（作物遗传育种专业论文）油菜和拟南芥组织器官特异性启动子克隆和功能分析.pdf

华中农业大学硕士学位论文 摘要 本研究通过生物信息学方法获取了五个拟南芥特异性启动子信息，并通过同源 序列分析获取了油菜基因组序列中两个完整和一个部分序列启动子序列。将这些启 动子片段克隆并构建报告基因表达载体用于转化拟南芥进行功能验证，主要取得了 以下四个方面的研究结果： 1 拟南芥组织器官特异性启动子的克隆和功能验证 根据拟南芥的基因组序列设计相应的引物，得到了五个特异性的启动子，将启 动子与表达载体p b l l 2 1 连接后，通过农杆菌介导的遗传转化，获得了一定数量的转 化植株，经选择标记卡那霉素基因和目的基因的p c r 分子检测，确认阳性苗中己插 入目标基因，取t 1 代植株材料g u s 染色观察，发现分别在根、茎杆、叶片、角果、 种子中特异表达。 2 拟南芥组织器官特异性启动子驱动的c y e d 3 对植物生长的影响 为了解特异性启动子驱动细胞周期基因对植物生长的影响，构建了3 个特异性 启动子驱动c y c d 3 的表达载体，转化野生型拟南芥得到一批阳性苗，通过对t 1 代植 株的观察，发现其中有两个特异性启动子使植物体的生长发育发生的明显的变化， 主要体现在生长时期的延迟。另外根特异性启动子驱动下表达c y c d 3 后引起植株根 部变小，生长滞后。 3 油菜叶片特异性启动子克隆和功能验证 在油菜基因组中得到两条完整的启动子片段，通过构建表达载体转化得到的阳 性苗验证其功能，结果发现油菜中的同源序列与拟南芥启动子表达相一致，在相关 叶片中有相应的表达。 油菜和拟南芥组织器官特异性启动子克隆和功能分析 4 拟南芥茎杆特异启动子油菜同源片段的侧翼序列克隆 根据对拟南芥茎杆特异性启动子序列比对油菜基因组数据库的结果，克隆得到 一个1 0 7 3 b p 的油菜基因组序列片段，利用加酶切接头的方法向3 端进行侧翼序列扩 增得到3 4 k b 的序列。通过与拟南芥序列对比分析发现含有两个同源性较高的区间， 分别是靠近启动子上游a 区的7 3 5 b p ( 同源性7 4 ) 和靠近下游b 区的1 3 3 b p ( 同 源性达到6 8 ) 。 关键词：油菜；拟南芥；特异性启动子；周期基因；遗传转化；g u s 华中农业大学硕士学位论文 a b s t r a c t i nt h i sr e s e a r c h ，w eo b t a i nf i v es p e c i f i cp r o m o t e r si n f o r m a t i o no na r a b i d o p s i s t h a l i a n ab yb i o i n f o r m a t i c st o o l ，a n df i n dt w oi n t e g r a t e d p r o m o t e r sa n do n ep a r t i a l p r o m o t e ri nb r a s s i c an a p u sg e n o m eb yh o m o l o g o u sa n a l y s i s b a s e do nt h ea n a l y s i s ，w e c l o n e dt h ep r o m o t e r sa n dc o n s t r u c t e de x p r e s s i o nv e c t o r si n c l u d i n gr e p o r t e rg e n ef o r p r o m o t e rt e s tt h r o u g ht r a n s f o r m a t i o n t h em a i nr e s u l t sa r ea sf o l l o w s 1 c l o n i n ga n df u n c t i o n a la n a l y s i so ft i s s u ea n do r g a ns p e c i f i cp r o m o t e r sf r o m a c c o r d i n gt ot h ea r a b i d o p s i st h a l i a n ag e n o m i cs e q u e n c e ，w ed e s i g n e dp r i m e r sa n d a c q u i r e df i v es p e c i f i cp r o m o t e r s ，t h e yw e r ec o n s t r u c t e db yv e c t o rp b i 121 ，t h r o u g ht h e a g r o b a c t e r i u m m e d i a t e dt r a n s f o r m a t i o ns y s t e m ，t r a n s g e n i cp l a n t sw e r eg a i n e d ，a n dt h et o g e n e r a t i o nw e r ec o n f i r m e db yp c r o fs e l e c t i v em a r k e rg e n en p ti ia n dc a n d i d a t ed n a f r a g m e n t g u ss t a i n i n gw a sc a r r i e dt h r o u g ho nt lg e n e r a t i o nt oa n a l y z ep r o m o t e r s f u n c t i o n t h er e p o r t e rg e n ew a si d e n t i f i e do n l ye x p r e s s e ds p e c i f i c a l l yi nr o o t ，s t e m ，l e a f , s i l i q u ea n ds e e d ，r e s p e c t i v e l y 2 e f f e c to fc y c d 3d r i v e nb yt i s s u ea n do r g a ns p e c i f i cp r o m o t e r sf r o ma r a b i d o p s i s t h a l i a n ao np l a n td e v e l o p m e n t t ou n d e r s t a n dt h ee f f e c t so fc y e d 3u n d e rt h ec o n t r o lo fs p e c i f i cp r o m o t e r so np l a n t d e v e l o p m e n t ，w ep r e p a r e dt h r e ee x p r e s s i o nv e c t o r s i nt r a n s g e n i cp l a n t st r a n s f o r m e dw i t h t h ec o n s t r u c t s ，t w oo ft h e mw e r eo b s e r v e dt oh a v eo b v i o u sc h a n g e si np l a n td e v e l o p m e n t ， m a i n l yb e h a v i n gad e l a y e dg r o w t h f u r t h e r m o r e ，e x p r e s s i o no fc y c d 3u n d e rt h ec o n t r o l o fr o o ts p e c i f i cp r o m o t e rr e s u l t e di nr o o tb u l kd i m i n i s h e da n dg r o w t hl a g g e d i i i 油菜和拟南芥组织器官特异性启动子克降和功能分析 3 c l o n i n ga n df u n c t i o n a lt e s to fl e a fs p e c i f i cp r o m o t e rf r o mb r a s s i c an a p u s w ei d e n t i f i e dt w oi n t e g r a t e dp r o m o t e r si nb r a s s i c an a p u sg e n o m eb yb l a s tt o o la n d t r a n s g e n i cp l a n t sw e r ep r o d u c e db ya g r o b a c t e r i u m m e d i a t e dt r a n s f o r m a t i o n s u b s e q u e n t f u n c t i o n a lt e s t ss h o w e dt h a tt h e ye x p r e s s e di nt h el e a f , s i m i l a rt ol e a fs p e c i f i cp r o m o t e r f r o ma r a b i d o p s & t h a l i a n a 4 c l o n i n go ff l a n k i n gs e q u e n c eo fb r a s s i c an a p u sh o m o l o g o u st os t e ms p e c i f i c p r o m o t e rf r o ma r a b i d o p s i st h a l i a n a a f r a g m e n to f10 7 3 b ph o m o l o g o u st oa r a b i d o p s i ss t e ms p e c i f i cp r o m o t e rw a s a c q u i r e di nb r a s s i c an a p u sg e n o m e a n df u r t h e r m o r ef l a n k i n gs e q u e n c e so f3 4 k bw e r e i s o l a t e da n dc o m p a r e dw i t hs t e ms p e c i f i cp r o m o t e rf r o ma r a b i d o p s i st h a l i a n a ，a n dt w o h i g h l yh o m o l o g o u sr e g i o n sw e r ei d e n t i f i e dl o c a t e di nr e g i o na ，w h i c hc o n t a i n s7 35 b p a n d t h eh o m o l o g o u sp r o p o r t i o nt o7 4 ，a n dr e g i o nb ，w h i c hc o n t a i n s13 3 b pa n dt o6 8 ， r e s p e c t i v e l y k e yw o r d s ：b r a s s i c an a p u s ；a r a b i d o p s i st h a l i a n a ；s p e c i f i cp r o m o t e r ；c y c l eg e n e ； g e n e t i ct r a n s f o r m a t i o n ；g u s i v 华中农业大学硕士学位论文 a m p a t b p b n c a t c t 八b d d h 2 0 d n a d n t p s e b e d t a g e n t g f p g u s h k a n k b l l b m g m m m l m m m 0 1 m s n g n p t i i 缩略语表 a m p i c i l l i n a r a b i d o p s i st h a l i a n a b a s ep a i r b r a s s i c an a p u s c h l o r a r n p h e n i c o la c e t y lt r a n s f e r a s e h e x a d e y l t r i m e t h y la m m o m u m b r o m i d e d o u b l ed i s t i l l e dw a t e r d e o x y r i b o n u c l e i ca c i d d e o x y r i b o n u c l e o s i d et r i p h o s p h a t e e t h d i u mb r o m i d e d i d o d i u me t h y l e n e d i a m i n e t e t r a - a c e t a t e g e n t a m i c i n g r e e nf l u o r e s c e n tp r o t e i n 1 3 - g l u c u r o n o d a s e h o u r k a n a m y c i n k i l o b a s e l i t r e l u d ab r o t h m i l l i g r a m m i n u t e m i l l i l i t r e m i l l i m e t e r m o l a r m u r a s h i g ea n ds k o o gs t o c k n a n o g r a r n n e o m y c i np h o s p h o t r a n s f e r a s e v 氨苄青霉素 拟南芥 碱基对 甘蓝型油菜 氯霉素乙酰基转移酶 十六烷基三甲基溴化铵 双蒸水 脱氧核糖核酸 脱氧核糖核苷三磷酸( 4 种) 溴化乙啶 乙二胺四乙酸 庆大霉素 绿色荧光蛋白 p 葡萄糖醛酸酶 小时 卡那霉素 千碱基 升 l b 培养基 毫克 分钟 毫升 毫米 摩尔 m s 培养基 纳克 新霉素磷酸转移酶 油菜和拟南芥组织器官特异性启动子克降和功能分析 o i 疆 p c r r n a r n a s e r p m s d s s e c t a q t a e 州s 肛g 山 o p e nr e a d i n gf r a m e p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n r i b o n u c l e i ca c i d r i b o n u c l e a s e r e v o l u t i o n sp e rm i n u t e s o d i u md o d e c y ls u l f a t e s e c o n d t h e r m u sa q u a t i c u sd n a p o l y m e r a s e t r i s a c e t i ca c i de l e t r o p h o r e s i sb u f f e r 耐s ( h y d r o x y m e t h y l ) a m i n o m e t h a n e m i c r o g r a m m i c r o l i t r e v i 开放阅读框 聚合酶链式反应 核糖核酸 核糖核酸酶 每分钟转速 十二烷基磺酸钠 秒 嗜热水生菌d n a 聚合酶 乙酸电泳缓冲液 三羟基甲基氨基甲烷 微克 微升 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文 是否保密否 如需保密，解密时间年 月 日 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书 而使用过的材料，指导教师对此进行了审定。与我一同工作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意。 研究生始；冉乡帆砂p 7 年占月8 日 学位论文使用授权书 本人完全了解华中农业大学关于保存、使用学位论文的规定，即学生必须按照学 校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印刷版和电子版， 并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位 论文。本人同意华中农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全 部或部分内容，同时本人保留在其他媒体发表论文的权力。 注：保密学位论文( 即涉及技术秘密、商业秘密或申请专利等潜在需要提交保密的论 文) 在解密后适用于本授权书。 学位论文作者签名：搿乓乡锄签名：浮1 、硐 蚴蚍。7 年9 日蛳期：文吵年号月弓日 注：请将本表直接装订在学位论文的扉页和目录之间 华中农业大学硕士学位论文 1 月u 吾 1 1 植物启动子概述 1 1 1 植物启动子的分类和特点 启动子作为基因时空表达的重要调节元件，己成为分子生物学研究的前沿和热 点。高等植物基因的转录起始位点一般位于翻译起始密码子( a t g ) 上游4 0 b p 7 0 b p 处，它是r n a 聚合酶识别并与之结合的行使基因转录功能的一段d n a 序列，一般 位于基因上游，含有依赖d n a 的r n a 聚合酶结合位点t a t a b o x ( 转录起始位点上 游约一3 0 b p 处) 和识别位点c a a t - b o x ( 转录起始位点上游约一8 0 b p 处) ，另外还含有g c 岛( 转录起始位点上游9 0 b p 处) 一般启动子上游元件，作为重要的顺式作用元件，它 决定转录的方向及效率( 路静等，2 0 0 4 ；李杰等，2 0 0 6 ) 。 启动子分为可分为组成型、组织器官特异型、诱导型三大类( 路静等，2 0 0 4 ) 。 特异性启动子可进一步分为根、茎、叶、花、种子等组织器官特异性启动子，每一 类型的特异性启动子都具有区别于其他类型的特殊作用元件。 在拟南芥根中特异表达的p y k l o 基因编码的黑芥子酶( m y r o s i n a s e ) ，其启动子中 有a c g t 、c a n n t g 、g a t a 等器官特异性的顺式作用元件，可与特异性的转录因 子相结合m i t zie ta 1 ，2 0 0 7 ) 。在拟南芥茎中特异表达的n a c 功能域转录因子s n d l ， 其启动子中存在相关的特异性结合模体( z h o n g e ta 1 ，2 0 0 6 ) 。在拟南芥叶片中特异表 达与衰老组织相关的半光氨酸蛋白酶s a g l 2 ，其启动子中包含两个与启动子活性有 关区域，缺失分析表明- 7 4 7 b p - 5 7 0 b p 与特异性表达相关，1 3 4 5 b p l l8 1 b p 含有一 个增强子m o ha n d a m a s i n o ，1 9 9 9 ) 。在种子特异性启动子中则广泛存在一个保守的 r y 基序( 刘晓娜等，2 0 0 7 ) ，其保守序列为c a t g c a t g ，它对于种子特异性基因的 表达有重要作用，另外还包含高度保守的e b o x 和g b o x ，这些顺式调节因子的突变 会造成种子特异性启动子的活性大部分丧失( c h a n d r a s e k h a r a ne ta 1 。2 0 0 3 ) ，此类特 异性的启动子在油料作物和谷物中的研究已经很深入，陆续还发现7 b - b o x 、e - b o x 和g - b o x ，在调节种子特异表达发挥重要作用。 研究者将研究中发现的各种信息整理归纳，逐渐发展形成了各种各具特色的相 关的数据库。表1 罗列了部分用于分析启动子顺式作用元件的数据库。目前，这些数 据库所包含的各种信息并不十分完整，在命名上也缺乏统一的规范和格式，导致在 使用不同软件分析启动子时的结果出现差异。因此，完善这项工作是非常有意义的。 油菜和拟南芥组织器官特异性启动子克隆和功能分析 1 1 2 植物启动子的研究方法及进展 目前启动子克隆大致可以分以下种： 第一种是p c r 技术，是建立在对基因序列十分清楚的基础上的，通过设计特异 性的引物p c r 扩增就可以得到目的基因的启动子片段( 李杰等，2 0 0 6 ) ，对于未知序 列则可采用环状p c r 、接头p c r 和t a i l p c r 技术( 聂丽娜等，2 0 0 8 ) 。 第二种是利用基因组文库筛选启动子，首先要建立一个比较大的基因组文库， 然后用已知道序列部分做探针与文库杂交，筛选目的片段。 第三种是利用启动子探针质粒载体筛选启动子，首先要构建含有相应的报告基 因但是不含启动子的载体系统，然后与酶切的d n a 片段重组载体，转化宿主细胞观 察报告基因的表达情况来验证d n a 片段是否具有启动子功能。该方法可以大量筛选 具有启动子活性的未知片段，但不能精确获得某一特定启动子。 第四种是利用启动子捕获得到和验证启动子，通过构建不含启动子片段的报告 系统，如果插入到内源基因的外显子中且与之方向一致，可由报告基因的表达情况 来判断是否有启动子活性，从而分离和克隆插入位点旁的启动子序列。 而研究方法主要有两种，其一为实验方法，另外可用计算机预测( 于翠梅等， 2 0 0 6 ) 。 实验法即构建启动子报告基因系统，常用的报告基因为g u s 和g f p ，另外还有 c a t ( c h l o r a m p h e n i c o la c e t y lt r a n s f e r a s e ) ，前两个由于在操作和使用中简便易行而被广 泛应用；最近有学者实验证明g f p 比g u s 更适合用于做启动子的表达分析，原因在 于实验证明g f p 比g u s 作为报告基因更加灵敏( k a v i t aa n db u r m a , 2 0 0 8 ) 。 此类实验的方法具体又可详细分成以下几种( 聂丽娜等，2 0 0 8 ) ： 一缺失分析。这种技术目前采用的比较广泛，将启动子片段通过5 端缺失、3 端缺失以及中间缺失与报告基因连接，通过报告基因的表达情况确认各种顺式作用 元件在启动子中具体所在的位置。 二点突变。通过人为地使启动子片段产生定点突变，建立报告基因系统，主 要用于验证启动子中特异性的各种模体在特异性表达中的作用。 三酵母单杂交技术。用于该系统的酵母g a l 4 蛋白是一种典型的转录因子，含 有个d n a 特异性的结合结构域和一个转录激活结构域，这两个功能域独立地发挥 作用，将d n a 结合结构域替换为文库中蛋白的编码基因，当表达的蛋白与与目的基 2 华中农业大学硕士学位论文 因相互作用，转录激活结构域激活r n a 聚合酶，下游的报告基因启动转录。此方法 可以大量筛选分析与启动子相关模体结合的蛋白质。 四凝胶阻滞。把蛋白加入到末端标记的启动子片段中，用电泳对混合物进行 分离，若特异的蛋白结合至u d n a 上，则在电泳中由于受到阻力大、速度减缓而分离 出来，然后用放射自显影使d n a 显现出来，可用于验证与启动子中顺式作用元件互 相结合的蛋白质。 五d n a s ei 足迹实验。启动子片段结合蛋白质后，保护结合部位免受d n a s ei 的破坏，那么蛋白质就会在d n a 片段上留下了相关的足迹，电泳凝胶经放射性自显 影，图片上就会显示由于受到蛋白质结合保护而没有放射性的标记条带。此方法不 仅可以寻找与特异的启动子中相关模体结合的蛋白质，而且可以确定具体结合所在 的碱基部位。 随着基因芯片( g e n ec h i p ) 技术的产生，在c h i p ( 免疫共沉淀) 技术基础上，结 合g e n ec h i p 技术，又发展出新的c h i p c h i p 技术，分析蛋白质和d n a 的相互作用。 另外一种计算机预测则依靠网络资源和各种软件的使用。该方法使用日益广泛， 已成为研究启动子的一个重要技术手段。预测启动子及其识别调控元件的数据库网 站和软件有多种，如在线免费提供的分析软件有s o i t b e r r y 、b c m 搜索引擎等。选择 合适且完整的数据库进行查询，有助于研究效率的提高。但是我们不得不面对的一 个问题是计算机在预测中的不可靠性，每种软件都有一定的“偏好性，得到的结果 只是一个初步的判断依据，需要综合分析，因此开发完善计算机预测是启动子的研 究是一项极具开发潜力的领域，列举一些关于启动子预测的在线软件和相关数据库 ( 表1 ) ，单机版的软件有p r i m e r5 0 等可以使用。 随着研究的深入，研究者的工作重心已经从分析启动子内部序列和相关模体功 能转移到人工设计序列替换启动子序列，以此来得到表达、调控水平更高的人工合 成启动子，在生物体内实现对目的基因所期望的相关调控，达到各种特异性组织器 官的表达，也可以由此做为研究各种顺式作用元件和反式作用元件的方法。 3 油菜和拟南芥组织器官特异性启动子克隆和功能分析 表1 常用网络版启动子分析软件工具 t a b l e1 o n l i n et o o l sf o rp r o m o t e ra n a l y s i s 4 华中农业大学硕士学位论文 1 2 植物细胞周期基因简介 1 2 1 植物细胞周期基因的类型 植物细胞分裂是其生长发育过程中重要的生命体征，并且是一个精密调控的过 程，其中g i 期到s 期和g 2 期到m 期是两个关键转换点。 研究者逐渐发现其中最重要的是周期蛋白( c y c l i n s ) 和依赖于周期蛋白激酶 ( c y c l i n d e p e n d e n tl 【i n a s e s ，c d k ) ，其他还有i c k ( c y c l i n d e p e n d e n tk i n a s ei n h i b i t o r ) 、 e 2 f d p ( a d e n o v i r u s e 2 p r o m o t e r - b i n d i n g p r o t e i n d i m e r i z a t i o n p r o t e i n s ) 、 r b ( r e t i n o b l a s t o m a r e l a t e dp r o t e i n ) 等因子。 细胞周期蛋白是含有同源序列的一类蛋白，作为依赖于周期蛋白激酶的调节亚 单位，单独存在是不起作用的，只有与相应的激酶形成复合体，才能发挥调节植物 生长的作用。在拟南芥中，周期蛋白被分为4 类( a 类、b 类、d 类、h 类) ，同时又 细分成不同的小类，a 类含3 个小类( a i a 3 ) 共1 0 个、b 类含3 个小类( b 1 b 3 ) 共9 个、d 类含7 个小类( d 1 d 3 ) 共1 0 个；依赖于周期蛋白激酶分成6 类，分别是c d k a 、 c d k b 、c d k c 、c d k d 、c d k e 、c d k f ，其中c d k b 细分成2 个小类共4 个、c d k c 细分成2 个小类共2 个、c d k d 细分成3 个小类共3 个( v a n d e p o e l ee ta 1 ，2 0 0 2 ) 。 1 2 2 细胞周期基因c y c d 3 的特点 研究发现，d 型周期蛋白参与调节细胞周期的g 1 期和g l s 的转折点，且c y c d 3 的r b 结合序列为l x c x e ( m e i j e ra n dm u r r a y , 2 0 0 0 3 m e n g e se ta 1 ，2 0 0 6 ) 。该细胞周期 蛋白受蔗糖和细胞分裂素和油菜类固醇诱导( r i o u k h a m l i c h ie ta 1 ，1 9 9 93m e i j e r a n d m u r r a y , 2 0 0 0 ；b o n i o t t ie ta 1 ，2 0 0 2 ) ，并且影响发育中的侧向器官的细胞数量( 如叶 片) ，但对器官整体大小并不影响，通过介导细胞分裂素作用于顶端组织的生长发育 ( d e w i t t ee ta 1 ，2 0 0 7 ) 。 5 油菜和拟南芥组织器官特异性启动子克隆和功能分析 1 3 本研究的目的意义 本研究利用拟南芥启动子数据库等有关生物信息学知识，克隆并分析五个组织 特异性表达启动子，在拟南芥中验证其功能，而后b l a s t 得到同源的油菜特异性启动 子的序列信息，转化拟南芥进行功能验证。通过探究特异性启动子基因结构的信息， 研究特异性启动子内部调节控制元件以及在高等植物的基因调控中发挥的作用，从 而可以为功能基因组学和进一步利用特异性启动子进行基因操作奠定基础，同时也 提供了一种克隆油菜特异性启动子的思路。 目前油菜中专门做特异性启动子研究工作的报导文章尚少，而且大部分还受专 利的保护，因此，分离和研究油菜几类特异性启动子对应用有关基因进行油菜遗传 改良具有重要作用和应用价值。 1 4 本研究使用的技术路线 所用技术路线可用以下流程图概述： 获得拟南芥特异性启动子序列信息获得油菜中特异性启动子序列信息 山山 设计引物、p c r 扩增设计引物、p c r 扩增 山j ， 测序搜索油菜中同源序列测序 山一山 连接表达载体连接表达载体 j ，山 转化拟南芥转化拟南芥 山山 表达分析表达分析 ( 第一阶段)( 第二阶段) 启动子序列信息汇总整理 6 华中农业大学硕士学位论文 2 材料与方法 2 1 实验材料 2 1 1 植物材料 本研究供试植物材料为野生型拟南芥( a r a b i d o p s i st h a l i a n a ) ：哥伦比亚( c d 觑m 6 f 口) 生态型，油菜为w e s t a r 品种。 2 1 2 主要试剂 d n a 片段回收试剂盒t m i q 1 0 柱式，购自上海生工；t 载体系统p m d l 8 t 以及高保真酶( e x - t a q ) 均购自t a k a r a 公司；普通t a q 酶、限制性内切酶、x g l u c 购 自f e r m e n t a s 公司；快速植物基因组d n a 提取系统( 非离心柱型) 购自t i a n g e n ；胰 蛋白胨( t r y p t o n ) 和酵母粉( y e a s te x t r a c t ) 购自o x i o d 公司，琼脂粉购自s i g m a ；琼脂糖 由西班牙b i o w e s t 生产；m s 粉剂由d u c h e f a 公司生产；引物由上海捷瑞和上海奥科 合成；测序由上海华大完成。其他试剂均为国产分析纯产品。 2 1 3p c r 反应的引物 在查阅相关报导拟南芥特异性启动子或者特异表达基因的文献后，筛选得到拟 南芥根、茎杆、角果、种子、叶片五个特异性启动子的相关信息。根据网站 ( h t t p ：w w w a r a b i d o p s i s o r e , ) 公布的序列设计的相关引物及实验室部分公用引物信 息，具体见表2 。 表2 引物信息 t a b l e2p r i m e ri n f o r m a t i o n 7 油菜和拟南芥组织器官特异性启动予克隆和功能分析 y m l l y m l 2 c y e d 3 检测 y m 8 8 8 g u s 检测 华中农业大学硕士学位论文 2 1 4 载体和菌株 本研究所用t 载体为t a k a r a 公司生产的p m d i8 tv e c t o r 试剂盒，表达载体为 p b l l 2 1 ( 图1 ) ：大肠杆菌菌株为d h 5 a ，农杆菌菌株为g v 3 1 0 1 。 图1 p b l l 2 1 载体结构图 ( 来源：h t t p ：w w w s u s a n y e h t e u e d u t w c o m t r u c t 2 0 2 0 p b l l 2 1 p d f ) f i g 1 t h es t r u c t u r em a po fp b l l 2 1v e c t o r ( s o u r c e ：h t t p ：w w w s u s a n y e h t e u e d u t w c o m t r u e t 2 0 2 0 p b l l 2 1 p d f ) 9 油菜和拟南芥组织器官特异性启动子克隆和功能分析 2 2 实验方法 2 2 1 拟南芥基因组d n a 的提取 参照m u r r a r y 和t h o m p s o n ( 1 9 8 0 ) c t a b 法提取基因组d n a ，步骤如下： ( 1 ) 取幼嫩拟南芥叶片放冰上取回。 ( 2 ) 称2 0 0 m g 样品在研钵中加7 0 0 i x lc t a b 研磨，将液体移至2 m l 离心管中。 ( 3 ) 样品放在6 5 水浴6 0 m i n ，每1 5 m i n 摇一次。 ( 4 ) 室温放置1 0 m i n 冷却，加7 0 0 i x l 氯仿( 2 4 ：1 ) ，摇1 0 r a i n 。 ( 5 ) 室温，1 20 0 0 r p m 条件下离心1 2 m i n 。 ( 6 ) 取上清6 0 0 p 1 到新2 m l 离心管中，加7 0 i x l 的3 m o l l n a a c ，再加l m l 冰冻无 水乙醇，轻轻上下颠倒5 - 6 次，放置3 0 r a i n 。 ( 7 ) 室温，1 00 0 0 r p m 条件下离心5 r a i n 。 ( 8 ) 加l m l7 5 乙醇上下颠倒数次，离心倒上清，重复一次，倒扣放置2 h 。 ( 9 ) 加1 0 0 “1t e ，2 0 冰箱保存。 2 2 2 拟南芥组织器官特异性启动子片段的克隆及相关载体构建 2 2 2 1p c r 反应体系及其程序 ( 1 ) p c r 反应体系( 2 0 i x l ) 如下： p c rb u f f e r 2 5 mm o l lm 9 2 + 2mm o l l d n t p s 5pm o l lf o r w a r d p r i m e r 5pm o l lr e v e r s ep r i m e r t a qd n ap o l y m e r a s e d n at e m p l a t e ( 5 0 n g i x l ) d d h 2 0 2 0i x l 1 5i x l 1 5 山 1 0 “l i 0 “l 0 1 5 i x l 1 5 “1 补至2 0 i x l ( 2 ) p c r 反应程序 9 4 c 变性5r a i n ；9 4 c3 0s e c ，x c3 0s e c ，7 2 c2m i n ，3 0 个循环：7 2 c1 0m i n ； 2 5 c3 0 m i n 。各目的片段最佳退火温度不同，x 表示退火温度，详见表3 。 】o 华中农业大学硕士学位论文 表3 拟南芥特异性启动子信息 t a b l e3 s p e c i f i cp r o m o t e r si n f o r m a t i o nf r o ma r a b i d o p s i st h a l i a n a 2 2 2 2p c r 产物的回收纯化 采用上海生工u n i q 1 0 柱式d n a 回收试剂盒，具体操作参照说明过程如下： ( 1 ) 浓度为0 8 琼脂糖凝胶电泳分离d n a 片段。 ( 2 ) 在紫外灯下小心迅速切取含目的d n a 片段凝胶。 ( 3 ) 称重，按4 0 0 p 1 1 0 0 m g 琼脂糖比例加入b i n d i n gb u f f e ri i ，置于6 0 c 水浴l o m i n , 使胶彻底融化。加热融胶时，每2 m i n 混匀一次。 ( 4 ) 将混合液移到2 m l 收集管内的u n i q 一1 0 柱中，室温放置2r a i n 。80 0 0 r p m 离 心l m i n 。 ( 5 ) 去离心液，加5 0 0 1 1 1w a s h s o l u t i o n ，8o o o r p m 离心l m i n 。 ( 6 ) 重复步骤5 一次。 ( 7 ) 去离心液，将u - n i q 1 0 柱放入一个无菌新的1 5 m l 离心管中，在柱子膜中央 加2 0 1 1 1 无菌双蒸水，室温2 m i n 。 ( 8 ) 1 20 0 0r p m 离心l m i n ，收集离心液，置于一2 0 c 冰箱备用。 2 2 2 3 目的片段与t 载体的连接、转化及鉴定 1 ) 连接 使用t a k a r ap m d l 8 tv e c t o r 连接试剂盒，操作步骤按试剂盒说明书进行。 ( 1 ) 连接反应体系5 p l ，反应混合液包含： 目的片断 2 0 1 a l b u f f e r 2 5 山 p m d l8 一t 载体0 5 1 1 1 油菜和拟南芥组织器官特异性启动子克降和功能分析 ( 2 ) 连接反应 1 6 反应1 2 h 后，置于4 。c 冰箱。 2 ) 连接产物转化大肠杆菌 参照分子克隆实验指南( 第三版) ( j 萨姆布鲁克和d w 拉塞尔，2 0 0 2 ) ， 采用c a c l 2 热击转化的方法，略修改具体操作步骤如下： ( 1 ) 将5 9 l 连接产物吸打入热击感受态细胞，冰上3 0 r a i n 。 ( 2 ) 4 2 水浴热击9 0s e c 。 ( 3 ) 放回冰上5 m i n 。 ( 4 ) 加4 0 0 9 ll b ，3 7 c 摇床l h ，1 5 0 r p m 。 ( 5 ) 涂于含1 0 0 9 9 m la m p 的皿中，3 7 。c 烘箱过夜。 3 ) 菌斑检测 挑斑于l o f t ln a o h ( o 0 2m o l l ) 中，取1 5 9 i 做模板，以引物m 1 3f r 做p c r 检测，p c r 反应体系及其程序参见2 2 2 1 ，退火温度为5 8 。c ，2 6 个循环。 4 ) 质粒d n a 的提取、检测 采用碱裂解法提取质粒d n a ，参照分子克隆实验指南( 第三版) ( j 萨姆布鲁 克和d w 拉塞尔，2 0 0 2 ) ，略修改具体过程如下： ( 1 ) 在无菌条件下，选取阳性单克隆菌落，于含有1 0 0 “g m la m pl b 培养基中， 3 7 摇床1 0 h ，2 0 0 r p m 。 ( 2 ) 取培养菌液1 5 m l 于灭菌2 m l 离心管中，1 20 0 0 r p m 离心2 m i n ，去上清。 ( 3 ) 加入1 5 0 1 t l 碱裂解液i ，用旋涡震荡器充分混匀。 ( 4 ) 加入3 0 0 “1 碱裂解液i i ，冰上1 0 r a i n 。 ( 5 ) 加入2 2 5 1 d 碱裂解液i i i ，冰上5 m i n ，1 20 0 0 r p m 离心5 m i n 。 ( 6 ) 取上清至1 5 m l 离心管中，加一倍体积氯仿，混匀后，1 20 0 0 r p m 离心5 m i n 。 ( 7 ) 取上清至1 5 m l 离心管中，加一倍体积异丙醇，2 0 * c 冰箱半小时。 ( 8 ) 室温1 30 0 0 r p m 离心1 0 m i n ，弃上清加7 5 7 , 醇洗涤，风干后加3 0 i t lt e 溶解 d n a ，存2 0 冰箱备用。 提取质粒后用引物m 1 3f r 及特异性引物p c r 鉴定，阳性单克隆送样测序。 1 2 华中农业大学硕士学位论文 2 2 2 4 启动子与表达载体p b l l 2 1 的连接 经测序验证得到正确单克隆后，以限制性内切酶双酶切t 载体和表达载体，回收 插入片段和p b l l 2 1 大片段做连接。 1 1 酶切体系 t - v e c t o r p b i1 2 1 载体 1 0 i _ t l 3 0 9 l t a n g ob u f f e r6 0 山6 o 山 酶i ( h i n di i i ) 0 9 9 l 0 9 9 l 酶i i ( b a m hi ) 0 9 9 l 0 9 1 d d d h 2 0 补至6 0 1 1 3 7 水浴3 h 。 2 ) 目的片段的回收 双酶切3 h 后取5 p l 样在t a e 缓冲液中跑琼脂糖胶( o 8 ，含e b ) 电泳检测是否酶 切成功，切开后实施回收，具体程序参见2 2 2 2 。 3 ) 目的片段与表达载体的连接 ( 1 ) 连接反应体系1 0 i t l ，反应混合液包含： i n s e r t 2 0 9 1 b u f f e r 1 0 9 l v e c t o r 5 0 i _ t l t 4l i g a s e 0 3 山 d d h 2 0 补至1 0 k t l ( 2 ) 连接反应 置于4 。c 冰箱过夜。 4 ) 连接产物热击转化大肠杆菌及鉴定 具体过程参见2 2 2 3 ，抗生素为5 0 p g m lk a n 。以相应启动子特异性引物、启动 子正向引物和g u s 反向引物y m 8 8 ；c y c d 3 特异性引物y m l l y m l 2 、启动子上游 引物和y m l 2 检测，并配合相