（临床检验诊断学专业论文）高效液相色谱测定血清胆固醇酯n3脂肪酸指数.pdf

北京协和医学院 硕十学位论文 s e r u mc h o l e s t e r y le s t e rn 一3f a t t ya c i di n d e x d e t e r m i n e db yh i g hp e r f o r m a n c el i q u i d c h r o m a t o g r a p h y m a s t e r ，sd e g r e ec a n d i d a t e c u ii 沁i f a n g s u p e r v i s o r p r o c h e nw e n x i a n g 9 2m 6 舢577 肌ii_y 北京协和医学院硕。 ：学位论文 目录 缩略语表3 中文摘要8 英文摘要。1o 弓j言12 材料与方法15 1 试剂和仪器15 1 1 化学试剂1 5 1 2 标本来源15 1 3 仪器和材料1 5 2 血清c en 3 脂肪酸指数的测定1 5 2 1 血清样品的分离、储存及分析前准备1 5 2 2 溶液的配制。l6 2 3 血清t g 水解及c e 的提取。1 6 2 4 高效液相色谱( h p l c ) 分析1 6 2 5c en 一3 脂肪酸指数的计算1 6 3c e 组分的质谱鉴定l6 3 1c e 标准溶液配制。1 7 3 2 样品中c e 组分的收集及分析前准备1 7 3 3 质谱条件17 3 4 质谱分析l7 4 校正因子( f ) 的测定及计算。1 7 4 1 胆固醇及c e 组分收集。1 8 4 2 内标的力口入。l8 4 3c e 水解18 4 4 游离胆固醇测定o 。1 8 4 5h p l c 分析18 4 6f 值计算1 9 5 方法学论证1 9 6 1 0 6 名北京居民c en 一3 指数及心血管病危险因素指标测定。1 9 北京协和医学院硕士学位论文 6 1 样本来源及储存。1 9 6 2c en - 3 指数测定19 6 3 危险因素指标测定19 7 统计分析：2 0 8 人群分析2 0 研究过程与结果。2 1 1n 一3c e 测定的影响因素2 1 1 1 正相色谱分离c e 和t g 。2 1 1 2 水解去除t g 。2 2 1 3 水解条件的确定。2 3 2 提取系统的选择。2 4 3 液相色谱条件的选择和优化。2 5 3 1 流动相组成的选择和优化。2 5 3 2 检测波长的选择2 6 4 定性研究一质谱鉴定c e 组分2 6 4 1 质谱条件的选择和优化2 6 4 2 所有c e 组分的鉴定。2 7 5 定量研究一归一化法定量2 8 6 方法的精密度评价2 9 7 人群分析3 0 讨论3 3 结论3 6 参考文献3 7 附录4 1 文献综述4 7 致谢6 8 个人简历7 0 独创性声明7 1 学位论文版权使用授权书7 1 北京协和医学院硕上学位论文 c en 3i n d e x e p a d h a 缩略语表 c h 0 1 e s t e r y le s t e rn - 3f a t t ya c i di n d e x 胆固醇酯n 3 脂肪酸指数 e i c o s a p e n t a e n o i ca c i d 二十碳五烯酸 d o c o s a h e x a e n o i ca c i d 二十二碳六烯酸 l i n o l e n i ca c i d a l l n a 亚麻酸 p 吼 p g l t a h a h p l c c e t g f a p l m u f a c v d p 0 1 yu n s a t u r a t e df 撕ya c i d 多不饱和脂肪酸 p r o s t a g l a n d i n 前列腺素 l e u k o t r i e n e 白三烯 a m e “c a nh e a r ta s s o c i a t i o n 美国心脏协会 h i 曲p e r f o r n l a j l c e1 i q u i dc h r o m a t o 掣印h y 高效液相色谱 c h 0 1 e s t e r o le s t e r 胆固醇酯 t r i g l y c e r i d e 甘油三酯 f a t t ya c l d 脂肪酸 p h o s p h o l i p i d 磷脂 】o n ou n s a t u r a t e df - a t t ya c i d s 单不饱和脂肪酸 c a r d i o v a s c u l a rd i s e a s e 冠心病 5 北京协和医学院硕l 学位论文 f i d l p l p b s f e r h d l h d l h d l c h d l f c h d l 2 h d l l l d l l d l c l d l a l d l b v l d l l p ( a ) t c f l 锄ei o n l z a t l o nd e t e c t o r 火焰离子检测器 l i p o p r o t e i nl i p a s e 脂蛋白脂肪酶 p h o s p h a t eb u f f e rs a l i n e 磷酸盐缓冲液 f r a l c t i o n a le s t e r i n c a t i o nr a t eo fh i g hd e n s i t yl i p o p r o t e i nc h o l e s t e r o l 高密度脂蛋白胆固醇分数酯化速率 h i g hd e n s i t y1 i p o p r o t e i n 高密度脂蛋白 h i g hd e n s i t y1 i p o p i o t e i nc h o l e s t e r o l 高密度脂蛋白胆固醇 h i g hd e n s i t yl i p o p r o t e i n 丘e ec h o l e s t e r o l 高密度脂蛋白游离胆固醇 b u o y a n th d l 大颗粒h d l s m a l ld e n s eh d l 小颗粒h d l l d w d e n s i t yl i p o p r o t e i n 低密度脂蛋白 l o w d e n s i t yl i p o p r o t e i nc h 0 1 e s t e i o l 低密度脂蛋白胆固醇 b u o y a n tl d l 大而轻l d l s m a l ld e n s el d l 小而密l d l v b r yl o wd e n s i t yl i p o p r o t e i n 极低密度脂蛋白 l i p o p m t e i n ( a ) 脂蛋白( a ) t b t a lc h o l e s t e r o l 总胆固醇 北京协和医学院硕i ：学位论文 f c n 1 z l c m s m s u s p | s l o f r e ec h o l e s t e r o l 游离胆固醇 m a s st oc h a r g e 质荷比 “q u i dc h r o m a t o g r 印h yt a n d e mm a s ss p e c t r o m e t 巧 液相色谱串联质谱 u n s a t u r a t e df 乱t ya c i d s a t u r a t e df a t t ya c i d 不饱和脂肪酸饱和脂肪酸 p o l ”m s a t u r a t e df a t t ya c i d s a t u r a t e df a t t ya c i d 多不饱和脂肪酸饱和脂肪酸 l i n o l e i ca c i d o l e i ca c i d 亚油酸油酸 北京协和医学院硕士学位论文 高效液相色谱测定血清胆固醇酯n 3 脂肪酸指数 中文摘要 目的： 建立一种简便、快速、精密的高效液相色谱( h p l c ) 测定血清胆固醇酯n 一3 脂肪酸指数( c en 3 指数) 的方法，用于多不饱和脂肪酸( p 切1 a ) 摄入人群营养 筛查，并研究c en 一3 指数与心血管疾病危险因素的关系。 方法： 采集血液样品，凝血后离心分离血清，用氢氧化钠( n a o h ) 乙醇溶液水解血 清甘油三酯( t g ) ，乙酸终止水解反应，f 己烷提取胆固醇和胆固醇酯( c e ) ，h p l c 分离脂质，紫外( 2 0 5i 吼) 检测，计算n 3 脂肪酸c e 在所有c e 中的百分比( c e n 3 指数) 。胆固醇二十碳五烯酸酯( 2 0 ：5 一c e ) 和二十二碳六烯酸酯( 2 2 ：6 c e ) 用 液相色谱串联质谱( l c m s m s ) 鉴定，各c e 峰面积校正因子用测定相应组分胆 固醇含量的方法确定，归一化法定量，各c e 的百分含量用校正的c e 摩尔百分比 表示。征集1 0 6 名健康北京居民，测量身高、体重、血压，用上述方法测定血清 标本c en 3 指数，描述此范围的人群分布特征，用h p l c 法测定f e r h d l ，用酶法 测定血清总胆固醇( t c ) 和t g ，用超速离心h p l c 法测定h d l c 、h d l 亚类胆固 醇( h d l 2 c 和h d l 3 c ) 、低密度脂蛋白( l d l ) 胆固醇( l d l c ) 、l d l 亚类胆固醇 ( l d l a - c 和l d l b c ) 和脂蛋白( a ) 胆固醇 l p ( 。) 一c ，分析c en - 3 指数与其他指标的关 系。 结果： 1 h p l c 测定c en 一3 指数的色谱条件为：采用n o v a p a l ( c 1 8 色谱柱( 5 m ，3 9 m m 1 5 0 m m ) ；流动相为乙腈一异丙醇正己烷= 5 5 。5 0 1 5 ；紫外2 0 5 n m 检测；流速 为1 2 m l m i n ；进样5 0 u l ；色谱分析在6 分钟内完成；且血清中n 一3c e 与其他c e 。分离良好。 2 影响c en 一3 脂肪酸指数测定的t g 用4 m 0 1 l n a o h 的乙醇溶液水解3 0 秒， 可被去除，c en 一3 指数预计比实际水平低约3 ，对测定结果影响较小，出于实用 考虑，可以作为去除t g 的方法。 3 比较两种提取溶剂对样品中各脂质的提取效率，结果显示一致，表明溶剂 可以充分提取各脂质组分，在一定程度上可以保证测定结果的准确性。 8 北京协和医学院硕士学位论文 4 测定血清c en 3 指数的批内和总变异系数分别为o 3 6 o 8 6 和 o 6 5 1 1 7 ，远优于红细胞膜n 一3 指数的分析重现性( c v = 4 7 ) 。 5 测定1 0 6 例北京居民血清c en 3 指数，全体指数略呈f 偏态分布( 偏度值 = 1 2 5 ，峰度值= 1 7 0 ) ，中位数为o 9 8 ( 0 3 7 2 4 0 ) 。n 3 指数对数基本呈正 态分布( 偏度值= 0 2 4 ，峰度值= o 2 7 ) ，均值为o 0 0 3 7 ，标准差为o 1 5 ，9 5 分 布区间为( o 0 2 4 8 ，0 0 3 2 2 ) 。性别组n 一3 指数分布与全体类似，女性和男性中 位数分别为1 0 8 ( o 6 0 2 4 0 ) 和o 9 5 ( 0 3 7 2 1 1 ) ，女性明显高于男 性( t = 2 6 9 4 ，p = 0 0 0 8 ) 。相关分析结果显示，c en 一3 指数与收缩压、t g 和f e r h d l 显著正相关( p o 0 5 或0 0 1 ) ；c en 6 n 3 与身高、t c 、t g 、l d l c 、l d l a c 、 f e r h d l 和c en 一3 指数显著负相关( p o 0 5 或o 0 1 ) ；p i a m u f a 与卸d l c 、 h d l 2 一c 、h d l 3 c 、l d l c 和l d l a c 显著正相关( p o 0 5 或o 0 1 ) ；与年龄、体 重、b m i 、收缩压、t g 和c en 6 n 一3 显著负相关( p 8 ) 可作为临床治疗的目标【2 7 】。a l b e r t 等【2 8 】在“p h y s i c i a n sh e a l t hs t u d y 中，评价了多种危险因素与心源性死亡的关系，在t c 、l d l c 、h d l c 、t g 、 t c h d l - c 、同型半胱氨酸、c 一反应蛋白( c r p ) 和n 3 指数等指标中，对心源性 死亡有预示能力的只有n 3 指数和c r p ，其中，n 一3 指数从低到高四分位数的预示 梯度更好，与c v d 的关系不受已知其他危险因素的影响等，其对心源性死亡的预 示能力优于c r p 和其他血脂指标。 目前红细胞膜n 3 指数测定的标准化方法是气相色谱法( g c ) ，常用火焰电离检 测器( f i d ) 【2 9 1 ，它可以检测碳链长度为1 4 2 2 个碳原子的2 0 2 5 种脂肪酸。但此法需 红细胞洗涤、脂质提取和转酯化等复杂操作，技术要求高，而且大规模营养筛查和 c v d 危险分析需要更简便的n 一3 指数测定方法。 气相色谱串联质谱( g s m s ) 是一项比较强大的分析技术。质谱检测器可以给出 化合物明确的结构信息，气相色谱与质谱的串联可以有效的分离和确认复杂混合物 中的各组分。但由于此设备价格昂贵，操作技术要求高，无法在大多数实验室广泛 推广。 高效液相色谱( h p l c ) 是脂肪酸分析的又一选择，它可以直接分析脂肪酸及 其衍生物( 如脂肪酸的甲酯) 。经过色谱分析的样品可通过馏分收集器等手段收集起 北京协和医学院硕上学位论文 来单独用于进一步的分析。这种分析技术常用的检测器是紫外检测器，不像f d 和 m s 会破坏样品，而且样品经h p l c 分析后，还可用来在m s 和g c 上分析。目前， 高效液相色谱仪的应用非常广泛，在大多数实验室己得到普及，适合作为大规模筛 查的检测方法。 血清是最常用的临床标本，血清胆固醇酯( c e ) 脂肪酸组成具有相对较高的生物 学稳定性，反映2 3 周膳食脂肪情况【3 0 1 。我们尝试用h p l c 分析n 一3p u f a 在c e 中的含量( c en 3 指数) ，以期用于n 一3p 认摄入和c v d 危险分析。 北京协和医学院硕上学位论文 1 试剂和仪器 1 1 化学试剂 材料与方法 作参考标准的2 0 ：4 一c e 、1 8 ：2 一c e 、1 8 ：l c e 和1 6 ：0 c e 购自美国s i 舯a _ a 1 “c h 公司，色谱纯乙腈、异丙醇和正己烷购自美国f i s h e rs c i e n t i f i c 公司，色谱纯氯仿、 甲醇为美国j b b a k e r 公司产品，乙酸铵、氢氧化钠( 纯度为9 8 ) 、氢氧化钾( 纯 度为8 6 ) 、硫酸葡聚糖5 0o o o ，5 ，5 一二硫代2 硝基苯甲酸( d n 旧) 和2 巯基乙醇( m e ) 为美国s i 舯a a l d r i c h 公司产品，乙酸为美国f i s h e rs c i e n t i f i c 公司产品，乙醇、丙 酮、浓硫酸及三氧化铬、n a n 3 购自北京化学试剂公司，脂蛋白酯酶( l p l ) 为日 本东洋坊公司产品。 1 2 标本来源 所用血清样本为自北京医院检验科收集的高甘油三酯血症患者( 2 4m m o l l 甘油三酯水平 5 6m m o l l ) 和血脂正常者( 甘油三酯水平 1 2m m 0 1 l ) 的新鲜混 合血清，及采集1 0 6 名健康北京居民空腹血液，分离血清后保存于一8 0 。 1 3 仪器和材料 a p i4 0 0 0 质谱仪( a p i 公司，美国) ，a 鲥e n t1 2 0 0 高效液相色谱仪( a g i l e n t 公司，美国) ， n o v a p a kc 1 8 色谱柱、n o v a _ p a ks i l i c a 色谱柱、真空泵( w a t e r s 公 司，美国) ，x l 9 0 超速离心机、c e n t r i t u b e 离心管切割器、1 m l 可切割的超速离 心管( 8 5 1 m m ) ( b e c k m a nc o u l t e r ，美国) ，3 1 8 k 离心机( s i g m a 公司，德国) ， 减压干燥箱 ( f i s h e rs c i e n t i f i c 公司，美国) ，w s l o o d 振荡器( w i g g e n s 公司， 德国) ，氮吹仪( 北京八方世纪公司，中国) ，m i c r 0 l a b5 0 0 稀释器( h 锄i l t o n 公 司，美国) ，l a u d r p l 8 水浴( l a u d r ，德国) ，电子天平( s a n o r i o u s ，德国) ， a n t 吣a r ( d m a 4 1 0 0 m ) 密度计( a n t o n p 虬恹，奥地利) ，等。 2 血清c en 3 脂肪酸指数的测定 2 1 血清样品的分离、储存及分析前准备 将收集到的新鲜血液样本于室温下静置1 小时凝固后，在4 下3 5 0 0 r p m 离 心1 5 分钟，分离血清，2 0 0 u l 份，分装后冻存于8 0 。分析前取出，在血液混匀器 北京协和医学院硕上学位论文 上室温混匀1 小时。 2 2 溶液的配制 ( 1 ) 甘油酯的碱醇水解液 千分之一天平称取1 6 3 2 9 n a 0 h ，用去离子水定容至1 0 0 m l ，混匀，即得4 m o l l 的n a 0 h 溶液，与无水乙醇按体积比l ：9 混合，混匀，即得甘油酯的水解液。 ( 2 ) 中和液的配制 耿1 8 m l 乙酸，加在5 0 m l 去离子水中，即得0 6 m o l l 的乙酸中和液。每次 使用需新鲜配制。 血清t g 水解及c e 的提取 用稀释器取血清2 0 p l ，冲入2 m l 试管中，冲洗液为甘油酯的碱醇水解液，冲 洗体积为o 8 m l ，v o r t e xo 5m i n ，加o 5 m l 中和液，v o r t e x ，加1 m l 正己烷，密封 试管，在水平震荡器上震荡3 0m i n ，提取正己烷层o 7 m l ，置于h p l c 进样瓶中， 4 0 下氮气流吹干或减压挥发至干。 2 4h p l c 分析 将样品残渣溶解于o 4 m l 流动相，取o 0 5 m l 进行h p l c 分析。采用n o v a p a k c 1 8 色谱柱( 5 “m ，3 9m m 1 5 0m m ) ，流动相为乙腈- 异丙醇一正己烷( 5 5 ：5 0 ：1 5 ) 的 混合溶剂，流速1 2m l m i n ，紫外( 2 0 5n m ) 检测。实验在室温下( 2 2 2 7 ) 进行。 2 5c en 3 脂肪酸指数的计算 c en 一3 指数表示为n 3c e 的校正摩尔数在所有c e 校f 摩尔数之和中的百分 比，即将c e 的峰面积乘以相应的校正因子，得到c e 的校f 峰面积，计算n 一3c e 的校f 峰面积在所有c e 校f 峰面积之和中的百分比。公式如下： c e n 3 指数= ( a 。3 f 。3 ) ( a i f i ) 1 0 0 注：式中a 为各胆l 司醇酯的峰面积；f 为各胆i 州醇酯的峰面积校止冈子。有关f 值的测定 及计算弛。卜文。 3c e 组分的质谱鉴定 目前国际上无2 0 ：5 一c e 和2 2 ：6 c e 商品，用h p l c 分离的预期色谱峰需用串联 质谱鉴定。由于各c e 结构相近，鉴定n 3c e 的质谱条件可通过已有的c e 标准品 确定。 北京协和医学院硕士学位论文 3 1c e 标准溶液配制 取2 0 ：4 - c e5 m g ，以5 m l 异丙醇溶解，浓度为1 m m l ；取1 8 ：2 一c e1 0 m g ，以l o m l 异丙醇一乙腈( 1 ：1 ) 溶解，浓度为2 5 m m l ；取1 8 ：1 c e7 5 m g ，以5 m l 异丙醇一乙腈 正己烷( 1 2 ：1 2 ：1 ) 溶解，浓度为1 5 m m l ；取1 6 ：o c e5 m g ，以5 m l 异丙醇正己烷 ( 1 ：1 ) 溶解，浓度为l m m l 。 3 2 样品中c e 组分的收集及分析前准备 用总胆固醇含量为2 0 0 m d l 的定值血清，按前述样品制备方法，在上述h p l c 条件下，根据各c e 的保留时间，收集各c e 组分，氮气下吹干，溶于含1 0m m o 儿 乙酸铵的氯仿甲醇( 3 ：1 ) 溶液中。 将前述配制的c e 标准溶液在氮气下吹干，残渣溶于含1 0m m o l l 乙酸铵的氯 仿甲醇( 3 ：1 ) 溶液中，用于质谱鉴定。 3 3 质谱条件 采用电喷雾离子源( e s i 源) 的正离子模式，流速1 0 肛l m i n ，裂解电压_ 2 0 v ； 入口电压= 1 0 v ；碰撞能量= 1 3 e v ；离子源温度2 0 0 。 3 4 质谱分析 用a p i4 0 0 0 型液相色谱串联质谱( l c m s ) 检测器，采用电喷雾离子源( e s i 源) 的正离子模式，对c e 标准品进行全扫描( q 1 扫描) 。用注射泵将样品溶液注 入质谱检测器。在子离子扫描模式下，扫描范围从6 0 0 到7 5 0 ，扫描时间为3 m i n ， 离子源温度为2 0 0 ，发现各c e 均产生以胆固醇脱去o h 的母核，其质荷比3 6 9 3 。 再以3 6 9 3 为子离子对样品中收集的各c e 组分进行母离子扫描，监测各c e 的 ( m + n h 4 ) 十，2 2 ：6 c e 、2 0 ：5 c e 、2 0 ：4 c e 、1 8 ：2 一c e 、1 6 ：1 c e 、1 8 ：l c e 和1