（内科学专业论文）内质网应激在大鼠酒精性肝病肝细胞调亡中的作用.pdf

目录 中文摘要l 英文摘要5 研究论文内质网应激在大鼠酒精性肝病肝细胞凋亡中的作用 前言9日i j 舌 材料与方法9 结果1 3 附图1 5 附表3 3 讨论3 7 结论4 1 参考文献4 l 综述内质网应激在酒精性肝病肝细胞凋亡中的作用4 4 致谢5 9 个人简历6 0 中文摘要 内质网应激在大鼠酒精性肝病肝细胞凋亡中的作用 摘要 目的：酒精性肝病( a l c o h o l i cl i v e rd i s e a s e ，a l d ) 是因长期过量饮酒引 起的中毒性肝脏疾病。其包括轻症a l d 、酒精性脂肪肝、酒精性肝炎、酒 精性肝纤维化和酒精性肝硬化等类型。a l d 的发病机制复杂，目前尚不完 全清楚，内质网应激( e h d o p l a s m i cr e t i c u l u ms t r e s s ，e r s ) 及其介导的肝细 胞凋亡可能在其中发挥重要作用。 e r s 指由于各种原因导致细胞内质网生理功能发生紊乱，钙稳态失 衡，错误折叠或未折叠的蛋白质在内质网腔内聚集的一种亚细胞器的病理 状态，它是使错误的蛋白质恢复正确构象并能够进一步加工的必需步骤。 e r s 是体内的一种自我保护机制，但如果e r s 反应过强或持续时间过长， 肝细胞所受损伤过于严重，则会启动细胞凋亡程序，最终导致肝细胞凋亡， 从而加重肝脏病变。 以往的研究证实，在a l d 中，高同型半胱氨酸血症( h y p e r h o m o c y s t e i n e m i a ，h h c y ) 可诱发e r s 。胱硫醚p 合成酶( c y s t a t h i o n i n eb e t a s y n t h a s e ，c b s ) 为吡哆醛磷酸依赖性酶，主要在肝脏中合成，是同型半胱氨酸( h o m o c y s t e i n e ，h c y ) 代谢过程中的关键酶，其活性的降低可能是导致高同型半胱氨 酸血症的重要原因。葡萄糖调节蛋白7 8 ( g l u c o s e r e g u l a t e dp r o t e i n ， g r p 7 8 ) ，是内质网内驻留最多的一种分子伴侣。应激状态下，g r p 7 8 大 量表达，与未折叠蛋白结合，恢复蛋白质的正确构象。因此，g r p 7 8 被认 为是e r s 的标志性分子。e r s 介导的肝细胞凋亡过程包括细胞内钙稳态失 衡及一系列的酶促反应和信号转导。需钙蛋白酶2 ( c a l p a i n2 ) 和c a s p a s e 1 2 是存在于肝细胞中的半胱氨酸蛋白酶类，可能在此过程中发挥重要作用。 本研究拟用酒精灌胃的方法建立大鼠酒精性肝病模型，检测血清总同型半 胱氨酸( t h c y ) 的浓度和肝组织c b s 的活性；分别用免疫组化法和r t - p c r 法检测肝组织中g r p 7 8 、c a l p a i n2 、c a s p a s e 1 2 蛋白和m r n a 的表达变化； 应用t u n e l 染色法检测肝细胞凋亡。以探讨内质网应激及其介导的肝细 胞凋亡在大鼠酒精性肝病中发挥的作用。 方法：选用雄眭w i s t e r 大鼠5 0 只，体重2 0 0 士2 0 9 ，正常饲养1 周后随机 中文摘要 分出1 0 只为对照组，其余动物采用逐渐增加酒精浓度( 浓度3 0 6 0 ，乙 醇5 9 9 k g i d 1 ) 的方法进行酒精灌胃，分别于4 周、8 n 、1 2 周和1 6 周末禁 食1 2 d , 时后随机处死动物9 只、9 r 、8 只和8 只( 大鼠在造模过程中死亡6 只) ，留取血清及肝组织标本；检测血清a l t 、a s t 、t g 、t c 、h d l 、l d l 、 v l d l 、t h c y 等生化指标；用比色法测定肝组织匀浆c b s 的活性。取部分 肝组织冰冻切片行苏丹染色，观察肝细胞脂肪变性情况；另取肝组织制 作石蜡切片，分别行苏木精伊红( h e m a t o x y l i n e o s i n ，h e ) 染色、天狼红 染色、过碘酸希夫染色( p a s ) ，观察肝组织普通病理改变，纤维化程度 和肝组织胞浆糖原变化；分别用免疫组织化学染色及逆转录聚合酶链反应 ( r e v e r s et r a n s c r i p t i o n p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ，r t - p c r ) 的方法，检测 肝组织中g r p 7 8 、c a l p a i n2 、c a s p a s e 1 2 蛋白和m r n a 的表达情况。采用 脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法( t u n e l ) 检测肝细胞 凋亡。 结果： 1 血清肝功能指标的变化：随着造模时间的延长，血清a l t 和a s t 水平 逐渐升高，c h e 水平降低，与正常对照组比较p 0 0 5 或p 0 0 1 。 2 血清血脂指标的变化：随着造模时间的延长，血清t g 、t c 、l d l 、v l d l 的水平逐渐升高，h d l 水平逐渐降低，与正常对照组比较p 0 0 5 或 p 0 0 l 。 3 肝组织病理学改变：光镜下，h e 染色显示对照组肝组织肝细胞索以肝 小叶中央静脉为中心呈放射样排列；随着造模时间的延长，出现肝细胞肿 胀，肝小叶内可见肝细胞小泡性脂肪变性、凋亡小体和坏死灶；模型1 6 周组大鼠肝细胞弥漫性小泡性脂肪变性，窦周纤维化，汇管区纤维组织增 生并有纤维间隔形成，可见多量凋亡小体和坏死灶。冰冻切片苏丹染色 显示正常对照组大鼠肝组织无脂肪变性，随着造模时间延长，肝细胞内有 红色脂滴分布，并逐渐增多，至1 6 周大鼠肝细胞内出现大量红色脂滴。 p a s 染色显示对照组大鼠肝细胞胞浆中出现大量紫红色颗粒，模型1 6 周 仅见少量紫红色颗粒分布。天狼红染色显示模型4 周组大鼠肝组织无明显 纤维组织增生，随着造模时间延长，纤维间隔逐渐形成，模型1 6 周组大 鼠肝组织出现明显纤维间隔。 4 血清总同型半胱氨酸( t h c y ) 浓度的变化：随着造模时间的延长，血清 5 肝组织c b s 活性的变化：随着造模时间的延长，肝组织匀浆c b s 的活 性逐渐下降，与正常对照组比较p 0 0 5 或p 0 0 1 。 6 免疫组化法检测大鼠肝组织g r p - 7 8 、c a l p a i n2 、p r o c a s p a s e 1 2 蛋白的 表达：光镜下，正常组大鼠肝脏内表达较少的g r p - 7 8 、c a l p a i n2 蛋白， 随着造模时间的延长g r p - 7 8 、c a l p a i n2 蛋白阳性表达逐渐增加，主要表 达于肝细胞胞浆内，光镜下对照组大鼠肝组织有较多p r o c a s p a s e 1 2 的表 达，主要表达于肝细胞胞浆内，随着造模时间的延长阳性表达逐渐减弱。 与正常对照组比较p 0 0 1 。 7r t - p c r 法检测g r p 一7 8 、c a l p a i n2 、e a s p a s e 1 2m r n a 的表达量：正常 组大鼠肝组织中表达g r p 7 8 、c a l p a i n 、c a s p a s e 1 2 m r n a 较少，随着造模 时间的延长，g r p 7 8 、c a l p a i n 、c a s p a s e 1 2 m r n a 表达量逐渐增加，与正 常对照组比较p 0 0 1 。 8t u n e l 染色法检测肝细胞凋亡指数：，在正常对照组仅有极少量肝细胞 凋亡，随着造模时间的延长，肝细胞凋亡指数呈上升趋势，与对照组相比， p 0 0 1 。 9 肝组织中c b s 的表达量与血清t h c y 水平呈负相关，相关系数为0 6 3 2 ， p 0 0 l 。 1 0 血清t h c y 水平与肝组织中g r p 7 8 的相对表达量呈正相关，相关系数 为0 6 1 7 ，p 0 0 1 。 1 1 肝细胞凋亡指数与c a l p a i n2 和c a s p a s e 1 2 m r n a 表达呈正相关，相关 系数分别为0 9 5 9 和o 8 8 7 , p 值均小于o 0 1 。 结论： 1 应用逐渐增加酒精浓度和剂量灌胃的方法可以成功制备大鼠a l d 模 型，该模型肝脏病变如脂肪变性、炎症反应和纤维化等可以反映临床a l d 的基本病变。 2 在大鼠a l d 模型中，c b s 的活性降低，导致h h c y ，从而进一步诱发 e r s ，激活c a l p a i n2 、c a s p a s e 1 2 ，最终导致肝细胞凋亡，可能为a l d 发 病的重要机制之一。 中文摘要 关键词：大鼠；酒精性肝病；内质网应激；细胞凋亡；葡萄糖调节蛋 白7 8 ；需钙蛋白酶2 英文摘要 c o n t r i b u t i o no fe n d o p l a s m i cr e t i c u l u ms t r e s st oh e p a t o c y t e a l c o h o l i cl i v e rd i s e a s e a p o p t o s i si na l c o l l o l i ci i v e ri s e a s e a b s t r a c t o b j e c t i v e ：a l c o h o l i cl i v e rd i s e a s e ( a l d ) i sat o x i cl i v e rd i s e a s ec a u s e d b ya l c o h o la b u s e h i s t o p a t h o l o g i c a lf e a t u r e so fa l d i n c l u d em i l da l c o h o l i c i n j u r y ，a l c o h o l i cf a t t yl i v e r , a l c o h o l i ch e p a t i t i s ，a l c o h o l i ch e p a t i cf i b r o s i sa n d c i r r h o s i s t h ep a t h o g e n e s i so fa l dw h i c hr e m a i n so b s c u r ea sy e ti sv e r y c o m p l i c a t e d e n d o p l a s m i cr e t i c u l u m ( e r ) s t r e s s c a ni n d u c e h e p a t o c y t e a p o p t o s i sw h i c hm a yp l a ya ni m p o r t a n tr o l ei nt h ep a t h o g e n e s i so f a l d e rs t r e s si sas u b c e l l u l a rp a t h o l o g i c a ls t a t ec h a r a c t e r i z e db yp h y s i - o l o g i c a ld y s f u n c t i o no fe n d o p l a s m i cr e t i c u l u mi n c l u d ec a l c i u mh o m e o s t a s i s d i s r u p t i o n ，t h e a c c u m u l a t i o no fu n f o l d e do rm i s f o l d e dp r o t e i n s i nt h e e n d o p l a s m i cr e t i c u l u m1 u m e nf r o ma l lc a u s e s ，i ti san e c e s s a r ys t e pw h i c hc a n r e c o v e rt h ec o r r e c tc o n f o r m a t i o no fp r o t e i nf o rf u r t h e rp r o c e s s i n g e rs t r e s si s as e l f - p r o t e c t i n gm e c h a n i s mo ft h eb o d y , b u ti ft h er e s p o n s ei st o ol o n go rt o o s t r o n g ，t o os e r i o u si n ju r e dh e p a t o c y t em a y l e a dt oa p o p t o s i s p r e v i o u ss t d u i e sh a v es h o w nt h a t e rs t r e s sc a nb ei n d u c e db y h y p e r h o m o c y s t e i n e m i a ( h h c y ) i na l d ，a n dt h er o l eo fh h c ym a y b em o r e i m p o r t a n t c y s t a t h i o n i n e b e t as y n t h a s e ( c b s ) ，t h ep y r i d o x a l p h o s p h a t e - d e p e n d e n te n z y m e s ，m a i n l ys y n t h e s i z e di nt h el i v e r i ti st h ek e y e n z y m ei nt h e m e t a b o l i cp r o c e s so fh o m o c y s t e i n e ( h c y ) t h ed e c r e a s eo fa c t i v i t yo fc b s m a y b et h ei m p o r t a n tr e a s o no fh h c y g l u c o s e r e g u l a t e dp r o t e i n 一7 8 ( g r p 7 8 ) i st h el a r g e s tc h a p e r o n i ni nt h ee n d o p l a s m i ca n di sas i g nm o l e c u l e so f e n d o p l a s m i cr e t i c u l u ms t r e s sr e s p o n s e g r p 7 8i ss t r o n g l ye x p r e s s e d u n d e re r s t r e s st or e c o v e rt h ec o r r e c tc o n f o r m a t i o no fp r o t e i nb yc o m b i n i n gw i t h u n f o l d e dp r o t e i n t h ep a t h w a yo fe rs t r e s s - m e d i a t e dh e p a t i ca p o p t o s i s i n c l u d e sas e r i e so fe n z y m a t i cr e a c t i o n sa n ds i g n a lt r a n s d u c t i o n s ，i nw h i c h c a l p a i n2a n dc a s p a s e 一12 ，t h ec y s t e i n ep r o t e i n a s e si nh e p a t o c y t e s ，p l a ya n i m p o r t a n tr o l e 英文摘要 m e t h o d s ：5 0m a l ew i s t a rr a t s ，w e i g h t i n g2 0 0 - x 2 0 9 ，w e r ea c c l i m a t i z e df o r 7d a y sa n dt h e n10r a t sw e r er a n d o m l ya s s i g n e dt ot h en o r m a lc o n t r o lg r o u p o t h e r sw e r et oe s t a b l i s ht h er a t sm o d e lo fa l d b yi n t r a g a s t r i ca l c o h o lo f i n c r e a s i n gc o n c e n t r a t i o ng r a d u a l l y ( 3 0 一6 0 ，5 - 9 9 k g 一1 d 一1 ) ，9 ，9 ，8a n d8 r a t sw e r es a c r i f i c e dr a n d o m l ya f t e r12h o u r sf a s t i n ga tt h ee n do f4 t h ，8 t h ， 12 t ha n d16 t hw e e k ，a n dt h es e r u ma n dl i v e r s a m p l e sw e r ec o l l e c t e d r e s p e c t i v e l y t h es e r u ml e v e l so fa l t , a s t , c h e ，t gt c ，l d l ，v l d l ，h d l ， t h e yw e r ee x a m i n e db yc h e m i c a lm e t h o d sa n dt h ea c t i v i t yo fc b si nl i v e r t i s s u ew a sm e a s u r e db yc h r o m a t o m e t r y s o m eo ft h eh e p a t i ct i s s u ew e r em a d e o ff r o z e ns e c t i o n sa n ds t a i n e db ys u d a ni vt oo b s e r v et h el i v e rs t e a t o s i s s o m e p a r to fh e p a t i ct i s s u e w e r em a d eo fp a r a f f i ns e c t i o n sa n ds t a i n e d b y h e m a t o x y l i n e o s i n ( h e ) ，s i r i u sr e da n dp e r i o d i ca c i ds c h i f fr e a c t i o n ( p a s ) t oo b s e r v et h eo r d i n a r yp a t h o l o g i cc h a n g e s ，l i v e rf i b r o s i sa n dg l y c o g e ni nt h e c y t o p l a s mo fh e p a t o c y t e s t h em r n ae x p r e s s i o n so fg r p 一7 8 ，c a l p a i n2 ，a n d c a s p a s e - - 12w e r ea n a l y z e db yr e v e r s et r a n s c r i p t i o n - - p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ( r t - p c r ) g r p - 7 8 ，c a l p a i n2p r o t e i ne x p r e s s i o n sa n dt h ep r e c u r s o rp r o t e i n e x p r e s s i o n so fc a s p a s e - 12 ( p r o c a s p a s e 12 ) w e r ea s s e s s e db yi m m u n o h i s t o - c h e m i s t r y h e p a t o c y t ea p o p t o s i sw a s d e t e r m i n e db yt d t - m e d i a t e dd u t pn i c k e n dl a b e l i n g ( t u n e l ) a s s a y r e s u l t ： 1t h ec h a n g eo fb i o c h e m i c a li n d e xo fs e r u m ：a st h ed u r a t i o no fe t h a n o l a d m i n i s t r a t i o ne x t e n d e d ，t h el e v e lo fa l t a s ti nt h es e r u mi n c r e a s e dw h i l e t h ec h ed e c r e a s e dg r a d u a l l y c o m p a r e dw i t ht h o s eo ft h en o r m a lc o n t r o l g r o u pp o 0 5a n d p 0 01 2t h ec h a n g eo fb i o c h e m i c a li n d e xo fs e r u m ：a st h ed u r a t i o no fe t h a n o l a d m i n i s t r a t i o ne x t e n d e d ，t h e1 e v e lo ft gt c ，l d l ，v l d li nt h es e r u m i n c r e a s e dw h i l et h eh d ld e c r e a s e dg r a d u a l l y , c o m p a r e dw i t ht h o s eo ft h e n o r m a lc o n t r o lg r o u pp 0 0 5a n dp o o1 3h i s t o p a t h o l o g i c a lc h a n g e so fh e p a t i ct i s s u e ：i nt h en o r m a lc o n t r o lg r o u p ， h e p a t i c c o r d sr a d i a t eo u tf r o mc e n t r a lv e i n so fh e p m i cl o b u l e s a st h ed u r a t i o n o fe t h a n o la d m i n i s t r a t i o n e x t e n d e d ，t h eh e p a t o c y t es w e l l i n g ，s t e a t o s i s ， 6 英文摘要 a p o p t o s i sa n dn e c r o s i si nl i v e rl o b u l e sc a nb ef o u n d a tt h el6 mw e e k ，d i f f u s e m i c r o v e s i c u l a ra d i p o s ed e g e n e r a t i o n ，f i b r o s i si nl i v e rs i n u sa n df i b r o s i ss e p t a i nt h ep o r t a la r e aw e r eo b s e r v e di nh e p a t i ct i s s u e ，w h i l et h ea p o p t o t i cb o d y a n dn e c r o t i cf o c u sw e r ei n c r e a s e d t h ef r o z e ns e c t i o n ss t a i n e db ys u d a ni v s h o w e dt h a tn o n s t e a t o s i sw a so b s e r v e di nt h eh e p a t i ct i s s u eo ft h en o r m a l c o n t r o lg r o u p w i t ht h ep r o c e s so fa l d ，t h eq u a n t i t yo fl i p i dd r o p l e t s i n c r e a s e dg r a d u a l l y , a n da tt h e16 mw e e k ，al a r g eq u a n t i t yo fl i p i dd r o p l e t s d i s t r i b u t e di nh e p a t o c y t e s t h ep a r a 伍ns e c t i o n ss t a i n e db yp a ss h o w e dt h a ta n u m b e ro fp u r p l eg u a n u l e si nc y t o p l a s m 、i t ht h ep r o c e s so fa l d ，t h e q u a n t i t yo fp u r p l eg u a n u l e sd e c r e a s e dg r a d u a l l y 功ep a r a f f i ns e c t i o n ss t a i n e d b ys i r i u sr e ds h o w e dt h a ta tt h e4 mw e e k ，t h ef i b r o s i so ft h eh e p a t i ct i s s u e s w e r en o to b v i o u s a st h ed u r a t i o no fe t h a n o la d m i n i s t r a t i o ne x t e n d e d ，f i b r o s i s s e p t aa p p e a r e dg r a d u a l l yi nh e p a t i ct i s s u e a tt h e16 t hw e e k s o fm o d e lg r o u p ， t h ef i b r o s i ss e p t aw e r eo b v i o u s 4t h ec h a n g eo ft h c yi nt h es e r u m ：a st h ed u r a t i o no fe t h a n o la d m i n i s t r a t i o n e x t e n d e d ，t h es e r u ml e v e lo ft h c yi n c r e a s e dg r a d u a l l y ，c o m p a r e dw i t ht h o s e o ft h en o r m a lc o n t r o lg r o u pp 0 01 5t h ea c t i v i t yo fc b si nt h el i v e r ：a st h ed u r a t i o no fe t h a n o la d m i n i s t r a t i o n e x t e n d e d ，t h ea c t i v i t yo fc b sd e c r e a s e dg r a d u a l l y , c o m p a r e dw i t ht h en o r m a l c o n t r o lg r o u pp 0 0 5a n dp 0 01 6t h ee x p r e s s i o n so fg r p - 7 8 ，c a l p a i n2a n dp r o c a s p a s e - 12i nt h el i v e rb y i m m u n o h i s t o c h e m i s t r ys t a i n i n g ：t h e r e w e r eo n l yal i t t l e e x p r e s s i o n s o f g r p - 7 8a n dc a l p a i n2i nh e p a t i ct i s s u eo fr a t si nn o r m a lc o n t r o lg r o u p w h i c h w e r ei n c r e a s e dg r a d u a l l yw i t ht h ep r o g r e s so fa l d ，a n dt h em a i ne x p r e s s i o n l o c a t e di nc y t o p l a s m a b u n d a n te x p r e s s i o no fp r o c a s p a s e - 12c a nb eo b s e r v e d i nn o r m a lc o n t r o lg r o u p w i t ht h ec o n s u m p t i o no fe t h a n o li n c r e a s e ，t h e e x p r e s s i o no fp r o c a s p a s e - 12d e c r e a s e dg r a d u a l l y ，a n dt h em a i ne x p r e s s i o n l o c a t e di nc y t o p l a s m c o m p a r e dw i t ht h en o r m a lc o n t r o lg r o u pp 0 01 7t h em r n a e x p r e s s i o n so fg r p 一7 8 ，c a l p a i n2a n dc a s p a s e 一1 2i nt h el i v e rb y r t - p c r ：t h e r ew e r eo n l yal i t t l em r n ae x p r e s s i o n so fg r p - 7 8 ，c a l p a i n2 a n dc a s p a s e 12i nh e p a t i ct i s s u e i nn o r m a lc o n t r o lg r o u p ，w h i c hw e r e 7 英文摘要 i n c r e a s e dg r a d u a l l yw i t ht h ep r o g r e s so fa l d ，a n dc o m p a r e dw i t ht h en o r m a l c o n t r o lg r o u pp o o1 8t h ec h a n g eo f h e p a t o c y t ea p o p t o s i sb yt u n e l ：t h e r ew e r ef e wa p o p t o t i c c e l l si nh e p a t i ct i s s u eo fr a t si nn o r m a lc o n t r o lg r o u p ，w i t ht h ec o n s u m p t i o no f e t h a n o li n c r e a s e ，t h eh e p a t o c y t ea p o p t o s i si n d e x ( a i ) e x h i b i t e da ni n c r e a s i n g t r e n d ，c o m p a r e dw i t ht h en o r m a lc o n t r o lg r o u p ( p 0 01 ) 9t h er e l a t i v ec b s e x p r e s s i o no ft h eh e p a t i ct i s s u ew a sn e g a t i v e l yc o r r e l a t e d w i t ht h es e r u ml e v e lo ft h c y ( r = 一0 6 3 2 ，氏o 0 1 ) 10t h er e l a t i v et h e ye x p r e s s i o no ft h eh e p a t i ct i s s u ew a sp o s i t i v e l yc o r r e l a t e d w i t ht h ee x p r e s s i o no fg r p - 7 8o ft h eh e p a t i ct i s s u e ( f o 617 ，p 0 0 1 ) 1 1t h eh e p a t o c y t ea p o p t o s i si n d e xw a sp o s i t i v e l yc o r r e l a t e dw i t ht h em r n a e x p r e s s i o n so fc a l p a i n2a n dc a s p a s e 一12o ft h eh e p a t i ct i s s u e ( r = o 9 59a n d r = 0 8 8 7 ，尸 o 0 1 ) c o n c l u s i o n ： 1t h em o d e lo fr a t sw i t ha l dc a nb ee s t a b l i s h e ds u c c e s s f u l l yb yi n t r a g a s t r i c a l c o h o lo fi n c r e a s i n gc o n c e n t r a t i o ng r a d u a l l y t h ep a t h o l o g i c a lc h a n g e s ，s u c h a ss t e a t o s i s ，i n f l a m m a t i o na n df i b r o s i s ，c a nr e f e c th u m a na l d 2i no u re x p e r i m e n t a la l d m o d e l ，d e c r e a s e dc b sa c t i v i t yr e s u l t si nh h c yt h a t f u r t h e ri n d u c e se rs t r e s sa n da c t i v a t e sc a l p a i n2a n dc a s p a s e 一12 t h e s e c h a n g e sm a yp r o v o k eh e p a t i ca p o p t o s i sw h i c hm a yp l a ya ni m p o r t a n tr o l ei n t h ep a t h o g e n e s i so fa l d k e yw o r d s ：r a t ；a l c o h o l i cl i v e rd i s e a s e ；e rs t r e s s ；a p o p t o s i s ；g r p - 7 8 ； c a l p a i n2 ；c a s p a s e 一1 2 8 研究论文 内质网应激在大鼠酒精性肝病肝细胞凋亡中的作用 - 屿! 釜 刖瞢 酒精性肝病( a l c o h o l i cl i v e rd i s e a s e ，a l d ) 是因长期过量饮酒引起的 中毒性肝脏疾病，其发病机制复杂，目前尚不完全清楚。内质网应激 ( e h d o p l a s m i cr e t i c u l u ms t r e s s ，e r s ) 及其介导的肝细胞凋亡可能在其发病 过程中发挥重要作用。在a l d 中，e r s 的诱导可能与高同型半胱氨酸血症 ( h y p e r h o m o c y s t e i n e m i a ，h h c y ) 有关，而h h c y 贝j j 可能是由于其代谢过 程中的限速酶胱硫醚届合成酶( c y s t a t h i o n i n eb e t a s y n t h a s e ，c b s ) 的活 性降低导致心。 葡萄糖调节蛋e t 7 8 ( g l u c o s e r e g u l a t e dp r o t e i n7 8 ，g r p 7 8 ) 是内质网内 驻留最多的分子伴侣，是e r s 的标志性分子。e r s 可促进细胞存活，但反 应过强或时间过长，则会启动细胞凋亡程序b 。5 1 。需钙蛋白酶2 ( c a l p a i n2 ) 、 c a s p a s e 12 的激活，是此过程发生的关键环节。 本研究拟用酒精灌胃的方法建立大鼠酒精性肝病模型，分别检测总同 型半胱氨酸( t h c y ) 浓度、c b s 的活性、g r p 7 8 、c a l p a i n2 、c a s p a s e 1 2 的表达和肝细胞凋亡，以探讨e r s 及其介导的肝细胞凋亡在大鼠酒精性肝 病中发挥的作用。 材料与方法 1 材料 1 1a l d 大鼠动物模型的建立：健康雄性清洁级w i s t a r 大鼠5 0 只，体重 2 0 0 - a ：2 0 9 ，由河北医科大学动物实验中心提供。大鼠正常喂养1 周后，随 机分出1 0 只为正常对照组，其余动物每日上午9 时酒精灌胃( 3 0 6 0 ， 5 9 9 k g i d 。) ，持续1 6 周，常规分笼饲养于温度2 2 + 2 ，湿度7 0 士5 清洁级动物实验室内，分别于4 周、8 周、1 2 周和1 6 周末禁食1 2 h 后随 机处死动物9 只、9 只、8 只和8 只( 大鼠在造模过程中死亡6 只) ，留取 血清及肝组织标本，用于血清、肝组织病理和分子生物学指标检测。 1 2 标本的制备：实验动物禁食1 2 h 后，股静脉放血取血，4 c 离心分离 研究论文 血清，2 0 冰箱保存，用于血清生化指标如丙氨酸氨基转移酶( a l a n i n e a m i n o t r a n s f e r a s e ，a l t ) ，天冬氨酸氨基转移酶( a s p a r t a t ea m i n o t r a n s f e r a s e ， a s t ) ，乙酰胆碱酯酶( c h o l i n e s t e r a s e ，c h e ) 的测定，以及血清甘油三酯 ( t r i g l y c e r i d e ，t g ) 、胆固醇( c h o l e s t e r i n ，t c ) 、低密度脂蛋白( 1 0 wd e n s i t y l i p o p r o t e i n ，l d l ) 、高密度脂蛋白( h i g hd e n s i t yl i p o p r o t e i n ，h d l ) 、总同型 半胱氨酸( t o t a lh o m o c y s t e i n e ，t h c y ) 的测定。迅速取出肝脏称重，部分做快 速冰冻切片行苏丹染色，观察肝细胞脂肪变性的程度；取部分左叶以 4 中性福尔马林固定，石蜡包埋、切片，用于苏木精伊红 ( h e m a t o x y l i n e o s i n ，h e ) 染色、过碘酸希夫( p e r i o d i ca c i ds c h i f f , p a s ) 染色、天狼红染色以及g r p 7 8 、c a l p a i n2 、p r o c a s p a