（作物遗传育种专业论文）木榄nah逆向运输蛋白基因的克隆.pdf

卜、 龟 海南大学学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取 得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写 过的作品或成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。 本声明的法律结果由本人承担。 黼秘卜 日期：2 吖口年月日 学位论文版权使用授权说明 本人完全了解海南大学关于收集、保存、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向 国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权海南大 学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫 描等复制手段保存和汇编本学位论文。本人在导师指导下完成的论文成果，知识产权归属海 南大学。 保密论文在解密后遵守此规定。 导师签名：徐弓勃 日期：印年多月，2 臼 本人已经认真阅读“c a l i s 高校学位论文全文数据库发布章程”，同意将本人的 学位论文提交“c a l i s 高校学位论文全文数据库”中全文发布，并可按“章程”中规定享 受相关权益。回盎i 盆塞握奎后进卮；旦坐生；旦= 生i 查垒生苤盔。 论文作者签名：谢 日期：州，年月f 阳 导师签名：徐纫 日期：1 刃辟多月f 日 | f i 捅要 环境中盐分对植物的伤害主要是n a + 引起的，而n a + h + 逆向转运蛋白催化n a + h 十 的逆向跨膜运输，是植物抵御盐胁迫的主要方式之一，在植物耐盐性方面起着重要的作 用。对植物n a + h + 逆向转运蛋白基因的克隆、表达及功能的分析将对阐明植物的耐盐机 理和培育耐盐基因工程植物有重要的意义。 本研究通过g e n b a n k 上登陆的其它植物n a + h + 逆向转运蛋白基因的同源序列设计 一对简并引物，利用r t - p c r 和r a c e 技术获得了木榄n a + h + 逆向转运蛋白基因液泡型 和质膜型的e d n a 全序列，分别命名为b g n h x l 和b g s o s l 。b g n h x ie d n a 全长2 1 3 0 b p ， 5 端非编码区3 3 2 b p ，3 端非编码区1 7 2 b p ，开放阅读框1 6 2 6 个核苷酸，编码一个由5 4 1 个氨基酸构成的多肽，含有n d h + 逆向转运蛋白的高度保守序列l f f i y l l p p i ，这是 n a + h + 逆向转运蛋白活力的竞争性抑制剂氨氯毗嗪脒的结合位点。该基因氨基酸序列与 蓖麻( r i c i n u sc o m m u n i s ) 、毛果杨( p o p u l u st r i c h o c a r p a ) 、胡杨( p o p u l u se u p h r a t i c a ) 、 柑桔( o t r u sr e t i c u l a t a ) 、大豆( g l y c i n em a x ) 、棉花( g o s s y p i u mh i r s u t u m ) 、葡萄( m t i s ，加归r 口) 、拟南芥( a r a b i d o p s 西t h a l i a n a ) 的n a + h + 逆向转运蛋白氨基酸序列具有很高的 同源性，分别为8 3 、8 3 、8 4 、8 0 、8 0 、8 l 、8 1 、7 8 。 b g s o s lc d n a 全长3 7 0 3 b p ，5 端非编码区11 6 b p ， 3 端非编码区1 2 5 b p ，开放阅 读框3 4 6 2 个核苷酸，编码一个由1 1 5 3 个氨基酸构成的多肽，该基因氨基酸序列与毛果 杨( p o p u l u s 妒i c h o c a r p a ) 、蓖麻( r i c i n u sc o m m u n i s ) 、胡杨( p o p u l u se u p h r a t i c a ) 葡萄( h t i s ，觑以朋) 、霸t ( z y g o p h ) 7 l l u mx a n t h o x y l u m ) 、美国野藜( c h e n o p o d i u mq u i n o a ) 、番茄 ( s o l a n u ml y c o p e r s i c u m ) 、水稻( o r y z as a t i v a ) 的n a + h + 逆向转运蛋白氨基酸序列具有 很高的同源性，分别为7 7 、7 5 、7 5 、7 3 、6 9 、6 7 、6 8 、6 4 。 根据b g s o s l 基因全长序列设计引物扩增其编码区，用于构建其植物表达载体 p c a m b i a l 3 0 2 b g s o s i ，重组质粒导入根癌农杆菌( e h a l 0 5 ) r 和，获得工程菌e h a l 0 5 p c a m b i a l 3 0 2 b g s o s i 。农杆菌介导法将b g s o s l 基因编码区导入烟草，获得卡那霉 素杭性植株，p c r 证明外源b g s o s l 基因已整合到烟草基因组中。 关键词：木榄耐盐n a + h + 逆向转运蛋白基因克隆转丝因炯草 。 a b s t r a c t p l a n ts a l ts t r e s si sm a i n l yc a u s e db yn a * t h en d w a n t i p o r t e r sc a t a l y z et h ee x c h a n g e o f n a + f o rh 十a c r o s st h em e m b r a n e ，a n dt h e y p l a ya l li m p o r t a n tr o l ei nt h em e c h a n i s m so f p l a n ts a l tt o l e r a n c e t h ec l o n i n g , e x p r e s s i o na n df u n c t i o ns t u d yo ft h en a + i - i + a n t i p o r t e ri so f g r e a ti m p o r t a n c ef o rt h es t u d yo fp l n a ts a l tr e s i s t a n tm e c h a n i s ma n dt h eb r e e d i n go fs a l t r e s i s t a n tp l a n t i no r d e rt oi s o l a t et h ef u l ll e n g t he d n ao fn a + i - i + a n t i p o r t e rg e n ef r o mt h eb r u g u i e r a g y m n o r h i z a ，r t - p c ra n dr a c ew e r ec a r r i e do u t , a n dap a i ro fd e g e n e r a t ep r i m e r sw e r e d e s i g n e da c c o r d i n gt h en 容暇a n t i p o r t e rh o m o l o g o u sg e n er e g i o no fo t h e rp l a n t s t h eg e n e s o b t a i n e dw e r en a m e db g n h x ia n d b g s o s l b g n h x l e d n a ( 2 1 3 0 b p ) i n c l u d e da3 3 2 b p 5 u t r ，a1 7 2 b p3 u t r ，a1 6 2 6 b po p e nr e a d i n gf r a m ee n c o d i n ga5 4 1 a m i n o a c i d p o l y p e p t i d ew h i c hw a s8 3 ，8 3 ，8 4 ，8 0 ，8 0 ，8 1 ，8 1 ，7 8 t os e q u e n c e so f r i c i n u s c o m m u n i s ，p o p u l u st r i c h o c a r p a ，p o p u l u se u p h r a t i c a ，c i t r u sr e t i c u l a t a ，g l y c i n em a x ， g o s s y p i u mh i r s u t u m 、v i t i sv i n i f e r a 、a r a b i d o p s 西t h a l i a n ai na m i n oa c i dh o m o l o g y r e s p e c t i v e l y t h ed e d u c e da m i n oa c i ds e q u e n c ei n c l u d e dt h ec o n s e r v e da m i l o r i d eb i n d i n g s i t e so fl f f i y l l p p i b g s o s le d n a ( 3 7 0 3 b p ) i n c l u d e da116 b p5 u t r ，a1 2 5 b p3 u t r ，a3 4 6 2 b po p e n r e a d i n gf r a m ee n c o d i n ga115 3 一a m i n o a c i dp o l y p e p t i d ew h i c hw a s 。7 7 ，7 5 ，7 5 ，7 3 ， 6 9 ，6 7 ，6 8 ，6 4 t os e q u e n c e so f p o p u l u st r i c h o c a r p a ，r i c i n u sc o m m u n i s ，p o p u l u s e u p h r a t i c a ，v i mv i n i f e r a ，z y g o p h y l l u mx a n t h o x y l u m ，c h e n o p o d i u mq u i n o a ，s o l a n u m l y c o p e r s i c u m 、o r y z as a t i v ai na m i n oa c i dh o m o l o g yr e s p e c t i v e l y t oa m p l i r yt h eo r f s e q u e n c eo fb g s o s l ，p r i m e r sw e r ed e s i g n e da c c o r d i n gt ot h ef u l l l e n g t hc d n as e q u e n c eo f b g s o s l a n dt h eb g s o s io r fw a su s e df o rt h ec o n s t r u c t i n go f t h ep l a n te x p r e s s i o nv e c t o rp c a m b i a l 3 0 2 - b g s o s l t h er e s u l t a n tp l a s m i d p c a m b i a l3 0 2 一b g s o s 1w a st r a n s f e r r e di n t oa g r o b a c t e r i u mt u m e f a c i e n s ( e h a l 0 5 ) t h e b g s o s lg e n ew a st r a n s f e r r e di n t ot o b a c c o p c ra n a l y s i ss h o w e dt h a tb g s o s lg e n ew a s i n t e g r a t e di n t ot o b a c c og e n o m e k e yw o r d s ：b r u g u i e r ag y m n o r h i z as a l t t o l e r a n c en a + h + a n t i p o r t e rg e n ec l o n et r a n s g e n i c t o b a c c o l 前言1 1 1 盐渍环境对植物生长的影响：1 1 1 1 盐胁迫对植物形态发育的影响1 1 1 2 盐胁迫对植物生理生化代谢的影响l 1 2 植物耐盐的分子机理2 1 2 1 小分子物质的积累2 1 2 2 脯氨酸2 1 2 3 甘氨酸甜菜碱3 1 2 4 多元醇( p o l y 0 1 ) 3 1 3 红树林植物的耐盐性3 1 3 1 红树林对盐渍环境的适应性3 1 3 2 红树林值物耐盐分子生物学研究：4 1 4n a + h + 逆向转运蛋白研究进展5 1 4 1n a + h + 逆向转运蛋白的特征及功能5 1 4 2 植物液泡膜n a + h + 逆向转运蛋白的研究5 1 4 3s o s l 基因与植物耐盐性的关系6 1 4 4 植物n a + h + 逆向转运蛋白转基因研究进展7 1 5 本研究的目的意义和技术路线8 1 5 1 研究的目的意义8 1 5 2 技术路线8 2 木榄液泡膜n a + h + 逆向转运蛋白基因的克隆1 0 2 1 实验材料l o 2 1 1 植物材料10 2 1 2 实验试剂：1 0 2 1 3 菌株和质粒。l l 2 2 实验方法和步骤1 l 2 2 1r n a 的提取1 l 2 2 2e d n a 第一链的合成1 2 2 2 3b g n h x i 基因中间保守区的扩增。1 3 2 2 4b g n h x l 基因全长克隆1 6 3 木榄质膜型n a + h + 逆向转运蛋白基因b g s o s l 的克隆1 9 3 1 实验材料1 9 3 2 实验方法和步骤1 9 3 2 ir n a 的提取1 9 3 2 2c d n a 第一链的合成2 0 3 2 3b g s o s l 基因中间保守区的扩增2 0 3 2 4b g s o s l 基因全长克隆2 l 3 2 5b g s o s l 表达载体的构建及遗传转化2 3 4 结果与分析3 0 4 1 木榄r n a 的提取3 0 4 2 木榄液泡膜型逆向转运蛋白基因b g n h x l 的克隆，3 0 4 2 1b g n h x i 基因e d n a 中间片段的分离3 0 4 2 2b g n h x l 基因3 端的分离3 1 4 2 3b g n h x l 基因5 端的分离3 l 4 2 4b g n h x l 基因全长c d n a 的克隆3 2 4 2 5b g n h x l 基因的生物信息学分析3 3 4 3 木榄质膜型逆向转运蛋白基因b g s o s l 的克隆3 8 4 3 1b g s o s l 基因e d n a 中间片段的分离3 8 4 3 2b g s o s l 基因3 端的分离3 8 4 3 3b g s o s l 基因5 端的分离3 9 4 3 4b g s o s l 基因e d n a 全长的克隆4 0 4 3 5b g s o s l 基因的生物信息学分析4 0 4 4 b g s o s l 基因功能的初步分析一4 6 4 。4 1 植物转化表达载体的构建4 6 4 4 2 植物表达载体p c a m b i a l 3 0 2 b g s o s l 转化农杆菌4 8 4 4 3 植物表达载体p c a m b i a l3 0 2 b g s o si 转化烟草4 9 5 讨论5l 5 1r a c e 实验几个关键因素5l 5 1 1r n a 的提取5l 5 1 2 引物的设计5 1 5 2 木榄液泡膜型逆向转运蛋白5 2 5 3 木榄质膜型逆向转运蛋白5 3 5 4 逆向转运蛋白转基因前景5 3 6 结论5 5 缩写词( a b b r e v i a t i o n ) 6 1 致 射6 2 1 前言 水资源短缺以及土壤盐渍化是目前制约农业生产的一个全球性问题，全球2 0 的耕 地受到盐害威胁，4 3 的耕地为干旱、半干旱地区。干旱与盐害严重影响植物的生长发 育，造成作物减产，并且日益恶化生态环境。提高作物的耐盐、抗旱能力已经成为现代 植物育种工作急需解决的关键问题之一，而植物抗旱、耐盐相关基因的挖掘已成为目前 植物遗传资源与品种改良研究的热点。 1 1 盐渍环境对植物生长的影响： 某些盐生植物的生长尽管需要n a + ，但土壤中过多的n a + 仍然是大面积盐荒地上植 物生长的主要限制因子之一，尤其是大多数农作物为甜土植物。盐影响着植物对1 0 的 吸收、细胞质酶的活性、光合作用和代谢作用【l ，2 】。过多的盐分引起植物水分亏缺导致 渗透胁迫以及过量的n a + 积累造成离子毒害【3 l ，其中离子毒害是造成植物在盐碱地上生 长发育受阻的主要原因。因为过多的n a + 影响了酶的活性，破坏细胞膜结构，使膜的选择 性功能丧失【4 1 。盐生植物虽然能适应高盐环境，但其胞质内的酶并不能适应高n a + 水平， 而是表现出与甜土植物酶同样的n a + 敏感性【5 6 】。因此，无论盐生植物还是甜土植物，在 高盐环境下，植物反应最终结果就是保持胞质内较低的n a + 浓度。植物降低细胞内n a + 浓度的措施有拒n a + 、n a + 的外排和n a + 的区隔化【7 1 ，其中n a + 的外排和区隔化是由n a + h + 逆向转运蛋白来调节的，所以该蛋白的功能、与植物耐盐性的关系及其分子生物学的研 究就成为近年来人们研究的热点问题之一。 1 1 1 盐胁迫对植物形态发育的影响 盐胁迫对植物个体形态发育的整体表现为抑制组织和器官的生长，加速发育过程， 缩短营养生长和开花期。在n a c i 胁迫( o 1 、0 2 、0 3 、0 4 ) 条件下，马铃薯试 管苗生长受到显著抑制，且随着盐浓度的增高，各个处理间差异加大【引。魏国强【9 】等用 2 5 、5 0 m m o l ln a c i 处理黄瓜幼苗，发现植株株高、鲜重和干重均降低。杨秀玲f l o 】等研 究也发现，随着n a c i 浓度的增高，黄瓜幼笛地上和地下部鲜重以及根冠比也表现为下 降。 1 1 2 盐胁迫对植物生理生化代谢的影响 ( 1 ) 水分平衡与质膜透性 在盐胁迫下，植物细胞脱水，膜系统破坏，位于膜上的酶功能紊乱，各种代谓 无 序进行，导致质膜透性的改变。一般认为耐盐能力强的植物品种在盐分胁迫下，细胞 膜透性变化较小，敏感植物则变化大。盐胁迫以及其它任何环境胁迫所造成的植物细 胞膜的损坏，都会使细胞膜的透性增大，对水和离子的交换能力下降，直至丧失【1 1 ，1 2 】。 ( 2 ) 光合作用 盐胁迫下植物叶绿体酶活性增加，促进了叶绿素b 分解，捕光色素蛋白复合体的结 构与功能受到损害甚至发生降解和破坏，光合速率下降，同化产物合成减少。同时，盐 胁迫还会降低c 3 循环的中间产物磷酸甘油酸和磷酸三糖磷酸甘油醛含量，不利于c 同 化的正常运转【1 2 ，1 3 1 。 ， ( 3 ) 呼吸作用 呼吸作用提供植物大部分生命活动所需要的能量，同时，它的中间产物又是合成多 种重要有机物质的原料。植物积累或拒绝盐离子，合成有机渗透调节物或抵抗盐胁迫等 一系列过程都需要消耗大量能量，因此盐胁迫下植物呼吸强度首先增强，随着时间的延 长而减弱。植物的呼吸作用和光合作用是既相互对立及又相互依存的，盐胁迫打乱正常 呼吸代谢的同时也影响到植物的光合代谢，造成一系列不良的连锁反应【1 2 】。 1 2 植物耐盐的分子机理 盐胁迫对植物的伤害主要是由于n a + 离子等离子过量使k + ，c a 2 + 离子吸收受到抑制， 细胞膜正常生理功能受损以及渗透胁迫造成生理失水而引起的。植物为了消除盐胁迫造 成的伤害，通常在细胞内主动积累一些小分子有机化合物和大分子的蛋白类等保护剂， 以维持细胞的正常膨压和正常的生理功能【1 4 15 1 。 1 2 1 小分子物质的积累 早期植物耐盐机制的研究多集中在一些小分子物质上，如已经清楚对植物耐盐有作 用的物质有：脯氨酸( ( p r o l i n e ) 、甘氨酸甜菜碱( g l y c i n eb e t a i n ) 、胆碱( c h o l i n e ) 、三甲基甘 氨醛( b e t a i na l d e h y d e ) 、二甲基甘氨酸( d i m e t h y lg l y e i n e ) ，肌醇( 1 n o s i t 0 1 ) 、甘露醇 ( m a n n i t 0 1 ) 、山梨糖醇( s o b i t 0 1 ) 、多轻基糖醇化合物( d o n o n i t 0 1 ) 、海藻糖( t r e h a l o s e ) ， 3 一二甲基硫丙酸等【”，l6 1 。这些小分子物质称为渗透保护剂。 1 2 2 脯氨酸 脯氨酸是水溶性最大的氨基酸，在受到高盐和干早等胁迫下，许多植物都积累了高 水平的脯氨酸，以调节渗透平衡和作为酶与细胞结构的保护剂【1 7 1 。脯氨酸积累是植物受 到胁迫的一种信号。在细菌中，脯氨酸的生物合成是由谷氨酸开始，在8 谷氨酸激酶的 作用下，谷氨酸转化成谷氨酸磷酸，谷氨酸磷酸在谷氨半醛脱氢酶的作用下形成谷氨半 醛，环化后形成p y r r o l i n e 5 c a r b o x y l a t e ( p 5 c ) ，然后p 5 c 在p 5 c 还原酶作用下形成脯氨 酸【1 8 l 。在植物中脯氨酸的合成由谷氨酸和鸟氨酸开始【1 9 1 ，p 5 c 还原酶和p 5 c 合成酶是脯 氨酸生物合成过程中两个重要酶，后者是限速酶，p 5 c 合成酶基因已从m o t h b e a n 、拟南 芥和水稻中克隆1 2 0 1 。将p 5 c 合成酶基因转入烟草后，可使脯氨酸合成增加1 0 - 1 8 倍，耐盐 性与对照比也有所提蒯引】。 1 2 3 甘氨酸甜菜碱 甜菜碱属于四甲基胺类化合物，广泛存在于高等植物的黎科、锦葵科、夕本科、茄 科、菊科、觅科植物中，在盐害、干早等逆境条件下，这些植物可不积累甜菜碱，由于 甜菜碱的生物合成途径比较简单，积累甜菜碱比积累脯氨酸的植物对盐的耐受性高，甘 氨酸甜菜碱能使三梭酸循环的关键酶类在盐胁迫等渗透胁迫下受到保护，因而被认为是 最有希望的植物渗透调节剂之一。在植物中甜菜碱的合成由两步氧化反应完成，负责这 两步氧化反应的酶类r ：h b _ 碱单氧化酶( c m o ) 和甜菜碱醛脱氢酶( ( b a d h ) 【2 2 , 2 3 】，其反应过 程如下： 2 h2 h ( c h 3 ) 3 n + c h 2 c h 2 0 h ( c h 3 ) 2 n 十c h 2 c h o + ( c h 3 ) 3 n + c h 2 胆碱甜菜碱醛甘氨酸甜菜碱 目前已从菠梨2 4 , 2 5 】、甜菜【2 6 】、山菠菜【2 7 】、大麦【2 8 】、高粱【2 9 1 、水稻【3 0 1 、甘菊和向 日葵【3 2 1 等植物中克隆至l j t b a d h 基因，c m o 基因从菠菜、甜菜【3 3 1 、山菠菜【2 7 1 、盐角草3 4 1 、 辽宁碱蓬【3 5 】和水稻【3 6 】等植物中克隆到。 1 2 4 多元醇( p o t y 0 1 ) 多元醇包括单链代谢物如甘露醇、山梨醇、环状多元醇、肌醇和其它的甲基化衍生 物。多元醇的积累与植物对干旱和盐分的耐受性有关，其作用是对植物提供渗透调节和 渗透保护。甘露醇和肌醇生物合成所需的酶基因i n o l 和i m t l 己从冰草( m e s e m b r y a n t h e m u m c 垆细胁“朋) 中克斛3 7 , 3 8 1 。这两个基因在冰草发育的任何阶段，都受到严格的控制，只有 在盐胁迫和低温下才被诱导表达。i m t d ( 1 磷酸甘露醇脱氢酶基因) 已从大肠杆菌中克隆 到，将其转入烟草后，转基因烟草可积累甘露醇，并对高盐具有耐性【3 们。负责肌醇向甲 基化肌醇转化的酶，即肌醇o 甲基转移酶，编码该酶的基因已得到克隆，其转基因植 物对盐害和干早都有一定的抗性 3 7 】。在盐胁迫和干早下，研究者发现，转基因植物的光 合作用c 0 2 固定能力受抑制的程度较对照小，且恢复较快。故认为转逆境诱导的基因比 转组成型表达的基因更能保护逆境下的植物。 1 3 红树林植物的耐盐性 1 3 1 红树林对盐渍环境的适应性 许多研究表明，无论是自然生长的，还是人工栽培的，随着盐胁迫程度的提高，红 树植物的光合速率( 以单位时间内单位面积叶片的c 0 2 净固定量表示) 下降，对照( 不加 n a c l 者) 最高【4 0 4 2 1 。也有研究表明随盐胁迫强度的提高，红树植物根系用于吸收养分 所需的能量增加，呼吸提高【4 3 1 。那么红树植物是通过何种方式来实现低盐对其生长的促 进作用的呢? 就木榄来说】，通过以下途径来弥补单位面积叶片净光合能力的下降： 增加光合作用面积，虽然盐胁迫导其叶片生长速率下降，但在一定的盐度范围内，平均 单叶面积却随盐度的提高而增加；延长叶片光合作用时间，这主要通过延长叶片寿命 的方式实现的。这两者共同作用使得胁迫对木榄幼苗每苗叶面积及叶片生物量积累的影 响比对其它生长指标的影响小得多，在盐度3 0 处达到最大，盐度5 0 处的叶面积及叶片 生物量积累与对照相当。虽然盐胁迫降了单位面积叶片的净光合能力，但叶面积的提高 在一定程度上抵消了这种抑制作用，使得低条件下木榄幼苗干物质的积累反而高于对 照。而对非盐生植物水稻、柑桔等的研究表明，盐胁迫不但降低了叶片的光合能力，还 促进了叶片的衰老【4 5 , 4 6 】。 1 3 2 红树林值物耐盐分子生物学研究 在红树林植物耐盐相关基因克隆方面，研究报导相对较少，目前只有日本人建立了 红树林植物海莲和木榄的表达序列标签( e s t ) ，m o r i y a a 掣4 7 】对红树林植物海莲 ( b r u g u i e r as e x a n g u l a ( l o u r ) p o i r ) 的咯琳：5 一酸合成酶进行了分子克隆和序列分析； y a m a d aa 等【4 8 】通过m r n a 差异显示( d d r t p c r ) 技术从海莲叶片悬浮细胞的e d n a 文 库中克隆了一个新的耐盐因子“m a n g r i n ”，其全长c d n a 由1 0 1 9 b p 组成，编码一个2 5 6 个氨基酸残基组成的蛋白质，这个蛋白质为丙二烯氧化物环化酶( a t l e n eo x i d ec y c l a s e a o c ) 的同系物，将其导入大肠杆菌、酵母菌和烟草，转基因大肠杆菌、酵母菌和烟草 的耐盐性都得到了增强，而来自番茄的丙二烯氧化物环化酶和拟南芥中的a o v 同源物 却都不具有此功能，其原因是红树林植物海莲的a o v 蛋白序列中有1 个从1 6 至8 6 位 的7 0 个氨基酸是耐盐所必需的功能区域，而番茄的a o v 和拟南芥的a o v 同系物则没 有此功能区域；y a m a d a a 等【4 8 】还克隆到另一个耐盐因子，这个耐盐因子能编码一个2 1 个从的t t c ( ac y t o s o l i cc h a p e r o n i n - c o t a i n i n gt - c o m p l e xp e p t i d e - 1 ) 的同系物，将这个耐 盐因子转入e c o l i ，能增强大肠杆菌的耐盐性；k o i c h is u g i h a r a 掣4 9 】从红树林植物木榄 ( b r u g u i e r ag y m n o r r h i z a ) 中克隆到一个编码氧释放增强子蛋白o e e i 的c d n a ，据推测， o e e l 的氨基酸顺序由3 2 2 氨基酸残基组成，与烟草的o e e 有8 7 的同源性，o e el 与 其它o e e 亚基及光系统i i 的d l 蛋白的表达分析表明，经n a c i 处理后，三种o e e s 的 转录水平均有所增强。厦门大学生命科学学院周涵韬和林鹏将红树林植物白骨壤 ( a v i c e n n i am a r i n a ) 的果分别置于含海水和淡水的砂中培养，分别提取新长出的根的r n a 后，利用m r n a 差异显示技术( d d r t - p c r ) 从中获得了一个5 9 3 b pe d n a 差异片段，推 测其与白骨壤的耐盐性相关【5 0 1 。目前被认为耐盐程度最高的n h x i 基因，虽然己在盐生 植物碱蓬中克隆到，但它首先是在甜土植物拟南芥和棉花中克隆到的，还不是盐生植物 所特有的基因，且其耐盐性也只是l 2 海水的盐度。红树林植物海莲的a o v 基因虽然 转入大肠杆菌、酵母和烟草中能显著提高转化子的耐盐性，但耐盐机理仍然不很清楚【5 1 1 。 4 因此，红树林植物耐盐分子机理及耐盐相关基因的研究仍处于初步阶段。 1 4n a + h + 逆向转运蛋白研究进展 1 4 1n a + h + 逆向转运蛋白的特征及功能 n a + h + 逆向转运蛋白是普遍存在于生物体内的一种膜蛋白，具有促进n a + 和h + 在细 胞和细胞器水平上的跨膜交换，对维持细胞内部的p h ，细胞的体积、形状，原生质中 的n a + 浓度等方面均起着调节作用【5 2 巧4 1 。迄今，在动物、植物、酵母和细菌中已克隆出 较多的n a + h + 逆向转运蛋白基斟5 3 5 5 ，5 6 1 。 质膜上的n a + h + 逆向转运蛋白于1 9 7 6 年在老鼠肾细胞中首次发现【5 2 】。近几年，动 物、植物、酵母和细菌中关于质膜上的n a + h + 逆向转运蛋白相继被发现报道【5 3 , 5 6 , 5 7 1 。在 动物中，n a + h + 逆向转运蛋白是一个较大的家族，被命名为n h e ，到目前为止，该家族 中至少有9 个成员被报划5 7 ，5 扪，上述成员分布在不同的组织和器官，不同成员的亚细胞 定位也有所不同【5 引。在裂殖菌酵母中，s o d 2 是报道较早的编码耐盐相关n a + h + 逆向转 运器的基因，此外，在酿酒酵母和结合菌酵母中发现了s o d 2 的同源基因。在酵母菌里， 和哺乳动物的n h e 基因同源的s c n h x 基因【6 1 1 。在大肠杆菌中，也发现了编码n a + h + 逆向转运蛋自的两种截然不同的基剧6 1 】。植物种属质膜上的n 棚逆向转运蛋自首先在 大麦质膜上被鉴定【6 2 】。近年来，在模式植物拟南芥中鉴定了n a + h + 质膜逆向转运蛋白 ( s o s i ) 6 3 】。关于植物种属液泡膜n a + h + 逆向转运蛋自的研究，自1 9 8 5 年b l m w a l d 和 p o o l e 5 9 】在甜菜根部贮藏组织的液泡膜上发现n a + h + 逆向转运活性以来，在冰叶日中花 6 4 】等盐土植物和大麦【6 5 1 、车前掣6 6 1 等甜土植物中也相继发现存在n a + h + 逆向转运活性。 在蛋白质的拓扑结构上，n a + h + 逆向转运蛋白含有9 至1 2 个的跨膜域。尽管不同 生物中n a + i - i + 逆向转运蛋白的氨基酸残基数量、跨膜域数目有所不同，但n a + h + 逆向 转运蛋白在跨膜域的组成上高度保守。此外，不同生物如拟南芥中的a t n h x i ，哺乳动 物中的n h e 以及酵母中的n h x i 编码的n a + i = i + 逆向转运蛋白具有相似的氨氯吡嗪脒绑 定蛋白区域f ( i l ) ( y f ) l f l l p p i 序列。在功能上，动物中的n a + h + 逆向转运蛋白n h e 家族，主要参与维持细胞体积、胞内p h 以及n a + 的平衡。裂殖菌酵母中的s o d 2 赋予 宿主在盐胁迫条件下较强的耐盐性。酵母菌中s c n h x l 编码的蛋白具有调节n a + 进入细 胞内一个称为前液泡体的特定区域，由此抵御盐害的功能 3 0 , 6 0 】。 1 4 2 植物液泡膜n a + h + 逆向转运蛋白的研究 g a x i o l a 等( 1 9 9 9 ) 根据酵母菌s c n h x i 序列，首先从拟南芥中克隆到与酵母菌s c n h x i 同源的编码液泡膜n a + h + 逆向转运蛋自的植物基因【5 5 】。通过对拟南芥基因组数据库 0 r a b i d o p s i s g e n o m ei n i t i a t i v e2 0 0 0 ) 进行分析，发现在拟南芥中存在着1 6 个被标注为编 码n a + h + 逆向转运蛋白的基科f 7 6 引。根据对a t n h x i 和这1 6 个成员的氨基酸序列和拓 扑结构的相似性进行比较，发现拟南芥液泡膜n a + h + 逆向转运蛋白均具有1 2 个跨膜区 域和一个保守的氨氯吡嗪脒绑定位点，同源进化树分析发现，与非植物组织编码n a + h + 质膜逆向转运蛋自基因及拟南芥质膜s o s l 相比，a t n h x 2 6 和a t n h x i 具有更大的序列 相似性，构成a t n h 家族。在表达特征上，拟南芥a t n h x 基因家族六个成员有所不 同 6 8 , 6 9 1 。其中，a t n h x i 和a t n h x 2 在幼苗的根、茎中表达，且转录本的丰度较高：a t n h x 5 在根、茎中也都有表达，但转录本的丰度与a t n h x i 和a t n h x 2 相比较低。a t n h x 3 主要 在根中表达，a t n h x 4 和a t n h x 6 仅通过r t - p c r 检测到微量转录本的存在。 在酵母突变体n h x l 中，超量表达拟南芥a t n h x i 可以抑制突变体对于n a + l i + 的敏感 性，预示着a t n h x i 具有作为一个内涵体n 矿h + 逆向转运器的功能【6 9 1 。对植物液泡膜 n a + h + 逆向转运蛋自基因对盐分胁迫的响应研究发现，部分基因受到盐分胁迫的诱导调 节，如盐分处理导致a t n h x i 转录在叶片中的表达水平增加【弛7 2 1 。 1 4 3s o s l 基因与植物耐盐性的关系 s o s i 基因编码的s o s l 蛋白即位于质膜上的n a r 反向运输体，在功能上有将细 胞内的n a + 糖l j 胞外的作用，这对维持植物细胞内k + 和n a + 的稳态、减少n a + 在细胞乃 至体内的积累非常重要，因此，它是s o s 基因家族中与植物耐盐性关系最直接的【7 3 7 4 】。 盐胁迫下s o s l 的m r n a 在拟南芥根尖表皮细胞及根、茎、叶木质部薄壁细胞中表达增 强。根尖中的s o s l 可把n a + 搬i j 胞外，部分进入到根、茎和叶木质部液流中的n a + 可 被木质部薄壁细胞中的s o s l 重新吸收，控制n a + 向上运输【7 5 】。s h i 等7 6 1 报道，s o s l 基 因在拟南芥中的超量表达( o v e r e x p r e s s i o n ) 后，在盐胁迫下的拟南芥植株木质部蒸腾流中 的n a + 明显减少，耐盐性显著增强。盐处理也能促进质膜h + a t p a u s e 表达，增强h + 跨膜 转运能力，这也为提高s o s l 活性起到协调作用。s o s i 蛋白在功能上相当于质膜n a + h - i + 反向运输体，在s o s 途径中成为其家族成员中调节的最终对象，因此它与植物耐盐性 的关系也最为密切【。7 7 j 。 。 6 网 i 照出f 晖：3 蕴矗l 圈( c n ”传感嚣和c p 结合鬣臼) 一+ 网( 熊氯竣苏氯酸类虽臼教晴。8 0 s 3 与其c 啊 调控区壤i * i s l 罄元自我抑翻区焰含) ls 0 s 3 一s 嘴2 堡体l ( 礁现一瞳化功能) 7 弋 膜、k 运输i i f n 活性变化ii 液泡膜n a 运输赞r 1 激活 眦激活等) ( 细胞铀麓蟹白) 图1s o s 蛋白家族与植物耐盐性的关系 f i , lt h em l a u o no fs o sg e n e sf a m i l ya n dp l a n ts a l tt o l e r a n e e 1 4 4 植物n a + h + 逆向转运蛋白转基因研究进展 。 超量表达a t n h x l t 。7 8 】能够调节植物的耐盐性，液泡膜n “h + 逆向转运蛋白的空突变 体基因在牵牛花的花冠正常表达，会破坏这些细胞的液泡p h 。在拟南芥中超量表达 a t n h x i 后，植株的耐盐性明显增加。a p s e 等【6 7 】在拟南芥中过量表达a t n h x i 基因发现， 非胁迫条件下转基因植株液泡膜n a + h + 逆向转运活性比野生型植株明显提高，并且这种 n a + h + 逆向转运活性的升高和a t n h x i 蛋白表达量的增加相一致。对蛋白表达量的研究 发现，编码蛋白数量的增加低于蛋自转运活性的增加【6 引。在2 0 0m m 高盐浓度下，转 a t n h x i 基因植株液泡膜n a + 转运活性增加，液泡中n a + 浓度增大，表明n a + 区隔化在转 基因植物的耐盐能力中具有重要作用。此外，转基因植株在高盐处理下生长正常，发育 和结实良好【7 9 】。表明超量表达植物种属液泡膜n a + h + 逆向转运蛋白基因在改善作物的耐 盐能力中具有广阔的应用前景。 利用基因工程手段，z h a n g 等【7 9 】在番茄中过量表达a t n h x l ，得到了世界上第一批 真正意义上的耐盐作物。在2 0 0m mn a c i 胁迫条件下，转基因植株仍可正常生一长、 开花并结实。且转a t n h x i 基因番茄叶片细胞的液泡中，盐分的累积量与对照相比明显 增加，但果实中的盐分含量与对照没有差异。超量表达s o s i 的拟南芥植株，与对照相 比，盐胁迫条件下木质部蒸腾流中n a + 的含量减少，植株对盐胁迫的耐性增强【8 0 1 。 1 5 本研究的目的意义和技术路线 1 5 1