微生物的营养.ppt

第四章微生物的营养,营养物质：微生物机体生长、繁殖和完成各种生理活动所需的物质。营养的概念：有机体吸取和利用营养物质的过程。,第一节微生物的营养要求第二节微生物的营养类型第三节营养物质的跨膜运输第四节培养基,第一节微生物的营养要求,一、微生物细胞的化学组成二、营养物质及其生理功能,一、微生物细胞的化学组成,1.化学元素大量元素:碳、氢、氧、氮、磷、硫、钾、镁、钙、铁（其中前6种占细菌细胞干重的97%）。微量元素:锌、锰、钠、氯、钼、硒、钴、铜、钨、镍、硼。,表41微生物细胞中几种主要元素的含量（干重）,2.元素在细胞内存在形式,上述元素在细胞中的主要存在形式：（1）有机物蛋白质、糖、脂类、核酸、维生素及其降解产物.（2）无机物参与有机物组成，单独存在于细胞质内以无机盐的形式存在.（3）水约占细胞总重70%90%，以游离水和结合水两种形式存在。游离水：干重法可测得；结合水：不易蒸发、不冻结、也不能渗透,占水总量的17%28%。,3.微生物细胞化学组成含量的变化,表42微生物细胞的化学组成,此组成可因菌种的种类、菌龄、培养基组成、培养条件、分析方法等而有所不同。,细胞组成成分的分析方式,有机成分：1.化学法直接抽提-定性、定量分析2.破碎细胞，获得亚细胞结构-化学分析无机成分：细胞-550-灰分-定性、定量分析,二、营养物质及其生理功能,1.碳源2.氮源3.无机盐4.生长因子5.水,1.碳源,定义：凡可被用来构成细胞物质或代谢产物中碳素来源的营养物质。,功能：（1）提供合成细胞物质及代谢物的原料（碳源）;（2）并为整个生理活动提供所需要能源（异养微生物）。种类:无机含碳化合物：如CO2和碳酸盐等。有机含碳化合物：糖与糖的衍生物（多糖：如淀粉、麸皮、米糠等；饴糖；单糖）,脂类、醇类。有机酸、烃类、芳香族化合物以及各种含碳的化合物。,表4-3微生物的碳源谱,微生物工业发酵中用做碳源的原料,传统种类：糖类（单糖，饴糖）淀粉（玉米粉、豆饼粉、野生植物淀粉等）麸皮及各种米糠等代粮发酵：纤维素、石油、CO2和H2,微生物利用碳源物质具有选择性。不同种类微生物利用碳源物质的能力也有差别。微生物利用含碳化合物的能力可因微生物的种类、培养条件等而有所不同。根据微生物对碳源利用能力差异，把碳源分为速效碳源和迟效碳源。不同的微生物其速效碳源和迟效碳源分类也有差异。通常速效碳源有利于机体的生长，迟效碳源有利于代谢产物的形成。通常单糖优于双糖优于多糖，己糖优于戊糖，淀粉优于纤维素，纯多糖优于杂多糖。糖类优于其他物质。在培养条件固定的情况下，同种微生物对碳源的利用基本相同，可据此对微生物进行分类鉴定。,凡用来构成菌体物质或代谢产物中氮素来源的营养源。种类：无机氮：铵盐、硝酸盐、亚硝酸盐、尿素、氨、N2等；有机氮：蛋白质及其降解产物（如胨、肽、氨基酸等）、牛肉膏、鱼粉、花生饼粉、黄豆饼粉、玉米浆等功能：1）提供合成细胞中含氮物，如蛋白质、核酸，以及含氮代谢物等的原料；（氮源）2）少数细菌可以铵盐、硝酸盐等氮源为能源。,2.氮源,表44微生物的氮源谱,硝酸盐NH4+,实验室常用的氮源有碳酸铵、硝酸盐、硫酸铵、尿素、蛋白胨、牛肉膏、酵母膏等。生产上常用的氮源有硝酸盐、铵盐、尿素、氨以及蛋白含量较高的鱼粉、蚕蛹粉、黄豆饼粉、花生饼份、玉米浆等。蛋白氮必须通过水解之后降解成胨、肽、氨基酸等才能被机体利用，这种氮源叫迟效氮源。无机氮源或以蛋白质降解产物形式存在的有机氮源可以直接被菌体吸收利用，这种氮源叫做速效氮源。速效氮源，通常有利于机体的生长，迟效氮源有利于代谢产物的形成。,铵盐氨基酸入胞细胞物质蛋白胨,豆饼蚕蛹粉,分解入胞细胞物质,诱导酶,诱导酶,生理酸式盐和生理碱式盐,3.无机盐,定义：为微生物细胞生长提供碳、氮源以外的多种重要元素（包括大量元素和微量元素）的物质，多以无机盐的形式供给。大量元素：P、S、K、Mg、Ca、Na、Fe（微生物生长所需浓度在10-310-4mol/L）微量元素：Cu、Zn、Mn、Mo、Co（微生物生长所需浓度在10-610-8mol/L）,一般微生物生长所需要的无机盐有：硫酸盐、磷酸盐、氯化物以及含有钠、钾、镁、铁等金属元素的化合物。,无机盐的生理功能,表4-5无机元素的来源和功能,4.生长因子,定义:是一类对微生物正常生活所不可缺少而需要量又不大，但微生物自身不能用简单的碳源或氮源合成，或合成量不足以满足机体生长需要的有机营养物质。不同微生物需求的生长因子的种类和数量不同。,缺乏合成生长因子能力的微生物称为“营养缺陷型”微生物。,最早发现的生长因子是维生素，目前已经发现许多维生素都能起生长因子的作用。维生素大部分是构成酶的辅基或辅酶，需要量很少，但是缺少维生素微生物不能正常生长。有些微生物缺乏或丧失合成某种或某些氨基酸的酶，所以不能合成生长所必需的氨基酸，这类微生物被称为“氨基酸缺陷型”。另外有些微生物生长还需要其它特殊的成分，例如某些乳酸杆菌生长需要核苷；某些酵母菌和真菌生长需要肌醇；某些肺炎球菌生长需要胆碱等。,根据微生物对生长因子的需要存在差异，可分为：,野生型(wildtype)原养型不需要生长因子而能在基础培养基上生长的菌株营养缺陷型(auxotroph)由于自发或诱发突变等原因从野生型菌株产生的需要提供特定生长素物质才能生长的菌株,水的生理功能：(1）溶剂(2）运输(3）反应物(4）维持分子构象(5）传热(6）维持细胞形态(7）控制多亚基组成的细胞结构的组装与解离等。,5.水,水在细胞中有两种存在形式：结合水和游离水不同细胞及不同细胞结构中游离水的含量有较大差别：,微生物对水的需要程度（水对微生物生长的影响）常用环境（或基质）中的水活度值（w）表示。所谓w就是水的有效浓度。定义：水活度为在一定的温度条件下，溶液的蒸汽压（材料上部蒸气相中水浓度）与纯水的蒸汽压（即纯水上部蒸气相中水浓度）之比，即：w=/o表示溶液的蒸汽压o表示纯水的蒸汽压在w为0.600.99的环境条件均有微生物生长，但对某种微生物而言，它对w的要求是一定的，微生物对水的需求有相当的变化程度。即微生物不同，其生长的最适w亦不同。,表4-6几类微生物生长最适w,为了表示微生物生长与水的关系，有时也常用相对湿度（RH)的概念（w100=RH）；通常也用测定蒸气相中相对湿度的方法得知溶液或物质的水活度。,第二节微生物的营养类型,根据生长所需要的营养物质的性质（碳源），可将生物分成两种基本的营养类型异养型生物：在生长时需要以复杂的有机物作为营养物质自养型生物：在生长时能以简单的无机物质作为营养物质大多数微生物属于异养型生物，少数微生物属于自养型生物。根据生长时能量的来源不同，又可将生物分成两种类型化能营养型生物：依靠化合物氧化释放的能量进行生长光能营养型生物：依靠光能进行生长大部分微生物属于化能营养型生物，它们从物质的氧化过程中获得能量。少部分微生物属于光能营养型生物。按氢供体分,无机营养型生物:有机营养型生物：,营养类型,光能自养型微生物以C02作为唯一碳源或主要碳源，并利用光能，以无机物如硫化氢、硫代硫酸钠或其他无机硫化物作为氢供体将CO2还原成细胞物质，同时产生单质硫光能CO2H2SCH2O+2S+H2O光合色素光能自养型微生物包括蓝细菌（含叶绿素）、红硫细菌和绿硫细菌等少数微生物（含细菌叶绿素），由于含有光合色素，因而能使光能转变成化学能（ATP），供机体直接利用。,光能异养型微生物以CO2为主要碳源或唯一碳源，以有机物（如异丙醇）作为氢供体，利用光能将CO2还原成细胞物质，红螺菌属中的一些细菌属于此种营养类型。光能2(H3C)2CHOH+CO22CH3COCH3+CH2O+H2O光合色素光能异养型细菌在生长时大多数需要外源的生长因子,化能自养型微生物以CO2或碳酸盐作为唯一或主要碳源，以无机物氧化释放的化学能为能源,，利用电子供体如氢气、硫化氢、二价铁离子或亚硝酸盐等使CO2还原成细胞物质。这类微生物主要有硫化细菌、硝化细菌、氢细菌与铁细菌。它们在自然界物质转换过程中起着重要的作用。,1.硝化细菌:亚硝化细菌2NH4+3O22NO2-+2H2O+4H+132Kcal硝化细菌NO2-+1/2O2NO3-+18.1Kcal2.硫化细菌:通过氧化还原态的无机硫化物（H2S、S、S2O32-、SO32-）获得能量（硫杆菌属，硫微螺菌属）H2S+1/2O2S+H2O+50.1KcalS+3/2O2+H2OH2SO4+149.8Kcal,3.铁细菌：氧化Fe2+为Fe3+获取能量并同化CO22Fe2+1/2O2+2H+2Fe3+H2O+21.2Kcal4.氢细菌：具有氢化酶，从氢的氧化获取能量，同化CO2H2+1/2O2H2O+56.7Kcal,化能异养型微生物多数微生物属于化能异养型，其生长所需要能量和碳源通常来自同一种有机物。根据化能异养型微生物利用有机物的特性，又可以将其分为下列两种类型：腐生型微生物：利用无生命活性的有机物作为生长的碳源。寄生型微生物：寄生在生活的细胞内，从寄主体内获得生长所需要的营养物质。存在于寄生与腐生之间的中间过渡类型微生物，称为兼性腐生型或兼性寄生型。,自养微生物：不依赖任何有机营养物即可正常生活的微生物异养微生物：至少需要提供一种大量有机物才能满足其正常营养要求的微生物（即其碳源必须是有机物，供氢体是有机物，能源可以是氧化有机物或利用日光能）,关于营养类型的定义：,第三节微生物吸收营养物质的方式,被输送的物质，靠细胞内外浓度为动力，以自由扩散的形式从高浓度区向低浓度区的扩散。,单纯扩散(simplediffusionorpassivediffusion),单纯扩散的特点：非特异性：营养物质通过细胞膜中的含水小孔，由高浓度的胞外环境向低浓度的胞内扩散；营养物质的结构不发生变化：即既不与膜上的分子发生反应，本身的分子结构也不发生变化；物质运输的速率较慢：速率与胞内外营养物质的浓度差有关，即随细胞膜内外该物质浓度差的降低而减小，直到胞内外物质浓度相同；不需要载体参与和不需要代谢能，因此，物质不能进行逆浓度运输。可运送的养料有限：限于水、溶于水的气体，及分子量小，脂溶性、极性小的营养物质。,flowstowardshighsaltconcentrations,营养物通过与细胞膜上载体蛋白（也称作透过酶permease）的可逆性结合来加快其传递速度,促进扩散(facilitateddiffusion/transport),促进扩散特点：营养物质本身在分子结构不会发生变化不消耗代谢能量，故不能进行逆浓度运输运输的速率由胞内外该物质的浓度差决定需要细胞膜上的载体蛋白（透过酶）参与物质运输被运输的物质与载体蛋白有高度的特异性养料浓度过高时,与载体蛋白出现饱和效应促进扩散的运输方式多见于真核微生物中，例如通常在厌氧生活的酵母菌中，某些物质的吸收和代谢产物的分泌是通过这种方式完成的。,主动运输(Activetransport),在代谢能的推动下，通过膜上特殊载体蛋白逆养料浓度梯度吸收营养物质的过程。,主动运输特点：需要消耗代谢能可以进行逆浓度运输的运输方式需要载体蛋白参与对被运输的物质有高度的立体专一性被运输的物质在转移的过程中不发生任何化学变化不同的微生物在主动运输过程中所需的能量的来源不同，好氧微生物中直接来自呼吸能，厌氧微生物主要来自化学能，光合微生物中则主要来自光能。主动运输是微生物吸收营养物质的主要方式。,主动运输模式图,细胞膜,细胞膜外,细胞膜内,恢复原构象,移位,再循环,结合,构象改变,初级主动运输：质子运输方式，建立质子浓度差（电势差），形成能化膜。能量来源：好氧和兼性厌氧微生物中直接来自呼吸能，厌氧微生物主要来自化学能，光合微生物中则主要来自光能。次级主动运输：与初级主动运输相偶联的其他物质运输过程。据其运输方向不同分为同向运输，逆向运输和单向运输。被运输的物质主要包括：无极离子、氨基酸和某些糖类等。ABC转运蛋白（ATP结合性的盒式转运蛋白系统）:被运输的物质主要包括：糖类和氨基酸等。由两个跨膜疏水域和两个核苷酸结合域构成。通过ATP水解提供能量。Na+-K+-ATP酶系统：消耗ATP,泵出钠离子，泵入钾离子。该酶由大小两个亚基组成。通过大亚基的磷酸化改变构象，而分别与钠离子和钾离子结合。,Na+-K+-ATP酶系统,Na+-K+-ATPase是存在于原生质膜上的一种重要离子通道蛋白功能:利用ATP能量将Na+由细胞内“泵”出胞外,并将K+“泵”入胞内。该酶由大小两个亚基组成（MW:12万,5.5万）,作用步骤:1.ATP酶(E)在细胞内侧与3个Na+结合,同时消耗能量;2.磷酸化ATP酶(E+)构象变化将Na+排出胞外,并与2个K+结合;3.K+激发E+脱磷酸化恢复为E,同时将K+运入细胞.,基团转位是一种特殊的主动运输，与普通的主动运输相比，营养物质在运输的过程中发生了化学变化（糖在运输的过程中发生了磷酸化）。其余特点与主动运输相同。基因转位主要存在于厌氧和兼性厌氧型细菌中，也主要是用于单（或双）糖与糖的衍生物，以及核苷与脂肪酸的运输,基团转位(Grouptranslocation),在酶的作用下HPr被激活,在酶的作用下P-HPr将磷酸转移给糖,运送机制:是依靠磷酸转移酶系统,即磷酸烯醇式丙酮酸-己糖磷酸转移酶系统.运送步骤:1.热稳载体蛋白(HPr)的激活细胞内高能化合物磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）的磷酸基团把HPr激活。酶1PEP+HPr丙酮酸+P-HPrHPr是一种低分子量的可溶性蛋白，结合在细胞膜上，具有高能磷酸载体的作用。,2、糖被磷酸化后运入膜内膜外环境中的糖先与外膜表面的酶2结合，再被转运到内膜表面。这时，糖被P-HPr上的磷酸激活，并通过酶2的作用将糖-磷酸释放到细胞内。酶2P-HPr+糖糖-P+HPr酶2是一种结合于细胞膜上的蛋白，它对底物具有特异性选择作用，因此细胞膜上可诱导出一系列与底物分子相应的酶2。,基团移位模式图,四种运输营养物质方式的比较,膜泡运输,第四节培养基(medium),定义：应科研或生产的需要，由人工配制的、适合于不同微生物生长繁殖或积累代谢产物用的营养基质（混合养料）。特点：任何培养基都应具备微生物所需要的五大营养要素，且应比例适当。所以一旦配成必须立即灭菌。,用途：促使微生物生长；积累代谢产物；分离微生物菌种；鉴定微生物种类；微生物细胞计数；菌种保藏；制备微生物制品,一、培养基配置的原则二、设计培养基的方法三、培养基的类型,一、培养基的配制原则,1.培养基组分应适合微生物的营养特点（目的明确）2.营养物的浓度与比例应恰当（营养协调）3.物理化学条件适宜（条件适宜）4.根据培养目的选择原料及其来源（经济节约）,1.培养基组分应适合微生物的营养特点,即根据不同微生物的营养需要配制不同的培养基。不同营养类型的微生物，其对营养物的需求差异很大。如自养型微生物的培养基完全可以（或应该）由简单的无机物质组成。异养型微生物的培养基至少需要含有一种有机物质，但有机物的种类需适应所培养菌的特点。按微生物的主要类群来说，它们所需要的培养基成分也不同：细菌：牛肉膏蛋白胨培养基LB(Luria-Bertani)放线菌：高氏1号培养基真菌：查氏合成培养基PDA(Potato-Dextrose-Agar)酵母菌：麦芽汁当对试验菌营养需求特点不清楚的时候，可以采用生长谱法进行测定。,2.营养物的浓度与比例应恰当,浓度过高微生物的生长起抑制作用，浓度过小不能满足微生物生长的需要。碳氮比（C/N）直接影响微生物生长与繁殖及代谢物的形成与积累，故常作为考察培养基组成时的一个重要指标；,速效性氮（或碳）源与迟效性氮（或碳）源的比例各种金属离子间的比例,碳源中的碳原子的mol数氮源中所含的氮原子的mol数,C/N比值=,例：谷氨酸生产中C/N4/1时，菌体大量繁殖，谷氨酸积累少；C/N3/1时，菌体生长受抑制，而谷氨酸大量增加。,3.物理化学条件适宜,各类微生物的最适生长pH值各不相同：细菌：7.08.0放线菌：7.58.5酵母菌：3.86.0霉菌：4.05.8在微生物的生长和代谢过程中，由于营养物质的利用和代谢产物的形成与积累，培养基的初始pH值会发生改变，为了维持培养基pH值的相对恒定，通常采用下列两种方式：内源调节：在培养基里加一些缓冲剂或不溶性的碳酸盐；调节培养基的碳氮比。外源调节：按实际需要不断向发酵液流加酸或碱液,（1）pH值,（2）渗透压和aw,渗透压等渗溶液适宜微生物生长高渗溶液细胞发生质壁分离低渗溶液细胞吸水膨胀，直至破裂,大多数微生物适合在等渗的环境下生长，而有的菌如Staphylococcusaureus则能在3mol/LNaCl的高渗溶液中生长。能在高盐环境（2.86.2/LNaCl）生长的微生物常被称为嗜盐微生物（Halophiles）。,（3）氧化还原电势,各种微生物对培养基的氧化还原电势的要求：好氧微生物：+0.3+0.4V,(在0.1V以上的环境中均能生长).厌氧微生物：只能在+0.1V以下生长兼性厌氧微生物：+0.1V以上呼吸、+0.1V以下发酵培养基是多氧化还原偶的复杂电化学系统，测出的Eh值仅代表其综合结果。对微生物影响最大的是：分子氧和分子氢的浓度培养基中常用的还原剂：巯基乙醇、抗坏血酸、硫化氢、半胱氨酸、谷胱甘肽、二硫苏糖醇等。,4.根据培养基的应用目的选择原料及其来源,培养基的应用目的，即：是培养菌体还是积累代谢产物？是实验室种子培养还是大规模发酵？代谢产物是初级代谢产物还是次级代谢产物？,用于培养菌体种子的培养基营养应丰富，氮源含量宜高（碳氮比低）；用于大量生产代谢产物的培养基其氮源一般应比种子培养基稍低，（但若发酵产物是含氮化合物时，有时还应提高培养基的氮源含量）；若代谢产物是次级代谢产物时要考虑是否加入特殊元素或特定的代谢产物；当所设计的是大规模发酵用的培养基时，应重视培养基中各成份的来源和价格，应选择来源广泛、价格低廉的原料，提倡以粗代精，以废代好。,1.生态模拟调查所培养菌的生态条件，查看“嗜好”，对“症”下料初级天然培养基.2.查阅文献查阅、分析文献，调查前人的工作资料，借鉴人家的经验，以便从中得到启发设计有自己特色的培养基配方.3.精心设计借助优选法或正交试验设计法等方法.4.实验比较不同培养基配方的选择比较单种成分来源和数量的比较几种成分浓度比例调配的比较小型试验放大到大型生产条件的比较pH和温度试验,二、设计培养基的方法,高压蒸气灭菌一般培养基:1.05Kg/cm2,121.3,15-30min含糖培养基:0.56Kg/cm2,112.6,15-30min过滤灭菌,分别灭菌,间歇灭菌的应用.,附1：配置培养基时应注意的几个问题及解决方法：,1、沉淀2、胶体强度的破坏3、褐色物质的形成4、pH发生变化,附2：培养基的灭菌,附图：过滤灭菌,器皿的灭菌：干热空气：160，2小时无菌室的消毒：紫外光化学药物熏蒸（苯酚；高锰酸钾+甲醛）,附3：器皿的灭菌及无菌室的消毒,三、培养基的类型及其应用,根据所培养微生物的微生物类群来分细菌培养基放线菌培养基酵母菌培养基霉菌培养基根据培养目的来分种子培养基(seedculturemedium)是为保证发酵生产获得大量优质种子而设计的培养基，特点是营养较丰富，氮源比例较高。有时为使菌种能迅速适应后面的发酵条件，还有意识地加入发酵培养基的基质。发酵培养基(fermentationmedium)用于生产预定发酵产物，一般以碳为主要元素，碳源含量往往高于种子培养基。大规模生产时，原料应价廉易得，还应有利于下游的分离提取。,-1,细菌培养基营养肉汤（nutrientbroth)：牛肉膏3g；NaCl5g；水1000ml；蛋白胨5g；pH7.27.4放线菌培养基高氏1号：可溶性淀粉20g；KNO31g;K2HPO41gMgSO40.5gNaCl1g;FeSO47H2O0.5g水1000ml;pH7.27.4霉菌培养基查氏（zapek)培养基：蔗糖30g;KCl0.5g;MgSO4.H2O0.5g;水000ml;K2HPO41g;FeSO47H2O0.5g;NaNO33g;pH6.7酵母菌培养基麦芽汁培养基,按对培养基成分的了解程度来分天然培养基：利用化学成分还不完全清楚或不恒定的天然物质，（如肉汤、蛋白胨、麦芽汁、酵母汁、豆芽汁、玉米粉、牛奶、血清等）制成的培养基，天然培养基比较经济，除实验室经常使用外，更适宜于在生产上用来大规模地培养微生物和生产微生物产品。合成（组合）培养基：由化学成分完全了解的物质配制而成的培养基，该类培养基的组成成分精确、清楚，重复性强，但微生物生长较慢，且价格昂贵，故一般适于在实验室范围内做有关微生物营养需要、代谢、分类鉴定、生物测定以及菌种选育、遗传分析等方面的研究工作。如高氏培养基、察氏培养基等。半合成（组合）培养基：在合成培养基的基础上添加些天然成份，以更有效地满足微生物对营养物的需要.如马铃薯蔗糖培养基。,按制备后培养基外观的物理状态来分固体培养基