（内科学专业论文）stat5、wwox和cmyc在非小细胞肺癌中的相关性研究.pdf

r 一 s t a t 5 、w w o x 和c m y c 在非小细胞肺癌中的相关性研究 摘要 目的：检测信号转导与转录激活因子5 ( s i g n a lt r a n s d u c e ra n d a c t i v a t o ro f t r a n s c r i p t i o n5 ，s t a t 5 ) 、w w 结构域氧化还原酶基因( w w d o m a i n c o n t a i n i n go x i d o r e d u c t a s e ，w w o x ) 和c - m y c 蛋白在非小细胞 肺癌( n o n s m a l lc e l ll u n gc a n c e r , n s c l c ) 组织和正常肺组织中的 表达，初步探讨它们在n s c l c 的发生、侵袭和转移中的作用。方法： 利用免疫组织化学s p 法检测4 0 例n s c l c 组织中和2 0 例正常组织 中s t a t 5 蛋白、w w o x 蛋白、c m y c 蛋白的表达水平。n s c l c 组 织均为手术切除获得，术前未作任何放疗或化疗。其中，男性2 9 例， 女性1 1 例；年龄为3 5 7 8 岁， 3 c m 者2 6 例； 有淋巴结转移者1 8 例，无淋巴结转移者2 2 例；i i i 期者2 4 例， 期者1 6 例；高一中分化者3 0 例，低分化者1 0 例。标本组织经福尔 马林固定，石蜡包埋，4 岬厚连续切片，切片常规脱蜡水化后，蒸 馏水冲洗，磷酸盐缓冲液( p h o s p h a t eb u f f e rs a l i n e ，p b s ) 浸泡，高温 抗原修复，3 h 2 0 2 阻断内源性过氧化物酶活性，并用正常山羊血清 封闭交叉反应。滴加一抗( s t a t 5 兔抗人多克隆抗体，鼠抗人w w o x 单克隆抗体，鼠抗人c m y c 单克隆抗体) 孵育，p b s 冲洗后滴加生物 素标记二抗孵育，p b s 冲洗后滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液 ( s - a h r p ) 孵育，p b s 冲洗，d a b 显色，苏木素复染，透明，封 片观察。以胞质或胞核内出现棕黄色颗粒、网织状或棕褐色团块为阳 性细胞。其中，s t a t 5 蛋白在n s c l c 组织中的阳性表达信号主要位 于细胞质，少数位于细胞核；w w o x 蛋白在n s c l c 组织中的阳性表 达信号主要位于细胞质；c m y c 蛋白在n s c l c 组织中的阳性表达信 号主要位于细胞质。结果：( 1 ) s t a t 5 蛋白在n s c l c 组织中的表达 与在正常肺组织中的表达比较，差异有显著统计学意义( 尸 o 0 1 ) ， 在肿瘤中的表达高于正常肺组织；w w o x 蛋白在n s c l c 组织中的 表达与在正常肺组织中的表达比较，差异有显著统计学意义( 尸 o 0 1 ) ， 在n s c l c 组织中的表达低于正常肺组织；c m y c 蛋白在n s c l c 组 织中的表达与在正常肺组织中的表达比较，差异有显著统计学意义 ( p o 0 5 ) 。结论：( 1 ) s t a t 5 蛋白和c m y c 蛋白在n s c l c 中的表达 增高，显著高于正常肺组织，同时，在n s c l c 中w w o x 蛋白的表 达明显低于正常肺组织，说明过度表达的s t a t 5 蛋白和c m y c 蛋白 以及表达明显缺失的w w o x 蛋白可能均参与了非小细胞肺癌的形成 过程。( 2 ) s t a t 5 蛋白和c m y c 蛋白在n s c l c 中的表达与肿瘤的组 织学类型有关，但与患者的年龄、性别、肿瘤大小、组织分化程度、 淋巴结转移和t n m 分期无关，提示它们可能只在肿瘤发生过程中发 挥作用，而与肿瘤进展、侵袭和转移无关；而w w o x 蛋白在n s c l c 中的表达与淋巴结转移有关，但与患者的年龄、性别、肿瘤大小、组 织学类型和组织分化程度无关，提示可能与肿瘤的转移有关( 3 ) s t a t 5 蛋白与w w o x 蛋白在n s c l c 中的表达呈负相关，提示 w w o x 可能通过抑制s t a t 5 信号转导系统，从而促进细胞凋亡，起 到抑癌作用。( 4 ) 在n s c l c 中，s t a t 5 蛋白与c m y c 蛋白的表达之间 无相关性，说明c m y c 可能并没有通过s t a t 5 信号途径或者是通过 其它的方式来诱导肿瘤的发生。( 5 ) 在n s c l c 中，w w o x 蛋白与 c - m y c 蛋白的表达之间无相关性，说明它们在促进细胞转化，导致肿 瘤的发生过程可能是各自独立发挥作用的，无协同作用。 关键词：非小细胞肺癌；信号转导与转录激活因子5 ；w w 结构 域氧化还原酶基因；c m y c 蛋白 c l i n i c a ls i g n i f i c a n c ea n d e x p r e s s i o no fs t a t 5 ，w w o x a n d c - m y ci nh u m a nn o n s m a l lc e l ll u n gc a n c e r a b s t r a c t ：o b j e c t i v e ：t oi n v e s t i g a t et h ee x p r e s s i o no fs t a t 5 ( s i g n a l t r a n s d u c e ra n da c t i v a t o ro f t r a n s c r i p t o n5 ) ，w w o x ( w w d o m a i n - c o n t a i n i n go x i d o r e d u c t a s e ) a n dc m y ci nn s c l c ( n o n s m a l l c e l ll u n gc a n c e r ) a n dn o r m a ll u n gt i s s u e ，a n dt oe x p l o r et h e i rp o s s i b l e r o l e si nt h et u m o r i g e n e s i so fn s c l co rt u m o ri n v a s i o na n dm e t a s t a s i s m e t h o d ：4 0c a s e so fn s c l c s p e c i m e n e sa n d2 0c a s e so fn o r m a ll u n g t i s s u e sw e r es u b j e c t e dt oi m m u n o h i s t o c h e m i c a ls t a i n i n g ( s p ) f o rs t a t 5 ， w w o xa n dc m y c t h en s c l ct i s s u e sw e r eo b t a i n e df r o m4 0p a t i e n t s u n d e r g o i n gl u n gc a n c e rr e s e c t i o na tt h ed e p a r t m e n to fs u r g e r y , t h e a f f i l i a t e dh o s p i t a lo fl u z h o um e d i c a lc o l l e g e n op a t i e n th a dr e c e i v e d c h e m o t h e r a p y o rr a d i a t i o n t h e r a p y b e f o r e s u r g e r y d e t a i l e d c l i n i c o p a t h o l o g i c a lp a r a m e t e r si n c l u d i n ga g e ，t u m o rd i a m e t e r , s t a g e ， l y m p hn o d em e t a s t a s i s ，a n dd e g r e eo fd i f f e r e n t i a t i o na r ea sf o l l o w i n g t h e r ew e r e2 9m a l e sa n d11f e m a l e s t h e i ra g e sr a n g e df r o m3 5t o s i t e sw e r eb l o c k e db yi n c u b a t i n gw i t hg o a ts e r u m t h es l i d e s w e r e i n c u b a t e dw i t h a p p r o p r i a t ep r i m a r ya n t i b o d y ( r a b b i t a n t i s t a t 5 p o l y c l o n a la n t i b o d y ，m o u s ea n t i - w w o xm o n o c l o n a la n t i b o d ya n d m o u s e a n t i c - m y cp r o t e i n ) w a i t2h o u r sa n dt h e nw a s ht h e mw i t hp b s t h es e c o n da n t i b o d yw i t hb i o t i nl a b e l i n gw e r ed r o p p e dt ot h es l i d e sa n d i n c u b a t e d w a i t15m i n u t e sa n dt h e nw a s ht h e mw i t hp b s a f t e rt h a t ，t h e s l i d e sw e r ei n c u b a t e dw i t hs a h r pf o r15m i n u t e sa n dt h e nw a s h e d w i t hp b s i m m u n o l o g i cr e a c t i o nw a s d e v e l o p e du s i n gd a b t h es l i d e s w e r ec o u n t e r s t a i n e dw i t h h e m a t o x y l i n ，m o u n t e da n dt h e no b s e r v e d t h r o u g hm i c r o s c o p e c o n s i d e rt h ec e l l sw h o s ec y t o p l a s mo rn u c l e u sh a d b r o w n i s hy e l l o wm a t t e ra sp o s i t i v ec e l l s t h es t a t 5 p o s i t i v es i g n a lw a s l o c a l i z e di nb o t hc y t o p l a s ma n dn u c l e u s ，b u tp r e d o m i n a n t l yi nc y t o p l a s m t h ew w o x p o s i t i v es i g n a lw a sm a i n l yi nn u c l e u sb u tc - m y cw a sm a i n l y i nc y t o p l a s m t h e yw e r ed i v i d e di n t o4l e v e l sa c c o r d i n gt op r o p o r t i o no f p o s i t i v e c e l l sa n dc o l o u r d e p t h o f e a c h s l i c e r e s u l t s ：( 1 ) t h e 5 o v e r e x p r e s s i o no fs t a t 5a n dc - m y ci nn s c l ca r ea p p a r e n t l yh i g h e r t h a nt h a ti nn o r m a ll u n gt i s s u e s ，a n dt h ee x p r e s s i o no fw w o xi n n s c l ci sa p p a r e n t l yl o w e rt h a nt h a ti nn o r m a ll u n gt i s s u e s ，t h i sh a sa s i g n i f i c a n c e ( p o 01 ) ( 2 ) t h ee x p r e s s i o no fs t a t 5a n dc - m y ca r e c o n c e m e dw i t hn s c l ch i s t o l o g i c a lt y p e s ，a n dt l l e yi na d e n o c a r c i n o m a w a ss i g n i f i c a n t l yh i g h e rt h a ni ns q u a m o u sc e l lc a r c i n o m a ( p 0 0 5 ) ；t h e e x p r e s s i o n o fw w o xg e n ew a s n tc o r r e l a t i o nw i t h h i s t o l o g i c a l t y p e ，a d e n o c a r c i n o m aa n dc e l ld i f f e r e n t i a t i o n ，w h i c hr e l a t e dt ow h e t h e r l y m p hn o d em e t a s t a s i ( p o 0 5 ) c o n c l u s i o n ：( 1 ) s t a t 5p r o t e i ne x p r e s s i o n i n c r e a s e di nn s c l cw a ss i g n i f i c a n t l yh i g h e rt h a nn o r m a ll u n gt i s s u e ， a n ds i m i l a r l y , i nn s c l c ，t h ee x p r e s s i o no fc m y cp r o t e i ni se l e v a t e d a n d s i g n i f i c a n t l yh i g h e rt h a nn o r m a ll u n gt i s s u e ，i n d i c a t i n go v e r - e x p r e s s i o no f s t a t 5p r o t e i na n dc - m y cp r o t e i n sm a yh a v ep a r t i c i p a t e di nn o n - s m a l l c e l ll u n gc a n c e rf o r m a t i o n w w o xp r o t e i ni nn s c l ct i s s u ew a sl o w , 6 a n di t se x p r e s s i o ni nt h ea b s e n c eo rr e d u c t i o no ft u m o ri n v a s i o nm a y b e r e l a t e d ( 2 ) s t a t 5 ，c m y ce x p r e s s i o na n dn o n - s m a l lc e l ll u n gc a n c e r h i s t o l o g i c a lt y p e s ，i na d e n o c a r c i n o m aw a s s i g n i f i c a n t l yh i g h e rt h a n s q u a m o u sc e l lc a r c i n o m a ，a n dp a t i e n ta g e ，t u m o rs i z e ，h i s t o l o g i c a lg r a d e ， l y m p hn o d em e t a s t a s i sa n dt n m s t a g eh a sn o t h i n gt od o ，i n d i c a t i n gt h a t t h e ym i g h to n l yp l a yar o l ei nt u m o r i g e n e s i s ，b u tn o tw i t ht u m o r p r o g r e s s i o n ，i n v a s i o na n dm e t a s t a s i s w w o xg e n ee x p r e s s i o na n d w h e t h e rt h el y m p hn o d em e t a s t a s i s ( p o 0 1 ) ，l y m p hn o d em e t a s t a s i so f l u n gc a n c e ri nt h et i s s u e sd e c r e a s e d ，l o s so rr e d u c t i o no fi t se x p r e s s i o n w i t ht u m o ra g g r e s s i v e n e s s ( 3 ) s t a t 5 p r o t e i ni nn s c l ct i s s u e sa n d c - m y cp r o t e i ne x p r e s s i o nw a sn o tc o r r e l a t e d ，i n d i c a t i n gc - m y c p a t h w a y i s n o ti n d u c e db ys t a t 5t h ef o r m a t i o na n dd e v e l o p m e n to ft u m o r s ( 4 ) s t a t 5p r o t e i na n dw w o x p r o t e i ne x p r e s s i o nw e r en e g a t i v e l yr e l a t e dt o t h eh i g h e re x p r e s s i o no fs t a t 5i nl u n gc a n c e r , w w o x e x p r e s s i o ni nt h e l e s so rw e r ea b s e n t ( 5 ) t h ee x p r e s s i o no fw w o xa n dc m y cw a sn o c o r r e l a t i o n ，t h e ym i g h tb ea f f e c t e db yt w od i f f e r e n t w a y s t ot h e o c c u r r e n c ea n d d e v e l o p m e n to fl u n gc a n c e r k e yw o r d s ：n s c l c ；s t a t 5 ；c m y c ；w w o x 7 - j 刖吾 原发性支气管癌( p r i m a r yb r o n c h i a lc a n c e r ) 起源于支气管粘膜或 腺体，简称肺癌( 1 u n gc a n c e r ) 。肺癌是目前世界上最常见的恶性肿瘤 之一，世界卫生组织国际癌症研究中心( i a r c 愚哪0 ) 报道，2 0 0 2 年全球肺癌男性发病率为3 5 5 7 1 0 万，发病9 7 万人，死亡率为3 1 2 1 0 万，死亡8 5 万人；女性发病率为1 2 1 1 0 万，发病3 9 万人，死亡率 为1 0 3 1 0 万，死亡3 3 万人n 2 1 。我国卫生部2 0 0 8 年4 月公布的第 三次全国居民死亡原因调查显示，在过去的3 0 年中，我国肺癌发病 率上升了4 6 5 ，已取代肝癌成为首位恶性肿瘤死亡原因。近年来， 虽然医学技术不断发展，但肺癌患者的5 年生存率并未得到明显改善 仅为1 0 - - 1 5 。肺癌患者的预后与诊断时的临床分期密切相关：0 期病人术后5 年生存率可达9 0 以上，i 期为6 0 ，i i 期病人则从 4 0 下降至5 以下。因此肺癌已经成为一个严重威胁人民健康和生命 的疾病。目前认为，肺癌的发生与吸烟、空气污染、职业性致癌因子、 饮食、遗传因素、基因改变等有关，但肺癌的发病机制仍不清楚。 肺癌发病率高，预后较差，已经引起了越来越多的重视。肺癌按 组织学分类，可以分为小细胞肺癌( s m a l lc e l ll u n gc a n c e l s c l c ) 和 非小细胞肺癌( n o n s m a l lc e l ll u n gc a n c e r , n s c l c ) 两种。小细胞肺癌 是肺癌中恶性程度最高的，早期就发生血行和淋巴转移。即使局部生 长的肿瘤，也显示侵袭性行为。对放疗和化疗均敏感。非小细胞肺癌 在肺癌中约占7 5 - - 8 0 ，包括鳞癌、腺癌、大细胞癌和腺鳞癌四 类。现在对非小细胞肺癌的治疗是以手术为主的综合治疗【3 1 。 、 信号转导与转录激活因子( s i g n a lt r a n s d u c e r sa n da c t i v a t o r so f t r a n s c r i p t i o n ，s t a t s ) 属于一个蛋白家族，是一类具有信号转导和 转录调节功能的蛋白质，参与多种细胞因子、激素和生长因子的信号 转导和转录调控，参与细胞的增殖和分化。在哺乳动物中有7 个成员， 分别是s t a t l 、s t a t 2 、s n 盯3 、s t a t 4 、s 丑盯5 a 、s t a t 5 b 、s t a t 6 ， 分别由不同的基因编码，大小约7 5 0 - - 9 0 0 个氨基酸。s t a t 蛋白的正 常表达与细胞的正常的生理功能相关，但其过度表达以及传导通路的 持续激活与多种疾病的发生密切相关，现在的研究表明，持续活化的 s t a t 蛋白与自身免疫性疾病( 如过敏性腹泻、类风湿性关节炎等) ， 感染性疾病如脓毒血症，以及一些肿瘤的发生有关【4 1 。其中，与肿瘤 研究较密切的s t a t s 家族成员中主要是s t a t l 、s t a t 3 以及s t a t 5 ， 研究认为s t a t l 是生长抑制因子和凋亡促进因子；s t a t 3 被认为是 一种原癌基因，它的持续激活与肿瘤的发生和发展关系密切，在人类 的恶性肿瘤( 包括前列腺癌、肺癌、脑肿瘤、乳腺癌以及鳞状上皮细 胞癌等) 中发现了高表达的s t a t 3 或者异常活化的s t a t 3 ，而s t a t 3 的抑制剂能减少细胞的增殖和促进细胞的凋亡【5 ；s t a t 5 被认为是细 胞增殖促进因子和凋亡抑制因子，它的异常激活和过度表达能诱发肿 瘤的形成，包括血液系统的恶性肿瘤( 如白血病、骨髓增生异常综合 征、淋巴瘤等) 和实体肿瘤( 如头颈部鳞状细胞癌、乳腺癌、前列腺 癌等) ，但在肺癌中的研究报道目前极少，仅有许学亮等的研究发现在 肺部肿瘤中存在着s t a t 5 表达增高 6 - 1 0 。 w w o x 基因是2 0 0 0 年由b e d n a r e k 1 1 】在染色体普通脆性位 ( c o m m o nf r i g a lo fs i t e s ，c f s s ) f r a l 6 d ( 1 6 q 2 3 - 3 2 q 2 4 1 ) 区域克隆 出的新基因。它与多种肿瘤的发生有关，如乳腺癌、前列腺癌、卵巢 癌及食管癌等，在这些肿瘤中存在频发的w w o x 基因6 8 外显子 的丢失，w w o x 蛋白表达的降低。位于染色体普通脆性位点的基因， 通常与肿瘤的生长抑制有关，如位于f r a 3 b 的脆性组氨酸三聚体基因 ( f r a g i l eh i s t i d i n et r i a d ，f h i t ) 在多种肿瘤中发现杂合性丢失、转录异 常及蛋白低表达n 刳。u w o x 基因与f h i t 基因非常相像，并且它的结 构及表达异常也与多种肿瘤密切相关。c h a n g 等【1 3 1 研究指出w w o x 蛋 白主要位于线粒体，在凋亡应激因素t n f 、十字胞碱、苍术苷等作用 下，w w o x 蛋白合成增加，第一个w w 结构域中的t r y 3 3 磷酸化，线 粒体通透性改变，w w o x 蛋白从线粒体转位至细胞核，上调促凋亡 因子p 5 3 ，下调抗凋亡因子b c l 一2 、b c l _ _ x l ，从而增强t n f 介导的细 胞毒性；同时增强t r a d d 介导的细胞死亡，因此认为w w o x 为新 的抑癌基因。 c m y c 是一种原癌基因，位于染色体8 q 2 4 上，在调节细胞程序 性死亡、细胞增殖、分化及细胞周期的进行中起着重要作用。c m y c 基因最先被确认的功能是参与了正常细胞的恶性转化，它可以通过染 色体易位、基因扩增或者基因突变被激活，组成性激活的c m y c 使成 纤维细胞获得永生化的能力并发生细胞周期失控。实验证实c m y c 基 因的表达在乳腺癌细胞的生长和乳腺癌进展中起着重要的作用。 c m y c 基因的扩增与肿瘤细胞的侵袭有关【1 4 】，c m y c 基因编码的蛋白 质是一种螺旋一环一螺旋亮氨酸的拉链蛋白，能与m a x 蛋白质家族 成员形成二聚体，调控靶基因的转录，属于反式作用因子或称转录因 子，在细胞的恶性转化、肿瘤发生过程中起到了关键的作用【1 5 】。许多 研究显示，在多种肿瘤中c m y c 蛋白及其m r n a 水平均过度表达 1 4 - 1 6 。c - m y c 过度表达可诱导细胞转化与肿瘤形成 16 1 。并且，c m y c 能抑制一些基因的转录，正好这些基因是促进细胞分化的基因，所以， 它还抑制细胞的分化。这些都表明了c m y c 与肿瘤关系非常密切。 综上所述，s t a t 5 、w w o x 、c m y c 与多种人类恶性肿瘤的关系 密切，本实验利用免疫组化方法研究它们在非小细胞肺癌中的表达及 其相互关系，从信号传导途径方向研究肺癌的发生、发展过程中的可 能存在的机制，对肺癌的临床诊断，寻求新的肺癌标志物及肺癌基因 治疗的新的靶点等有着重要意义。 材料与方法 1 标本来源 收集泸州医学院附属医院病理科2 0 0 8 年1 月- - 2 0 0 9 年1 2 月临床病 理资料完整的4 0 例非小细胞肺癌组织标本。其中，男性2 9 6 0 ，女性1 1 例；年龄为3 5 7 8 岁， 3 c m 者2 6 例；有淋巴结转移者1 8 6 4 ，无淋巴结转移 者2 2 6 0 ；i i i 期者2 4 例，i 期者1 6 6 0 ；高一中分化者3 0 6 0 ，低分 化者1 0 例。所有标本均经福尔马林固定，常规石蜡包埋。并取2 0 例正 常肺组织作对照。以上标本均为手术切除获得，术前未作任何放疗或 化疗。 2 主要实验试剂 2 1s t a t 5 兔抗人多克隆抗体由美国a b z o o m 公司提供。 2 2 鼠抗人w w o x 单克隆抗体及鼠抗人c m y c 单克隆抗体由美国 s a n t ac r u z 公司提供。 2 3 免疫组化染色试剂盒( s p 试剂盒) 和p o l y l l y s i nl 划l 京中杉金 桥生物有限公司提供。 2 4 d a b 显色剂由美 s i g m a 公司提供。 2 5p b s 磷酸盐缓冲液、l m o l l 氢氧化钠、浓盐酸、3 过氧化氢、 o 5 淡氨水、1 0 0 乙醇、二甲苯和封片剂等由泸州医学院附属医院 病理科实验室提供。 3 主要实验仪器 4 实验方法 4 1主要试剂的组成和配制 4 1 1 a a f ( 酒精、冰醋酸、甲醛) 液 ( 1 ) 配制比例 9 5 酒精 4 0 甲醛 冰醋酸 ( 2 ) 配制方法 8 0m l 15m l 5m l 作压力9 0 k p a 。 将9 5 的酒精8 0m l ，4 0 甲醛1 5m l ，冰醋酸5m l 混匀后即配 成a a f 液( 1 0 0 m 1 ) 。 4 1 2 m a y e r 苏木精溶液 ( 1 ) 配制比例 钾明矾 m a y e r 苏木精 枸橼酸 1 3 5 0g 1g 1g 碘酸纳 o 2g 水合氯醛 5 0g 蒸馏水 1 0 0m l ( 2 ) 配制方法： 先将1 9 苏木精加温溶于蒸馏水中，再加入5 0 9 碘酸纳和5 0 9 钾明 矾，促其速溶后加入枸橼酸l g 和水合氯醛5 0 9 ，继续搅拌溶化，使其 变成紫红色，用前过滤。 4 1 3o 0 1m p h 6 0 枸橼酸盐缓冲液( c i t r a t eb u f f e r ) ( 1 ) 储存液： a o 1 m 枸橼酸溶液：称取2 1 0 1 9 枸橼酸溶于1 0 0 0 m l 蒸馏水中。 b o 1 m 枸橼酸钠溶液：称取2 9 4 1 9 枸橼酸三钠溶于1 0 0 0 m l 蒸 馏水中。 ( 2 ) 工作液： 取9 m la 液和4 1 m lb 液加入4 5 0 m l 蒸馏水中，溶液p h 值应为 5 9 6 1 。 4 1 4p b s 磷酸盐缓冲液( o 0 1 m p h 7 2 - - 7 4 ) 取z l i 9 0 6 1p b s 溶于1 0 0 0 m l 的蒸馏水中，混匀，将p h 值调至7 2 74 。 4 1 54 多聚甲醛溶液 将4g 多聚甲醛d n a l o om l 蒸馏水，充分混匀即可。 4 2免疫组化s p 法染色步骤 4 2 1 将标本组织固定，脱水，透明，浸蜡后制成组织蜡块，常规4 1 a m 连续切片。 4 2 2 石蜡切片依次进入以下溶液，常规脱蜡至水。 ( 1 ) 二甲苯i8m i n ； ( 2 ) 二甲苯i i8m i r a ( 3 ) 二甲苯i i i8m i n ； ( 4 ) 无水乙醇8m i n ； ( 5 ) 9 5 乙醇8m i n ； ( 6 ) 7 5 乙醇8m i r a 4 2 3 蒸馏水冲洗，p b s 浸泡5 m i n 。 4 2 4 高压热修复抗原：将2 0 0 m l 的枸橼酸盐缓冲液( 工作液，p h 为6 o ) 注入不锈钢压力锅中加热至沸腾。切片置于修复架上，放入 锅内，使切片位于液面以下，盖锅压阀。当压力锅开始喷气时，计 时3 m i n ，然后将压力锅端离热源，取下气阀，打开锅盖，取出切片， 冷却至常温，蒸馏水冲洗后，o o1mp b s 磷酸盐缓冲液冲洗3m i n x 3 次。 4 2 5 用3 过氧化氢孵育1 0 m i n ，以消除内源性过氧化物酶的活性。 4 2 6 滴加封闭用正常山羊血清工作液，室温孵育1 5m i n 后甩去多 余液体，不水洗，用吸水纸除去样本边缘的液体。 4 2 7 滴加一抗( s t a t 5 兔抗人多克隆抗体的稀释度为l ：2 0 0 ；鼠 抗人w w o x 单克隆抗体的稀释度为1 - 1 0 0 ；鼠抗人c - m y c 单克隆抗 体的稀释度为1 ：1 0 0 ) ：3 7 ，孵育2h ，o 0 1mp b s 磷酸盐缓冲 液冲洗3m i n x 3 次。用p b s 代替一抗作为阴性对照。 4 2 8 滴加生物素标记二抗：3 7 c ，孵育1 5m i n ，o 0 1mp b s 磷酸 盐缓冲液冲洗3m i n x 3 次。 4 2 9 滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液( s a h r p ) ：3 7 。c ，孵育 1 5m i n ，o 0 1mp b s 磷酸盐缓冲液冲洗3m i n x 3 次。 4 2 1 0 d a b 显色：取1r n l 蒸馏水加入d a b 液各1 滴混合，室温下， 镜下控制显色时间2m i n ，蒸馏水洗涤5 次。 4 2 1 1 m a y e r 苏木精溶液轻度复染( 室温下4m i n ) ，酸化( 1 盐酸 酒精) ，蓝化( 0 5m l 氨水加入1 0 0m l 蒸馏水) ，梯度脱水( 7 5 酒 精、9 5 酒精、1 0 0 酒精) ，透明( 二甲苯i3m i n ，二甲苯i i3m i n ) ， 封片，显微镜观察。 4 3 注意事项： 4 3 1 石蜡切片脱蜡要彻底。 4 3 2 正常血清封闭之后、滴加第一抗体之前不能用p b s 缓冲液洗。 4 3 3 抗体稀释应遵循“现用现配”的原则；滴加抗体应完全覆盖组 织，避免引起组织边缘效应；孵育时切片应放置水平，否则会导致 抗体流失。 4 3 4 抗体孵育切片后冲洗要充分。 4 3 5d a b 显色：一定要在显微镜下观察，注意控制背景。 4 4 结果判断 以胞质或胞核内出现棕黄色颗粒、网织状或棕褐色团块为阳性 细胞。s t a t 5 蛋白的阳性表达信号主要位于细胞质，少数位于细胞核； w w o x 蛋白的阳性表达信号主要位于细胞质；c m y c 蛋白的阳性表达 划分 每张 浅进 6 则 为4 分。 ( 2 ) 根据着色强度进行评分：无显色为0 分，淡黄色为1 分，棕黄 色为2 分，棕褐色为3 分。 取( 1 ) ( 2 ) 项评分的和值作为染色结果的评判标准：o 分为阴性( ) ， 1 3 分为弱阳性( + ) ，4 5 分为阳性( + + ) ，6 7 分为强阳性( 卅) 表达。 4 5 统计分析 采用s p s s1 3 0 统计软件进行分析。等级资料的两样本比较用秩 和检验，双变量资料的等级相关性s p e a r m a n 等级相关作统计分析。 p o 0 5 有统计学意义，p o o1 有显著统计学意义。 结果 1 s t a t 5 蛋白、w w o x 蛋白和c m y c 蛋白在n s c l c 组织和正常肺组 织中的表达 1 1s t a t 5 蛋白在n s c l c 组织和正常肺组织中的表达情况 1 1 1s t a t 5 蛋白在n s c l c 组织中的表达 s t a t 5 蛋白在n s c l c 组织中的阳性表达信号主要位于细胞质， 少数位于细胞核，如图片1 2 。在4 0 例n s c l c 组织中，s t a t 5 蛋白 阳性表达3 7 例( 其中弱阳性表达6 例，阳性表达1 2 例，强阳性表达1 9 例) ，阴性表达3 例，阳性表达率为9 2 5 。 1 1 2s t a t 5 蛋白在正常肺组织中的表达 在2 0 侈t j 正常肺组织中，s t a t 5 蛋白阳性表达4 例( 其中弱阳性4 例， 阳性、强阳性无) ，阴性表达1 6 例，阳性表达率为2 0 。如图片3 。 1 1 3s t a t 5 蛋白在n s c l c 组织和正常肺组织中的表达比较 s t a t 5 蛋白在n s c l c 组织和正常肺组织中的表达比较，经过统 计学分析，差异有显著性( 尸 o 0 1 ) ，s t a t 5 在n s c l c 组织中的表达 水平明显高于正常肺组织，见表1 。 表1s t a t 5 蛋白在n s c l c 组织和正常肺组织中的表达 t a b l e1 e x p r e s s i o no fs t a t 5p r o t e i ni nn s c l c t i s s u ea n dn o r m a ll u n gt i s s u e 注：8 p 0 0 1v 8 正常肺组织 w w o x 蛋白在n s c l c 组织和正常肺组织中的表达 w w o x 蛋白在n s c l c 组织中的表达 w w o x 蛋白在n s c l c 组织中的阳性表达信号主要位于细胞质， 片4 5 。在4 0 例n s c l c 组织中，w w o x 蛋白阳性表达1 2 例( 其 阳性1 2 例，阳性、强阳性无) ，阴性表达2 8 例，阳性表达率为3 0 。 1 2 2w w o x 蛋白在正常肺组织中的表达 在2 0 例正常肺组织中，w w o x 蛋白阳性表达1 5 例( 其中弱阳性4 例，阳性7 例，强阳性4 ) ，阴性表达5 例，阳性表达率为7 5 。如图 片6o 1 2 3w w o x 蛋白在n s c l c 组织和正常肺组织中的表达比较 w w o x 蛋白在n s c l c 组织和正常肺组织中表达比较，经过统 计学分析，两者有显著性差异( 尸 o 0 1 ) ，它在n s c l c 组织中的表 达水平明显低于正常肺组织，见表2 。 表2w w o x 蛋白在n s c l c 组织和正常肺组织中的表达 t a b l e2 e x p r e s s i o no fw w o xp r o t e i ni nn s c l c t i s s u ea n dn o r m a ll u n gt i s s u e 注：4 p 0 0 1v s 正常肺组织 1 3 c m y c 蛋白在n s c l c 组织和正常肺组织中的表达情况 1 3 1 c m y c 蛋白在n s c l c 组织中的表达 c - m y c 蛋白在n s c l c 组织中的阳性表达信号主要位于细胞质，如 图片7 8 。在4 0 侈z j n s c l c 组织中，c - m y c 蛋白阳性表达3 6 例( 其中弱 l q 阳性表达1 2 例，阳性表达l o 侈j j ，强阳性表达1 4 例) ，阴性表达4 例， 阳性表达率为9 0 。 1 3 2 c m y c 蛋白在正常肺组织中的表达 在2 0 例正常肺组织中，c m y c 蛋白阳性表达3 例，阴性表达1 7 侈l j ， 阳性表达率为1 5 。如图片9 。 1 3 3 c m y c 蛋白在n s c l c 组织和正常肺组织中的表达比较 c m y c 蛋白在n s c l c 组织和正常