（免疫学专业论文）细胞色素c在缺血预适应中的释放及作用机制的研究.pdf

南开大学学位论文使用授权书 根据南开大学关于研究生学位论文收藏和利用管理办法，我校的博士、硕士学位获 得者均须向南开大学提交本人的学位论文纸质本及相应电子版。 本人完全了解南开大学有关研究生学位论文收藏和利用的管理规定。南开大学拥有在 著作权法规定范围内的学位论文使用权，即：( 1 ) 学位获得者必须按规定提交学位论文( 包 括纸质印刷本及电子版) ，学校可以采用影印、缩印或其他复制手段保存研究生学位论文， 并编入南开大学博硕士学位论文全文数据库；( 2 ) 为教学和科研目的，学校可以将公开 的学位论文作为资料在图书馆等场所提供校内师生阅读，在校园网上提供论文目录检索、文 摘以及论文全文浏览、下载等免费信息服务；( 3 ) 根据教育部有关规定，南开大学向教育部 指定单位提交公开的学位论文；( 4 ) 学位论文作者授权学校向中国科技信息研究所和中国学 术期刊( 光盘) 电子出版社提交规定范围的学位论文及其电子版并收入相应学位论文数据库， 通过其相关网站对外进行信息服务。同时本人保留在其他媒体发表论文的权利。 非公开学位论文，保密期限内不向外提交和提供服务，解密后提交和服务同公开论文。 论文电子版提交至校图书馆网站：h t t p ：2 0 2 1 1 3 2 0 。1 6 l ：8 0 0 1 i n d e x h t m 。 本人承诺：本人的学位论文是在南开大学学习期间创作完成的作品，并已通过论文答辩： 提交的学位论文电子版与纸质本论文的内容一致，如因不同造成不良后果由本人自负。 本人同意遵守上述规定。本授权书签署一式两份，由研究生院和图书馆留存。 作者暨授权人签字：奎4 1 赁 2 0 1 0 年6 月8 日 南开大学研究生学位论文作者信息 论文题目细胞色素c 在缺血预适应中的释放及作用机制的研究 姓名李小倩 学号 2 1 2 0 0 7 0 8 9 3答辩日期2 0 1 0 年5 月3 1 日 论文类别博士口学历硕士口 硕士专业学位口高校教师口同等学力硕士口 院系所医学院专业免疫学 联系电话 1 3 9 0 2 1 2 9 4 3 3 e m a i l c o l a s k y 8 0 71 y a h o o c o r n c n 通信地址( 邮编) ：天津市南开大学医学院2 1 2 室邮编：3 0 0 0 7 1 备注：是否批准为非公开论文否 注：本授权书适用我校授予的所有博士、硕士的学位论文。由作者填写( 一式两份) 签宇后交校图书 馆，非公开学位论文须附南开大学研究生申请非公开学位论文审批表。 南开大学学位论文使用授权书 根据南开火学芙丁研究生学位论文收藏和利用管理办法，我校的博十、硕士学位获 得者均须向南开人学提交本人的学位论文纸质本及相席电子版。 本人完全了解南开人学有关研究生学位论文收藏利利圳的管理规定。南开人学拥有在 著作权法规定范嗣内的学侥论文使h j 权，即：( 1 ) 学位获得者必须按规定提交学位论文( 包 括纸质印刷本及电子版) ，学校可以采川影印、缩印或其他复制手段保存研究生学位论文， 并编入南开人学博硕十学位论文全文数据库；( 2 ) 为教学和科研目的，学校可以将公开 的学位论文作为资料在图1 0 馆等场所提供校内师生阅读，在校园网上提供论文目录检索、文 摘以及论文全文浏览、卜载等免费信息服务；( 3 ) 根据教育部有关规定，南开人学向教育部 指定单位提交公开的学位论文；( 4 ) 学位论文作者授权学校向中国科技信息研究所和中国学 术期刊( 光盘) 电子山版社提交规定范同的学位论文及其电子版并收入相应学位论文数据库， 通过其相关网站对外进行信息服务。同时本人保留在其他媒体发表论文的权利。 啦公开学位论文，保密期限内不向外提交和提供服务，解密厉提交雨j 服务同公开论文。 论文电子版提交至校图j i5 馆网站：h t t p ：2 0 2 1 1 3 2 0 1 6 1 ：8 0 0 1 i n d e x h t m 。 本人承诺：本人的学位论文是在南开人学学习期间创作完成的作品，并已通过论文答辩； 提交的学何论文电子版与纸质本论文的内容一致，如冈不同造成不良后果由本人白负。 本人同意遵守上述规定。本授权+ 1 5 签署一式两份，由研究生院和图书馆留存。 作者鲰权人擀壅! 嗑 2 0 1 0年6 月3日 南开大学研究生学位论文作者信息 论文题目细胞色素c 在缺血预适应中的释放及作用机制的研究 姓名李小倩学号 2 1 2 0 0 7 0 8 9 3答辩日期2 0 1 0 年5 月3 1 日 论文类别博十口学，刃硕十一硕十专业学位口高校教师口同等学力硕+ 口 院系所 医学院 专业免疫学 联系电话1 3 9 0 2 1 2 9 4 3 3。e m a i l c o l a s k y 8 0 71 y a h o o c o r n c a 通信地址( i | i b 编) ：天津i 订南开人学医学院2 1 2 室邮编：3 0 0 0 7 1 备注：无是否批准为非公开论文否 注：本授权书适用我校授予的所有博士、硕士的学位论文。由作者填写( 一式两份) 签字后交校图书 馆，非公开学位论文须附南开大学研究生申请非公开学位论文审批表。 南开大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下进行研究工作所 取得的研究成果。除文中已经注明引用的内容外，本学位论文的研究成果不包 含任何他人创作的、已公开发表或者没有公开发表的作品的内容。对本论文所 涉及的研究工作做出贡献的其他个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本 学位论文原创性声明的法律责任由本人承担。 学位论文作者签名： 奎型! 值2 0 1 0 年6 月8 日 非公开学位论文标注说明 根据南开大学有关规定，非公开学位论文须经指导教师同意、作者本人申 请和相关部门批准方能标注。未经批准的均为公开学位论文，公开学位论文本 说明为空白。 论文题目 申请密级 口限制( 2 年)口秘密( 1 0 年)口机密( 2 0 年) 保密期限 2 0 年月日至2 0年月日 审批表编号批准日期 2 0 年月日 限制2 年( 最长2 年，可少于2 年) 秘密1 0 年( 最长5 年，可少于5 年) 机密2 0 年( 最长l o 年，可少于1 0 年) 线粒体产生的小剂量活性氧自由基( r e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s ，r o s ) 是这种 缺血预适应保护的关键因素，然而有关r o s 的作用机制尚不清楚。我们假设， 这种小剂量的r o s 能够抑制m p t p 开放，减少线粒体损害，从而减轻再灌注损伤。 方法与结果：主体实验采用急性分离大鼠肝细胞线粒体、大鼠心肌细胞系 h 9 c 2 及急性分离培养的成年大鼠心室肌细胞( a d u l tr a tv e n t r i c l em y o c y t e ， a r ) 。以高钙刺激细胞色素c ( c y t o c h r o m ec ，c y t - c ) 释放量衡量m p t p 开放。 结果显示，c a 2 + 能够稳定地诱导m p t p 开放，流式细胞技术发现c a 2 + 诱导m p t p 开 放伴随线粒体膜电位、肿胀度改变，小剂量( 2 0l am ) h 。0 2 预处理抑制c a 2 + 诱导 的m p t p 开放，但不能逆转此过程中线粒体膜电位、r o s 产生及肿胀度变化。小 剂量h 。0 2 预处理增加线粒体内膜心磷脂( c a r d i o l i p i n ) 和c y t - c 的亲和力。细 胞实验显示，小剂量h 。0 2 ( 2 0nm ) 能够明显减轻h 9 c 2 缺氧复氧损伤，这一结 果也能在a r 上得到重复。 结论：小剂量h 。0 。预处理通过增加c y t - c 与心磷脂的亲和力抑制m p t p 开放， 减少c y tc 释放，从而减轻再灌注( 复氧) 损伤。 关键词：再灌注损伤缺血预适应通透转换孔细胞色素c 活性氧自由基 a b s t r a c t a b s t r a c t r e p e r f u s i o ni n j u r yi st h em a i nm e c h a n i s mf o rp a t h o l o g i c a ld a m a g eo fm a n y d i s e a s e ss u c ha sa c u t em y o c a r d i a li n f a r c t i o na n di s c h e m i cs t r o k e ，i nf e wm i n u t e s a f t e ri s c h e m i aa n dr e p e r f u s i o r t , al a r g en u m b e ro fm i t o c h o n d r i a lp e r m e a b i l i t y t r a n s i t i o np o r e s ( m p t p ) a r ef o r m a t e do nm i t o c h o n d r i a li n n e rm e m b r a n ew h i c hi c a d t os w e l lo fm h o c h o n d f i a lm a t r i x ，m i t o c h o n d r i a ld i s i n t e g r a t e ，t h e nt h ec e l ld e a t h c l i n i c a la n de x p e r i m e n t a ls t u d i e ss u g g e s tt h a tr e p e a t e db r i e fe p i s o d e so fi s c h e m i a c a nr e d u c er e p e r f u s i o ni n j u r y , t h e r ei se v i d e n c et h a tab r i e fp e r i o do fi s c h e m i aa n d h y p o x i a , m i t o c h o n d r i ag e n e r a t es m a l ld o s e so fr e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s ( r o s ) w h i c h i st h ek e yf a c t o r so fp r o t e c t i o nf r o mi s c h e m i cp r e c o n d i t i o n i n g ，b u t ，t h em e c h a n i s m o ft h er o si sn o tc l e a r w ea s s u n l et h a ts u c hs m a l l d o s e so fr o sc a ni n h i b i tm p t p o p e n i n g ，r e d u c i n gm i t o c h o n d r i a ld a m a g e ，t h e r e b yr e d u c i n gr e p e r f u s i o ni n j u r y m e t h o d sa n dr e s u l t s ：t h em a i n e x p e r i m e n tu s i n g i s o l a t e dr a tl i v e r m i t o c h o n d r i a , r a tc a r d i a cc e l ll i n eh 9 c 2a n da c u t ei s o l a t e da n dc u l t u r e da d u l tr a t v e n t r i c u l a rm y o c y t e s ( a r v m ) u s i n gh i g hc a ? t os t i m u l a t ec y t o c h r o m ec ( c y t - c ) r e l e a s em e a s u r e di n p t po p e n i n g t h er e s u l t ss h o w e dt h a t ，c 铲+ c a nb ei n d u c e d 加p t po p e n i n gr e l i a b l y f l o wc y t o m e t r yf o u n dt h a tc 一+ i n d u c e d 埘【p t po p e n i n g a s s o c i a t e d 、析t l lc h a n g eo fm i t o c h o n d r i a lm e m b r a n ep o t e n t i a l a n ds w e l l i n g d o s e ( 2 0 p m ) h 2 0 2p r e t r e a t m e n ti n h i b i t st h ec 扩一i n d u c e dm p t po p e n i n g ，b u tn o tr e v e r s et h e c h a n g e so fm i t o c h o n d r i a lm e m b r a n ep o t e n t i a l ，r o sg e n e r a t i o na n ds w e l l i n g l o w d o s eo fh 2 0 2p r e t r e a t e di n c r e a s e dm i t o c h o n d r i a lc a r d i o l i p i na n dc y t ca f f i n i t y c e l le x p e r i m e n t ss h o wt h a ts m a l ld o s eo fh 2 0 2 ( 2 0 p m ) c a l ls i g n i f i c a n t l yr e d u c et h e i n j u r yo fh 9 c 2r e o x y g e n a t i o n , t h er e s u l t sc a nb er e p e a t e do nt h ea r v m c o n c l u s i o n ：l o wd o s e so fh 2 0 2p r e c o n d i t i o n i n gi n h i b i tt h em p t po p e n i n gb y i n c r e a s i n g t h ea m n i t yc y t - ca n dc a r d i o l i p i n ，r e d u c i n gc y t - c r e l e a s e ，t h e r e b y r e d u c i n gr e p e r f u s i o n ( r e o x y g e n a t i o n ) i n j u r y k e yw o r d s ：r e p e r f u s i o ni n j u r yi s c h e m i cp r e c o n d i t i o n i n g m i t o c h o n d r i a l p e r m e a b i l i t yt r a n s i t i o np o r e sc y t o c h r o m ec r e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s i i 英汉缩略词对照表 缩略词 i p c i r c y t - c r o s m p t p k a t p m k a t p s a l e ka t p a n t v d a c s m a c a v r m m k c a p k c a r g p i d a p i r i p a t m f 己m c y s 英汉缩略名词对照表 英文名称 i s c h e m i cp r e c o n d i t i o n i n g i s c h e m i ar e p e r f u s i o ni n j u r y c v t o c h r o m ec r e a c t i v eo x y g e ns p e c t e s m i t o c h o n d r i a l p e r m e a b i l i t y t r a n s i t i o np o r e a t p s e n s i t i v ek 十c h a n n e l m i t o c h o n d r i a la t p s e n s i t i v ec c h a n n e l s a l c o l e m m ak q s e n s i t i v e c h a n n e l a d e n i n en u c l e o t i d et r a n s l o c a s e v o l t a g ed e p e n d e n ta n i o nc h a n n e l s e c o n dm i t o c h o n d r i a - d e f i v e d a c t i v a t o ro fc a s p a s e a d u l tr a tv e n t r i c l em y o c y t e m i t o c h o n d r i a lc a 2 + - a c t i v a t e dc c h a n n e l s p r o t e i nk i n a s ec a l g l n m e p r o p i d i u mi o d i d e 4 ，6 d i a m i d i n o 一2 一p h e n y l i n d o l e ， d i h y d r o c h l o r i d e r a d i oi m m u n o p r e c i p i t a t i o n a s s a y t e t r a m e t h y l r h o d a m i n em e t h y le s t e r p e r c h l o r a t e c y s t e i n e 中文名称 缺血预适应 缺血再灌注 细胞色素c 活性氧自由基 线粒体通透性转换孔 a t p 敏感型钾通道 线粒体a t p 敏感型钾通 j 厶 埴 肌纤维膜a t p 敏感型钾 通道 腺嘌呤核苷酸转移酶 电压依赖的阴离子通道 第二个线粒体来源的胱 氨酸酶激活剂 成年大鼠心室肌细胞 线粒体钙激活钾通道 蛋白激酶c 精氨酸 典化丙锭 4 ，6 一联脒- 2 - 苯基吲哚 二盐酸盐 全细胞提取液 四甲基若丹明甲酯酸铵 半胱氨酸 目录 目录 第一章引言1 第一节背景1 第二节相关研究现状1 1 2 i 线粒体与心肌保护2 1 2 2 线粒体通透性转换孔3 1 2 3 钙激活的钾通道4 i 2 4 蛋白激酶c ( p r o t e i nk i n a s ec ，p k c ) 6 1 2 5 线粒体a t p 敏感钾通道( m i t o c h o n d r i a la t p s e n s i t i v ek + c h a n n e l ，m i 【a t p ) 7 1 2 6 心磷脂( c a r d i o l i p i n ) 8 第二章实验材料和方法1 0 第一节主要实验材料，试剂与仪器1 0 2 1 1 主要实验材料1 0 2 1 2 主要试剂l o 2 1 3 主要仪器1 1 第二节实验方法1 2 2 2 1 所需各种溶液的配制1 2 2 2 2h 9 c 2 的培养1 5 2 2 3 大鼠原代心肌细胞的分离和培养1 6 2 2 4 缺血预适应h 9 c 2 模型1 7 2 。2 5 缺血预适应a r 模型1 8 2 2 6a r v m 中r o s 的检测1 8 2 2 7 大鼠肝脏线粒体的分离1 9 2 2 8 游离线粒体i p c 模型1 9 2 2 9 蛋白检测( s d s 一聚丙烯酰胺凝胶电，s d s p a g e ) 2 0 目录 2 2 1 0 游离线粒体膜点位的检测2 2 2 2 1 1 游离线粒体r o s 的检测2 2 2 2 1 2 结果分析2 2 第三章实验结果2 3 第一节c y t - c ，s m a c 定位于线粒体2 3 第二节c a 2 + 能诱导游离肝脏线粒体m p t p 开放2 4 3 2 1 不同浓度的c a 2 + 刺激游离线粒体c y t - c ，s m a c 释放的检测2 4 3 2 2c a 2 + 诱导m p t p 开放伴随着线粒体膜电位，肿胀度改变2 5 第三节小剂量h ：0 ：预处理抑制c a 2 + 诱导的m p t p 开放2 7 第四节p k c 抑制剂取消h 。0 ：对m p t p 的抑制2 8 第五节c y s 、a r g 的修饰抑制c a 2 + 诱导的m p t p 开放3 0 第六节h ：o ：预处理不能逆转c a 2 + 诱导的线粒体膜电位、r o s 产生及肿胀度变 化3 l 第七节h 。o ：预处理增加心磷脂和c y t - c 的亲和力3 3 第八节h ：0 ：预处理减轻心肌细胞系( h 9 c 2 ) 缺血再灌注损伤3 5 第九节h ：0 。预处理减轻a v r m 缺血再灌注损伤3 7 第四章讨论3 9 第一节在缺血预适应模型中，低剂量h ：0 ：通过降低胞内r o s 的产生保护心 肌细胞3 9 第二节低剂量h ：0 ：对不同浓度c a 2 + 刺激，对线粒体的影响4 0 第三节低剂量h 。0 ：起到ip c 作用的机制4 1 第四节p k c 在lp c 中的作用4 2 第五节a n t 的c y s ，a r g 在m p t p 的开放起了重要作用4 3 第五章结论4 5 参考文献4 6 致谢5 2 v v i 胞坏死。缺血预适应( i s c h e m i ep r e c o n d i t i o n i n g ，i p c ) 是在经历一次或多次短 暂缺血后，对随后较长时间再次缺血能产生耐受的现象。心脏反复短暂缺血后， 可使心肌在随后持续性缺血中得到保护，其效应包括缩小心肌梗死范围、减少 再灌注心律失常和促进心功能恢复等。 第二节相关研究现状 缺血预适应是广泛存在的内源性保护机制缺血预适应( i p c ) 是在经历 一次或多次短暂缺血后，对随后较长时间再次缺血能产生耐受的现象。1 9 8 6 年， m u r r y 掣l j 发现犬在短暂冠脉结扎后，能减少较长时间缺血所引起的心肌损伤， 并首次提出i p c 概念。心脏反复短暂缺血后，可使心肌在随后持续性缺血中得 到保护，其效应包括缩小心肌梗死范围、减少再灌注心律失常和促进心功能恢 复。i p c 不仅存在于心脏，还广泛存在于多种其他器官系统，如脑、肝脏和肾 脏。虽然i p c 现象已达到共识，但其确切机制尚不完全明了，因而一直以来是 缺血再灌注研究领域的一个热点问题。越来越多的研究证实，线粒体损害在介 导缺血再灌注损伤的坏死和凋亡中均起到重要的作用，因而i p c 作为防治缺血 再灌注损伤的最有效方式之一，尽管涉及多种信号通路和效应因子，最终将通 过减轻线粒体损害而发挥保护作用【l 。4 1 ，而其终末效应器目前仍不清楚。 第一章引言 1 2 1 线粒体与心肌保护 线粒体是能源发生器，通过氧化磷酸化产生a t p ，线粒体也是胞内环境和 胞内复杂信息的检测器，包括生长因子的存在与否，氧含量，活性氧含量和d n a 损伤等等，都是线粒体监测的对象。在心肌缺血再灌注损伤，心肌炎，充血性 心衰等许多病理性心脏疾病引起的细胞丢失中线粒体都会被牵连。从线粒体中 释放的因子包括细胞色素c ( c y t o c h r o m ec ，c y t c ) ，第二个线粒体来源的胱氨 酸酶激活剂( s e c o n dm i t o c h o n d r i a - d e f i v e da c t i v a t o ro f c a s p a s c ，s m a c ，凋亡刺 激因子( a p o p t o s i s i n d u c i n gf a c t o r ，a i f ) 等激活复杂的信号途径调节细胞的死 亡程序。另外，线粒体的钙超载可以使线粒体通透性转换孔( m i t o c h o n d r i a l p e r m e a b i l i t yt r a n s i t i o np o r e ，m p t p ) 打开，导致氧化磷酸化作用解偶联，水的内 流引起线粒体的肿胀，使线粒体外膜破裂。 线粒体对于心肌细胞的生存和死亡都起到了重要的作用，在健康的细胞中， 线粒体首要的责任就是通过呼吸链的氧化磷酸化作用提供支持心脏跳动所需要 的能源a t p 。细胞内很大部分空间都被线粒体占据，线粒体位于肌原纤维之间， 肌纤维膜下方，它的有利位置和丰富的数量保证了a t p 的产生，从而使心脏收 缩，新陈代谢，离子的动态平衡正常进行【2 】。 然而，线粒体也是细胞死亡的调节器，多种类的严重的刺激，包括生长因 子的丢失，缺氧，超氧应激，d n a 损伤等等。这些刺激将通过打开线粒体内膜 上的线粒体通透性转换孔m p t p 来来介导细胞死亡程序，m p t p 的打开又使线 粒体膜电位改变，并且导致线粒体肿胀【3 】，这些结果将导致两种结果，一是导 致细胞坏死，二是线粒体外膜( m i t o c h o n d r i a lo u t e rm e m b r a n e ，m o m ) 通透性 发生改变，凋亡前蛋白如c 弦c ，s m a c ，a i f 等的释放，激活能量依赖的细胞凋 亡【4 】。 线粒体a t p 敏感性钾通道( m i t o c h o n d r i a la t p s e n s i t i v ek + c h a n n e l ，m ka t p ) 在缺血预适应介导的心肌保护中切了重要作用，药理性的激活此通道对缺血再 灌注造成的心肌损伤起到保护作用，而抑制此通道则消除了这种保护作用【5 】。 据报道，i n p t p 的打开能降低线粒体内的钙超载 6 1 ，组织m p t p 的开放【7 1 ，增加 电子传递链中r o s 的产生【4 5 】。大剂量的r o s 会诱导细胞死亡，而低水平的r o s 将介导短暂缺血缺氧，从而激发缺血预适应作用【8 】。然而，m k a t p 的缺血预适 应中的具体机制仍在研究当中。 2 第一章引言 1 2 2 线粒体通透性转换孔 正常生理条件下，线粒体内膜是不通透的，只选择性的通透一些代谢物和 离子，这种通透性对维持线粒体膜电位，膜内外p h 梯度是十分重要的，而膜 电位及p h 梯度的维持又对a t p 合成途径氧化磷酸化十分重要。然而，在线粒 体脊内钙超载时，尤其是在氧化应激，高浓度磷酸盐，低浓度的腺嘌呤核苷酸 的情况下，线粒体内膜上一种非特异的孔道打开，这种孔道称为线粒体通透性 转换孔( m i t o c h o n d r i a lp e r m e a b i l i t yt r a n s i t i o np o r e ，m p t p ) 。一旦m p t p 打开， 小于1 5 k d 的所有分子均可以通过此孔，扰乱线粒体内膜的通透屏障。这会导 致两种结果，一是质子自由穿过内膜，导致氧化磷酸化解偶联，阻止了a t p 的 合成，这种情况下，胞内a t p 浓度迅速降低，破坏了离子和代谢物的动态平衡， 二是m p t p 的打开激活了磷酸酯酶，核酸酶和蛋白质酶等降解酶【3 9 ，1 0 。，除非 m p t p 关闭，否则这些改变将会使细胞产生不可逆的损伤导致细胞的死亡。 m p t p 的分子身份仍不清楚，被广泛接受的是线粒体内膜组成物亲环蛋白d ( c y c l o p h i l i nd ，c y p d ) ，肽酰脯氨酰顺反式异构酶，环保霉素a ( e y c l o s p o r i n a ，c s a ) 阻止m p t p 的开放而发现了c y p d 的作用，在敲除了c y p d 的小鼠 肝脏线粒体不再对钙敏感，m p t p 也不再被c s a 抑制。m p t p 的膜成分还不清 楚，被广泛接受的是腺嘌呤核苷酸转移酶( a d e n i n en u c l e o t i d et r a n s l o c a s e ，a n t ) 组成了m p t p 的膜组成成分，m p t p 的开放被腺嘌呤核苷酸所抑制，原因可能 是外源的腺嘌呤核苷酸补充了a n t 的底物，这种抑制又被a n t 的抑制剂胶苍 术甙( c a r b o x y a t r a c t y l o s i d e ，c a t ) 所抑制，c a t 将a n t 固定在“c 型 。相反， a n t 的另一个抑制剂b o n g k r e k i ca c i d 将a n t 阻止在“m ”构型，阻止了孔道 的打开【1 1 1 。虽然许多证据都表明a n t 是m p t p 重要的膜成分，但似乎不是最 重要的成分，一些研究表明，将线粒体上a n t l ，a n t 2 敲除后，m p t p 仍然能 够打开，仍然能被c s a 所抑制【l 引。然而a n t 敲除后需要更多浓度的钙才能打 开m p t p ，也不再对a n t 的两种构型敏感，这都说明a n t 对m p t p 至少起到 了很重要的调节作用。针对这些现象，一种解释是a n t 是m p t p 的膜成分，但 是在敲除a n t 后，线粒体上有其他线粒体转运蛋白补充了a n t 的作用【1 3 1 。 m p t p 的其他分子构成主要是电压依赖的阴离子通道( v o l t a g ed e p e n d e n t a n i o nc h a n n e l ，v d a c ) ，v d a c 与a n t 之间的相互作用可能与内外膜的接触点 相关，另外，最近研究显示v d a c 可能被辅酶q 的类似物所抑制，然而，敲除 3 第一章引言 v d a c i 的肝脏线粒体的m p t p 能够正常打开，这使v d a c 在m p t p 的组成上 变得不能确定。 在钙超载尤其伴有过氧化刺激时，线粒体通透性转换孔打开，导致线粒体 基质增加，外膜破裂，从而使得内外膜之间的蛋白分子，如c y t c 等，释放入 胞浆中，导致细胞凋亡，是被广泛接受的缺血再灌注损伤的主要机制。有研究 认为，i p c 通过抑制m p t p 的开放减轻再灌注损伤，也有研究认为m p t p 在i p c 保护作用中的机制为其瞬时开放，证据为在i p c 时检测到位于线粒体内、外膜 之间的嘌呤等成分释放入胞浆，在i p c 时应用m p t p 抑制剂，则可消除i p c 的 保护作用，表明r n p t p 的瞬时开放在i p c 的作用机制中起关键作用。 线粒体c y t - c 释放是导致细胞凋亡的关键因素。大鼠离体心脏灌注模型研 究发现心肌缺血l o m i n 即出现心肌细胞凋亡，缺血3 0 m i n 达高峰，提示缺血可 引起心肌细胞凋亡。实验和临床研究发现，细胞凋亡是心肌缺血再灌注损伤的 主要形式【1 4 ，1 5 】，因此，细胞色素c ( c y t o c h r o m ec ，c y t c ) 的释放机制及其在缺 血再灌注损伤中的作用是近年来的研究的热点。正常情况下，c y t c 存在于线粒 体内外膜之间膜间隙( i n t e r m e m b r a n es p a c e ，i m s ) 中，与线粒体内膜的心磷脂 结合，不能漏出外膜，在严重缺血缺氧情况下，线粒体外膜破裂，c y t c 从线粒 体释放入胞浆。c y t c 与胞浆中的凋亡蛋白酶激活因子l ( a p o p t o t i cp r o t e a s e a c t i v a t i n gf a c t o r - 1 ，a p a f - 1 ) 和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9 ( c a s p a s e 9 ) 组成凋亡 复合体( a p o p t o t i cc o m p l e x ) ，继而激活c 硒p a s e 9 ，再作用于其下游的半胱氨酸 天冬氨酸蛋白酶3 ( c a s p a s e 3 ) 酶原，活化的c a s p a s e 3 作为效应子，致细胞凋亡 b 6 1 o s m a c 是一种存在于线粒体内外膜之间能调节细胞凋亡的蛋白，称为第二个 线粒体来源的胱氨酸酶激活剂( s e c o n dm i t o c h o n d r i a - d e r i v e da c t i v a t o ro f c a s p 硒e ， s m a c ) ，又被称为低等电点i a p 直接结合蛋白( d i r e c ti n h i b i t o ro f a p o p t o s i s b i n d i n g p r o t e i nw i t hl o wp i ，d i a b l o ) ，由细胞核d n a 编码，凋亡信号刺激，s m a c 从线 粒体释放入胞浆，与胞浆中i a p s 接触，拮抗l a p s 对c a s p a s e 的抑制作用，s m a c 又 可以促进前c a s p a s e 3 水解，增强c a s p a s e 3 的活性，促进细胞凋亡。 1 2 3 钙激活的钾通道 钙激活的钾通道( c a 2 + - s e n s i t i v e ，k + - c h a n n e l s ，k c a ) 广泛分布在平滑肌和神 4 第一章引言 经元细胞膜表面，通过调节动作电位的复极化过程来调节动脉生理活动和神经 元神经递质的释放。根据钙激活钾通道的电导水平，将其分为大三类：小电导 钙激活钾通道，中性电导钙激活钾通道和大电导钙激活钾通道。s i e m a n 等1 1 7 1 首次在胶质细胞线粒体内膜上发现线粒体钙激活的钾通道( m i t o c h o n d r i a lc a 2 + a c t i v a t e dk + c h a n n e l s ，m k c a ) ，它的生理学特性与细胞膜上的大电导钙激活钾通 道类似，可以被电压和c a 2 + 激活。 很多研究证明，它在对细胞的保护方面起了十分重要的作用。大电导钙激 活的钾通道由两种亚基组成，组成孔道的q 亚基，分成q1 型和q2 型，和围绕 着孔道的调节型亚基，1 3 亚基，包括四种亚型，b1 ，1 32 ，1 33 ，1 34 。其中， 组织特异性表达的1 3 亚基对通道的药理学和生理学特性起着关键的作用( t o r t e s e ta 1 2 0 0 7 ) ，它本身不是组成此通道的主要成分，它主要通过增加通道的钙离子 敏感性和电压敏感性来调节通道活性。 通过短暂性缺血来减少接下来的长时间的缺血缺氧对心肌细胞造成的损害 的缺血预适应现象涉及到很多膜受体，如g 蛋白偶联受体超家族，报道过的包 括腺苷酸a 1 和腺苷酸a 3 受体( s o m m e r s c h i l aa n dk i r k e b o e n ，2 0 0 0 ；h e a d r i c ke t a 1 ，2 0 0 3 ；p e a r ta n dh e a d r i c k ，2 0 0 7 ) ，涉及的蛋白包括蛋白激酶c ( h e n r ye ta l ， 1 9 9 6 ) ，胞外信号调节激酶1 2 ( e x t r a c e l l u l a rs i g n a lr e g u l a t e dk i n a s e l 2 ，e r k l 2 ) 和p 3 8m a p k ，这些通路通过开放线粒体内膜a t p 敏感的钾通道，关闭线粒体 通透性转换孔的方式来改善线粒体功能，保护细胞。 x u 等【l8 j 等发现m k c a 通道在心肌细胞的丝状体中存在，并首次揭示了m k c 。 通道的开放与心肌取损伤与保护的关系，自此之后，人们陆续在分离的大鼠， 小鼠，狗的心肌细胞上发现了这种现象。许多研究表明，这种保护作用涉及到 g 蛋白偶联受体的拮抗剂，l a u r i c e 等研究证实，在大鼠心肌细胞系h 9 c 2 上， 腺苷酸a 1 受体通过开放大电导钙激活的钾通道来减少导致炎性反应的乳酸脱 氢酶释放，降低凋亡途径中c a s p a s e 3 的活性，起到保护心肌细胞的作用。 与m k a t p 的作用类似，m k c 。通道的开放可以增加线粒体k + 内流，抑制 c a 2 + 内流，减轻引起细胞凋亡的钙超载程度。为研究m k c a 通道对线粒体钙超载 的作用，s u n gh y u nk a n g 等【1 9 】用m k c 。通道激动剂n s - 1 6 1 9 处理经诱导产生钙 超载现象的心肌细胞线粒体，发现线粒体内钙离子浓度远低于对照组，而这种 抑制作用又可被m k c 。的抑制剂p a x i l l i n e 抑制。a n d r e h e i n e n 等人发现m k c 。 的开放又能抑制线粒体电子流导致的r o s 的产生【2 0 l ，综上所述，m k c 。可能通 5 第一章引言 过抑制线粒体钙超载和r o s 的产生，从而起到保护心肌的作用。 1 2 4 蛋白激酶c ( p r o t e i nk i n a s ec ，p k c ) 缺血的心肌再灌注后会伴随细胞凋亡和坏死的增加，导致心功能下降，缺 血预适应能保护再灌注引起的心肌损伤。从属于丝氨酸苏氨酸激酶的蛋白激酶 c ( p r o t e i nk i n a s ec ，p k c ) 家族涉及到很多信号通路，其中的对钙不敏感的两 个成员p k c 6 和在缺血再灌注损伤中对细胞保护起到了积极的作用。在再灌 注期间激活p k c 6 会加重细胞的凋亡和坏死，而在缺血之前激活p k c c 可以保 护线粒体功能已达到减少凋亡和坏死的作用。 细胞的生存取决于死亡和生存两条信号途径的竞争，改变这些信号途径将 导致病态情况发生，如癌症，神经推行性疾病等，这些途径十分复杂，涉及到 蛋白翻译后的加工和改变。蛋白表达部分受控于2 6 s 蛋白酶体的活性，缺血再 灌注损伤涉及到蛋白酶体活性的降低，坏死和凋亡的增加，心肌组织的丢失等 等方面，两个对钙不敏感的p k c 同工酶可以逆转缺血再灌注引起的心肌损伤。 再灌注期间激活p k c 8 对线粒体功能负面调节，导致了凋亡的发生。相反，在 缺血之前激活p k c s 又可以通过保护线粒体的功能减少缺血再灌注引起的凋亡 的坏死。这两个高度同源的同工酶是如何通过调节线粒体功能达到相反的作用 效果的呢? 有人【2 1 j 假设p k c 6 和p k c 的调节能改变蛋白酶体活性，在心脏中 发现，这种调节机制可能是细胞存亡的主要方式。 p k c 家族是由十种不同的丝氨酸苏氨酸激酶组成，根据同源性和激活条件 有将其分成三个亚家族，p k c 8 和p k c 显示了高度的同源性和相似的底物特异 性，预示着这两个同工酶在信号通路中有相同的作用位点。在心脏中，p k c 8 在缺血再灌注损伤中起了主要的作用，它与线粒体结合导致线粒体呼吸作用的 降低，降低了三羧酸循环的活性，降低了胞内p h 值和a t p 产量，增加了线粒 体活性氧的产生，所有的这些作用共同导致了c y t c 的释放从而引发细胞凋亡。 而在再灌注过程中抑制p k c 5 的活化能起到保护心肌的作用。与p k c 8 的作用 相反，在缺血预适应过程中激活p k c 使其与线粒体结合能减少凋亡的产生， 涉及的机制是p k c e 的活化导致线粒体敏感钾通道( m i t o c h o n d r i a la t p s e n s i t i v e k + c h a n n e l ，m k a t p ) 开放，阻止了m p t p 的打开，调节c y t c 氧化酶的活性。 另外，在缺血之前药理性的激活p k c e 也能保护心脏，作用与缺血预适应类似。 6 缺血预适应是短暂性缺血缺氧对接下来的严重缺