c 的浓度在5 1 5 m m o l l 之间d n a 结合量变化不大； 上下游引物比例8 ：1 时适合e l i s a 检测同时适合电泳检测；液相产物和固相产物的杂 交时间分别为4 0 m i n 和6 0 m i n ；变性时间1 0 m i n 。加入标准对照后则可以使转基因产品 不仅能定性检测而且可以定量检测。 关键词：转基因豆粕；多重p c r ；p c r e l i s a ；杂交 青岛农业大学硕十学位论文 a b s t r a c t e s t a b l i s h m e n to fd e t e c t i o nm e t h o d s m o d i f i e db e a nm e a li k s i s t a n tt o o f g e n e t i c a l l y g l y p h o s a t e a b s t r a c t g l y p h o s a t ei sak i n do fo r g a n o p h o s p h o r o u sh e r b i c i d e s t h ep u r p o s eo ft h i ss t u d yi st oe s t a b l i s hg m c d c t e c t i o nm e t h o d su s i n gp c rb a s e dt e c h n o l o g y t h er e s u l t sa l eo b t a i n e da sf o l l o w s ： 1t h ea n n e a l i n gt e m p e r a t u r ea n dd n t pc o n c e n t r a t i o no f i _ e c t i n ，c a m v 3 5 s ，n o sa n dc p 4 一e p s p sg e n e s i ng e n e t i c a l l ym o d i f i e db e a nm e a lw d l eo p t i m i z e d u n d e rt h eo p t i m a lc o n d i t i o n ，g e n es e g m e n t sw e r e a m p l i f i e d a f t e rs e q u e n c ed e t e r m i n a t i o n , r e s t r i c t i v ea n a l y s i so fc a m v 3 5 sa n dn o sg e n e sw m c o n d u c t e d r e s u l t ss h o w e dt h a to b j e c t i v ef r a g m e n t sa p p e a r r e d 2 a c c o r d i n gt op u b l i s h e df f a g m e n 招m u l t i p l xp c ro fl e c t i nw i mc a m v 3 5 s n o sa n de p s p sg e n e s w e r ec o n d u c t e d r e s u l t ss h o wt h a tt h ea n n e a l i n gt e m p e r a t u r eo f l e c t i ng e n ew i t hc a m v 3 5 s n o sa n d e p s p s g e n e ss h o u l d b e6 1 ，5 8 。c a n d5 8 c a n d t h e p r i m e r p r o p o r t i o ns h o u l d b c5 ：1 ，1 ：1 a n d l ： 1 t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a ti tc a ns w i f t l ya n de c o n o m i c a l l ya m p l i f yt h et a r g e tf r a g m e n t s i ti ss u i t a b l e f o rl a r g e - s c a l ee x t e n s i o n ，b u tn o tf o rq u a n t i t a t i v et e s t s 3a f t e rt h ep r i m e ra n dp r o b eo fc a m v 3 5 sa n dn o sg e n e sw e r ed e s i g n e da n ds e l e c t e d ，h y b r i d i z a t i o n w e r ec o n d u c t e d t h er e s u l t ss h o wt h a tn oo b v i o u sc h a n g e sa r ef o u n di ne d cc o n c e n t r a t i o nb e t w e e n5 m m o l l a n d1 5 r e t o o l l ；w h e n t h e p r o p o r t i o n o f f o r m e r p r i m e r a n d l a t e r p r i m e r i s8 ：1 ，t h e b e t t e rr e s u l t s o fe l i s aa n dg e le l e c t r o p h o r e s i sc a nb eo b t a i n e d ；h y b r i d i z a t i o nt i m eo fl i q u i dp h a s ep r o d u c t sa n d s o l i dp h a s ep r o d u c t si s4 0m i na n d6 0m i n ；t h ed e n a t u r a t i o nt i m ei s1 0m i n t h i sm e t h o dc a l lb eu s e d b o t hi nq u a l i t a t i v ea n dq u a n t i t a t i v ed e t e c t i o no f g m o k e yw o r d s ：g mb e a nm e a l ；m u l t i p l e xp c r ；p c r - e l i s a ；h y b r i d i z a t i o n 青岛农业大学硕士学位论文a b s t r a c t l m o g m o g m c g r r 大豆 b t e p s p s e l i s a p c r d n a c 副v 3 5 s n o s c t a b d n l l p d a 皿 d c t p d g l l p d u t p b p e d c c 口 p n p p b s a a p d d h 2 0 s s c l i v i n gm o d i f i e do r g a n i s m g e n e t i c a l l ym o d i f i e do r g a n i s m g e n e t i c a l l ym o d i f i e dc r o p g e n e t i c a l l ym o d i f i e df o o d r o u n d u pr e a d ys o y b e l l b a c i l l u st h u h n g i e n s i s 5 - e n o l p y r u v y l s h i k i m a t e 一3 - p h o s p h a t e s y n t h a s e e n z y m el i n k e di m m u n o s o r b e n ta s s a y p o l y m c r a s ec h a i nr e a c t i o n d e o x y r i b o n u c l e i ca c i d 3 5 sp r o m o t e rf r o mc a u l i f l o w e rm o s a i c v i r u g t e r m i n a t o ro f n o p a l i n es y n t h a s eg e n e f r o ma g r o b a c t e r i u mt u m e f a c i e n s c e t y lt r i m e t h y l a m m o n i u mb r o m i d e d e o x y r i b o n u c l e o s i d et n i p h o s p h a t e d e o x y a d e n o s i n et r i p h o s p h a t e d e o x y c y t i d i n et r i p h o s p h a t e d e o x y g u a n o s i n et r i p h o s p h a t e d e o x y u r i d i n et r i p h o s p h a t e b a s ep a i r e t h y l - 3 c a r b o d i i m i d e a l k a l i n ep h o s p h a t a s e ，c a l fi n t e s t i n a l p n i t r o p h e n y lp h o s p h a t e b o v i n es e r u ma l b u m i n a l k a l i n ep h o s p h a t a s e d o u b l ed i s t i l l e dw a t e r s t a n d a r ds a l i n ec i t r a t e 转基因活性生物 转基因生物 转基因农作物 转基因食品 抗除草剂转基因大豆 苏云金芽孢杆菌 5 一烯醇丙酮酸莽草酸一3 一磷酸 合成酶 酶联免疫吸附测定 聚合酶链式反应 脱氧核糖核酸 花椰菜花叶病毒3 5 s 启动子 来源于农杆菌的胭脂碱合成酶 基因终止子 十六烷基三甲基溴化铵 脱氧核苷三磷酸 脱氧腺苷三磷酸 脱氧胞苷三磷酸 脱氧鸟苷三磷酸 脱氧尿苷三磷酸 碱基对 碳二亚胺 小牛肠碱性磷酸酶 对硝基苯磷酸 小牛血清蛋白 碱性磷酸酶标记的链霉亲和素 无菌双蒸水 标准柠檬酸钠盐 学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表 或撰写过的研究成果。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了 明确的说明并表示谢意。如不实，本人负全部责任。 学位论文作者躲孜娜 签字日期：擗f 月2 细 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国 家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权学校可 以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描 等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：魂印 签字日期：勿。7 年月二f 日 导师签字 签字日期：咿b 月彳日 青岛农业人学硕十学位论文 文献综述 文献综述 转基因技术，通俗地说，就是指与那些传统的遗传育种技术不同的，能克服自然生 育繁殖障碍的核酸重组、细胞融合等现代生物技术。通过转基因技术，很容易将一种生 物的遗传物质转移到其它生物之中，从而产生新的功能或性状，或者使某种生物丧失某 些特性卜2 1 ，利用这种技术生产出的生物叫做转基因活性生物( l m o ，l i v i n gm o d i f i e d o r g a n i s m ) ，又叫转基因生物( g m o ，g e n e t i c a l l ym o d i f i e do r g a n i s m ) 。目前g m o 一般也 包括转基因生物和转基因生物加工出来的产品，从转基因产品纯化出的不含遗传物质的 新加工产品是否还算是转基因产品，目前在国际上还有争论【3 捌。自1 9 8 6 年美国和法国 的科学家在世界上进行了第一次抗除草剂转基因烟草的田间试验后，植物转基因的研究 与应用在世界各地蓬勃发展，被认为是二十世纪农业的希望，是新的农业科技革命的 重要组成部分【6 o l 。 1 全球转基因作物发展概况 1 1 转基因作物种植面积 表1 全球转基因作物面积1 1 3 - 1 6 i ( 1 9 9 6 - 2 0 0 6 ) t a b l e lg l o b a lt r a n s g e n i ec r o pa r e a s ( 1 9 9 6 - 2 0 0 6 ) 2 0 0 5 年全球转基因作物种植面积估计为9 0 0 0 万公顷( 见表1 ) ，2 0 0 6 年全球转基因 青岛农业人学硕十学位论文文献综述 作物种植面积比2 0 0 5 年增加了1 3 ，首次突破1 亿公顷，达到1 0 2 亿公顷。据墨西司 科学家提供的数字，近l o 年来全球转基因作物种植面积增加了约5 0 倍，从1 9 9 6 年塌 初的1 7 0 万公顷猛增到2 0 0 5 年的近9 0 0 0 万公顷【“】。这种发展速度反映出，无论是发达 国家还是发展中国家，农民对转基因技术这种高新技术的接受程度是很高的。其中，美 国仍保持领先地位，但发展中国家势头强劲，种植面积以相当于发达国家三倍的速度翅 速增长。据国际农业生物技术应用服务组织( i s a a a ) 预测，到2 0 1 5 年，将有约4 0 个国 家的2 0 0 0 万以上的农民种植2 亿公顷转基因作物。中国今后农业生物技术的发展将面 对更大的挑战，今后的发展走向更为世人所关注【l2 1 。 1 2 转基因作物在发达国家和发展中国家的分布 白1 9 9 6 年以来，累计高达8 5 的转基因作物在发达国家种植，而发展中国家种植 的转基因作物占全球转基因作物面积的比例也在持续增长。2 0 0 6 年己批准的转基因作物 的种植面积是1 0 2 亿公顷，分布在2 2 个国家，比去年增加了1 3 。2 0 0 6 年，超过9 0 即9 3 0 多万转基因作物种植户都是发展中国家资源匮乏的小型农户，发展中国家的转基 因作物增长率为2 1 ，远远高于工业化国家9 的增长率。美国、阿根廷、巴西、加拿 大、中国、西班牙、印度、墨西哥、罗马尼亚、南非和乌拉圭等国转基因作物的总种植 面积超过8 9 0 0 万公顷。 如今，发展中国家占全球转基因作物种植国家总数的4 0 。主要的增长中心有以下 几个大洲： 美洲：美国继续推进转基因作物在北美乃至全球的增长，在2 0 0 6 年取得了最高的 绝对面积增长率，种植面积增加了4 8 0 万公顷。南美增长最快的国家是巴西，增长率达 2 2 ，共有1 1 5 0 万公顷大豆和棉花采用了转基因技术，并且转基因棉花在2 0 0 6 年首次 实现了商业化。 亚洲：印度正在成为亚洲的一个主要领先国。该国取得了全球最高增长率，达1 9 2 ， 即2 5 0 万公顷，总面积达到了3 8 0 万公顷，在全球排名中跃升了两个档次，成为了全球 第五大转基因作物种植国，首次超过了中国。 非洲：南非2 0 0 5 年的种植面积是5 0 万公顷，2 0 0 6 年增加到了1 4 0 万公顷。在非洲 大陆首屈一指。增长最快的是主要用做食物的转基因白玉米和用作牲畜饲料的转基因黄 玉米。 欧洲：欧盟成员国也在继续增加转基因作物的种植面积，其中斯洛伐克成为2 5 个 成员国中第6 个种植转基因作物的国家。西班牙依然在欧洲大陆处于领先地位，2 0 0 6 年的种植面积达6 万公顷；根据报告，欧盟其他五个成员国的种植面积增长了五倍，从 2 青岛农业人学硕十学位论文文献综述 2 0 0 5 年的1 , 5 0 0 公顷增长到了2 0 0 6 年的约8 , 5 0 0 公顷。 2 0 0 5 年，2 1 个种植转基因作物的国家包括1 1 个发展中国家和1 0 个工业化国家。 按种植面积的大小顺序排列，它们分别是美国、阿根廷、巴西、加拿大、中国、巴拉圭、 印度、南非、乌拉圭、澳大利亚、墨西哥、罗马尼亚、菲律宾、西班牙、哥伦比亚、伊 朗、浃都拉斯、葡萄牙、德国、法国和捷克共和国【1 2 , t 7 - 2 3 】。 图12 0 0 5 年世界转基因作物种植国家分布i “3 i f i g 1t h ep l a n t i n gs t a t u so fg m o i nt h ew o r l d ( 2 0 0 5 ) 1 2 1 转基因作物的种类 全球进行商业化种植的转基因作物包括大豆、玉米、棉花、油菜、土豆、烟草、番 茄、南瓜和木瓜等。其中，前四种转基因作物占主导地位。 1 9 9 2 年中国成为第一个转基因烟草商业化的国家，1 9 0 4 年种植面积达到了1 0 0 万 公顷。后来我国又先后培育出转基因抗虫水稻，抗病和延迟成熟的转基因番茄，抗病转 基因甜椒，转b t 抗虫玉米和高赖氨酸玉米等等，其中番茄、棉花、甜椒、矮牵牛已经 进入商业化，中国本地培育的抗环斑病毒番木瓜也在2 0 0 6 年末实现了商业化。 2 0 0 6 年，一种新型的转基因作物抗除草剂苜蓿在美国实现商业化。抗除草剂 r r 苜蓿是首个多年生的商业化转基因作物，种植面积已达8 万公顷，占2 0 0 6 年美国 1 3 0 万公顷苜蓿总面积的5 。r rf l e x 抗除草剂棉花也于2 0 0 6 年推出，第一年的种植 面积就已经达到8 0 万公顷以上，包括单一特性品种及兼有抗虫特性的复合性状品种。 青岛农业人学硕十学位论文文献综述 这些作物主要种植于美国，少量种植于澳大利亚【1 2 , 2 4 - 2 6 。 图2 生物技术作物的全球分布( 1 9 9 6 2 0 0 5 ) 1 2 2 - 2 3 1 f i g 2d i s t h b u f i o no fg mc r o p si nt h ew o r l d ( 1 9 9 6 - 2 0 0 5 ) 1 2 2 转基因作物的性状分布 从性能上区别，转基因作物分为四类：一是可抵御害虫侵害、减少杀虫剂使用的作 物；二是抗除草剂作物；三是抗疾病作物；四是营养增强性作物。在过去的1 0 年里， 抗除草剂一直是商业化转基因作物主要的性状，其次是抗虫性以及含这两种基因的复合 性状。2 0 0 6 年全球抗除草剂作物大豆、玉米、油菜和苜蓿的种植面积( 6 ，9 9 0 万公顷) 占 全球转基因作物总面积( 1 0 2 亿公顷) 的6 8 ；1 ，3 1 0 万公顷( 1 3 ) 种植了兼备抗虫 和抗除草剂特性的复合性状作物。抗虫性状的转基因作物( 全球共1 2 2 0 万公顷) 占全球转 基因作物面积的1 8 ；抗虫兼抗除草剂的作物占全球转基因作物总面积的8 。值得注 意的是，从2 0 0 2 年到2 0 0 3 年，抗除草剂兼抗虫的转基因作物的种植面积都有所增加， 从2 0 0 2 年的4 4 0 万公顷增加到5 8 0 万公顷，并且全球转基因作物市场上多抗性状基因作 物面积增长的趋势将会持续下去1 1 2 - 2 7 。 1 2 3 全球转基因大豆、玉米、棉花、油菜的种植情况 商品化的主要转基因作物有大豆、棉花、油菜、玉米四类，主要用于生产动物饲料、 炼制植物油、制药等【2 ”，其中大豆已被广泛用于食品生产。全球4 种主要转基因作物的 4 青岛农业人学硕十学位论文 文献综述 商业化面积和比例见表2 【1 1 - 1 2 , t s l 。 裹21 a 9 6 - 2 t ) 0 6 年全球四种主要转基因作物的种植面积( 单位l 百万公顷) t a b l e 21 9 9 6 - 2 0 0 6c u l t i v a t e da 瑚o ff o u rm a j a rg mc r o p s ( u n i t ：m i l l o nh e c t a r o ) 转萆斟人豆转基i h 玉米转基棉化 转基w 油菜转基州作 芷 面 i ( t g m ) 面t 畸( t g m )面占( t g m )面 r 叶( t g m )物总面积 份积积积 积 ( t g m ) 1 9 9 60 - 52 9 40 31 7 60 ，84 7 1o 15 91 7 1 9 9 75 14 6 43 22 9 l1 41 2 71 2l o9】10 1 9 9 81 4 55 2 28 32 9 92 59 02 48 62 7 8 1 9 9 92 1 65 4 1i ll2 783 79 33 48 53 99 2 0 0 02 5 8 5 8 41 032 3 3s 31 2 02 8634 4 2 2 0 0 l3 3 36 3 _ 398 1 86 6 81 2 9 2 75 l5 26 2 0 0 23 6 55 2 21 2 4 2 1 16 81 1 63 o5 ，l5 8 7 2 0 0 3 4 1 46 1 21 5 52 2 97 21 0 63 65 36 7 7 2 0 0 44 8 46 0 01 932 3o9 01 1 04 3 6 o 7 2 0 2 0 0 55 4 46 0 o2 1 2 2 409 81 1 _ 04 650 2 0 0 65 9 65 7 02 5 2 2 5 01 3 4】2 ，94 85 0 1 3 全球转基因大豆生产现状 图3 全球转基因大豆和转基园作物种植面积( 2 0 0 1 - 2 0 0 6 ) 1 1 1 - 1 2 t s i f i g 3t h ew o r l dt r a n s g e n i cs o y b e a n sa n dc r o p sp l a n t a t i o na r e a ( 2 0 0 1 - 2 0 0 6 ) 转基因大豆自1 9 9 4 年获准推广以来，种植而积一直居于转基因作物之首，表明农 艺性状发生改变的转基因大豆己经成为最常见的大规模商业化生产和流通的转基因作 物。l 9 9 7 年，转基因大豆种植面积为5 1 0 万公顷，2 0 0 2 年增加到3 6 5 0 万公顷，2 0 0 6 年，转基因大豆依然是最主要的转基因作物，达5 ，8 6 0 万公顷，占全球转基因作物总种 5 青岛农业大学硕十学位论文文献综述 植面积的5 7 。然而，转基因大豆种植存在着地区的不均衡性。美国是全球最大的大豆 生产国，1 9 9 6 年抗除草剂转基因大豆种植面积仅为5 0 万公顷，1 9 9 9 年增加到1 6 2 0 万 公顷，占全美大豆种植总面积的5 5 ，2 0 0 2 年已上升到7 4 。阿根廷继美国之后，1 9 9 8 年转基因大豆种植面积就已超过本国大豆种植总面积的6 0 ，2 0 0 2 年接近1 0 0 。近几 年来，中国g m c 虽然发展极其迅速，但是仍无大宗转基因粮油作物包括转基因大豆进 入商业化生产 2 8 - 3 3 】。 1 4 中国转基因大豆进口概况 当前，我国转基因产品的焦点主要集中在转基因大豆进口方面。我国是大豆原产国， 同时又是大豆生产大国、消费大国、加工大国和种植资源大国。但是我国进口大豆主要 为转基因大豆，还有大量的转基因豆油、豆粕等加工品和副产品。国内大豆市场中转基 因大豆的流通量已经接近或超过非转基因大豆，进口转基因大豆对国产大豆的冲击加 大，使我国大豆产业形势非常严峻。自2 0 0 0 年进口转基因大豆每年超过2 亿吨，主要 从美国、阿根廷和巴西进口。这些进口的转基因大豆主要用于大豆油、豆粕等加工品【3 4 1 。 1 5 草甘膦分子特性 草甘膦( g l y p h o s a t e ) 学名n - p h o s p h o n o m e t h y l - g l y c i n e ，化学式为：h 0 2 c c h 2 n h c h 2 p 0 3 h 2 ， 是一种施用于叶片的广谱、非选择性有机磷类除草剂，对于许多一年生和多年生杂草控 制能力很强，且杂草不易产生耐药性。因为草甘膦很容易被土壤微生物代谢，分解为氨 基甲基磷酸，形成c 0 2 和无机磷终产物，所以它在土壤中不具有活性。在动物体内，草 甘膦可通过肾脏迅速降解，它对动物没有毒性。草甘膦对环境也较为安全，实验室尚未 发现其有致癌、致畸和致突变等潜在危害。由于具有优异的性能，草甘膦已成为全球用 量最大的除草剂，2 0 0 4 年的消费量接近4 0 万吨。 从1 9 9 6 至2 0 0 5 的第一个十年间，耐除草剂一直是最重要的转基因作物特性。抗 草甘膦的转基因作物具有单位除草费用低、除草操作方便快捷、免耕除草等特点，因而 自1 9 9 6 年种植转基因作物以来，种植面积保持快速增长。2 0 0 5 年，转基因技术作物全 球种植面积达9 0 0 0 万公顷，其中耐除草剂的大豆、玉米和油菜占7 1 ( 6 3 7 0 万公顷) ， 耐除草剂作物的增长率为9 。目前，美国、欧盟、巴西、阿根廷是草甘膦需求最大的 地区，而东南亚是近年来发展最快的草甘膦区域市场，据最新预测，全球2 0 1 0 年草甘 膦的需求量将达到1 0 0 万吨，这意味着草甘膦市场还有很大的成长空剐3 5 4 。 1 6 抗草甘膦转基因大豆 草甘膦是农药中最为安全的一种，其毒性无论是按世界卫生组织( w h o ) 或美国环保 6 青岛农业大学硕士学位论文文献综述 署( ( e p ：a ) 标准都划在m 级，即低毒类，但是它对植物没有选择性，几乎所有绿色植物， 不论是作物还是杂草都能被其杀死。草甘膦的杀草原理是抑制植物、细菌和真菌必需氨 基酸生物合成途径中的酶活性，它特异性地结合并抑制植物莽草酸酯合成途径中的5 烯醇丙酮酸莽草酸3 磷酸合成酶( 5 - e n o l p y r u v y l s h i k i m a t e - 3 - p h o s p h a t es y n t h a s e e p s p s ) 。 e p s p s 是芳香族氨基酸合成途径中的一个关键酶，它可逆地催化莽草酸3 磷酸和磷酸烯 醇丙酮酸缩合成e p s p ( 5 一e n o l p y r u v y l s h i k i m a t e 3 - p h o s p h a t e ) 和磷。草甘膦能阻抑e p s p s 的 合成，以芳香族氮基酸为底物的一些蛋白质和次生代谢物的合成由此受到抑制，从而表 现出毒杀作用。 美国孟山都公司通过基因工程手段在常规大豆品种中导入了抗除草剂e p s p s 基因， 研制出抗草甘膦转基因大豆，商品名为r r ( r o u n d u pr e a d y ) 大豆。导入的外源基因能在 大豆中高效表达出e p s p s ，因此，在田间施用除草剂草甘瞵时，大豆组织中芳香族氨基 酸的生物合成因e p s p s 存在而未受影响，但是杂草中芳香族氨基酸的生物合成途径由 于e p s p s 的合成受到阻碍而隔断，从而使大豆表现出对草甘膦的高度耐受性，即杂草 被毒杀而大豆组织正常生长【4 3 掣】。 2 转基因产品的安全性问题 “生物安全”这一概念首先于1 9 7 5 年2 月在美国加利福尼亚卅i 阿西罗玛( a s i l o m a r ) 举行的一次国际会议上提出，这标志着人类开始正式关注转基因生物的安全性问题。生 物安全涉及生物多样性、生态环境、现代生物技术的开发和应用，农业生物安全及人体 健康等方面。 2 1 过敏原性 图42 0 0 1 决定树方案1 2 6 i f i g 4f a o w h o 2 0 0 1d e c i s i o nt r e e 7 青岛农业人学硕十学位论文 文献综述 转入巴西坚果储藏蛋白2 s 清蛋白的转基因大豆，经证明与巴西坚果含有同样的过 敏原性，这就是著名的巴西坚果事件。c h a t e l 等( 1 9 9 6 ) 也报道，大肠杆菌表达的重组 牛蛋白有同样的免疫原性和过敏特性。针对这些情况，1 9 9 6 年国际食品生物技术委员会 与国际生命科学研究所过敏与免疫研究所( i f b c i l s i ) 提出决定树方案，用于评价转 基因食品中新的基因产物( 蛋白) 的潜在过敏性】。 2 2 毒性成分的影响 食品中的主要毒性物质较多，如油菜中的e r u c i ca c i d 、g l u c o s i n o l a t e s ，马铃薯中的 龙葵碱，番茄中的茄碱等。这些食品人类食入后容易引起中毒，在动物这些食品大多没 有经过加工，直接食入，所以更容易中毒。因此对转基因产品，要考虑外源蛋白的背景。 尽管到目前为止还没有有说服力的研究报告表明转基因食品有毒，但一些研究学者认为， 对于基因的提炼和添加，有可能产生或积累食物中原有的微量毒裂4 卯。 2 3 对人和动物健康的影响 外来基因可能会以一种人们目前还不甚了解的方式破坏食物中的营养成分，使得转 基因产品中的主要营养成分、微量营养成分以及抗营养因子的变化会降低食品的营养价 值，导致营养结构失衡。英国伦理与毒性中心的报告指出，与天然大豆相比，在耐除草 剂的转基因大豆中，具有防癌功能的异黄酮减少了，这意味着大豆营养质量下降了【4 5 舶j 。 有的转基因产品中含有的蛋白质从来就不是人类食物的成分。这些异种蛋白有可能 引起食物过敏，特别是对儿童和过敏体质的成人【4 ”。据报道，美国a v e n t i sc r o ps c i e n c e 公司研制的一种转基因抗虫玉米“星联”中含有一种c r y9 c 的蛋白质可能会引起部分人 皮疹、腹泻及呼吸系统的过敏反应并且还具有潜伏效应。虽然美国政府规定其产物只能 作为动物饲料，不能用作人类食品，但是后来在商店货架上的炸玉米粉卷壳和其它谷物 食品中检测到含有微量的“星联”玉米，随之掀起轩然大波【鹌1 。而且这种玉米饲喂动物 后c r y 9 c 会不会通过人类进食了动物产品而进入人体内也尚未可知。 3 转基因作物检测技术及进展 世界上曾经发生多起涉及转基因安全的事件，如p u s z t a i 事件、斑蝶( m o n a r c h b u r e r f l y ) 事件、巴西坚果事件等。转基因生物的安全性问题已成为全球争论的焦点之一，这就需 要我们对转基因产品有一个可靠的、实用的检测方法 4 9 - 5 1 】。 3 1 转基因产品的核酸检测技术 核酸检测最常用的是p c r 法，适用于原料及经过加工的食品与饲料。p c r 技术的 青岛农业人学硕十学位论文 文献综述 发展十分迅速，目前已形成多种p c r 衍生技术，如重组p c r 、原位p c r 、固着p c r 等 【5 2 1 。聚合酶链式反应检测方法包括定性聚合酶链式反应和定量聚合酶链式反应两种方 法。下面介绍常见的几种。 3 1 1 核酸分子定性检测技术 定性聚合酶链式反应是定性检测调控基因或目的基因的存在来显示转基因成分的 存在。它包括以下几种方法： 常规p c r 技术：p c r 包括三个基本步骤，即双链d n a 模板加热变性成单链( 变性) ； 低温下引物与单链d n a 互补配对( 退火) ；合适温度下引物沿模板延伸( 延伸) 。这三 个步骤重复循环，使模板d n a 的某一个靶序列呈特异性指数扩增，是其它p c r 技术的 基础。 多重p c r 技术：在p c r 反应中使用一对以上的引物，目的在于同时扩增模板d n a 中的几个片断，模板可以为单一的也可以是不同的。如果基因的某一区段消失，则电泳 图谱上相应的区带就会消失。每种扩增产物的产量随着反应中引物数量的增加而成比列 减少。多重p c r 比单一p c r 反应更快捷、更经济，只需一次p c r 反应，就能同时检测 多个靶基因，提高了检测效率，降低了检测成本，还可以有效防止假阳性并且其适时检 测灵敏度耐3 1 。3 2 5 3 矧。 p c r e u s a 【3 9 - 4 1 , 5 7 , 5 8 ：将p c r 的高效性与e l i s a 的高特异性结合。即p c r 反应完 成以后，用生物素标记的探针与诱捕在p c r 反应管上的特异聚合酶链式反应产物杂交， 再用碱性磷酸酯酶标记的链霉素进行e l i s a 反应。常规的p c r - e l i s a 技术只能作为一 种定性实验，但若加入内标，作出标准曲线就可定量检测。该方法灵敏度高达o 1 ， 足以达到欧盟的要求( 转基因检测阈值为1 ) 。s t a v e 等报道过应用e l i s a 法测定g m 玉 米中重组蛋白质c r y i a 。沈法富等建立了d o t e l i s a 检测b t 棉杀虫蛋白的方法，这些 都是e l i s a 方法实用的例证。e l i s a 检测成本低，但是由于蛋白质对热敏感，在加热 过程中容易变性，因此采用e l i s a 法可能无法检出由转基因原料加工食品中的转基因 成分。 p c r g e n e s c a n 法：p c r 扩增后，借助d n a 测序仪中基因片段扫描( g e n e s c a n ) 的功 能替代琼脂糖凝胶电泳对p c r 产物进行分析。该方法可以分辨出相差5 - - 6 个碱基的 p c r 产物，从而准确判定扩增片段的大小。利用该方法可以检测出食品和食用油脂中 c a m v 、3 5 s 启动子、n o s 终止子、c p 4 e p s p s 和b t 等转基因成分，检测灵敏度高。 p c r g e n e s c a n 法所需仪器昂贵，并且需要在p c r 反应体系中加入荧光标记的d c t p 进 行扩增，从而限制了其推广应用。 9 青岛农业人学硕十学何论文文献综述 3 1 2 核酸分子定量检测技术 定量检测是对原料和转基因产品中的成分进行定量。随着人们对转基因食品重视程 度的提高，定性检测方法已经不能满足需要，加上所采取的p c r 法因其高灵敏度常伴 有假阳性或假阴性现象。为此，研究者们在定性筛选p c r 方法的基础上，发展了不同 的转基因生物的定量p c r 检测方法。目前转基因成分的准确定量检测在国际贸易中日 趋重要 5 9 1 。常用检测方法有： 竞争性p c r ：在同一反应管中，未知含量的待测模板和已知含量的内标模板( 竞争 性模板) 用同一对引物同时扩增，扩增后用内切酶消化p c r 产物。竞争性模板的产物 可被酶解为两个片断，而待测模板不被切割，通过凝胶电泳或高效液相色谱可以将两种 产物分开，分别测定荧光强度，然后根据已知模板推测未知模板的起始拷贝数 4 2 , 5 9 , 删。 荧光定量p c r ：荧光定量p c r 技术是在常规p c r 基础上，添加一条标记了两个荧 光基团的探针。一个标记在探针的5 端，称为荧光报告基团( r ) ；另一个标记在探针 的3 端，称为荧光抑制基团( q ) 。两者可以构成能量传递结构，即5 端荧光基团发出 的荧光可被3 端荧光抑制基团抑制或吸收。当二者距离较远时，抑制作用消失，报告基 团荧光信号增强。荧光信号与p c r 产物同比增长，随着p c r 产物的增加而增强。利用 荧光信号积累时监测整个p c r 进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量【6 l 】。 s o u t h e r n 杂交：该法子1 9 7 5 年首创，是将核酸凝胶电泳、印迹技术和分子杂交融 为一体的技术。被检的d n a 分子用特定的限制性内切酶消化后分成若干片断，经琼脂 糖凝胶电泳分离后转移到硝酸纤维素膜或尼龙膜上，然后将膜放置在含有同位素或其它 标记的d n a 探针溶液中进行分子杂交。杂交膜显影后如果有条带出现，则说明被检测 d n a 片断与核酸探针具有互补序列。在基因工程操作中，它可以检测重组d n a 分子中 插入的外源d n a 是否是原来的目的基因，并验证插入片断的分子质量大小。此技术已 广泛应用于克隆鉴定、品种鉴定、以及基因作图等方面。但此方法对样品的质量和纯度 要求较高 4 4 , 6 2 - 6 3 。 套式p c r ( n e s t e dp c r ) ：即先后用两套引物扩增的p c r 技术。通常先用第一套引物 ( 外引物) 扩增1 5 3 0 个循环，再用已扩增的d n a 片段内设定的第二套引物( 内引物) 扩增1 5 3 0 个循环。利用该方法检测转基因r r 大豆中c p 4 e p s p s 基因和t n o s 终止子 的方法都已建立。该方法具有很高的特异性和灵敏度，检测限为2 0 p gd n a ，相当于一 般原料中含有0 0 1 o 1 的g m 大豆。采用套式p c r ，将外引物扩增的片段又经内 引物扩增，提高了反应的特异性和灵敏度，能检测d n a 含量低的转基因产品【“。6 5 】。 3 1 3 转基因产品的蛋白检测技术 蛋白质检测方法有多种，如酶联免疫吸附法、层析技术、双向电泳( 2 d e ) 技术 1 0 青岛农业人学硕士学位论文 文献综述 及免疫印迹法、免疫层析试纸条法，检测插入基因表达蛋白功能的生化活性检测方法 等等【5 5 , 6 6 - 6 7 1 。 酶联免疫吸附法( e l i s a 法) ：是蛋白质检测应用最多的检测方法。e l i s a 是将抗 原与抗体反应的特异性与酶对底物催化的高效性结合起来。在测定时，受检标本与固相 载体表面的抗原或抗体起反应，用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液 体中的其他物质分开，再加入酶标记的抗原或抗体，通过反应结合在固相载体上。加入 酶反应的底物后，底物被酶催化成有色产物，根据酶作用于底物后的显色反应判定检测 结果 6 8 1 。 试纸条法：与e l i s a 相比，试纸条检测蛋白也是根据抗原抗体特异性结合的原理， 不同之处之一是以硝化纤维代替聚苯乙烯反应板为固相载体。外源蛋白特异结合的抗体 上联结了显色剂被固定在试纸条内，当试纸条一端被放入含有外源蛋白的植物组织提取 液中，另一端吸水垫的毛细管作用使提取液向上流动，当特异抗体与外源蛋白相结合时， 呈现颜色反应。当在试纸条上只显示一条区带( 质控线) 时，为阴性结果，表明不含有 被检测的转基因蛋白，而当显示两条带时则为阳性结果，表明含有被检测的转基因蛋 白【6 7 】。 本法可以定性，也可以定量，但需要针对转基因产品中特定蛋白质的酶标抗体。目 前商品化的转基因食品e l i s a 检测试剂盒只能检测少数几种转基因食品，且一种试剂盒 只针对一种特定转基因产物，无法高剂量、快速地检测具有多种混合成分的样品。 2 - d e 法：根据蛋白质等电点不同在p h 梯度胶中等点聚焦( i s o e l e c t r i cf o u s i n g ，i e f ) 将其分离，然后按照它们的分子量大小在垂直方向或水平方向进行十二烷基磺酸钠一聚 丙烯酰胺凝胶电泳( s d s p a g e ) 第二次分离。该方法分辨率高，一般的2 d e 能分辨 1 0 0 0 3 0 0 0 个蛋白质点，但对于碱性蛋白质不能有效分离【6 “”】。 w e s t e r n 杂交法：从植物细胞中提取总蛋白，将蛋白质样品溶解于含去污剂和还原 剂的溶液中，经s d s 聚丙烯酰胺凝胶电泳使蛋白质按分子量大小分离，将分离的各蛋 白质条带原位转移到固相膜( 硝酸纤维素膜或尼龙膜) 上，膜在高浓度的蛋白质( 如牛 血清白蛋白) 溶液中温浴，以封闭非特异性位点。通过抗体与附着于固相支持物上的靶 蛋白所呈现的抗原抗体特异性反应进行检测 7 1 - 7 2 。 w e s t e r n 杂交是植物基因工程中检测外源基因是否表达出蛋白质的权威方法，将蛋 白质的电泳、印迹、免疫测定融为一体，具有很高的灵敏性，可以从植物细胞总蛋白中 检出5 0 n g 的特异蛋白质。若是提纯的蛋白质，可检出1 - 5 n g 。但其操作较烦琐，费用 较高，不适于检验检疫机