（作物遗传育种专业论文）基因工程创建无侧芽烟草的初步研究.pdf

海南大学硕士学位论文 摘要 打顶抹芽是优质烤烟种植过程中项重要的生产技术措施。烟草在一定的生长时期 必须打顶，而打顶后会萌生大量的侧芽。侧芽耗费营养，会降低烟叶的品质和产量，因 此必须抹掉侧芽。人工抹芽耗费人力和物力，提高了烟叶生产成本。打顶后施用化学药 剂可抑制腋芽生长，降低了烟叶生产劳动强度。但化学药剂需要成本，且会造成环境污 染。用基因工程方法创建无侧芽的烟草，则有可能从根本上解决上述问题。 陈兴江( 2 0 0 5 ) 根据番茄口基因进行同源克隆了烟草黜基因的部分片段7 4 9 b p ， 与番茄的l s 氨基酸序列同源性达9 2 ，利用伤诱导启动子构建的娜基因的删载 体并转化烟草，可能因黜基因在愈伤组织中的表达受到抑制而无法得到再生芽 本研究通过间接诱导途径对其方案进行完善，首先从p 0 1 ) o i l 2 1 载体克隆了转录因 子u l g 4 ，构建了一个组成型的花椰菜花叶病毒3 5 s 启动子表达转录因子l h g 4 的表达 载体，同时构建了一个i g 4 能识别结合的p 印6 启动子的l 冰灿聊表达载体：由于 陈兴江所构建载体的酶切位点无法与p o p o f n 的多克隆位点匹配，所以先根据已知序列 扩增了娜基因，通过g a t e w a y 技术，b p 、l r 反应后将其最终克隆到p o p o m 载体上， 构建了删启动子的脚的酬载体。然后将这两个载体分别进行烟草转化。转基 因成功后将这两个转基因材料进行人工授粉杂交，其f l 即有望获得无侧芽烟草。目前， 利用这两个载体转化烟草的部分工作已经进入壮苗培养阶段。 我们拟利用伤诱导基因彳d s 的启动子替换组成型的花椰菜花叶病毒3 5 s 启动子， 伤诱导启动勉s 的r n 加的表达，因此本研究对爿傩启动子的部分序列进行了克隆， 并对其启动子结构进行了分析。此外还成功克隆了死s 基因5 端序列。这为进一步开 展本研究奠定了良好基础。 关键词：烟草咒s 基因侧芽伤诱导彳傩启动子转录因子l h g 4 基因工程创建无侧芽烟草的初步研究 a b s 的c t t b p p i n gte c ：t u l 0 1 0 9 yi s 锄i 1 i 】岬n 锄tp r o c e s si n 协b a c c 0p r o d u c t i o n w h 饥m eb u di s t o p p e d ，也eg 锄j n a t i o no fl a t e m lb u d s 谢l lr e d u c en l eq u a l 时o fn 心t o b a a 。0 s oi t i s n e c e s s a 巧f o rt 1 1 el a t 硎b u d st 0b et o p p e da w a yi nt i i i l e t h ec o s to ft o b a c c 0l e a v 鹤 p r o d u c t i o ni n c r c 弱懿b e c a u s eo ft l l el a b o r - c o n s u m i n g i i lm et o p p i n g 觚dd e b u d d i n g b 锄e f i c i a lal o tt 0c h e m i c a l s 矗mc 0 曲的1 1 i n gm ea u x i l i a d rb u d s ，i ts t i l lh 弱i t so w nl i i l l i t ss u c h 嬲i i l c r e 嬲i n g 廿1 ec o s to fe h 锄i s 仃y 龇l da l h a 讥n gas i d ee f f e c to ne n 啊r 0 姗e n t w i mt l l e d e v d o p m 铋to f b i o t e c ：1 1 l l o l o 鼢g 吼e 锄百n e 耐n gh 嬲b e e i l 印p l i e d 丽d e l yt oi m l 鹏v en l ep l 锄t b r e e d i n 岛a n dm 龇l y 廿a n s 彤斌ct o b a c c ol i n 鹤w e r es u c c e s s 旬l l yi n b r e e d e d t h e r e f o r c ，i ti s p o s s i b l et 0c o n t r o lm el a t e r a lb u dt h r o u 曲g e n ee n g i l l e 甜n g a 7 4 9 触舯舶to f 儿sg 黜i n t o b a c c 0w 笛c l o n e da c c o r d i n g t 0t l l er 印0 n e d 船g eb y c h 饥( 2 0 0 5 ) t h eg eh 0 i n o l o g yb e 咐e 锄t o b a c c 0 肌dt o m a t 0i s9 2 r n am t c r 陆锄c e ( r n ) v e c t o ro f 死sg e n ew 觞c o n s 仃u c t e d 谢n lw o u i l di n d u c i b l ep r o m o t t 1 1 仃趾s 向n n l c d i n t ot o b a o c 0 ，i i lw 1 1 i c hb u d d i n g 、釉u l db ep r o h i b i t e d 矗汀廿l a t l e 兕sg e n ec o m d i l tb e e x p r e s s e d 龃dm n 嘶o n e di nc a l l i t l 圮麟e a r c hi i l0 1 1 rs t i l d yw 勰a b o u tt 0o p t i m i z et l l ep r o c e d l u r em e n t i o n e da _ b o v e a tf i 璐t ， t r a n s 嘶p t i o nf a c t o rl h ( 抖w 勰d o n c d 龀胁m ep o p o n 2 1v e c t o r t l l 即c o n s 协l c t i n g 觚 e x p r e s s i o nv c c t o ro fl h g 4r e g u l a t e db yac o n s t m c t i v ep r o m o t c a u l i f l o w 盯m o s a i c 讥n 玛 3 5 s ( o 肘乃蹰p r o m o t m e 锄砒i l ea 懿p r 销s i o nv e c t o rr n 舡- 7 乙so f p d p 6p r o m o t e r l a t r e c 0 9 i l i z e d 锄dc o m b i n e db yl h ( mw 勰c 0 衄t m c t c d 【 u et 0m em i s m a t c hb e 呐e 饥m e m u l t i p l ec l o l l i n gs i t 铝o fp o p o f nv e c t i d r 锄dc l e a 们n gs i t 鹤o fm ev e c t o r h a db e 饥c o n s t m c t e d b yc h 饥，s 0 圮死sg 吼ew 嬲锄叩l m e da c c 0 r d i n gt 0m ep r e v i o l l sr c p o r t 锄df i n a l l yd o n c d m eg c n et 0t h ep o p o f nv e 酏0 rv i ag a t e w a yt e c h n o l o g y 锄db pa n dl r r e a c t i o n ，叭c c 伪s 如l l y c o n 栅c t i i 培m ei 灿一死sv e c t o rc 0 i l t a 蛐gl h g 4 、 恤c hc 肌缸锄s 嘶p t 锄dc 0 i n b i r l c 劂 p r o m o t 既t h e s e 铆ov e c t o 墙w e r c 衄s f o m e di n t ot o b a c c 0r e s p e c t i v e l ya r 盯f i i l i s l l i n g c o l l s 仃u c t i o n t o b a c c 0 州m o u tl a t e r a lb u dw c i u l db e0 b t a i n e di i lf 1g 饥e r a t i o nn l 】的u g 量l a r t i f i c i a lp o l l i n a t i o n 趾dh y b r i d i z a l i o nw | h e l ls u c c 骼sn 锄s g e l l ew 硒m a d eb e 附e e i lt 1 1 e s e 押o m a t e r i a l s a tp r e s e m ，n l e 衄l s f o n i l i n gw o r ki sg o i n gs m o o t l l l y t h es 文l u e n o ft h ew o u i l di i l d l l c i b l ep m o t e r 爿( 坯w 蠲c l o n e da n d 柚a 】y z e di nt h i s 懈e 哪h i i l a d d i t i o n ，骶h a v e9 0 t t m e 伽s 。q u c eo f 见，5 g 肌锄i cw a d n g 她t 砌ll a ya9 0 0 df o u n d a t i o nf b f t l l ef i l 曲盯佗s e a r c h k e yw o r d s ：t o b c o ，7 乙sg e ，l a t c 招lb u d s ，w 0 岫d - i l l d i l c 6 0 n ，p n 加。衙4 0 慢l h g 4 海南大学硕士学位论文 本论文中用到的部分缩略词表 6 一b a 挪 b p c d n a c e f e d t a h y g l 认 口t g k 跹 o d p c r 鼬f s d s s p e s 廿 t h s x g a l 缩略词表 6 一苄基氨基嘌呤 氨苄青霉素 碱基对 互补d n a 头孢霉素 乙二胺四乙酸 潮霉素 萘乙酸 异丙基b d 硫代半乳糖苷 卡拉霉素 光密度 聚合酶链式反应 利福平 十二烷基磺酸钠 壮观霉素 链霉素 三羟甲基氨基甲烷 5 溴4 氯3 吲哚b d 半乳糖苷 7 l 海南大学学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。 除文中已经注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品或成果。 对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律结果由本人 承担。 一：吴锋 b 甄徊导年6 黾 6 日 学位论文版权使用授权说明 本人完全了解海南大学关于收集、保存、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国家有 关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权海南大学可以将本学 位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和 1 5 2 倦 论文作者签名：务节 日期：) 钾莎年勿月6 日 篙羹纛篪日期：俩占年莎月f 易日 文数据库发布章程”，同意将本人的学位论文提交 并可按 海南大学硕士学位论文 刖吾 优质烤烟种植过程中，打顶抹芽是一项重要的生产技术措施，为保证烟叶质量，烟 草在一定的生长时期必须打顶，而打顶后会萌生大量的侧芽。侧芽消耗营养，会降低烟 叶的产量和品质，因此必须抹掉侧芽。打顶加人工抹芽耗费劳力过大，提高了烟叶生产 成本。打顶后施用化学药剂可抑制腋芽生长，降低烟叶生产劳动强度，仍解决不了烟叶 生产成本增加问题，且化学制剂的使用会造成环境污染。用基因工程方法创造打项后可 自行抑制腋芽的烟草品种，则可能从根本上解决上述问题。 本研究涉及基因工程抑制烟草腋芽、诱导启动子的选择和克隆、删技术及 p o l 矧l h g r 系统的应用等，因此就上述相关领域的进展情况做一综述。 1 分子生物技术与我国烟草业 1 1 我国烟草生产概况 我国是世界上最大的烟草生产国，烟草业在国民经济中占有重要地位。 烟叶生产总体发展稳定，基本保证了卷烟工业生产发展和烟叶出口的需要。但是，我 国烟叶水平与其他优质烟叶生产国相比，还存在较大差距。目前我国烟叶生产中大面积 推广的品种大部分是从国外引进的，例如，2 0 0 2 年全国烤烟种植的1 4 4 5 万亩烤烟中， 我国育成品种只占1 6 ，烟草行业面临巨大挑战，所以开发本土优质烟草品种、提高我 国烟草种植业的水平显得尤为重要。 在生产中，为提高烟叶的产量和品质，必须适时去除生殖器官，即打顶，以集中营 养物质供应叶片由于打顶去除了顶端优势，腋芽会很快发生，每个叶腋可先后长出纠 个腋芽。所以，除在一定条件下酌留l 2 个腋芽培育权烟外，其他腋芽在萌芽后应及 时抹掉，否则植株中下部叶片不充实，身份轻，油分少，弹性差，吃味和香气都降低； 上部叶片长得小而薄，导致减产降质( 王关安，2 0 0 2 ) ，还会加重当年虫害发生和病害侵 染，加大下年虫害的群体。l a p h 锄等人指出，若打顶后不控制腋芽生长，那么每天要损 失1 的产量。w e e l 【s 和s e l n n a i l l l 的实验结果证明有效控制腋芽可以改进烟叶的产量和 质量，以前控制腋芽多采用人工抹权法，易造成病害且耗费大量人力物力。为克服传统 抹权方式的缺点，人们开发了烟草抑芽剂。应用某些抑芽剂后，烟株中上部叶面积明显 增大，尤其是上部叶增大幅度极为明显；烟叶内在化学成分各项指标更接近适宜值，明 显地提高了烟叶品质。但化学抑芽剂同化学农药一样，同样存在成本高，环境污染等缺 点，并且化学抑芽剂持效期短，多次喷施对人力、物力造成很大浪费。因此开发高效、 无毒的新的抑芽方法势在必行( 陈德鑫，2 0 0 3 ) 。 1 2 国内外烟草生物技术研究概况 随着分子生物技术的迅速发展，基因工程越来越多地应用于抗病、抗虫、抗逆和品 质性状等的改良。从1 9 8 3 年第一株转基因烟草获得以来( 倘等，1 9 9 5 ) 已经有一大批抗 基因工程创建无侧芽烟草的初步研究 病、抗虫转基因烟草品种( 系) 被相继育成( b m d l e 等，1 9 9 9 ；g a d a ，1 9 9 9 ；f o t o p o u l o s 等，2 0 0 8 ) 。烟草生物技术的研究主要集中在抗性基因工程的研究。 抗性基因工程研究较多的是抗虫基因工程，利用基因工程方法，将抗虫基因转入到 烟草中，使其稳定遗传和表达杀虫活性，培育出抗虫烟草品系。烟草生物技术研究中最 早最常使用的抗虫基因主要是苏芸金杆菌( b a c i l l 瑚m l j r i 蟛e i l s i s ，b t ) 毒蛋白基因 ( d e l 猢a y 1 9 8 9 ) 。1 9 8 7 年，比利时植物遗传系统公司首次将b t 毒蛋白基因导入烟草， 并获得表达，培育成能够有效地抵抗一龄烟草夜蛾( m 觚d u c 弱懿t a ) 幼虫侵害的转基因烟 草( 任民等，1 9 9 7 ) 。目前研究较多的是蛋白酶抑制剂基因( p r o t e i n 嬲ei i “b i t o r ，p d 、淀粉酶 抑制剂基因( a a m y l 勰ei i l l l i b i t o r ，a a d 、外源凝集素基因( 1 e c 曲) 等。与b t 毒蛋白基因相比 这些基因不仅具有较广的抗虫谱，而且它作用于昆虫消化酶的活性中心，是酶的最保守 部位，可以排除昆虫通过突变产生抗性的可能；再者蛋白酶抑制剂基因来源于植物本身， 更易于被公众所接受。较为成功的例子是将豇豆胰蛋白酶抑制剂( c p t d 基因导入烟草 ( h o f | 陆a 肌等，1 9 9 2 ) ，h i l d 叫h i l d e r 等，1 9 9 5 ) 将从雪莲分离出来的l e c t i n 基因转移到烟 草，获得了抗蚜虫( m y 硼s p e r s i c ) 的后代植株。 另一研究较多的是抗除草剂转基因工程，h 肌g l l l l 等从心a b i d o p s i s 中分离出一个对 磺酰脲类除草剂具有抗性的突变基因c s r l 1 ，并将其导入加拿大烤烟品种并获得了两个 抗性品系( h 叭g h n 等，1 9 8 8 ；b r 趾d l e ，1 9 9 3 ) 。1 9 9 4 年法国科学家d e l o n 等将控制溴氧 化物类除草剂降解的基因导入烟草获得的转基因植株不仅抗此类除草剂，而且其他农艺 性状都与正常品种一样( f r c y s s i n 等，1 9 9 4 ) 。 烟草的抗病基因工程研究主要集中在烟草抗病毒育种，常用的方法是将某一病毒的 外壳( c p ) 蛋白基因导入烟草。1 9 8 6 年p o w e na b e l 等首次将烟草花叶病毒( n 乱，) 外壳蛋 白基因成功导入烟草( p o w e l l 等，1 9 8 6 ) ，获得抗n 的转基因烟草植株。目前，除n 病毒外壳蛋白基因外，还发现了其他很多病毒外壳蛋白基因对病毒具有抗性，如烟草脆 裂病毒( t o b a c c 0r a 仕l e v i m s ) ( 、等，1 9 8 8 ) 、马铃薯y 病毒( p o t a t 0v i ：m s 和马铃薯x 病 毒t a t 0 啊m s x ) ( k a n i e 、v l d 等，l9 9 0 ) 、番茄叶斑病毒( t o m a t 0s p o t t e d 讯l t 讯r i 玛) ( m a c 凡瓠e i e 等，1 9 9 2 ) 、烟草线条病毒( t o c c 0s 仃c a l 【v i i u s ) m n 等，1 9 8 8 ) 等病毒蛋白基因等。中国 科学院微生物研究所还将c m v 卫星r n a 基因和c m v 外壳蛋白基因同时成功地导入烟 草，获得了对c m v 侵染具有高度抗性的转基因植株。 相对于抗虫和抗病毒病研究，抗细菌和真菌性病害的研究则落后得多。已经获得的 这类转基因烟草包括抗野火病、立枯丝核菌( 黜l i z o c t o i l i as o l a n 曲l l l n ) 等的植株。1 9 9 5 年 1 1 1 i l m o n y 等将抗野火病原菌p s e u d o m o n 嬲s y r i n g 的基因导入烟草，获得抗野火病植株 ( 1 1 l i l m o n y 等，1 9 9 5 ) 。时焦等将几丁质酶基因转入烟草，获得了对立枯丝核菌( r k z o c t o l l i a s o l 锄i l ( u h n ) 引起的烟草立枯病有一定抗性的转基因烟草植株( z h o u 等，1 9 9 4 ) 。1 9 9 3 年 舢e c a n d 呱砧e c 锄d c r 等，1 9 9 3 ) 等将表达与发病机理有关的基因( p 砒o g e n s i sr e la t i 。dg e n e ) 转入烟草，获得抗霜霉病( p e r o n o p o r at a b a c i i l a ) 和黑胫病( p b 忉p l l t h o r ap a r 够i t i c a ) 的转基因 2 海南大学硕士学位论文 烟草。 1 3 烟草生物技术研究和应用展望 用生物技术对作物进行改良，会使人类有目的地应用多种性状基因，改善包括产量、 品质、抗逆性在内的植物性状，可以克服常规育种技术的不足，打破物种之间存在的天 然屏障，实现基因在动物、植物、微生物之间的转移。因此，生物技术尤其是基因工程 技术的发展，对农业生产具有深远的意义。随着生物技术的日臻完善，大批转基因作物 相继育成并得以推广，且种植面积在迅速增加，现在转基因作物的种植面积可以占全球 作物种植总面积的3 左右由于种种原因，烟草生物技术成果的应用举步维艰。目前 有关基因工程安全性问题的争论主要围绕重组基因在自然界释放的可能性，抗菌素抗性 基因转移的可能性，通过农用杆菌释放基因的可能性，基因产物通过花蜜对人类造成危 害的可能性，转基因植物成为野生的可能性等。由于烟草的特殊用途，转基因烟草除了 具备上述可能性危害之外，还存在吸食过程中对人体的可能性危害。 毫无疑问，安全性无疑是基因工程基础研究的重要课题，随着基因结构、功能和表达、 调控的深入研究，将有可能构建具有精细调控机制的安全无害的目的基因。同时加强转 基因品种的检测和安全性评估工作。因此，培育无侧芽烟草，我们也可以采用基因工程 的方式进行一些研究。 2 侧芽发生的相关基因的研究进展 形态结构对一个生物体的生存有着极其重要的作用。植物体的形态能够随环境的不 同而发生巨大变化。它必须依赖形态和生理的可塑性去适应多变的环境，植物拥有这种 能力的基础是因为它具有一个可行使多种功能的分生组织( k e r s t e t 嘧锄dh a l ( e ，1 9 9 7 ) ， 特别是侧生分生组织对胚胎后期植物的形态影响巨大，所以调控侧生分生组织的起始和 发展对植物全面的形态以及对变化环境的适应方面有着重要的作用( l o h a r 等，2 0 0 7 ； s u s s 既锄d k e 呔，2 0 0 1 ) 。 为了研究侧芽发生的机制，从拟南芥、番茄、玉米、牵牛花和豌豆中得到了许多侧 芽生长异常的突变体，通过对这些突变体的特性进行分析，将他们分为三个类别：第一 类突变体拥有比正常植株多的分枝，这种表型是因为休眠芽的抑制被解除，也就是顶端 优势消失后造成的。这个类别中，突变体对侧生分生组织早期的发展没有什么影响，换 句话说，侧生分生组织起始的时间和数量是正常的。泐s 伽纪咖以c p d j ( d o e b l e y 等， 1 9 9 7 ) 、如饥琊甜印北口，面朋伽口以( n a p o l i 等，1 9 9 6 ) 、，口m d s 螂( a n 姗i n g 哆勰等，1 9 9 2 ： b e v 耐d g e 等，2 0 0 1 ；f 0 0 等，2 0 0 1 ) 、口l 耐疗嬲括幻疗攻s t m e r g ，1 9 9 9 ) 等突变体都属于 这种类型；第二种类型，同第一种类型一样，侧枝的数量比对照植株明显增多，但是在 该类型突变体的早期发展中，侧生分生组织的数量就受到了影响；拟南芥 j 恍坶 妇 ) ，( r 矗n t a l l z 等，2 0 0 l ；t a m i k 锄j 锄a 等，2 0 0 1 ) 突变体属于这种类型；第 三种类型，这种类型和前两者正好相反，不形成侧枝，或者侧枝很少。例如，番茄的，口棚， 3 基因工程创建无侧芽烟草的初步研究 s 印即哪d ，、幻m ，口一2 突变体( t u c k e r ，l9 7 9 ) 。 2 1 抑制侧芽生长的基因的研究 侧枝过多的突变体之所以比对照植株侧芽( 侧枝) 多，就是因为抑制侧芽或侧生组 织生长的基因缺失。通过对这些突变体的分析发现缺失的基因一般都有维持顶端优势或 抑制侧芽生长的作用。这类基因现在发现的比较多，除了上面介绍的外，另外还有 f r ? ：z z 】，黝m c 己日k b m a t 蛐，2 0 0 3 ) 、伪纺j ( t a l 【e d a ，2 0 0 3 ) 等基因，此外还有： j 咒j ，烟草的朋吃j 基因同拟南芥的l y 瑾因有9 7 的氨基酸同源序列e 锄， 2 0 0 1 ) ，三y 琏因从营养生长到生殖生长过程中在侧生原始细胞中一直持续表达( h 嬲l d a ， 2 0 0 l 】，控制拟南芥从营养生长到生殖生长的转变，( h u a l a ，1 9 9 2 ；【e d a 等，2 0 0 7 ) d 停 的突变体延长了营养生长的时间并且在花器官的位置长出大量的枝条，( s o u e r ，1 9 9 8 ) ， 为了研究n f l l 基因的功能，将其转化到烟草中去，结果发现过量表达该基因的烟草植 株与对照植株相比较，没有产生花的分枝，只长出了一个比对照大约3 5 倍的花，另外 转基因植株中还有一批再生苗出现了共抑制现象，检测不到l y l f 的i r 瓜n a ，这批植株萌 生大量的侧芽，说明朋吃j 基因在调控侧芽的发生中有重要的作用，可能调节侧芽向花 芽的转变( a h e 锄，2 0 0 1 ) s 只5 = 偈【稷：拟南芥的突变株册帕珊，可以产生5 0 0 或者更多的花序( r e i n t a l l z 等， 2 0 0 1 ；眦i k a i l j a n a 等，2 0 0 1 ) 。对突变体的分析发现，侧枝过多是因为叶腋中侧生分生 组织数量的增多以及芽抑制的解除。删潞基因编码细胞色素p 4 5 0 ，a 伸7 9 f 1 在 叩帕淞突变体中，z 类型细胞分裂素的水平比野生型的增加了3 9 倍。这个发现暗示 觥吣基因在植物体中有调控植物激素水平的作用。舢硼基因在叶腋中表达量 非常大，可能正常植株因为该基因的表达而使细胞分裂素水平降低而不能生出侧芽。用 该基因转化拟南芥，转化植株出现了共抑制现象，顶端优势消失( h 锄s 锄等，2 0 0 1 ) 。 2 0 0 1 年r e i n t 啦等人用鼬1 0 c k o u t 技术敲除田芍基因得到的植株表型和缺失& 咨基因的 突变体表型完全一致( r e i n t 眦等，2 0 0 1 ) ；2 0 0 3 年，s i 】【u ec h 肌等也发现当删基因l i l 】 a 水平的下降会促进拟南芥侧芽的生长( c h 锄，2 0 0 3 ) 。 2 2 侧芽休眠相关基因的研究 、j 研究发现休眠芽并不处于休眠状态，代谢非常旺盛。在拟南芥休眠芽和副芽里面都 检测到p s a b l 3 基因的表达。另外，l 疆d 基因也在休眠芽里面表达，当打项后，它的 水平便迅速下降。这两个基因都是与a b a 相关的一些基因，表明a b a 对保持芽的休眠 可能有重要的作用( a n t i e ，2 0 0 0 ) 。另外许多在休眠芽里表达的基因被克隆，通过观察 发现这些基因在侧芽里面对保持芽的休眠可能扮演一个重要的角色。例如风d r 膨， 风删，m j 和m 2 都是从豌豆中克隆到的。( s t a f s 仃0 m 等，1 9 9 8 ： m a d o k aa n d m o r i ，2 0 0 0 1 。而r d 删2 的序列同紫花苜蓿中冷诱导和a b a 诱导的基因有相似之处， 风d 尺m ，以及m j 的l i 心a s 主要在植株完整的休眠芽里积累，l 】刚a s 在打顶后迅 4 海南大学硕士学位论文 速降低，并且在芽恢复到休眠状态后又迅速回升。 2 3 促进侧芽生长的基因的研究 对侧生分生组织缺陷的突变体研究较少，除拟南芥外研究较多的是番茄。 z & 番茄的l s 突变体( w i l l i a n 塔，1 9 6 0 ) 。b 突变体在营养生殖时期侧生分生组织不 能形成( m a l a y 1 9 6 4 ) 。另外，该突变体的花器官发育也不正常。生化测定实验表明该 突变体中脱落酸、生长素、赤霉素的水平都出奇的高，然而细胞分裂素的水平却非常的 低，醪编码的蛋白质属于一个生化功能未知的蛋白家族一i d 域蛋白( s c h u m a c h 盯 等，1 9 9 9 ) 这个蛋白家族包括拟南芥的g 和r g 疆基因产物，这两个基因产物是g a 信号转导中的负调控因子，因为船基因也可能是g a 信号转导的负调控因子，而g a 在控制侧芽的发生中也扮演一个重要的角色。如2 突变体和6 ，f ，耐突变体在叶腋处缺少 侧生分生组织，所以自始至终没有侧芽发生( m a p e l l i ，1 9 8 2 ；s c h m i t z 等，2 0 0 2 ) 。 翻s ：早在2 0 0 1 年，m a “勰就揭示出番茄的朋基因同拟南芥“s 基因有同源序 列( m a t h i 弱，2 0 0 1 ) g r e b 等克隆了l a s 基因并对其进行了研究( g r 曲，2 0 0 3 ) ，发现 “s 基因的表达在茎尖、侧芽、花芽、根部以及开放的花里都能检测到，但是不能在节 间部位和叶片中检测到；序列分析揭示“s 基因同番茄的l s 基因有5 0 5 氨基酸同 源序列；缺失“s 基因的突变体不能形成侧芽，将“s 基因转到l s 突变体里面，恢复 了烟草的表型，表明l 岱基因对拟南芥的侧芽发生起重要作用。 朋d c j ：我国科学家李家阳在水稻中找到了水稻分蘖的关键基因肋a 基因( 李学 勇等，2 0 0 3 ) ，缺乏该基因的突变体只形成一个主干而没有分蘖。通过对该基因的研究 发现，加c j 基因主要在侧生分生组织部位表达，转基因结果显示，其对侧芽的起始有 重要的作用；对朋r d a 基因的开放阅读框的分析发现该基因编码的蛋白质序列同番茄的 船基因的编码产物有4 4 的同源性。 通过对上s ，l 4 s ，加a 三个基因编码产物分析，他们都属于g r a s 基因家族。 g r a s 基因家族的成员编码的转录因子在植物的生长和发育中行使各种各样的功能，例 如赤霉素信号的转导，细胞色素a 的信号转导，配子体的形成和发育以及侧生分生组织 的形成等，有些基因还被认为是核酸定位信号( t i 锄，2 0 0 4 ) 。我们对这三个基因的核酸 序列进行了比较，也发现了一些三者共有的同源系列。 另外厶刚m r c e 和5 1 铂比尉朋r c 硒( 洲) 基因在水稻中是主要的侧芽 调控因子，厶和删基因在各种类型的侧芽中都有表达。除了水稻中的加a 基因， 玉米中的占儿和剧咒基因外( m c s t e 髓，2 0 0 1 ) ，番茄中的彪和s 基因，还有向日葵 脚基因( f a m b 枷，2 0 0 3 ) 作用方式都是相互独立的，说明在侧芽的形成是个多基因参与 调控的过程( k e i s l l i ，2 0 0 3 ) 。 3 高等植物启动子研究进展 启动子是r n a 聚合酶能够识别并与之结合，从而起始基因转录的一段d n a 序列， 基因工程创建无侧芽烟草的初步研究 通常位于基因上游。典型的启动子包括c a a t b o x g 和t a t a b o x ，它们分别依赖d n a 的r n a 聚合酶的识别和结合位点，一般位于转录起始位点上游几十个碱基处。在核心 启动子上游通常会有一些特殊的d n a 序列，即顺式作用元件，转录因子与之结合从而 激活或抑制基因的转录( h i 9 0 ，1 9 9 9 ) 。一旦对临聚合酶定位并结合在启动子上即可启 动基因转录，因此启动子是基因表达调控的重要元件，它与l a 聚合酶及其他蛋白辅 助因子等反式作用因子的相互作用是启动子调控基因转录的实质。 植物基因工程中常用的启动子按其作用方式及功能可分为三类：组成型启动子 ( c o n s t i t u t i v ep r o m o t e r ) 、组织特异型启动子( t i s 跚es p e c i 6 cp r o m o t 哪和诱导型启动子 ( i n d u c i b l ep r o m o t 砷。这种分类大体上反映了它们各自的特点，但在某些情况下，一种类 型的启动子往往兼有其它类型启动子的特性。 3 1 组成型启动子 组成型启动子在所有组织中都启动基因表达，具有持续性，不表现时空特异性；i 矾a 和蛋白质表达量也是相对恒定的。从结构上看大多数组成型启动子转录起始点上游几百 个核苷酸处，都存在核苷酸序列t g a c t g ( w d s i n g ，1 9 9 1 ) 。目前使用最广泛的组成型启 动子是花椰菜病毒( c 删3 5 s 启动子、来自根癌农杆菌t it d n a 区域的胭脂碱合成酶 基因( n o s ) 启动章鱼碱合成酶基因( o c s ) 启动子。后者虽然来自农杆菌，但都具有植物启 动子的特性。另外，水稻a c t l 启动子也逐渐得到大量的研究和应用。 3 1 1c a m v 3 5 s 启动子 对许多双子叶植物转基因工作而言，最常用的一种启动子是来自花椰菜花叶病毒 ( c 删的3 5 s 启动子。这种启动子在植株被c 抓感染期间，指导3 5 s l 心队合成，并 且使之在许多双子叶植物的组织中高效表达，但它是单子叶植物的一种较弱的启动子 ( b r u c e ，1 9 8 9 ；c s t e l l s 饥等，1 9 9 2 ；l i 等，2 0 0 7 ) 。3 5 s 启动子起始于c 心3 5 s 鼬叮a 转录起始点9 4 l 至+ 2 0 8 的b 酉片段，在位于c 心3 5 sd n a 中的4 6 至1 0 5 区段存在 增强子序列。该启动子包括t a t a 盒、c a a t 盒、倒转重复序列和增强子核心序列四个 部分。最近发现3 5 s 启动子可以划分为两个区域：从9 0 b p 至+ 8 b p 为a 区域，主要负责 在胚根、胚乳及根组织内表达；区域b ( 3 4 3 至9 0 b p ) 主要控制在胚的子叶及成熟植株的 叶组织及维管组织内表达。 3 1 2n o s 和0 c s 启动子 虽然n o s 和0 c s 启动子来自细菌但都具有与植物基因相似的共有序列，在转录起点 上游3 0 4 0 b p 处它们都含有与t a t a 盒同源的序列：位于57 末端上游6 0 8 0 b p 处也 有类似的c a t 盒的序列，因此具有植物启动子的特性。值得注意的是，n o s 和o c s 启 动子也具有一定的损伤诱导和激素诱导活性( a n g o n ，1 9 9 0 ) ，另外还发现，n o s 启动子 的强度依组织部位及器官位置不同而变化，在老组织内通常比新生组织中强，在生殖器 官内随发育状态也不同。 6 海南大学硕士学位论文 3 1 3a c t l 启动子 植物a c t i i l 启动子是一个高效表达的组成型启动子。a c t i i l 蛋白是植物细胞骨架的基 本组分，因此该启动子可能在所有组织中都有活性( s 衄g u l l ，1 9 8 9 ) 。a c t l 启动子是a c t i n 基因家族中使用最广泛的启动子之一，其启始转录的必需元件位于a c t l 基因转录起始 密码子上游的1 3 k b 长的区域。 3 2 组织特异型启动子 此类启动子调控下的基因转录一般只发生在某些特定器官或组织中，目前已发现这 类启动子中一般同时存在几种控制组织特异性表达的元件，其表达特异性由这些元件的 种类、数目及相对位置等共同决定。m 撕a i l i ( 1 9 9 2 ) 等将烟草花药绒毡层特异表达基因 启动子t a 2 9 与核酸酶b 锄a s e 、r n a s c t l 基因融合后转化植物，核酸酶基因在花药中特 异表达，破坏绒毡层，获得雄性不育烟草和油菜开创了基因工程创造雄性不育系的先河， 至今已在烟草( l i ，1 9 9 5 ) ，玉米( m a r i 锄i ，1 9 9 3 ) ，油菜( 动0 u ，1 9 9 7 ) ，拟南芥( l i u ， 2 0 0 0 ) ，水稻( z l l 柚g ，1 9 9 7 ) 等植物上获得成功。 3 3 诱导型启动子 在某些物理或化学信号的刺激下，此种类型的启动子可以大幅度地提高基因的转录 水平。他们有以下共同特点：启动子的活化受物理或化学信号的诱导：具增强子、沉默 子或类似功能的序列结构；感受特异性诱导的序列都有明显的专一性；一部分该类型的 启动子同时具组织特异性表达的特点；该类启动子常以诱导信号命名，可分为光诱导表达 基因启动子、热诱导表达基因启动子、创伤诱导表达基因启动子、激素诱导表达基因启 动子、真菌诱导表达基因启动子和共生细菌诱导表达基因启动子等( 王关林等，1 9 9 8 ) 。 3 3 1 光诱导表达启动予 l 锄p p a 等( 1 9 8 5 ) 就把小麦的c a b 基因转入双子叶植物烟草，在烟草中表现出了光 调控和器官特异性。t a d a 等( 1 9 9 1 ) 把l h c p 基因与g u s 连接形成嵌合体转化水稻，黑 暗中生长的植株检测不到表达活性，但在光照后诱导表达。西红柿叶绿体s o d 基因的 上游区具有t a t a 盒以及一个2 8 5 b p 的启动子区域，转基因烟草植株也显出光照诱导表 达( k a r d i s h ，1 9 9 4 ) 。a w i n d 盯等( 1 9 9 9 ) 将水稻r 4 c l l 基因与g u s 基因融合导入烟草基 因组中，在紫外照射下r 4 c l l 启动子能在植物发育过程中指导g u s 报告基因的组织特 异性表达。 3 3 2 激素诱导表达启动子 植物激素本身不能直接作用于d n a ，必须首先与其受体结合，使受体蛋白激活再 启动特定基因的表达，从而引起生理反应。由于缺少特定的受体或启动子，植物一般不 受外界激素的刺激。x u ( 1 9 9 3 ) 在转基因水稻中研究了马铃薯p i n 2 启动子诱导表达活性， 构建的嵌合体经m j 或a b a 处理后，g u s 酶活性及i i l i 矾a 水平都受到强烈诱导。j 觚e 等( 1 9 9 5 ) 利用转基因拟南芥和烟草的气孔保卫细胞分析了e m 、c d e t 2 7 - 4 5 基因的a b a 7 基因工程创建无侧芽烟草的初步研究 诱导活性。受a b a 调节表达的基因启动子区域存在a b a 反应元件( a b i 也s ) ，在受到 a b a 诱导时，通过a b i 也s 的顺式调节作用导致了基因的表达。a b r e s 具有a c g ，r c 屺 保守序列和g 盒元件，与具有亮氨酸拉链( b z i p ) 的核结合蛋白特异性的结合。 3 3 3 真菌诱导表达启动子 高等植物具有严密的抗病防御体系，病原菌感染可诱导许多基因的表达，形成多种 防卫机制。马铃薯p 6 9 b 和p 6 9 c 基因编码2 个密切相关的枯草杆菌蛋白酶，并与它们 的抗菌反应相关联。l u c i a ( 2 0 0 0 ) 等把这2 个基因的启动子分别与g u s 和l u c 基因相 连后转入拟南芥，比较它们的基因调控模式，发现p 6 9 b 和p 6 9 c 启动子受水杨酸诱导 以及在假单胞菌的侵染下启始抗性。b e l b 捌( 2 0 0 1 ) 等将来自烟草的病原菌诱导基因 l 塔r 2 0 3 j 的启动子与来自青枯菌的p o p a 诱导子基因相连，转入烟草植株，发现诱导表达 的p o p a 基因定位在h r 且转基因植株对卵菌病原体具有高度抗性。 3 3 4 创伤诱导表达启动子 许多植物都能对人为创伤或害虫造成的机械损伤作出反应，使某些创伤诱导基因启 动表达发挥抗性作用。这些创伤诱导的基因编码多种蛋白产物：包括几丁质酶和b 1 ，3 葡萄糖酶等水解酶类，木质素，蛋白酶抑制剂等。目前对双子叶植物几丁质酶基因的表 达调控和启动子的功能分析取得了一定的进展。在单子叶植物中，尤其是在禾本科作物， 这方面的研究已引起重视( z h u ，1 9 9 3 ) 。r c h 8 是水稻的i 类几丁质酶基因，李红等( 李红 等，1 9 9 7 ) 在p u c l 9 载体质粒中构建了一组5 端不同程度缺失的r c h 8 基因启动子与 g u s 报告基因翻译融合的重组质粒。用p e g 法转入烟草原生质体中，通过测定g u s 酶 活性发现r c h 8 启动子1 0 1 6 6 7 6 b p 之间的d n a 序列缺失后表达活力显著下降，缺失 到6 8 b p 处的启动子仅有很低的活力。此外，泛素核糖体蛋白融合基因u b i 3 ，马铃薯p i l l 2 基因启动子同样也受到创伤诱导( j o 锄，1 9 9 5 ) 。l 0 9 锄锄n 等对土豆的损伤诱导基因蝴j 进行了研究。删刀j 基因编码一个1 8 k d a 的蛋白质，与植物对致死胁迫产生的生理反应 有关。 在许多植物中过氧化物酶( p e r o x i d e ，p o x ) 基因是一种伤诱导应答基因。外源茉 莉酸、乙烯加强了伤诱导p o x 基因的表达，同时也诱导伤应答基因p r 的表达。因此， 茉莉酸和乙烯被认为是伤诱导信号传导的中间体。s 舔a l 【i 等对烟草的过氧化物酶基因 ( t p o x n l ) 进行了研究，该基因在伤诱导后迅速表达且维持较长的时间，而茉莉酸和乙 烯处理t p o x n l 的表达并不加强，认为可能是唯一的伤诱导和伤愈合基因。他们将t p o x n l 的5 上游序列克隆并与g u s 基因结合构建成嵌合基因，将载体转化烟草，发现转基因 烟草叶片和茎干都表现损伤诱导活性，并且在维管束部位g u s 表达活性最强，而且可 以持续表达两周左右，说明该启动子非常适合作为一种基因工程的诱导载体使用 ( s 丛a l ( i ，2 0 0 2 ) 。 8 海南大学硕士学位论文 4 r n a i 技术研究进展 l 讯a 干扰眦i n t 刊衙锄c e ，r n 越) 是多种生物体内由双链砒叮a ( d 叫b l 懿t r a n d c d m 蛆，d s 砌蛆) 介导同源m l 矾a 降解的现象。删现象先后在不同生物中被发现，植 物学家称它为共抑制( c 0 唧p r c s s i o n ) 或转录后基因沉默( p o s t 仃趾s c r i p t i o n a lg e l l e s i l 锄c i n g ，p t g s ) ；线虫和果蝇的研究人员称它为r n a i ；真菌的研究者称它为消除作用 ( q u e l l i n 曲。现在人们己经意识到l 斟础现象在生物体中普遍存在，而且可能有着共同的 生物学