（作物遗传育种专业论文）旱稻耐盐基因的转化及耐盐性试验.pdf

摘要 本研究采用基因工程的手段将戤菜碱醛脱氢酶( b a d h ) 基因转入到已经具有1 磺酸甘露醇 脱氢酶( m t l d ) 基因并稳定遗传的早稻2 9 7 、早稻2 7 7 、早稻5 0 2 材料中，以期增加早稻的耐 盐性，解决盐碱地的开发利用问题，同时推动早稻的大面积推广。 以胚性愈伤组织为受体材料，利用农杆菌介导法将b a d h 基因导入旱稻材料。对外源基因 在早稻植株中的整合和表达情况进行了研究，同时在转化过程中，对影响转化的各个因素做了进 一步的探讨，从而进一步完善旱稻的遗传转化体系。 经过p c r 检铡和s o u t h e m 杂交证明，b a d h 基因也整合到早稻基因组中，再经p c r 检 测，b a d h 基因和m t l d 基因同时导入早稻材料中。获得同时转入b a d h 基因和m t l d 基因的 植株共有4 4 株，其中早稻5 0 2 植株中有2 8 株，早稻2 7 7 植株中有9 株早稻2 9 7 中有7 株。 对转基因植株后代t 】进行反转录p c r 证明，b a d h 基因在早稻材料中得到表达 转双基因植株t o 代生长情况总体看来，株高明显下降。穗长明显变短，成穗率也下降，转 化植株生育期延长6 4 2 的转化植株可育，但育性普遍下降，并且各株之间结实率差异较大。 将已经转入m t d 基因的并稳定遗传的t 5 代单基因材料和已经转入b a d h 基因t 2 代的 单基因材料在山东东营0 5 - 0 6 n a c i 的盐碱地上种植选择，大部分转基因植株正常生长，非 转基因对照植株( 早稻5 0 2 最严重) 几乎不能生长。经过主要农艺性状的观察，以及p c r 检测，以 及耐盐性检测，已选育出优良株系9 个：t 0 0 8 ，1 6 t 5 2 6 ，1 5 6 6 ，t 4 1 0 ，t 4 6 1 ，1 6 ，t 1 2 2 ， t 1 3 6 。这些品系，稻米品质达到国家1 - 2 级米标准，单株产量在7 8 9 5 1 2 8 9 9 之间。 转基因植株耐盐性试验表明，转双基因植株的耐盐性得到明显的提高，能达到0 7 5 饭量， 体积) n a c a 的耐盐能力：而在此盐浓度下，非转基因植株是不能生长的。 转单基因早稻植株与转双基因植株的在0 7 5 ( 质量体积) n a c t 水培条件下，耐盐性比较 实验发现，无论是它们所表现出来的盐害症状的差异，还是转基因早稻的叶片相对电导率结果 以及地上部、地下部n a + 醛含量的测定结果都表明，转双基因植株比转单基因檀株表现出更 好的耐盐性。因此，推断出这两个耐盐基因起到了一定的协同( 或累加) 效应。这也证明了在 植物耐盐碱这种数量性状的改良上，进行多基因转化来改良的方法是可行的。 关键词：早稻，农杆菌，甜菜碱醛脱氢酶( b a d h ) ，转化，耐盐 a b s t r a c t t h r o u g h 黜e n g i n c e r m ga p p r o a c h ，b e t a i n e - a l d e h y d ed e h y d r o g e n e s e ( s a d 奶g e n eh a sb e e n t r a n s f o r m e di n t ou p l a n dr i c et h a th a sc a r r i e dm a n n i t o l l - p h o s p h a t e 加a o ) g e n ea n di n h e r i t e di t s t e a d i l y , w h i c hn o to n l yh e l pt ob m e dw a n s g e n i cu p l a n dr i c ev a r i e t i e sw i t hs a l tt o l e r a n c e ，b u ta l s ob e b e n e f i c i a lt oe x p l o i ta n du t i l i z ea l k a l i n el a n da n dt oe n l a r g et h ep l a n t i n ga r e ao fu p l a n dr i c e t h eb a d g e n ew a st r a n s f e r r e di n t ot h eu p l a n dr i c eb ya g r o h a c t e r i n m - m e d i a t e dt r a n s f o r m a t i o n ， a n di nt h i st r a n s f o r m a t i o n t h ec a l l ii n d u c e df r o mm a t u r ea n di n l m a t u r ee m b r y o sw a st a k e nf o r e x p e r i m e n t a lm a t e r i a l t h ei n t e g r a t i o na n de x p r e s s i o no fe x o g e n o u sg e n ei nu p l a n dr i c eg e n o m ew c i c s t u d i e d ，a n da tt h es a m et i m e ，a f t e rt h ef a c t o r si n f l u e n c i n gt r a n s f o r m a t i o nh a db e e nd i s c u s s e d c a r e f u l l y ，ah i g h l ye f f i c i e n tt r a n s f o r m a t i o ns y s t e mw a se s t a b l i s h e d t h er e s u l t so fp c ra n ds o u t h e mb l o t t i n ga n a l y s i ss h o w e dt h a tb d d hg e n eh a db e e ni n t e g r a t e d i n t ou p l a n dr i c eg e n o m es u c c e s s f u l l y p c ra g a i n t h em s u l ms h o w e dt h a tt h em a dg e n ea n db a d h g e n ew e r eb o t hi n t e g r a t e di n t ou p l a n dr i c e 4 4t r a n s g e n l cp l a n t sw i t ht h em t l dg e n ea n db a d hg e n e h a sb e e no b t a i n e d ，i n c l u d i n g2 8u p l a n dr i c e5 0 2 ，9u p l a n dr i c e2 7 7 ，7u p l a n dr i c e2 9 7 t h e e x p r e s s i o n o f t h e b a d h g e n e i n t h e u p l a n d r i c e w a s p r o v e d b yr e v e r s e t r a n s c r i p t i o n p c r t h ep l a n t st ow i t ht w oe x t r a n e o u sg e n e sa p p e a rl o w e rp l a n th e i g h t , s h o r t a rs p i l c el e n g t ha n d l o w e rp e r c e n t a g eo fe a r b e a r l n gt i l l e r t h et r a n s f o r m e dp l a n th a sar e l a t i v el o n gg r o w i n gs e a s o n ， 6 4 凹bo ft h ep l a n t sc a nf e r t i l i t e ，b u tt h ef e r t i l ea b i l i t yd e c l i n e d ，a n dt h er a t i oo fs e e ds e tb e t w e e n p l a n t sv a r i e sal o t t h eg e n e r a t i o n 瓦o fu p l a n dr i c ec a r r i e dm t l dg e n es t e a d i l ya n dt h eg e n e r a t i o nt 2o fu p l a n dr i c e c a r r i e d b a d h g e n es t e a d i l y w e i e c u l t i v a t e d i n 0 5 - 0 6 n a c la l k a l i n e l a n d i n v o n g y i n g s h a n d o n g p v i n c e m o s to ft h 6 仃a m g # 正cu p l a n dr i c ec o u l dg r o wn o r m a l l y , w h i l et h en o n t r a n s g e n e # a n t sc a l l n o tg r o w ( u p l a n dr i c e5 0 2 ) b a s e do nt h em a i na g r o n o m i ct r a i t si n v e s t i g a t i o n ，p c rc h e c k i n g , a n d s l a t - t o l e r a n c ea b i l i t ye v a l u a t i o n ，9l i n e s ，i n c l u d i n g 删，t 0 0 6 ，i 5 2 6 , t 5 6 6 ，t 4 1 0 , t 4 6 1 ，t 0 3 6 , t 1 2 2 , t 1 3 6 ，w e r es e l e c t e d t h er i c eq u a l i t yo ft h e s ep l a n t sr e a c h e dn a t i o n a lr i c ec r i t e r i o nl e v e li l e v e li i ， a n dl i n e sy i e l dv a r yf r o m7 8 9 5 9 1 2 8 9 9 t h es a l t - t o l e r a n c ea b i l i t yt e s to ft r a n s g e n l cp l a n ti n d i c a t e st h a t ，t h ep l a n t ，w h i c hh a sb e e n t r a n s f o r m e dt w og e n e s , e x h i b i t e dh i g hs a l t - t o l a r a n c ea b i l i t y r e a c h e d0 7 5 n a c l ( w v ) w h i l et h e n o n t r a n s g e n ep l a n t sc a nn o tg r o w i nw a t e rc u l t u r ei n c l u d e d0 7 5 n a c i ( w n ) w h e nt h et r a n s g e n l co f f - s p r i n g sw i t ho n ee x o g e n o u sg e n ea n dt h ep l a n t sw i t ht w oe x o g e n o u s g e n e sw e r es u b j e c t e dt o0 7 5 ( w v ) n a c l ，妞a p p e a r a n c e ，r e l a t i v ee l e c t r i cc o n d u c t i v i t y , a n dt h en a + c c o n t e n to ft h ep l a n t si n d i c a t et h a tt h el a r e re x h i b i t sh i g h e rs a l t - t o l e r a n c ea b i l i t y s ow ec o n c l u d e d t h a tt h et w og e n e s ( m 衄a n d 且伽h a v ec e r t a i ni n t e r a c t i o n ，a n dl l 辩p o l y g e n e st r a n s f o r m a t i o nt o i m p r o v ep l a n t ss a l t - t o l e c a n c ea b i l i t yi sr e a s o n a b t e k e yw o r d s ：u p l a n dr i c e , a g r o b a c t e r i u mt u m e f a e t i o t 口，b e t a i n e - a l d e h y d ed e h y d m g e n a s e ( & 舡) 觇 t r a n s f o r m a t i o n ，s a l t - t o l e r a n c e 本论文是国家转基因植物研究与产业化 开发专项中“优质、抗旱、耐盐旱稻新品种、 新材料选育 ( j y 0 3 - 1 3 1 0 ) 的部分研究内容 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已 经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位 或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文 中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名： ；长翮 时间： 2 j d 哆年6 月形日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保 留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描 等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业大学可以用不同方式在不同媒体上 发表、传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名：孰久丽 时间： 弦口f 年二月，f 日 导师签名： 时间：砑年6 月一日 孓 中国农业大学硬士学位论文第一章前言 i i 基因枪转化技术 第一章前言 基因枪法是1 9 8 7 年由美国康奈尔大学生物化学系s a n f o r d 提出的，是指用钨粉或金粉包裹外 源d n a ，而后依靠基因枪装置，利用高压氨气冲击波加速微弹去穿透植物细胞壁和细胞膜，使外 源d n a 进入植物细胞并接合到植物细胞染色体组中，从而达到稳定遗传和表达的目的。 其优点是无宿主限制，能转化任何植物，不受外檀体限制。靶受体类型广泛，不受基因型的 限制，可以适用于不同的物种以及同一物种的不同品种细胞、组织、器官等均可作为转化受体， 并且可用于酵母、细菌及动物的转基因中可以转化线粒体、叶绿体等植物的不同细胞器，用基 因枪技术转化这类细胞器，转化频率高，重复性好，是目前该领域研究中最常用和最有效的d n a 导入技术。可控度高，采用高压放电或高压气体驱动，可根据实验需要，将金属颗粒( 载体) 射入 特定层次的细胞( 感受态细胞和再生区细胞) ，这大大提高了遗传转化效率。操作简便快速。目前 通过基因枪技术，很多植物都可以得到转化，如小麦( v a s i l 等，1 9 9 2 ) 、水稻( 许新萍等，1 9 9 9 ) 、 玉米( 王国英等，1 9 9 5 ) 、大豆( m c c a b e 等，1 9 8 8 ) 、棉花( f i n e r 等，1 9 9 2 ) 等。 另外，用基因枪进行基因转化也有其局限性。如基因枪轰击的随机性导致转化效率不高。基 因插入往往是多拷贝成簇整合到受体基因组中，而且可能发生多种方式重排。同源序列能以 d n a - d n a 、d n a - r n a 、r n a - r n a 的方式相互作用，导致转录或转录后水平d n a 的基因沉默。 轰击过程中可能造成外源基因的断裂使插入的基因成为无活性的片段，出现非转化体或嵌合体 的可能性较高。可能导致植物本身的某些基因非正常表达还有可能发生共抑制现象。 1 2 农杆菌转化技术 自1 9 8 3 年利用农杆菌转化获得首例转基因烟草以来。农杆菌介导的基因转化重要环节已形 成了相当成熟的实验流程，在油抖、塘料、纤维、花卉、果树、蔬菜、林木、谷类等植物中均获 得了转基因植株。据统计至今获得的转基因植株中8 0 以上是农杆菌介导转化法获得的( 傅荣昭 等，1 9 9 5 ) 。农杆菌转化的具体操作方法也多种多样，如直接感染植物伤口法、叶盘法、原生质 体共培养法、真空容器中浸染完整植株( u u 等，1 9 9 9 ) 、愈伤组织共培养等。由于单子叶植物不 是农杆菌的天然寄主，农杆菌介导的遗传转化在水稻、小麦、玉米等主要农作物上的应用一度曾 非常缓慢，但自1 9 9 4 年首先在水稻上取得了重要突破以来( h i d 等，1 9 9 4 ) ，在小麦、玉米等粮 食作物中相继取得了成功，显示了j f i 用此法改良主要农作物品种的巨大潜力。 农杆菌介导法与其它方法相比较具有许多优点：操作简便不需特殊仪器，培养周期短；技术 最成熟( 转化效率高；外源基因多以单拷贝插入，稳定性好；可以利用不同的启动子控制目的基 因在特定的器官进行特异表达；较少出现基因沉默现象( 王关林，1 9 9 8 ；p a u l ，1 9 9 2 ) ；可将较大 片段d n a 完整地转移到植物基因组中等m m i l t o n ，1 9 9 7 ；i j u 等，1 9 9 9 ) 。缺点受受体材料的限 制f h ： ：t - d n a 可以在植物染色体的任何区域内插入，就有可能导致有益基因的插入失活，因 此外源基因插入问题尚有待于基因转移技术的进一步完善，特别是在禾本科粮食作物的遗传转化 方面还存在许多局限 1 2 1 农杆菌介导的转化机理 农杆菌是一种革兰氏阴性土壤杆菌。现已发现，与植物基因转化有关的有两种类型：为根 癌农杆菌( a g r o b a c t e r i u m 加咖出m ) ，它含有t i 质粒，能诱导被侵染的植物细胞形成肿瘤，即 诱发冠瘿瘤：二为发根农杆菌臼g r o b a c t e r i u mr h i z o g e n e s ) ，它含有础质粒，能够诱导被侵染的植 物细胞产生毛发状根。农杆菌是天然的“遗传工程师”，它能将自己的一部分遗传物质引入寄主 植物的染色体上，从而改变寄主的遗传性状，因此它已被用作转移外源基因到植物内的主要载体 工具。t i 质粒上有一d n a 片段( t - d n a ) 能够被转移植物细胞核，并整合进寄主植物的染色体 上。t - d n a 上含有参与植物生长激素和冠瘿碱合成的基因，它们在植物细胞中的表达能导致植 物生长激素的过度分泌和冠瘿碱的产生。另外，t i 质粒上还含有一个致病基因区( v i n i l e r e g i o n ，v i r 区) ，其编码产物参与t - d n a 的加工、转移以及整合到植物细胞核等过程。v i r 区 上有6 个操纵子( v i r a ，v i r b ，v i l c ，v i r d ，v i r e 和v r g ) 是t d n a 转移所必须的。v i r a 和v i l g 可调控v i x 区其它基因的表达。v i r c 、v i m 和v i r e 参与t - d n a 复合体的形成和转移。v i r b 操纵 子编码的1 1 种蛋白以及r d 4 蛋白参与形成一种与膜相连的结构，这种膜结构是t - d n a 转移所 必须的。在自然情况下，只有当植物受伤时，农杆菌才能诱发植物形成肿瘤现在我们知道，所 有v i i 基因操纵子均可被植物刨伤组织释放出的信号分子所诱导，其中最为明确的信号分子是简 单的酚类化合物，如乙酰丁香酮( a c c t c 目y r i n g o n e ，a s ) 。这些酚类化合物在植物受伤后被合成， 以便木质索的合成，从而有利于伤口的修复。另一类诱导化合物是组成植物细胞壁的一些特异单 糖。a s 和单耱可协同诱导v i r 基因的表达。v l r a 作为“感应”蛋白，定位于农杆菌细胞的内膜 上，可受感于酚类化合物的刺激，自我磷酸化变为活化状态，它然后将v i r g 磷酸化；v i r g 作为 胞质“反应调节”蛋白，被活化后参与被其调控的基因的活化过程v i f 基因被诱导后产生的蛋 白将进行t - d n a 的加工与转移。v i r d 基因编码的两个产物v k d l 和v i r d 2 直接参与加工过程。 v i r d l 蛋白是一种拓扑异构酶，可将超螺旋型d n a 转变成松弛型d n a 。v i r d 2 蛋白具有特异剪 切单链d n a 的内切酶活性，它可识别t - d n a 底链边界重复序列的特定位点，并在底链2 4 b p 重 复序列的第三和第四个碱基之间切割t - d n a ，从而在切口处释放出一条线形单链d n a 分子 ( t - s t r a n d 或t 链) 。切开t - d n a 后，v t r d 2 蛋白与t 链的5 端共价结合，避免核酸外切酶降 解t - 链。此外，v i r d 2 作为一个导向蛋白，可以指导整个t - d n a 复合体( 或叫t - 复合体) 从农 杆菌进入到植物细胞核。t - 复合体是由一条线形的t - d n a 分子、一个v 证d 2 分子和许多v i r e 2 分 子( 约6 0 0 个) 所组成。t - 复合体形成后，在v i r b 基因产物的作用下实现跨膜转移。v i r b 操纵 子共有1 1 个基因，其产物均定位于细胞膜上并形成一种膜结合t 复合体运输器，供t 复合体越 膜转移，t 复合体转移至植物细胞后，通过核膜上的小孔进入细胞核内，与核d n a 发生整合作 用，从而完成整个转化过程 影响农杆菌转化因素主要有菌株的染色体背景和载体质粒、受体的生理生化状态和共培养条 件等( h i c i 等，1 9 9 4 ) 。 2 1 2 2 影响农杆菌法转化效率的因素 1 2 2 1 酚类等化合物的加入 双子叶植物是农杆菌的天然宿主。大部分双子叶植物通过农杆菌介导的方法很容易获得转 基因植株，那是因为双子叶植物在农杆菌浸染后能产生酚类物质，诱导v i r 基因表达。而单子 叶植物却很少产生酚类物质，即使产生也不足以达到有效诱导v l r 基因表达的程度由于像马 铃薯和番茄这样的作物含酚类物质较多，并且对农杆菌敏感。因此，李宝键等( 1 9 9 0 ) 把马铃 薯和番茄的细胞培养物加入到共培养培养基中进行悬浮培养。有效的增加了转化效率。目前发 现9 张酚类物质：乙酰丁香酮、羟基乙酰丁香酮、几茶酚、原儿茶酚、没食子酸、二羟基苯甲 酸、香草醛和对羟基酚。其中，乙酰丁香酮和羟基乙酰丁香酮作用最强在单子叶植物转化中， 添加酚类物质是转化成功的关键，在水稻中一般加1 0 0pm 乙酰丁香酮较为适宜 此外，还发现一些小分子量的糖类，如半乳糖和葡萄糖等在乙酰丁香酮浓度很低或缺乏时， 也可极大地促进v i r 基因的表达，但在乙酰丁香酮浓度1 0 0um o l l 时，两者却没有协同作用。 r a s h i d 等( 1 9 9 6 ) 用未经伤害处理的盾片愈伤组织作为起始材料，实现了对籼稻b a s m a t i 3 7 0 的转化，转化频率高达2 2 ，并证明乙蘸丁香酮( a s ，5 0 a m o l l ) 必, 须在农杆菌的悬浮培养液中 和共培养的培养基中同时使用，才能大大提高转化效率。 1 2 2 2 基因墼 尽管利用农杆菌介导转化水稻3 个亚种粳稻、籼稻和爪哇稻都获得了成功。但不同品种对 农杆菌的敏感程度不同，一般粳稻容易被转化成功，转化频率高，籼稻转化则较为困难，成功 率较低，仅在极少数品种取得成功，这主要与籼稻愈伤组织形成、继代和再生植株比较困难有 关。然而，籼稻品种分布广，占整个水稻品种以上，对其改良意义更大。 黄健秋等( 2 0 0 0 ) 建立了一套根癌农杆菌介导的水稻高效转i f , * 0 转基因植株的高频再生系 统，其中抗性愈伤组织产生频率最高达5 5 1 ( 籼稻) 和8 5 2 ( 粳稻) ，转化植株产生频率最高达 3 7 8 ( 籼稻) 和6 9 0 哺e 稻) 。 1 2 2 3 转化受体 可用于水稻基因转化的受体有愈伤组织、幼胚、茎尖、悬浮培养细胞、原生质体等，但转 化效果差异很大，其主要原因在于受体对农杆菌的敏感性不同。胚性愈伤组织和幼胚含有大量 胚性细胞，分裂活动旺盛，易接受外源基因，是水稻转基因的优良受体，但仍需考虑其最佳感 受期。利用茎尖的转化效率很低，可能主要在于其细胞分裂和再生能力有限。 愈伤组织的状态也至关重要，生长状态良好的细胞在被农杆菌浸染后仍能保持良好的生活 能力，同时旺盛的细胞分裂和d n a 复制有利于外源基因的整合因此，共培养的培养基，不 仅要适合农杆菌的生长而且要适合水稻愈伤组织的生长 3 中国农业大学硕士学位论文 第一章前言 1 2 2 4 共培养时间 共培养时间的长短影响到农杆菌的吸附t - d n a 的转移，从而影响转化率，不同受体组织 培养时间不同。一般地，共培养2 - 3 天能使农杆菌t - d n a 转化到水稻愈伤组织，处理时间过 长会导致愈伤组织变褐而丧失分化力。 1 2 2 5 农杆菌菌株及载体系统 不同农杆菌的宿主范围不同，所以选取适合的农杆菌菌株和高效的载体系统对转化成功至 关重要。目前用于水稻转化的一般均为双元载体，即t - d n a 区和毒力区分别在两个不同的质 粒上，而超双元载体则是在这两个载体上均有毒力区，因而可以增强农杆菌的侵染力。在菌株 的选择上，e h a l 0 1 、e h a l 0 5 、a g l l 是常用的超毒力菌株，比其他菌株更常用于单子叶植物 的转化。刘巧泉等( 1 9 9 8 ) 证明在同样携带质粒p c a m b i a l 3 0 1 的农杆菌中，e h a l 0 5 对受体 的敏感性高于l b a 4 4 0 4 ，而a g l l l 最低，e h a l 0 5 是用于水稻转化的良好菌株m e i 等( 1 9 9 4 ) 检测了两个菌株和两个载体的不同组合的转化频率，菌株是i b a 4 4 和e h a l 0 1 ，载体是一个 普通的双元载体p i g l 2 1 h m 和一个超双元载体p t o k 2 3 3 ，结果表明l b a 4 4 0 4 p t o k 2 3 3 转化最 好，并指出不同的水稻品种对菌株和载体的反应不同。但是，有许多实验证明超双元载体并非 是必须的，普通双元载体也获得了较好的转化效率。 1 2 2 6 供选择的标记基因和选择剂 在植物基因转化中，外源基因稳定整合的频率低。如何选择适当的筛选标记以准确、有效 地区分转化与非转化细胞，产生选择压力，使未转化细胞不能生长，且不干扰细胞的正常生长 与植株再生是转化成功的重要环节之一。常用的筛选标记基因有：新霉素磷酸转移酶o q p t l d 、 潮霉素磷酸转移酶0 n r 或h p h ) 、p h o i 曲i n o l h 崩n 口p t ) 乙酰基转移酶( 瞰) 、a m i n o g l y c o s i d e 乙酰转移酶、二氢叶酸还原酶( d i - r ) 等，其中前三种使用较为普遍。 新霉素磷酸转移酶基因编码产物对某些氨基葡萄糖苷类抗生素如卡那霉素、新霉素、( 3 4 1 8 等具有抗性，可以利用这些抗生素作为选择剂。但对水稻而言，卡邓霉紊对愈伤组织的选择效 果较差，且选择后愈伤组织再生绿苗困难，c a l 8 是一种与卡那霉索相近的氨基糖苷类抗生素， 同样不能被新霉素磷酸转移酶激活，用它作选择标记比卡那霉紊更有效，而且再生绿苗频率更 高。 潮霉素是一种很强的细胞生长抑制剂，对许多种植物都产生很高毒性，能有效识别转化与 未转化组织，对愈伤组织再生影响较小，在农杆菌介导的水稻转化中，r r 基因已被广泛使用。 其它选择剂如除草剂b a r 基因等已被分离出来，并成功遣运用于选择转基因水稻愈伤组织和植 株。 4 中国农业大学碗士学位论文 第一章前言 1 3 启动子 目前用于水稻转基因研究的启动子大多是组成型启动予，如花椰菜花叶病毒( c a m v ) 3 5 s 启 动子玉米乙醇脱氢酶基因l ( a d h l ) 启动子玉米泛蛋白基因( u b i l ) 启动子，根癌土壤农杆菌 胭脂碱合成酶基因( e n o s ) 启动子，水稻肌动蛋白基因( a c t l ) 启动子等。其中a c t l 被认为是目 前水稻遗传转化中表达频率最高、应用最为广泛的一个强启动子。而c a m v 3 5 s 启动子虽然在 双子叶植物中最有效、最常用，但在单子叶植物的转化中效率并不高。但组成型启动子的缺点 是使外源基因在水稻的所有部位以及所有发育阶段都有可能表达，这势必影响转基因水稻正常 的生长发育，而且在水稻基因工程中使用组成型启动子使得食用部分中可能含有外源基因的表 达产物，因而使转基因产品的应用中存在相当大的安全性隐患。因此，为解决此类问题，我们 必须大力发掘和研究特异性启动子用于水稻的转化中使外源基因只在水稻中的特异部位表达。 使转基因植株在获得耐盐性的同时，又不影响正常的生长发育，同时也可解决安全性的问题。 目前已发掘的特异性的启动子有来源于小麦组蛋白基因的i t i s 3 启动子、来源于水稻杆菌病毒 的r t b v 启动子等。 1 4 多种转基因方法协同作用 各种转基因方法各有其优点和缺点，很难找到适台各种植物的高效转基因方法。因此科研过 程中常常同时采用多种转基因方法协同作用，来提高外源遗传物质向受体转移的效率。譬如： 农杆菌介导转化受体前，可以利用电激法、基因枪轰击法、超声波及减压或高压渗透处 理等物理手段提供一定的受体微损伤以提高农杆菌侵染的成功率： 基因枪也可以直接将脂质体、农杆菌质粒甚至农杆菌细胞直接射入受体细胞及其间隙， 使外源基因转移更直接有效； 将病毒载体和农杆菌质粒载体相结合得到“农感染”法，有效的利用病毒的强感染能力 和农杆菌的转基因整合能力，在单子叶植物转基因中有广阔的应用前景： 农杆菌以花粉管通道为侵染途径进行转化。 多种转基因方法的综合运用可以有效地提高转基因效率，简化操作步骤，扩大受体范围。 研究表明，增加受体材料的有效被感染能力如改变创伤方式、添加创伤反应诱导物等是提高农杆 菌转化水稻成功率的方法。b i d n e y 等( 1 9 9 2 ) 借鉴基因枪法转化的优点，报道用基因枪轰击烟草 和向日葵顶端分生组织造成细小创伤，再进行农杆菌侵染，其转化效率有所提高。h a n s c 等 ( 1 9 9 6 ) 将这一方法完善，提出t a g r o l i s t i e 法，并在烟草、玉米和水稻上获得了成功。明小天等 ( 2 0 0 1 ) 报道通过基因枪将农杆菌细胞轰击到水稻愈伤组织中可以提高转化效率。李红等( 2 0 0 0 ) 在已经发现的低能离子束注入可以造成植物细胞壁亥4 蚀并产生局部穿孔现象的基础上，利用低能 离子与农杆菌介导转化水稻，使转化率得到提高。 5 中国农业大学硕士学位论文 第一章前言 1 5 多基因转化 自然界中生物的许多性状往往是由多个基因控制的，一般的生化代谢过程需要多种酶的催化 作用才能完成。在酵母中像简单的海藻糖的代谢过程也需要4 个基因产物的直接参与( t h e v e l e i n 等，1 9 9 5 ) ，因此在基因工程中为使一个由多基因控制的性状发生改变，补充一条新的代谢途径 就需要把多个基因送入植物细胞并使之整合到染色体上，这样做的优势在于能够把一个长度合适 的代谢途径从一个物种搬到另一个物种中去以实现多基因性状的物种间转移。而且长期咀来培育 高产、优质、抗病虫害、抗逆境等具有多个优良性状的作物品种是每一个从事作物遗传改良科学 家的共同愿望。为此，研究者们对发展多基因转化系统，将多个目的基因导入到作物基因组中进 行了探索，并且成功地实现了多个目的基因在作物中的表达。耐盐性状在遗传上属于数量性状， 植物耐盐性是多种机制综合作用的结果，采用单基因转移的方式，实际上只能获得部分抗性，要 想获得真正的耐盐转基因水稻植株，必须同时转入多个基因。 为实现多个i i 的基因在植物中表达，首先在表达载体构建上，可以采取以下两条途径安排目 的基因在载体中的位置。一是将多个目的基因用表达结构隔开或者直接融合在一起构建多基因表 达载体；二是多个目的基因分别构建多个表达载体。 1 5 1 表达载体构建 1 5 1 1 多个目的基因构建于一个表达载体 多个目的基因用表达结构隔开或者直接融合在一起构建多基因表达载体。可以通过两种方 法实现； 多个目的基因的两端均具有各自的启动子、增强序列、终止子等转录和翻译调控元件， 将它们串联在一起共同组建于一个表达载体中。当这种载体构建好，只要通过一次转化就可以方 便而成功地获得多价基因同时表达的转基因植物。现已组建t b t + 0 7 7 、b t + g n a 、及 r c 2 4 十r a c 2 2 * r c h l o 等多价抗虫、抗真菌病基因表达载体。并通过一次性转化获得了转多价基 因的抗虫烟草和抗病水稻。但是由于受到载体容量的限制及插入的d n a 大小对载体转化基因能 力的影响，需转化的目的基因数目不能太多。 多个目的基因的d n a 序列融合在一起，使其处于同一表达框内。多个基因在同一个启动 子下转录成一个转录本，翻译后得到一个由不同的功能蛋白拼合在一起而形成的新型多结构域的 人工蛋白。v a n ( 1 9 9 4 ) 等将含c r y l c - c r y i a 御融合蛋白基因表达载体成功地转化烟草和番茄， 获得了抗多种害虫的转基因植株。采用融合蛋白基因的方式构建基因表达载体，也要考虑载体的 容量，组建载体的难度也较大。融合在一起的多个基因由于具有相同的表达调控元件，它们之间 的表达是完全同步的，表达水平也相当，因此易于进行表达调控。而且各个基因编码序列同处于 一个表达盒中，缩小了整合d n a 片断的长度，减轻了载体的运载负担 6 1 5 1 2 构建多个表达载体 一个目的基因构建一个表达载体需转化多少目的基因就构建多少个表达载体。这种载体构 建方式，相当于把多价基因的转化变为多个单基因的转化。若构建了多个表达载体可首先获得多 个分剐含有不同召的的基因的转基因植株，再通过有性杂交的方式使多个基因存在于一个植株 内。b o u t l e r 等( 1 9 9 0 ) 先获得e - t e c 基因和c p t i 基因的抗虫植株然后通过有性杂交方式获得了同 时表达这两种抗虫基因的转基因烟草。这样可以充分利用现在相当成熟的载体构建以及基因转化 技术，不必顾虑载体的容量，而现有的质粒载体就能够满足需要，目的基因数目也可以不受限制。 但随着转化的基因数目的增多，工作量将增加，试验周期要延长，得到转多价基因植株的难度就 越来越大。而且由于在转化时可能进行多次独立的转化各个基因的表达水平差异较大。 1 5 2 共转化 共转化是把含有不同目的基因的表达载体混合在一起对同一受体进行转化，将多个基因共同 导入到受体基因组中，这些d n a 分子可整合入同一基因座位或相同染色体，不同染色体不同基 因座位。通过共转化的途径，许多研究者利用农杆菌介导法、基因枪法、电击法等转化方法把含 不同目的基因的表达载体混合在一起对同一受体进行转化，将多个基因共同导入到受体基因组 中，已经获得了大量的转多价基因植株。 一般说来，当基因转化载体的数目增加时，获得多基因转化体的频率就会成倍的下降。 c h r i s t o n 等( 1 9 9 0 ) 报道了位于同一载体上的不同的目的基因的共整合频率等于或接近1 0 0 9 6 ，而 位于两个不同载体上的基因进行转化时，共转化频率一般为3 f f y n 。随着载体数的增加，获得所需 多基因转化体的频率成倍下降。发生共转化的目的基因在受体植物基因组的整合位点也很难确 定，一般情况下是分布在植物的不同染色体上，但许多报道发现共转化的多个目的基因倾向于整 合在植物一条或者两条染色体的同一或少数几个遗传位点上，由于对共转化的作用机理研究的还 不清楚，也难以保证发生共转化的目的基因都能导入到同一受体中。一些作者报道，位于两个载 体上的共转化的外源基因往往在后代中呈现共分离现象，即两个外源基因呈连锁遗传( c h a r t ， 1 9 9 8 ) 。 基因枪法一次能导入多达i 2 一1 4 个不同的质粒，总长度约为鲫k b 的d n a ，冯道荣等( 2 0 0 0 ) 将含有2 3 个抗真菌基因和两个抗虫基因的多基因表达载体按1 ：1 摩尔比混合，利用基因枪法导 入到水稻胚性愈伤组织中，发现7 0 转基因植株含有6 7 个目的基因。( ：h e n 等( 1 9 9 8 ) 将1 4 个 基因分别构建在不同载体上用基因枪法转化水稻，发现也仅1 7 的r o 代转基因植株中含有9 1 3 个目的基因a 戴顺洪等在进行水稻3 个含不同基因的质粒载体的共转化研究表明。只有1 2 的转 基因植株中三个目的基因同时发生了转化。y e x d ( 2 0 0 0 ) 将合成维生素a 前体的3 个酶基因分 蹦构建在3 个载体上，应用农杆菌法一次转化水稻，转基因植株的籽粒胚乳中合成了维生素a 。 7 中国农业大学硕士学位论文 第一章前言 1 6 转基因沉默 转基因沉默是指利用遗传转化方法导入并稳定整合进入受体细胞中的完整的外源基因在当 代转化体或在其后代中表达受到抑制的现象。首例基因沉默是1 9 8 6 年p e e r b o l t e 等( 1 9 8 6 ) 发现 根癌农杆菌t - d n a 上的基因在转基因烟草中发生甲基化而其表达受到了抑制。 目前人们通常将转基因沉默分为转录水平的基因沉默( t r n s c f i 州o n a lg c n es i l e n c i n g ；t g s ) 和转录后水平的基因沉默( p o s b t r a n s c r i p t i o ng e n es i l e n c i n g ；p t g s ) 两种。转录水平的基因沉默是 指对转基因专的细胞核r n a 合成的失活，它的发生主要是由于基因无法被顺利转录成相应的 r n a 而导致基因沉默。转录后水平的基因沉默是指转基因在细胞核里能稳定转录，但在细胞质 里却无相应的稳定态m r n a 存在现象。其中共抑制( c o s n p p r e s s i o n ) 是转录后水平基因沉默中最 常见的现象。它是由于转基因编码区与受体细胞基因组问存在的同源性，导致转基因与内源基因 的表达同时受到抑制。共抑制现象最初由m o l 等( 1 9 8 9 ) 在研究矮牵牛苯基苯乙烯酮合成酶( h s ) 时报道。 基因沉默可能来源于转基因植株体内的不同核酸之间的相互作用，即d n a - d n a 、d n m 鼢n 、 r n a - r n a 的非正常配对作用而导致基因核苷酸的甲基化作用和m r n a 的降解从而引发基因 沉默。基因沉默可能是植物防御机制的一种自然现象在d n a 或r n a 水平上抵锯外源 d n a ，就象植物体内的对细菌、病毒的天然抗性样( h c r v e ，1 9 9 7 ) 。这一现象给转基因工作者 提出了新的难题，它已经成为转基因技术的严重障碍。它要求我们不断去探索、改进植物转基因 技术，做到转基因定点、定量转化重要农作物，并得以稳定、高效表达从而加速转基因技术在 农业生产中的应用。甲基化、重复序列、反式失活和共抑制是基因沉默的主要诱因。 衰l 一1 转基因沉默的控期方法( 韦珂等，2 0 0 3 ) t a b l e l - 1t h ec o n t r o l o f t r a n s g o n c s i l e n c i n g 转基因失活的可能原因 控制失活的可脏措施 p r o b a b l ef f a s o g lo f p r o b a b l em e t h o do f i n a c t i v a t i o ac o n t r o l l i n g t r a l l s g e l l ei n a c t i v a t i o n 多拷贝的插入 农杆菌法优于基因抢及电激法谷类作物改用表杆菌转化法选择完整单拷贝插入序列。 转基因甲基化 避免同源序列包括启动子，结构基因及标记基因；不同基因用不同启动子驱动；避免 用相同的选择标记：第二次转化时用两种选择标记同时选择，建立删除选择标记的技术 体系鉴定并利用去甲基化序列，如免疫球蛋白k 链基因中的一个增强子可局部去甲基化 ( d i r e c tr e g i o n a ld e m e t h y l a t i o n ) 共抑制 从大量转基因植株中筛选稳定表达的个体建立位点特异重组体系 转基因与插入位点附近 用m a r ( m a t r i xa t t a c h m e n t 亿g l o n