（作物遗传育种专业论文）促进部分同源染色体配对的phKL基因在小麦远缘杂交中的遗传与应用评价.pdf

摘要 普通小麦是个异源六倍体，由具有部分同源关系的a 、b 、d 三个染色体组组 成，然而在其减数分裂中期i 时花粉母细胞却呈现二倍体化的配对特征，即只发 生同源染色体间的配对而没有出现部分同源染色体问配对紊乱的现象，这是由位 于5 b l 上的肋，基因和3 d s 上的基因控制的。 本研究利用a e g i l o p sv a r i a b i l i s 和s e c a l ec e r e a el 为测验种对存在 于普通小麦开县罗汉麦中的p h k l 基因促进部分同源染色体的配对能力与中国春 人工突变体c s p h ，。c s p h ；, 。c s p h , , 进行比较，结果表明c s 肋。促进部分同源染 色体配对能力最强，肋触促进部分同源染色体配对能力介于_ d 方。和口乜之问。 t k l 是由具有p h k l 的小麦开县罗汉麦与中国春肋。杂种f 为母本。 a e v a r i a b i l i s 为父本杂交，而后自交选择得到的含有外源a e v a r i a b i i i s 遗 传物质的易位系，本研究通过细胞学表明t k l 促进部分同源染色体配对能力与具 有p h k l 基因的丌县罗汉麦类似，而显著低于小麦中国春p h 属同时通过微卫星 分子标记并不支持t k l 中3 d s 臂缺失( 3 d s 染色体臂上有户扎基因，此基因的缺少 可显著增加部分同源染色体配对) 这表明t k l l 易位系的获得不是肋。的作用或 者户基因缺少诱导部分同源染色体配对产生的易位，而可能是由p h k l 基因的诱 导产生的，这表明p h k l 基因在远缘杂交进行外源基因转移中有实际的应用价值。 在t k l t 的微卫星扩增产物中出现了多个与所有亲本都不同的扩增结果，这可 能与小麦一a e v a r i a b i l i s 远缘杂交过程中的d n as l i p p a g e ( d n a 滑链) 有关 许多微卫星引物在a e v a r i a b i l i s 有扩增产物，表明来自小麦的一些微卫星 引物可能在a e v a r i a b i l i s 分子标i 已工作中有利用价值。 关键词：小麦，p h 基因。染色体配对，易位，微卫星，a e g i l o p sv a r i a b i l i s a b s t r a c t g e n e t i ca n du t i l i z a t i o ne v a l u a t i o n0 1 1p h k lg e n e f a c i l i t a t i n gh o m o e o l o g o u sp a i r i n gi nw i d e c r o s so f w h e a tw i t ha l i e ns p e c i e s x i a n gz h i - g u o ( p l a n tb r e e d i n ga n dg e n e t i c s ) s u p e r v i s e db yd r l i ud e n g - c a i b r e a dw h e a tc o n t a i n st h r e ec l o s e l yr e l a t e dg e n o m e sa ，ba n dd ，w h i c hs h o w sa sa h o m o e o l o g o u sr e l a t i o n s h i p h o w e v e r ，w i t h o u th o m o e o l o g o u sc h r o m o s o m ep a i r i n go c c u r s d u r i n gm e i o s i s i nt h i s a l l o h e x a p l o i da n dp a i r i n g i s s t r i c t l y c o n f i n e dt o h o m o l o g o u s c h r o m o s o m e s w h i c hi sm a i n l yc o n t r o l l e db yt h em a j o rg e n e sp h ia n dt h ep h 2 ，l o c a t e do n5 b l a n d3 d s ，r e s p e c t i v e l y c o m m o nw h e a tl a n d r a c ek a i x i a n l u o h a n m a i ( a b b r e v ，k l ) ，o r i g i n a t e di ns i c h u a no fc h i n a , c a r r yg e n ep h k lw i t hp r o m o t i n ge f f e c to nh o m o e o l o g o u sp a i r i n gb e t w e e nw h e a ta n da l i e n c h r o m o s o m e s i nt h i sr e s e a r c h ，a e g i l o p sv a r i a b i l i sa n dr y ew e r eu s e da st e s tl i n e st oe v a l u a t e t h ee f f e c to nf a c i l i t a t i n gh o m o e o l o g o u sp a i r i n go f p h k lb yc o m p a r i s o nw i t hm u t a t i o n sc s t ， h c s r h 2 ba n dc s p h l b i tw a ss h o w e dt h a tm u t a t i o nc g p h l bh a st h es t r o n g e s te f f e c to nf a c i l i t a t i n g h o m o e o l o g o u sp a i r i n g t h a n o t h e r s t h e e f f e c t o f p h k l w a ss i t u a t e db e t w e e n p h l b a n d p h 2 t k l i ，at r a n s l o c a t i o nd e r i v e df r o ma ev a r i b i l i sa sm a l et oc r o s sw i t hf th y b r i d i z a t i o n b e t w e e nc s ( w h e a tl a n d r a c ec h i n e s es p r i n gw a sa b b r e v i a t e da sc s ) w i t hp h l ba n dk lw i t h p h k l i nw i d ec r o s s e sw i t ha l i e ns p e c i e s ，t k l is h o w e ds i m i l a rh o m o e o l o g o u sp a i r i n gl e v e la s t h a to fk lw i t hp h k la n dm u c hl o w e rp a i r i n gl e v e lt h a nt h a to fc sw i t hp h l b m e a n w h i l e ， s s r ( m i c r o s a t e l l i t e ) m a r k e ra n a l y s i ss h o w e dt h a t3 d so f w h e a ti ss t i l le x i s t ，w h i c hc a r r i e sp h 2 g e n e t h es t u d i e sr e s u l t ss u g g e s t e dt h a tt r a n s l o c a t i o nt k l lw a sp r o b a b l yc a u s e db yt h e i n d u c t i o no f p h k lg e n er a t h e rt h a np h _ ho rp h 2d e l e t i o n ，t h u ss u g g e s t i n gt h eu t i l i z a t i o nv a l u eo f p h k li na l i e nc h r o m o s o m a ls e g m e n ti n t r o g r e s s i o nf r o ma l i e ni n t ow h e a tc h r o m o s o m ev i a h o m o e o l o g o u sc h r o m o s o m ep a i r i n g i na d d i t i o nt o ，s o m es s rp r o d u c t si nt k l fw e r ed i f f e r e n tf r o mt h a to fi t sp a r e n t s ，w h i c h m a yb ec a u s e db yd n as l i p p a g ed u r i n gt h ec o u r s fo fw h e a tc r o s s i n gw i t ha e v a r i b i l i s al o t o fs s r p r i m e r sc a na m p l i 母p r o d u c t si na e v a r i b i l i s ，w h i c hr e f e r r e dt h a tt h e s es s rp r i m e r s f r o mw h e a tm i g h tb eu s e da sm o l e c u l a rm a r k e r si na e v a r i b i l i s k e yw o r d s ：w h e a t ，p hg e n e ，c h r o m o s o m ep a i r i n g ，t r a n s l o c a t i o n ，s s r ，a e v a r i b i l i s 附什一 论文独创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行研究工作所 取得的成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，学位论文中 不包含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果也不包含为获得四川农 业大学或其它教育机构的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作的同志对 本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名：林通文司 山$ 年o 月衫同 关于论文使用授权的声明 本人完全了解四川农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借 阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意四川农业 大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 研究生签名 湘三习 跏鼢笏 p 等年p 莎月) 石日 。，年品月易日 1 文献综述 在自然界生物中，特别是显花植物中，大约7 0 是多倍体。多倍体可分为同 源多倍体和异源多倍体。同源多倍体是由相同染色体组组成，而异源多倍体由具 有部分同源关系的不同染色体组构成。这种具有部分同源关系的异源多倍体在花 粉母细胞的减数分裂中却没有发生染色体配对的紊乱，而是呈现二倍体化的配对 特征。普通小麦是典型的异源六倍体，普通小麦中减数分裂染色体二倍体化配对 机制是由肋基因控制的。在野生型中，肋基因呈显性，即抑制部分同源染色体 间配对的发生，而当其呈隐性突变或缺失或受到抑制时，便会在花粉母细胞减数 分裂中期i 观察到部分同源染色体间配对。 1 1 小麦肋基因遗传体系的发现及其突变体f i i j a i 0 普通小麦( 行j t i c u ma e s t i v u ml ) 是由a a 、b b 、d d 三个染色体组构成的异 源六倍体( 2 n = 6 x = 4 2 ) ，每个染色体组有7 对染色体，分别来自3 个不同的近缘 二倍体物种。虽然小麦这三个染色体组相应染色体成员之间( 如1 a 1 b ，i d ) 有部分同源关系，但是减数分裂终变期和中期i ，染色体配对只发生在闹源染色 体之间而部分同源染色体之删并不发生配对，染色体配对成2 1 个二价体，而没 有三价体或多价体，表现为“二倍体”化特征。大量的研究已表明。这是由肋 ( p a i r i n gh o m o e o l o g o u s ) 基因系统所控制的。r 本学者o k a m o t o 首先于1 9 5 7 年发现普通小麦的5 b 缺体在减数分裂中期i 不是正常的2 0 个二价体。而是出现 了单价体和多价体”3 ，由此拉丌了助遗传体系研究的序幕：接着在普通小麦的 单倍体2 n = 2 1 与5 b 缺失的单倍体2 n = 2 0 的减数分裂中期i 比较发现前者只形 成2 1 个单价体，而后者则形成一定数量的二价体、三价体等多价体。由此可确 定普通小麦的5 b 染色体上存在影响配对的基因“1 。1 9 7 1 年w a l l 等用5 b l 、5 b s 双端体分析法。将此基因定位在5 b l 的近末端，距离着丝粒5 0 6 5 - - + 0 4 3 c m 。并 取p a i r i n gh o m o e o l o g o u s 的缩写，将其定名为肋基因“1 。1 9 7 1 年，m e l l o s a m p a y o 用相似的研究方法发现3 d s 上也存在一个部分同源染色体配对抑制基 因，但作用强度仅为5 b l 的一半或略强一点。1 。1 9 7 9 年m c h i n t o s h 将5 b l 、3 d s 上的抑制基因区分为肋，和户氇基因。在普通小麦的肋遗传体系中，除了胁和 产扎两个注效抑制部分同源染色体配对基因外，还在2 、3 、4 、5 、6 等多个部分 同源染色体群上存在多个促进或抑制配对的微效基因“。 由于助遗传系统也会阻碍小麦与外源物种杂种的部分同源染色体配对的发 生。当肋遗传系统不发生作用( 缺失或突变或受到抑制) 时，部分同源染色体间 配对就会发生，就有可能引起遗传重组，使外源遗传物质向小麦转移。因此，获 得肋基因的突变体就变得相当重要。w a l l 等用e m s 处理中国春种子，s e a r s 用 x 一射线照射中国春幼穗，而后以黑麦、粘果山羊草测配分别获得3 d s 上的比 和p h i “。肋，。是用中国春经x 一辐射诱变而来是一段包括肋，在内大约7 0 m b 片段 的缺失”3 。脚。是栽培圆锥小麦c a p p e l l i5 b l 的一段中部缺失。“”。肋，的5 b 缺 体一5 d 四体，以及5 b s 的双端体等这些人工创造的遗传工具都曾用于外源遗传物 质的转移。另外在小麦族近缘种属存在肋基因的抑制基因。如黑麦5 r 、长穗偃 麦草3 e 、4 e 、5 e 、6 沙，山羊草属a e g i o p ss p e t o i d e s 和a e g j l o p s m u t i c a 等物种具有对肋基因的抑制作用“。”3 。其中来自a e g i l o p ss p e t o i d e s 的显著抑制p h ，基因的显性基因肋已转移到普通小麦中国春中 14 1 获得了肋7 这 个有力的工具材料。 与这些人工突变体或导入外源抑制基因不同在自然界中也可能天然存在 肋基因的隐性突变体“。”7 。例如，在来自以色列的野生四倍体小麦，天然 存在这种隐性突变，并且可能是肋，位点的变异“。在一些小麦地方品种中天然 存在作用与施类似的隐性基因，如来自中国四川的普通小麦地方品种“开县罗 汉麦”的6 a 染色体上存在一个助隐性突变基因p h k l “。“。”1 。 1 2 肋遗传体系的作用机理 肋基因从发现至今已研究了几十年，对其作用机理提出了许多假说，概括 起来主要有两种。( 1 ) 减数分裂前联会假说。或称体细胞联会假说。( 2 ) 减数 分裂前期i 联会假说：该假说认为肋，基因主要作用于第一次减数分裂的偶线期 和粗线期，在偶线期的早期阶段，联会受到了严格控制。对偶尔发生的部分同源 染色体间的配对起纠错作用，在粗线期肋，基因的主要作用是抑制偶尔发生配对 的部分同源染色体间交换的发生。 支持体细胞联会假说的证据有：f e l d m a n 等发现，在正常剂量助，情况下， 没有部分同源染色体间配对的发生，而在超剂量肋一情况下( 三条等臂5 b l ) ， 同源染色体配对减少而部分同源染色体问配对和互锁二价体增加，由此推测助- 基因通过抑制减数分裂前染色体的联合来控制染色体的配对“4 “1 。在正常剂量 肋，情况下，减数分裂前染色体问联合受到部分抑制，导致部分同源染色体间的 配对消失：在高剂量肋，情况下，同源染色体间的联合在减数分裂前也受到抑 制，导致整个同源染色体配对的减少而使多价体和互锁二价体的增加。另外他们 还通过观测端着丝粒染色体在根尖细胞有丝分裂中期的分布研究表明，非同源端 着丝粒染色体在根尖细胞中的位置是随机的，而同源端着丝粒染色体则明显紧挨 在一起”- 。 秋水仙碱等破坏微管系统的药物被用来表型模拟肋，基因的作用。用秋水仙 碱处理含不同剂量助，基因的小麦根尖，发现缺少p h , 基因的植株极显著地比f 常植株敏感，而超剂量植株最不敏感表明肋，基因可能是与微管的结构和功能 特征有关，推测肋，基因的存在可能会干扰构成微管亚单位的装配与反装配间的 动态平衡，从而牵引着着丝粒在核内形成不同的排列方式圳。肋，基因的存在 可能会使着丝粒和微管系统更具稳定性。进一步，利用等臂同源染色体来分析 肋，基因与秋水仙碱间作用方式的近似性。由于等臂同源染色体具有相同的着丝 粒，两臂同源，如果此染色体内配对受到抑制，表明是在联会或联会后事件得到 削弱，如果染色体自j 配对得到抑制而染色体内配对正常表明此是联会前事件得到 削弱。基于这种认识基础，他们发现肋，基因与减数分裂前秋水仙碱处理具有类 似的作用模式，即肋，基因和秋水仙碱能减少染色体问配对而不影响染色体内的 配对，而在s y n - b l ( 位于3 b l 上对联会和交叉形成起作用) 缺失时，染色体内部 配对减少，表明助，基因在减数分裂联会前起作用“。近年来应用原位杂交技 术，在小麦的大麦和黑麦附加系在减数分裂间期染色体的排列情况也为此假说提 供依据啪1 。因此认为肋，基因可能至少在两个不同时期表达，第一次是在即将进 入减数分裂的间期表达，而后才在减数分裂的前期i 的细线期至粗线期表达。在 间期户竹，通过空间隔离基因来决定同源染色体与部分同源染色体间减数分裂前的 联合模式，只有同源染色体阃相互靠近。导致他们发生减数分裂前的联合。而只 有在减数分裂前发生联合排在一起的染色体才会在减数分裂的前期i 发生配对， 即发生排他性的同源染色体配对，在此基因缺失的情况下，在间期同源染色体和 部分同源染色体问也发生相互靠近，导致第一次减数分裂的前期和中期发生多价 体的配对“。 同样承认异源多倍体在减数分裂前间期会发生染色体的联合，但励，基因具 有不同的作用方式。m a r t i n e z e 等应用三维成像技术对小麦减数分裂前联合进行 了观察。观察表明，在间期末至细线期染色体呈r a b l ( 拉布尔) 构型，即着丝 粒先在核的一端聚集呈单倍体数目，而端粒在相对一极分散j 丌。数目为二倍体 数，此时由于染色体还处于分离状态，故着丝粒间的联合多为非同源染色体问的 联合，紧接着染色体呈v 字形。据此可判断联会先在着丝粒处发生，形成2 1 个 联合的着丝粒对o “8 。“，但此时的联合中7 0 8 0 为部分同源染色体间的联合，这种 联合必须得到纠错才可保证同源染色体间的联合肋，基因的作用可能就是降低 部分同源染色体间联合的稳定性。”。1 ”。此后联合的染色体沿着染色体的整个长度 相互靠近，端粒慢慢聚集成簇，此时称为端粒花束期，在严密的花束期形成之 前，2 1 个联合的染色体对通过着丝粒的多重相互作用，形成每个组群含有6 个 相应部分同源染色体( 如l a1 bi d ) 的呈弥散分布的7 个组群，这样6 个部分 同源染色体可能通过着丝粒间多重相互作用被重新筛选，此时同源染色体着丝粒 间的联合增加至9 0 。出于部分同源染色体间具有不同的浓缩比率肋，基因 可能与部分同源染色体问浓缩差异相结合起作用。“1 ，以确保同源染色体分布在同 一个组群中并在同一时间发生浓缩，保证同源染色体间的联合在其缺失时，同 源染色体可能在不同组群中分布，也就不可能在同一时间发生浓缩。他们还在小 麦与黑麦的杂种的间期观察到，肋，基因不可能阻止非同源染色体的着丝粒在减 数分裂前的联合，但在端粒花束期的后期，只有在助，基因缺失的情况下形成的 七个组群内部分同源染色体问向两个方向延伸分解成两个着丝粒对。即仍能观察 到配对，而在该基因存在时，组群内形成四向结构即a 、b 、d 、r 非同源着丝 粒间发生解离，没有配对发生。因此，助，基因具有对减数分裂前在着丝粒或沿 着染色体其他位点发生错误联合的纠错的潜力“”。染色体联会起始于其端部，而 此时着丝粒多重结构己完成，在产基因存在时，使得那些起始于部分同源染色 体间端部的联会由于在着丝粒处未配对而使发生的错误联会立即得到纠正。另外 他们还在小麦根中木质部微管柬细胞和花粉囊中花粉母细胞处于间期的绒毡层细 胞中发现着丝粒的联合进一步证实体细胞联会假说。”。 支持减数分裂前期i 联会假说的证据有：l u o 等1 9 9 6 年利用来自，黼c d c 口册 的1 a “和小麦的1 a 之间形成的易位系1 a ”，该易位系或具有相同着丝粒而染色体臂 发生易位，或具不同着丝粒而具有相同的染色体臂，利用此易位系与肋小麦和 肋。小麦杂交，观察其f p m c 的配对情况。发现在肋，中很少发生重组，而在胁一 中则发生重组，由此可以证明肋，不具有影响微管与着丝粒之间相互作用的作 用。而可能只是在同源染色体配对中可能起促进识别的作用。“”1 。 d v o r a k 等2 0 0 0 年用在小麦遗传背景中部分同源等臂染色体2 b l - 2 r l 在 肋j 基因存在或不存在状态下对其配对情况进行了观察。发现在砌，基因不存在 时。2 b l 和2 r l 间发生配对，而在助，基因存在时，此两个部分同源等臂染色体 间没有配对的发生。由于这条部分同源等臂染色体2 b l 2 r l 具有相同的着丝 粒，由此推断着丝粒并不是助，基因作用的位点，助，基因可能在染色体配对过程 的纠错中起作用”。“”。 与此相一致，m a r t i n e z 等通过电镜观察了不同剂量肋，基因的四倍体小麦的 减数分裂的配对情况。发现在前期i 的偶线期，p 。和助，基因型中都有多价联 会复合体的形成且不存在差异。在粗线期由于胁基因的纠错作用，使肋，基 因型中多价联会复合体逐渐减少，而二价联会复合体增加，在肋，。基因型中出现 较多的多价体。在四剂量肋，基因型的中偶线期具有较多的二价联会复合体，且 其多价联会复合体在中偶线期至粗线期随着联会的进程在不断减少“”1 。 肋，缺失区可能不只含有个基因，暗示上述两种假说可能都存在。现已通过 中子微辐射处理小麦中国春得到一系列励，突变体。其中有的作用强度强于肋，。 而与5 b 缺体5 d 四体作用强度相当。这就可用来解释缺失段内有基因作用于减数 分裂前m 期联合，也有基因作用于此后的过程“1 1 关于现基因的作用机理研究的很少，一般以为与肋，基因具有相同的作 用。只是其作用效应比较小。仅为所，的一半，然而m a r t ir l e z 等通过电镜对三 种不同基因型( p h ”肋。，p h ，p h 。，p h ，尸扎) 在减数分裂前期i 的偶线期至粗线 期形态观察表明，髓z 基因与助，起不同的作用，肋，位点在整个前期i 都会对部 分同源染色体联会起纠错作用，在粗线期抑制部分同源染色体闻交叉的发生，所 以助，基因是真正的作用于部分同源染色体配对的基因，对多倍体的类二倍体行 为具有作用，而助，基因主要影响联会的完成。在砌廊k 中，联会的进程被推 迟，致使助，在粗线期对部分同源染色体联会的纠错过程中不能完全发挥作用。 因此不是真正的p h 基因，而是联会基因，它可能间接作用于肋，基因而起作用 。另通过观察p h 。卢k 与黑麦的配对构型发现，p h ，。相对卢如来说不能区分染 色体删的远近关系，p h 。的交叉多发生在染色体的远端，因而在后期易发生解 体，所以旆中后期小麦一黑麦染色体发生的频率比中期观察的配对要少的多 ( 1 0 ) ，而肋，。则相对较高( 3 3 8 ) “”。 1 3 肋基因的来源及在小麦进化中的作用 普通小麦中的肋遗传体系是由其二倍体供体提供的呢? 还是杂交后，各基 因组发生急剧的基因交流后，在相互适应的进化中形成一个相对稳定平衡的肋 遗传体系呢“”? 对助基因而言，在四倍体小麦的5 b l 上就已经存在肋，1 。尽 管提供肋，基因的b 染色体组二倍体供体还没有完全确定下来“”3 ，但是从其可 能的供体物种a e g i o p ss p e t o i d e s 具有抑制p h ，基因作用的显性基因来看 ”“肋，基因可能在b 染色体组的野生二倍体供体物种中就已经存在。 对于户钆基因来源，1 9 7 9 年，k t t i a 等利用节节麦( 小麦d 染色体组的野生 供体物种) 与助，缺失的普通小麦3 d l 双端体材料杂交，发现其有补偿助，的作 用，由此推测节节麦自身就含有胁基因“。 普通小麦是由大约八千年前分布在同一生境区的四倍体小麦与节节麦杂交而 后杂种发生自然加倍，获得的异源六倍体小麦。这种异源六倍体能够迅速稳定与 位于肋，基因的作用分不丌，f 是肋，基因的作用使刚获得的多倍体在减数分裂 过程中的染色体配对表现为二倍体化特征，而不是形成许多多价体，这就保证了 该多倍体物种能够正常结实，提高了育性“，因此砌，基因对小麦能迅速稳定下 来繁衍f 常子代起了关键作用。近年的分子进化研究表明，在新合成多倍体小麦 d n a 序列的非随机消失从而增加部分同源染色体的异质性可能对肋遗传系统充 分发挥功能起重要作用，这非常有助于普通小麦的起源m 。 1 4 肋基因系的应用及其改良 自从肋基因发现以来，国内外科学家对利用它进行小麦族近缘遗传物质向 小麦转移寄予厚望。相继研究了各肋基因突变体与粘果山羊草、易变、离果、 小亚、牧山羊草和三芒山羊草、黑麦、偃麦草、簇毛麦等近缘种属的杂种配对情 况，研究表明肋m 和肋7 诱导部分同源染色体配对作用强度最大且两者相当， 6 p h 2 b 、p h 2 , 作用强度为肋。的一半，但比野生型肋要大，约为其二倍。发现肋。 对物种的亲缘关系相对于施不敏感，因此一般在转移山羊草属外缘物质可用 p h 2 ，而在转移与小麦亲缘关系较远的小麦族其他近缘种属遗传物质，一般用 肋， ”1 。 为进一步提高助遗传体系转移外源遗传物质的能力，一个办法就是提高现有 部分同源染色体间配对的能力，例如口， 。和肋。的重组。”3 ，然而已有的研究表 明，这种策略虽然可以提高部分同源染色体问的配对能力，但是杂种的育性却大 大降低，很难得到回交种子”。另一种办法就是寻找一种与现有的肋遗传体系 作用机制不同的新型砌基因，特别是与重组有关的基因，与现有的肋体系结合 起来有望使肋体系得到更有效利用m 。“3 。 很难用助基因系培育出小麦品种。这一方面是由于p h , 。突变体与外源物种形 成的杂种中，其花粉母细胞中形成二价体的配对既有小麦与黑麦间配对。也有小 麦部分同源群间，致使小麦整套染色体分离到同一个配子中的几率大大降低，所 以无论回交或自交都难以得到种子：另一方面是由于肋基因工具材料以小麦“中 国春”为遗传背景，其农艺性状很差，较难改良，即使得到含外源物质的材料， 却难以在生产中得到应用。鉴于此，人们希望将，。基因转移到农艺性状优良的 小麦中，但肋，。是隐性基因，在转移过程中存在如何选择的问题，在用阿勃，北 京1 0 号的5 b 单体与肋，杂交选单体，而后用亲本5 b 单体连续回交，选单体，而后 自交通过与山羊草或者黑麦测交和选择来获得肋。纯合体，实现肋， 基因在品种间 的转移，克服了中国春农艺性状差的缺点“”，但此过程需要大量细胞学工作，况 且转育周期也较长。为了更简单迅速转移p h , 。基因，分子标记辅助选择是必要 的王新望等从大麦的s t s 引物中选择出肋基因的特异分子标记”，利用肋，。突变 体，仅用了三年时间就获得肋，蔗因的转移。通过, f l p 对c s 和c s ，扩增出差异产 物，并对扩增产物进行克隆，获得直接p c r 扩增用于肿， i 应择的特异引物”“”3 。 1 5p h 遗传体系的研究展望 1 5 1 p h 基因作用机理 对于p h 基因作用机理目前搞的还不是很清楚，克隆出该基因，无疑对弄清 其机理至关重要。由于p h m 是一段约为7 0 m b 大片段的缺失，且小麦在该区域多 态性标记较少，使该基因克隆变的非常困难”删。目前利用显微分离克隆技术已 建立了5 b l 和3 d s 染色体臂文库；同时，由于水稻基因组序列已经测定，利用禾 本科植物间基因分布的同线性原理，在水稻中找到与肋基因缺失区段共线的克 隆重叠群，可以利用水稻中共性的高密度的遗传图和部分基于y a c 的物理图去获 得这些肋基因缺失区段的特异标记，随着这些特异标记丰富可能使该基因利用 图位克隆策略得到克隆”5 。利用比较遗传学原理，发现水稻染色体l 短臂与 肋。呈共线性，并利用分布在其上的克隆群对小麦的e s t 文库进行同源性检索， 结果在水稻的6 0 个p a c 克隆重叠区的6 5 8 m b 区域内鉴定出2 1 8 个小麦e s t 分布 在p h 2 , ，缺失区段，估计约为8 0 m b 。分析表明有些p h z , , 的e s t 可能与d n a 的修复。 复制，重组和配对有关“。另发现肋。缺失区段与水稻的9 染色体末端同源1 。 异源多倍体含有多个部分同源基因组。这就比在二倍体物种配对中只要能区 别丌非同源染色体具有更高要求，即还要严格地区分丌含有多个基因与同源染色 体呈共线分布的部分同源染色体阳j 的配对。这需要更高效的染色体识别、配对以 及发生交换的策略，肋基因可能是作用于这种高效策略的基因之一。现在还不 知那些在二倍体物种中对染色体识别、配对以及发生交挽中起作用的各基因如 肋醇，d m c ，s p o 。p h s ，尼觋，尸a ，a h p , 等与肋基因之间的关系，这些基因 的突变是否在多倍体中由于得到部分同源染色体的部分补偿而表现得不明显，这 些都还需要进一步鉴定。 1 5 2p h 基因可否代表多倍体物种“二倍体化”配对的模型 自从在小麦中发现肋基因以来，科学家们推测在多倍体物种中可能都拥有 类似肋作用的基因，然而四十多年过去了，目前只在燕麦和多花黑麦草等为数 不多的几种物种中得到证实1 ，这使人们有理由怀疑在多倍体物种中可能还存在 有别于目前肋基因的新基因作用于减数分裂同源染色体二倍体化配对机制。例 如在山羊草属中在偶线期的联会只严格地发生在同源染色体间，在粗线期阻止偶 尔发生联会的部分同源染色体问配对的发生这不同于小麦中在偶线期有多价体 联会的存在，而在粗线期得到纠错，并且阻止已发生联会的部分同源染色体间交 换的发生”“7 ”1 。以前的研究表明肋，在普通小麦的正常及单倍体状态下均起抑 制部分同源染色体间配对的作用，而在六倍体f e s c u e s 和山羊草属的一些物种， 还有最近在油菜( b r a s s i 8n a p u s ) 中也发现在正常倍数下抑制部分同源染色 体配对，即自身配对正常，而在单倍体或杂种中却发生部分同源染色体配对，这 是一个不同于目前肋系统新的与配对和重组有关的基因，被命名为p r b n 基因 ”“。在开县罗汉小麦p h k l 中自身配对f 常，却在杂种中表现出高的部分高得部 分同源染色体配对情况1 ，作用类似于p r b n 基因，当然，有必要对p h k l 诱导的 单倍体植株自身配对情况进行鉴定后才可得到证实，如果单倍体也发生部分同 源配对，则是不同于肋系统的新基因。最近，m a r t i n e 等在对含中国春在内的三 个普通小麦的单倍体 f i i 的配对情况比较发现，另两个小麦单倍体配对水平明显高 于中国春，进一步观察表明这是出于在联会期能获得更多的联会所致”“。在四倍 体小麦单倍体中也观察到配对水平存在差异“”。这种类似p r b n 基因的二倍体化 机理仍不清楚。 1 5 2p h 基因的起源问题 现在还不是很清楚p h i 基因是否存在于二倍体物种中，因为通过细胞学观察 在山羊草和小麦属的二倍体物种都不存在减数分裂前的着丝粒等异染色质的联 合，而在如a 和d 染色体组人工合成的多倍体a a d d 中却存在，由此推测励基因 在二倍体物种中已存在，但是在二倍体物种中由于某些原因发生沉默只有在形 成多倍体中才诱导其表达州。但m o o r e 等在水稻中观察到着丝粒等异染色质在减 数分裂前有发生联合”，s u z u k i 等发现在l i l i u m 的二倍体物种中”“间期也能 观察到着丝粒数目呈单倍体数，由此推测在小麦尚未明确的b 染色体组供体二倍 体中也可能存在问期联合。但这样的认识都是基于肋基因在减数分裂前着丝粒 等异染色质的联合中起作用。综观果蝇、玉米、酵母、哺乳动物、小麦、水稻等 减数分裂过程中染色体的识别过程m 1 ，其起始过程各有特色，主要区别是识别的 时期和部位。如玉米中能观察到最早的染色体识别是在减数分裂前期的花束期端 粒的联合，着丝粒在整个配对过程没有联合发生。哺乳动物与此基本相同只是在 间期没有r a b l 构型产生，在前期才出现r a b l 构型。果蝇、小麦和j j f 册一样在 间期出现着丝粒联合，酵母中也发现着丝粒间期联合，但出现频率只有5 0 。而水 稻在间期出现了着丝粒和端粒都发生联合的现象，且大多是同源染色体联合。这 些不同的识别模式表明，识别蛋白作用于不同的识别异染色体质位点，是各物种 g 选取不同策略保证减数分裂严谨有序进行的一种进化的结果，在多倍体与二倍体 减数分裂识别过程中是否存在特异性还不得而知。减数分裂过程是个特别复杂过 程，染色体的识别，配对和重组都涉及到不同基因的表达，且可能在不同物种中 发生作用的模式不同，所以在二倍体水稻和l i l i u m 中观察到的着丝粒等异染色 质在减数分裂前有发生联合趋势是否是真f 类似肋基因在起作用尚不得而知， 这些有趣的问题值得近一步深入探讨。 2 立题依据 小麦族是个内含多种抗病抗逆的多个小麦近缘种属。远缘杂交是利用丰富小 麦族近缘种属向小麦中转移对其生产有益基因的有效方法。但在远缘杂交过程 中。由于存在远缘杂交后代的部分同源染色体不发生配对、交换外源遗传物质 难导入小麦染色体中等困难。通过操作册a 对控制系统可克服这一困难。例如， 运用肋基因突变体作为遗传工具，通过促进远缘杂种部分同源染色体间的联会。 从而发生小麦一外源d n a 交换，能迅速将近缘种属的遗传物质以易位系的方式转移 到小麦中。 现在已知的肋基因突变体肋。肋。成p h i , 都是通过人工诱变的方法获得 的。与之不同的是，一些学者发现在一些小麦地方品种中天然存在其诱导部分同 源染色体配对能力类似于助，基因突变体的隐性肋基因，例如在四川小麦地方 t 品种丌县罗汉麦的6 a 染色体上存在p h k l 基因。但是，目前还没有在同一实验条 件下，对这种天然存在的隐性p h 基因与已知的肋基因人工突变系的作用强度进 行比较。本研究目的是通过用具有p h k l 基因的小麦材料开县罗汉麦与肋基因突 变系k 如和肼分别与a e g i l o p sv a r i a b i l i se i g ( 2 n = 2 8 ，u u s l s ) 和 s e c a l ec e r e a el ( 黑麦，2 n = 1 4 ，r r ) 远缘杂交，对杂种的部分同源染色体中 期i 配对构型进行比较分析，以评价p h k l 这一隐性突变体新类型在诱导小麦一外 源杂种部分同源染色体配对的作用效果。同时，运用具有p h k l 基因转移后代材料 t k l l 进行细胞及分子生物学研究，以评价p h k l 基因在远缘杂交转移外源基因的 实际应用效果。 3 材料与方法 3 1 供试材料 普通小麦中国春与具有肋肌基因的普通小麦开县罗汉麦( 简称为k l ) 同属 于四川白麦子类群( s i c h u a nw h i t ew h e a tc o m p l e x ) 。中国眷肋基因突变系分 别被称为c s p h , 。，c s kc s p h 。t k l l 是由杂种f ( c s p h m p h k l ) 与彳日 v a r i a b i l i s 远缘杂交，从其自交后代选择得到的小麦稳定易位系“州。 本研究使用的测验材料彳bv a r i a b i l i s ( 与普通小麦的亲缘关系更近) 和s c e r e a e ( 与普通小麦的亲缘关系更远) 这两个物种已被证实是对助基因较敏感 的物种，因此被广泛用来作为肋基因研究的测验种”。 3 2 研究方法 3 2 1 细胞学检测 上述普通小麦材料分别与, 4 e v a r i a b i l i s 材料a s 2 4 和sc e r e a e 品种秦 岭黑麦杂交，杂种f 统一种植在四川农业大学小麦研究所实验地，取杂种幼穗固 定在卡诺固定液i 中，2 4 h 后转入7 0 酒精中，4 保存，镜检杂种花粉母细胞减 数分裂中期i ，统计染色体配对情况。部分同源染色体配对水平以平均交叉结数 ( x t a ) 柬估算。x t a = 观察的染色体交叉结总数观察细胞数( n ) ，交叉结的计 算参考马瑞等( 1 9 9 9 ) “。 3 2 2 分子标记检测 s s r 扩增分析，按照r s d e r 等所描述的方法”“。略有改动，简述如下：用 c t a b 法提总d n a ，s s r 总反应体系为2 5 u l ，内含lx b u f f e r ( 1 0 m m o l lt r i s - h c i ，p h = 8 3 ，5 0 m m o l lk c i ) ，1 5 m m o l lm g c l2 2 0 0 u m m o l ld n t p s ，i ut a q 酶，2 5 0n m o l l 引物和5 0 l o o n gd n a p c r 扩增前在9 4 变性3 m i n p c r 扩增 为4 0 个循环，每个循环在9 4 变性i m i n ，5 0 ，5 5 或6 0 c ( 以引物而定) 复性i m i n ，7 2 c 延伸2 m i n 循环结束后，在7 2 c 延伸l o m i n 2 琼脂糖凝胶电 泳，8 0 v 电泳9 0 m i n ，紫外灯凝胶成像仪照相。所选用引物为每个染色体至少选 取一对s s r 引物( 表1 ) 。 表l ：本实验中采用的4 8 对微甲尾引物 t a b l e l ：4 8s s rm a r k e r sir lt h er e s e a r c h 退火温度 6 0 5 5 5 0 x g w m 9 9 一i a ，x g w m l 3 6 一l ax g w m l 4 0 一l b x g w m 3 3 7 1 dx g w m l l l b x g w m 6 4 2 1 d x g w m l 5 7 2 dx g w m 3 5 6 2 a ，x g w m 5 2 6 2 b x g w m 4 2 9 2 b 引 x g w m 3 6 9 3 a ，x g w m l 6 2 3 ax g w m 2 6 1 2 d ，x g w m 4 4 a x g w m 6 0 9 4 d 物 x g w m 2 6 4 3 b ，x g w m 5 4 7 3 b x g w m 3 3 d ，x g w m 2 51 4 bx g w m 3 3 4 6 a 名 x g w m 5 2 3 d x g w m 7 l 一3 d x g w m 2 9 3 5 a x g w m 2 3 4 5 8x g w m 6 2 6 6 b 称 x g w m l 6 l 一3 d x g w m 6 3 7 4 a x g w m 4 0 8 5 b x g w m 4 4 3 5 bx g w m 2 3 3 7 a x g w m 3 6 8 4 b ，x g w m 6 0 8 4 d x g w m 5 4 0 - 5 b ，x g w m 5 4 4 5 b x g w m 4 9 9 5 b x g w m 4 9 4 6 a x g w m 3 5 8 5 d x g w m l 7 4 5 d x g w m 5 7 0 6 a ，x g w m 4 6 9 - 6 d x g w m 4 5 9 6 a x g w m 5 1 8 6 b x g w m 3 2 5 6 d 。x g w m 4 6 7 b x g w m 2 7 6 7 a ，x g w m 3 4 4 7 b x g w m 2 9 5 7 d x g w m 4 2 8 7 d 4 结果与分析 4 1 染色体配对评价 4