密度梯度离心.ppt

蛋白质的化学3,蛋白质的分离与纯化的基本原理,一、蛋白质的提取二、蛋白质的分离与纯化三、蛋白质的纯度鉴定、含量测定和结构分析,一、蛋白质的提取,1材料的选择选择适当的材料，所需蛋白质含量较高，来源方便。注意保存条件（低温）2组织细胞的粉碎超声、反复冻融、溶菌酶等3提取选用适当的溶媒防止蛋白酶对有效成分的破坏。,二、蛋白质的分离与纯化,（一）根据溶解度不同的分离纯化方法（二）根据分子大小不同的分离纯化方法（三）根据电离性质不同的分离纯化方法（四）根据配基特异性的分离纯化方法,根据溶解度不同的分离纯化方法,溶液的pH等电点沉淀离子强度盐析沉淀溶剂性质低温有机溶剂沉淀注意：温度低温,分子大小不同的分离纯化方法,透析和超滤透析（dialysis）法是利用蛋白质大分子对半透膜的不可透过性而与其他小分子物质分开。超滤法(ultrafiltration)是依据分子大小和形状，在10-8cm数量级进行选择性分离的技术。其原理是利用超滤膜在一定的压力或离心力的作用下，大分子物质被截留而小分子物质则滤过排出。,半透膜阻留pr分子，而让小的溶质分子和水通过，以达到除去蛋白质溶液中小分子（盐、低分子酸等）,超滤膜，是一种孔径规格一致，额定孔径范围为0.001-0.02微米的微孔过滤膜。在膜的一侧施以适当压力，就能筛出小于孔径的溶质分子，以分离分子量大于500道尔顿、粒径大于220纳米的颗粒。,分子排阻层析：分子筛层析、凝胶过滤葡聚糖凝胶(Sephadex)丙烯酰胺凝胶(Bio-gel)琼脂糖凝胶(Sepharose),聚糖凝胶是以葡聚糖与交联剂形成有三维空间的网状结构物，两者的比例和反应条件决定其交联度的大小，用G表示。G越小、交联度越大、孔径越小。,密度梯度离心（densitygradientcentrifugation）蛋白质颗粒的沉降速度取决于它的大小和密度当其在具有密度梯度的介质中离心时，质量和密度大的颗粒沉降得快并且每种蛋白质颗粒沉降到与自身密度相等的介质梯度时，即停滞不前，可分步收集。,根据电离性质不同的分离纯化方法,电泳法带电质点在电场中向电荷相反的方向移动，这种性质称为电泳蛋白质在电场中移动的速度和方向主要取决于蛋白质分子所带的电荷的性质、数量及质点的大小和形状。外界影响因素：电场强度、溶液的pH、离子强度及电渗等,醋酸纤维薄膜电泳：临床用于血浆蛋白电泳分析。,1.滤纸桥2.电泳槽3.醋酸纤维素薄膜4.电泳槽膜支架5.电极室中央隔板,聚丙烯酰胺凝胶电泳:它以聚丙烯酰胺凝胶为支持物，具有电泳和凝胶过滤的特点,等电聚焦电泳两性电解质作为支持物，电泳时即形成一个由正到负极逐渐增加的pH梯度。分辨率高，pl相差0.02pH单位即可分开,两性电解质载体，实际上是许多异构和同系物的混合物，它们是一系列多羧基多氨基脂肪族化合物，分子量在3001000之间。载体两性电解质是一系列不同分子的两性电解质的混合物,在通电后，它们各自迁移到适当位置形成一个连续的pH梯度。对两性电解质的要求是缓冲能力强，有良好的导电性，分子量要小，不干扰被分析的样品等。,等电聚焦电泳进行过程中,等电聚焦电泳结束后,（）,（）,（）,（）,高pH,高pH,低pH,低pH,免疫电泳电泳技术和抗原与抗体反应的特异性相结合，一般以琼脂或琼脂糖凝胶为支持物。方法是先将抗原中各蛋白质组分经凝胶电泳分开，然后加入特异性抗体经扩散可产生免疫沉淀反应。,免疫电泳,二维电泳根据蛋白质等电点和相对分子量采用等电聚焦方式和SDS-PAGE在两个相互垂直的方向上进行分离。双向电泳的第一向为等电聚焦（等电点信息），第二向为SDS-PAGE（分子量信息）。是目前所有电泳技术中分辨率最高，信息量最多的技术。,第一向电泳：等电聚焦电泳,聚焦后凝胶放置在SDS凝胶上，进行第二向电泳,第二向电泳：SDS-PAGE,分子量大,分子量小,pH9,pH3,pH9,pH3,大肠杆菌全蛋白提取液双向电泳凝胶染色后照片,利用离子交换基质上的可解离活性基团对各种蛋白结合力不同而达到分离目的的一种分离方法,常用的支持基质：纤维素，琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶、树脂,由于蛋白质分子具有两性性质，所以可用阳离子交换剂，也可用阴离子交换剂进行蛋白的分离纯化。,离子交换层析,阴离子交换层析分离蛋白质,阳离子交换层析原理,洗脱方法：改变盐浓度和改变pH的方法,亲和层析(affinitychromatography),利用生物分子与配基之间所具有的专一而又可逆的亲和力，使生物分子分离纯化的技术。这种分离纯化方法专一性强，理论上可以从复杂的体系中一步提取所需的物质。,免疫亲和层析：抗原抗体凝集素亲和层析：糖凝集素金属螯和层析：如NTA-Nipoly-His,根据配基特异性的分离纯化方法,氨基酸、多肽、蛋白质类生物药物(一)氨基酸及其衍生物1.AA营养价值及其与疾病治疗关系八种必需氨基酸：是人体必需从食物中获取的营养物胱氨酸、酪氨酸为非必需AA，但由蛋氨酸、苯丙氨酸产生所以食物中若有足够的胱氨酸和Tyr，可以减少对Met和Phe的需求量，故胱氨酸和Tyr也称为半必需氨基酸。Lys对婴幼儿来说具有特殊的重要意义赖氨酸的需求量，按每天每kg体重计算，成年人为12mg，1岁以下婴幼儿为103mg。,谷氨酸谷氨酰胺乙酰谷酰胺铝组胺酸盐酸盐甘氨酸及其铝盐谷氨酸盐酸盐,通过调节胃液酸碱度，实现治疗作用,通过保护消化道粘膜或促进粘膜增生而防治胃及十二指肠溃疡,2.治疗消化道疾病的氨基酸,精氨酸盐酸盐磷葡精氨酸鸟天氨酸谷氨酸钠瓜氨酸赖氨酸盐酸盐天冬氨酸,3.治疗肝病的氨基酸及其衍生物,支链氨基酸,4.治疗脑及神经系统疾病的氨基酸及其衍生物,谷氨酸钙盐及镁盐维持神经肌肉正常兴奋，治疗神经衰弱氢溴酸，谷氨酸钠官能症酪氨酸中枢神经系统的抑制性递质，治疗记忆、色氨酸语言障碍、脑外伤后遗症5羟色氨酸酪氨酸亚硫酸盐治疗脊髓灰质炎、结核性脑膜炎,偶氮丝氨酸治疗白血病氯苯丙氨酸治疗癌症综合症磷乙天冬氨酸治疗B16黑色素瘤及Lewis肺癌氨基酸药物中治疗作用比较显著的多数是其衍生物。,5.用于肿瘤治疗的氨基酸及其衍生物,（二）多肽类药物1.多肽激素：促皮质素（ACTH）促黑激素（MSH）垂体多肽激素脂肪水解激素（LPH）催产素（OT）加压素（AVP）促甲状腺激素释放激素（TRH）下丘脑激素生长素抑制激素（GRIF）促性腺激素释放激素（LHRH）甲状腺激素甲状旁腺激素（PTH）降钙素（CT）,胰岛激素胰高血糖素（不包括胰岛素，因为胰岛素是蛋白）胰解痉多肽胃泌素胆囊收缩素促胰酶素（CCKPZ）肠泌素胃肠道激素肠血管活性肽抑胃肽(GIP)缓激肽P物质胸腺素胸腺激素胸腺肽胸腺血清因子,2.多肽类细胞因子这是一类目前研究十分活跃的多肽类药物。已批准生产的细胞因子多肽药物,已批准临床试验的细胞因子多肽药物,有可能用于临床的细胞因子多肽药物,3.含有多肽成份的其它生化药物骨宁抗关节炎、镇痛眼生素用于眼科疾病脑氨肽作用类似脑活素蜂毒治疗关节炎蛇毒抗血栓谷胱甘肽解毒剂妇血宁胎盘提取物花粉提取物脾水解物肝水解物,（三）蛋白质类生物药物1.蛋白质激素生长素（GH）催乳激素（PRL）垂体蛋白质激素促甲状腺素（TSH）促黄体生成激素（LH）促卵泡激素（FSH）人绒毛膜促性腺激素（HCG）促性腺激素绝经尿促性腺激素(HMG)血清性促性腺激素(SGH)胰岛素胰岛素及其它蛋白质激素胰抗脂肝素松弛素尿抑胃素,2.血浆蛋白质白蛋白纤维蛋白溶酶原血浆纤维结合蛋白（FN）两种免疫球蛋白抗淋巴细胞免疫球蛋白抗HBs免疫球蛋白抗血友病球蛋白纤维蛋白原抗凝血酶凝血因子凝血因子,3.蛋白质类细胞生长调节因子干扰素（、）神经生长因子（MGF）肝细胞生长因子（HGF）血小板衍生的生长因子（PDGF）组织纤溶酶