疟原虫检验技术.ppt

疟原虫镜检技术,中国CDC寄生虫病所疟疾室郑香,分子生物学、血清学技术发展迅猛,但是确诊疟疾的“金标准”仍然是血液显微镜检查显微镜检查是唯一可鉴别4种疟原虫的方法厚薄血涂片的检查仍被认为是不可替代的疟疾诊断的金标准,实验室技术,厚薄血膜的制作,镜检技术血片制作,制作血片前，首先要核对患者的姓名和年龄,取血部位和血量,取血方法采血部位：耳垂或无名指，通常在耳垂取血，先用75%酒精棉球消毒取血部位，待酒精干后，用左手拇指和食指紧捏耳垂上方或无名指指尖，右手持消毒针迅速刺入皮肤，不宜过深或过浅。然后用右手中指轻轻挤压出血。厚血膜血量约一粒米大小。,厚血膜用推片的一角，从取血部位刮取约4微升血量（相当于火柴头大小），使血滴与平置的载玻片接触，再由里向外一个方向旋转，转24圈，涂成直径0.81厘米大小圆形厚血膜。薄血膜再取一小滴血.将血置于第一张玻片离厚血膜适当远的地方.将采血玻片(推片)的边缘紧贴载玻片使血液沿边缘散开(如图示).,正确的推片姿势,标准的疟疾厚薄血膜片位置,各种不同的疟疾血片涂制法：,标准血片,门诊发热病人血片,居民普查血片,厚薄血膜的标准,厚血膜血量适宜，不宜过多或过少薄血膜平整,无皱折和空泡.红细胞单层排列,血片染色,两种染色方法:吉氏染色法瑞氏染色法常用吉氏染色法,吉氏染液(原液)的配置,吉氏染粉(AzureBtype)5g甘油(纯)250ml甲醇(纯)250ml吉氏粉放入研钵中，加少量甘油充分研磨,然后边加边磨，直至甘油加完，将研磨的染液倒入棕色瓶中，在研钵中加入少许甲醇清洗研钵，然后倒入棕色瓶中，再放入甲醇清洗，反复数次，直至甲醇用完。盖好瓶盖，将染液充分摇匀，置于室内，每天晃动数分钟，存放一周后经过滤即可使用。保存时间越长染色效果越好。整个染色液配制时间不能少于5个小时,稀释吉氏原液,原液需经缓冲液或净水稀释后，方可用于厚薄血片染色。吸取母液时，不要晃动瓶子,以免沉淀物泛起影响染色效果.,操作1（快染）量筒内量2ml缓冲液或净水，直接滴加吉氏原液7滴，混匀，滴入待染标本的厚薄血膜上，染色10min，清水细缓冲洗，晾干镜检。操作2(慢染)在量筒内量2ml蒸馏水或净水，再滴加吉氏原液4滴，混匀，滴入待染标本上，染色3040min。清水细缓冲洗，晾干镜检。,吉氏染液浓度,门诊染色,将已固定薄血膜的血片插入染色缸，倒入3%吉氏染液稀释液（3毫升吉氏原液加缓冲液或净水97毫升，混匀）浸没血片，同时对厚薄血膜染色30min（如染液不合标准时，得酌情增减染色时间和浓度），然后用清水轻轻将染液漂洗干净，将血片标本（血膜面朝下）插于晾干板上晾干，包装，镜检。,成批血片染色,质量好的染色:核呈红色,胞浆呈蓝色如果血片偏红,说明染液偏酸性如果血片偏蓝,说明染液偏硷性,外观吉氏染色血片,染色过程,将血片平置于染色板上.用吸管吸取已稀释的吉氏液约2ml于厚薄血膜上，染色10min。用流水轻轻冲去染液，注意不要冲走厚血膜。置玻片于插板上，自然晾干。,血片干燥后,用甲醇固定薄血膜,血片制作注意事项,载玻片必须清洁无油污，不然会影响血片制作和镜检结果干燥血片时不要加热，加热会使原虫变形，影响镜检结果配置母液时过滤可除去杂质颗粒，有助于提高镜检质量,原虫密度计算,计算疟原虫密度的三种方法：白细胞原虫密度计数法(厚血膜WHO)半定量计数法(厚血膜)红细胞感染率计算法(薄血膜),在厚血膜按视野顺序，从看到第一个疟原虫开始计数，记录200个白细胞中的疟原虫数（可分有性体和无性体），如果原虫密度较低，可增加白细胞计数（5001000个）。白细胞疟原虫计算公式：疟原虫数计数的白细胞数患者每微升血白细胞数=疟原虫数/l血。如果不知患者的白细胞数，则每微升血以8000个白细胞计数(国际标准)。,白细胞疟原虫密度计数法,白细胞疟原虫计数法举例,假设计数200WBC中有35个疟原虫，在不知患者白细胞数的情况下，以每微升血8000个白细胞为数,由此计算出每微升血液疟原虫密度为：,35（疟原虫数）200（计数的白细胞）x8000（每微升血白细胞数）=1400/l,答：该患者的疟原虫密度为1400/l。,用厚血膜每个视野中所观察到疟原虫的平均数粗略地估计出疟原虫密度。这种方法简便，缺点是计数的疟原虫数受血膜厚薄影响，只能定性，不宜作定量分析。国内常用。此方法将密度分为6级：1.全厚血膜查见疟原虫数在10个以内，记录实际数字2.全厚血膜查见疟原虫数在10个以上，但平均每个视野不到1个虫，记录“少”3.平均每个视野15个虫，记录“”4.平均每个视野610个虫，记录“+”5.平均每个视野11100个虫，记录“+”6.平均每个视野100个虫以上，记录“+”。,半定量计数法,薄血膜不同区域的红细胞疟原虫感染率有较大差别，通常血膜后端和边缘部疟原虫密度常比前半部或中央部高，所以，镜检时不宜只检查一个角落，应顺玻片的横轴检查。镜检时，应当记录下所观察到的各种疟原虫虫期，不要笼统地记录为Pv或Pf。,红细胞感染率计算法（薄血膜）,1.按以下公式计算：红细胞原虫感染率（%）=疟原虫数计数的红细胞数X1002.显微镜下选择红细胞排列整齐密集，无重迭的视野（300-500红细胞/视野）3.按一定顺序移动血片记数红细胞的同时，记录疟原虫数,4.如果能见到疟原虫，但是记数10000个红细胞时却没有感染红细胞，那么设定感染率为,红细胞感染率计算法（薄血膜）,如何确定疟原虫血片为阴性,检查全部厚血膜未查见疟原虫最少检查100个厚血膜油镜视野未查见疟原虫,人类四种疟原虫的基本特征,感染人的疟原虫有四种:,恶性疟原虫P.falciparum间日疟原虫P.vivax三日疟原虫P.malariae卵形疟原虫P.ovale,恶性疟P.falciparum,分布热带、亚热带，是非洲的重要疾病我国流行区域为云南省和海南省四种疟原虫中致病力最强，无免疫力者感染后出现急性症状,不及时治疗可危及生命,间日疟P.vivax,间日疟原虫分布于我国大部分地区,主要是中部地区病程良性,有复发,遍布全球温带地区及大片热带地区。在热带非洲，特别是西非则很少见,三日疟P.malariae,遍及热带和亚热带地区，特别是东、西非洲，圭亚那及印度部分地区，呈片状、块状分布三日疟在我国非常少见，只在南方广西有过散在报告无复发卵形疟P.ovale又称蛋形疟原虫,主要分布非洲。太平洋地区、缅甸、东南亚有散在报告在我国已基本消灭症状与间日疟相似,有复发,四种疟原虫的诊断要点,环状体钎细,红细胞不涨大一个红细胞内可有几个环状体,环状体内可有2个核环状体可贴在红细胞边缘血片中没有其他发育期滋养体配子体呈新月形或腊肠形成熟裂殖体约含8-26个裂殖子可出现茂氏点,恶性疟（P.falciparum）鉴定要点,红细胞通常涨大薛氏点明显成熟环状体粗大滋养体胞浆有阿米巴样伪足可见各发育期滋养体成熟裂殖体约含12-24个裂殖子,间日疟（P.vivax）鉴定要点,红细胞不涨大或略小环状体可呈方形胞浆不活跃呈带状形成熟滋养体呈菊花状,内含6-12个裂殖子核可能出现在环状体边缘,三日疟（P.malariae）诊断要点,卵形疟（P.ovale）诊断要点,红细胞涨大常见慧星状(也称齿轮状)环粗大薛氏点明显成熟滋养体类似三日疟原虫,但更粗大成熟裂殖体约含6-14个裂殖子,薄血膜中疟原虫寄生时红细胞的变化,镜检示教,以下血片采自现症病例,AtypicalPlasmodiumfalciparumpresentation.,NumerousfineringformsDoublechromatindotsMarginalformsRedcellsarenotenlarged,AtypicalPlasmodiumvivaxpresentation,Salientfeaturesare:Developingandthick(signet)ringformsEnlargedredcells,AtypicalPlasmodiumovalepresentation,DevelopingformofplasmodiumComet-likeredcellsEnlargedredcell,AtypicalPlasmodiummalariaepresentation,BroadbandformofplasmodiumRedcellsnotenlarged,NumerousringformofPlasmodiumcanbeseen(asindicatedbythearrows).Notesizeofneutrophils(forcomparison).,TheonlydefinitivediagnosisthatcanbemadefromthisfilmisthatMalariaispresent.Thinfilmswouldhavetobeexaminedforspeciesidentification.,读片练习,2.Intermittentfever;arrivedfromIndia2monthsago.,3.HistoryofroundtheworldsafariincludingS.America,AsiaandAfrica.Generalmalaise.,4.Unspecifiedoverseastravel.Presentedwithtemperature38.4C,5.MalerecentlyreturnedtoAustraliaafterbackpackingthroughAsia.Historyofflulikesymptoms.,6.NewAustralianpreviouslyfromMalaysia.Intermittenttemperaturesandheadaches.,7.Achesandpains,withfever.?GlandularFever,?malaria.,12.Businessman;historyofextensiveoverseastravel.Hashadfrequentboutsofvirusinfections.,14.50yearoldmalepatientpresentedwithfeverafterholid