（免疫学专业论文）1型单纯疱疹病毒间层蛋白vp22的转录调控功能分析.pdf

( 五) h a t 抑制剂a a 对i c p o 转录激活功能的影响，- 一 5 0 ( 六) v p 2 2 高表达在h s v 1 感染后一定时间内抑制h s v 1 a 、) ，m r n a 的表达5 2 ( 七) v p 2 2 高表达在h s v 1 感染后一定时间内抑制h s v - l 的增殖 5 4 ( 八) 酵母双杂交分析v p 2 2 与i c p 0 或p c a f 间的相互作用 5 4 ( 九) v p 2 2 、i c p o 、p c a f 细胞内的共定位分析5 6 ( 十) 免疫共沉淀分析v p 2 2 与i c p o 的相互作用及相互作用的功能域5 9 ( 十一) v p 2 2 竞争性抑制i c p 0 与p c a f 的相互作用 6 0 ( 十二) c 1 1 i p 分析v p 2 2 与i c p 0 对、g c 基因启动子区组蛋白乙酰化修 饰的影响 6 0 ( 十三) i c p o 与v p 2 2 对v e r o 细胞总组蛋白的乙酰化修饰无影响 6 2 三讨论6 3 ( 一) v p 2 2 抑制h s v - 1 仅、) ，基因的转录与h s v 1 的增殖6 3 ( 二) 初步探讨v p 2 2 抑制h s v - 1 仅、) ，基因转录与h s v - 1 增殖的机制6 5 ( 三) v p 2 2 抑制i c p 0 对h s v - 1 、) ，基因转录的促进作用一6 5 ( 四) v p 2 2 抑制i c p 0 对h s v - 1 、) ，基因转录促进作用的分子机制 6 6 ( 五) i c p 0 与v p 2 2 对v | e r o 细胞总组蛋白的乙酰化修饰无影响 6 9 四小结7 1 参考文献7 2 论文综述7 9 附录8 6 附录一缩略词8 6 附录二主要溶液的配制8 8 致谢9 5 研究生简历9 6 北京协和医学院中国医学科学院博上研究生学位论文 摘要 1 型单纯疱疹病毒( h e r p e ss i m p l e xv i n l st y p e1 ，h s v 1 ) 是一类对人类具有很强 感染性的病毒，人类是其唯一的宿主，世界各地约4 5 以上的人曾感染过h s v - 1 。 h s v - 1 原发感染后，机体虽然能够产生特异性免疫反应，但并不能彻底消除病毒， 病毒以潜伏感染的形式终生存在于宿主神经细胞内，在一定状态下可以被重新激活 而启动新一轮的裂解性感染。h s v - 1 基因以级联反应的方式表达，根据基因表达时 序的不同，病毒基因被分为立即早期基因( a 基因) 、早期基因( 口基因) 和晚期 基因( 丫基因) 。由于h s v 1 基因表达方式的特殊性，它已被作为研究真核基因表 达调控的模型和工具。 除了d n a 核心、核衣壳、包膜三种结构外，h s v - 1 还具有一种特殊的结构， 即无定形的蛋白层间层。虽然这2 0 余种间层蛋白约占病毒体积的5 0 ，并且 许多间层蛋白以高拷贝数存在( 1 0 0 0 一2 5 0 0 个病毒颗粒) ，但是人们对这类蛋白的 系统认识仅处于起步阶段。其中，v p 2 2 便作为一种在h s v - 1 中以高拷贝数存在的 间层蛋白( 2 4 0 0 个病毒颗粒) 而受到研究者的关注。迄今为止，对v p 2 2 的研究结 果表明v p 2 2 对h s v - 1 的装配以及病毒颗粒的形成具有重要的支持意义。本研究以 间层蛋白v p 2 2 的体外转录调控功能分析为切入点，首次揭示了v p 2 2 的普遍转录 抑制效应，并初步探讨了v p 2 2 普遍转录抑制效应的可能机制；此外，还首次证明 了v p 2 2 能显著抑制0 【蛋白i c p 0 的转录促进活性，并深入探讨了v p 2 2 、i c p 0 、组 蛋白乙酰化酶伽s t o n ea c e 哆l t l a i l s f e r a l s e s ，h a t ) p c a f 三者间的相互作用与v p 2 2 抑制 i c p 0 的转录促进作用之间的密切联系。实验结果显示，v p 2 2 高表达在h s v 1 感染 v e r o 细胞后的一定时间内抑制h s v 1a 、和) ，基因的转录；同时，v p 2 2 高表达在 h s v 1 感染v e r 0 细胞后的一定时间内也抑制h s v 1 的生长增殖能力。体外转录调 控功能分析显示，v p 2 2 在一定范围内呈剂量效应关系普遍抑制h s v - 1 及、和) ，基 因启动子的转录活性；此外，v p 2 2 也可以在一定范围内呈剂量效应关系，消除i c p 0 利用p c a f 的有关功能而针对、y 基因的转录促进作用。而v p 2 2 羧基端( 1 5 1 3 0 1 a a ) 是v p 2 2 行使其转录抑制功能的决定性功能域。初步探讨发现，募集组蛋白去乙酰 化酶咖s t o n ed e a c e t y l 仃a m f e r a s e s ，h d a c ) 并非为v p 2 2 普遍抑制病毒启动子转录的机 制。进一步研究v p 2 2 、i c p o 、p c a f 三者间的相互作用表明，v p 2 2 能分布于细胞 核与细胞质中，v p 2 2 通过其羧基端( 1 5 1 3 0 1 a a ) 与i c p o 的环指区发生相互作用， v p 2 2 与p c a f 间不存在相互作用。此外，v p 2 2 能竞争性抑制p c a f 与i c p o 环指 区的结合。利用染色质免疫沉淀技术，我们进一步发现，在h s v - l 感染过程中， v p 2 2 本身不能改变病毒基因启动子区组蛋白h 3 第1 4 位赖氨酸( h 3 k 1 4 ) 的乙酰 化状态，但却能显著抑制i c p 0 通过其环指区促进病毒基因启动子区组蛋白h 3 k 1 4 乙酰化修饰的功能。然而i c p o 与v p 2 2 对v e r o 细胞总组蛋白h 3 k 1 4 的乙酰化修饰 北京协和医学院中国医学科学院博上研究生学位论文 均无影响。 基于上述的实验结果，我们建立了一个关于调控病毒基因转录的v p 2 2 、i c p 0 、 p c a f 三种蛋白间相互作用的模型：i c p o 通过其环指区与p c a f 结合而增强病毒基 因启动子区组蛋白的乙酰化修饰，继而引发i c p 0 依赖p c a f 的转录促进作用；而 v p 2 2 羧基端与i c p 0 环指区的相互作用能竞争性抑制p c a f 与i c p 0 环指区的结合， 结果导致v p 2 2 显著抑制i c p 0 通过其环指区与p c a f 结合而增强的病毒基因启动子 区组蛋白的乙酰化修饰，最终造成v p 2 2 显著抑制i c p 0 依赖p c a f 促进病毒基因转 录的生物学效应。 关键词：l 型单纯疱疹病毒：间层蛋白v p 2 2 ：基因转录调控，i c p o ? 组蛋白乙酰 转移酶p c a f 2 北京协和医学院中国医学科学院博士研究生学位论文 a b s t r a c t h e 叩e ss i m p l e xv i m st ) ，p e1i sal ( i n do fl l i 刚yi 疵c t i o u sp a t h o g e nf o rh m 柚w h i c h i st h e0 1 1 l yh o s t a n da tl e a s t4 5p e r c e r n a g eo ft l l ew o r l d ，sp o p u l a t i o na r ei 疵c t e dw i t h h s v - 1 h 1i t s 砸m a r ) ，i 疵c t i o i l ，h s v l ，讹c hi sa b l et 0i n d u c et h es p e c i f i ci m m u n e r e s p o n s eo fi n d i v i d u a l ，c a i lk e e pi t s1 0 n gt i i l l ee x i s t e n c ei i ln e u r o n so f h o s tt h r o u 曲l a t e m s t a t e i t 弼ub er e a c t i v a t e dt 0al ”i ci n f e c t i o na g a i nu 1 1 d e rs o m ec e n a i nc o n d i t i o n s d u r i n g i t s r e p l i c a t i o i l ，m i s v i r a l g e n ee x p r e s s i o n i s c o o r d i n a t e l yr e g u l a t e d a 1 1 d s e q u e m i a l l yo r d e r e di nac a s c a d em a i l l l e r a c c o r d i n gt h es e q u e n c eo fg e n ee x p r e s s i o i l h s v 一1g e n e sa r ed e s i 班a t e d2 l s a g e n e s ，g e n e sa n d 坞e n e s b 2 l s e do nt l l i su n d e r s t a n d i n g ， h s v 一1i sa ni m p o r t a n tm o d e lf o re x p r e s s i o n a lr e g u l a t i o no fe u k a 巧o t i cg e n e s b e s i d e sc o r e ，c 印s i da n de n v e l o p e ，h s v 一1h a sa i l 吼s t m c t u r e dp r o t e i n a c o u sl a y e r c a l l e dt h et e g u m e m a l t h o u g ht h e s em o r et h a n2 0d i f r e r e n tl ( i n d so ft e g u m e n tp r o t e i n s a r ea b o u t5 0p e r c e n t a g eo ft h ev i r a lv o l u m ea n dm a l l yt e g u i i l e n tp r o t e i n sh a v eal a r g e n u m b e ro fc o p i e s ( 10 0 0 2 5 0 0m o l e c u l e s v i r i o n ) ，t h e r ei s l i t t l es y s t e m a t i ck n o w l e d g e r e g 砌i n gt h e s et e g u n l e mp r o t e i n s v p 2 2h a u sr e c e i v e dn o t a b l ea ：t t e n t i o nf o ri t sl a r g e n 啪b e ro fm o l e c u l e si i le a c hp o l y p e p t i d ep e rv i r i o n ( 2 4 0 0m o l e c u l e s v i r i o n ) a tp r e s e n t ， v p 2 2i sc o n f i n l l e dt ob ei m p o n a n tf o rv i r u sa s s e m b l ya 1 1 dv i m ss 廿1 l c t u r e b a s e do n f i n d i n g so fi t s 衄1 s c r i p t i o n a lr e g u l a t o 巧如n c t i o n si nc h l o r 锄p h e l l i c o la c e 哆l t r a n s f e r a s e ( c a t ) a s s a y ，t m ss t u d yr e v e a l e dt h eg l o b a lt r a m c r i p t i o n a li i 蛳b i t o d ，e f f e c to fv p 2 2f o r t h ef i r s tt i m e ，a n dt h e na n a l y z e dt l l em e c h a l l i s m s h la d d i t i o l l ，t t l i ss t u d ya l s oi 1 1 u m i n a t e d v p 2 2r 印r e s s i n gap r o t e i n i c p 0 位a i l s c r i p t i o n a l a c t i v a t i o nt h a ta t t r i b u t e dt o 吐i e i n t e r a c t i o n so fv p 2 2 ，i c p 0a i l dh i s t o n ea c e t ) ，l t 啪s f e r a s e s ( h a t ) p c a f t h er e s u l t sa r e s h o w n嬲f o l l o w d u r i n g h s v - 1i i l f e c t i o i l ， o v e r e x p r e s s e d v p 2 2i n l l i b i t e dt l l e n 觚s c r i p t i o n so fh s v - 1 仅，a n d ) ，g e n e sd u r i n gap e r i o do ft i m e ，a n di n h i b i t e dh s v 一1 r e p l i c a t i o ni i lv e r oc e l l sd u r i n gap e r i o do ft i m e t h ec a ta s s a yi n d i c a t e dt h a tv p 2 2 e x e r t sad o s e d e p e n d e n tn ? a n s c r i p t i o r l a l i n h i b i t o 巧e f r e c to nh s v 二1 反，a n d ) ，g e n e p r o m o t e r s ，a n dv p 2 2i sc a p a b l eo fe l i m i n a t i n gt l l ei c p o 仃a n s c r i p t i o n a la c t i v a t i o n m e d i a t e db yp c a fo n a i l d ) ，g e n ep r o m o t e r si nad o s e d e p e n d e n tm a n n e r c 孙o x y l t e m i n u so fv p 2 2w a u sa b s o l u t e l yr e q u i r e df o ri t s 仃a i l s c r i p t i o m li n 王l i b i t o 巧f u n c t i o n s a n d v p 2 2 把蛆s c r i p t i o n a lr e p r e s s i v e f h n c t i o i l sw e r en o ti 1 1 v 0 1 v e di nr e c m i t i n gh i s t o n e d e a c e t y l t m s f e r a s e s i na n a l y s i so fi n t e r a c t i o n so fv p 2 2 ，i c p o ，a i l dp c 扯t h er e s u l t s i n d i c a t e dt l l a tv p 2 2l o c a l i z e si nc y t o p l a s ma n dn u c l e i ，a n dc a r b o x y lt e 珊i 1 1 u so fv p 2 2 i 1 1 t e r a c t s 埘t h 也e 剐附gf i n g e rd o m a i l lo fi c p o ，b u tn o tp c a f n 郴i m p o n a n tt h a t v p 2 2i sa b l et 0c o m p e t i t i v e l yi n l l i b i tt l l ei n t e r a c t i o no fp c a fa i l dt l l ei c p oi m 寸gf i n g e r d o m a i l l c h r o m a t i n1 1 i l m u i l o p r e c i p i t a t i o na 1 1 a l y s e sr e v e a l e dt h a tv p 2 2d on o ti m 】) a c tt h e 3 北京协和医学院中国医学科学院博上研究生学位论文 l e v e l so fa c e t y l a t e dt l i s t o r l eh 3 k 1 4a tv i r u sp r o m o t e r s ( h l r i n gh s v - 1i n f e c t i o n ，b u tv p 2 2 c a nr e p r e s sm ee n r i c l l r i l e mo fa c e 够l a t e dl l i s t o n e sh 3 k 14a tv i n l sp r o m o t e r sd e p e n d e n t o nt h et h ei c p 0r i n gf i n g e rd o m a i n h o w e v e r ，b o t hi c p 0a n dv p 2 2d i d n ta l t e r9 1 0 b a l p a ：t t e mo fa c e t y l a t e d1 1 i s t o n e sh 3 k 14i nv e r oc e l l s b a s e do no u rs t u d i e s ，、v cs u m m a r i z eap r o t e i n - p r o t e i ni n t e r a c t i o nm o d e lo fv p 2 2 ， i c p oa n dp c a f o no n eh a l l d ，e 面c h m e mo fa o e t y l a t e d1 1 i s t o n e sa tv i m sp r o 】m o t e r s m e d i a t e db yi n t e r a c t i o no ft h ei c p or j n gf i n g e rd o m a i na n dp c a f1 e a d st 0 t r a l l s c r i p t i o m la c t i v a t i o l l o nt h eo 也e rh 觚d ，v p 2 2c o m p e t i t i v e l yi i l l l i b i t s t l l ei n t e r a c t i o n o fp c a fa i l dt h ei c p 0r j n gf i n g e rd o m a i l l ，w l l i c hc o n t r i b u t e st ov p 2 2r e p r e s s e si c p o a i l dp c a f m e d i a t e de 面c i m e n to fa c e t y l a t e dm s t o n e sa tv i r u sp r o m o t e r s a n da sar e s u l t ， v p 2 2e l i m i n a t e st h ei c p 0t r a n s 蹦p t i o n a la c t i v a t i o nd e p e n d e n to np c a f k e yw o r d s ：h e 叩e ss i m p l e xv i m st ) ，p e1 ，t e g 啪e n tv p 2 2 ，t r a l l s c r i p t i o n a lr e g u l a t i o n ， i c p 0 ，1 1 i s t o n ea c e 哆l t r a l l s f i e r a s e sp c a f 4 北京协和医学院中国医学科学院博士研究生学位论文 引言 在人类对自然界纷繁多样的生物种群的认识中，病毒这类最简单的生 据了重要的一页。这类个体极其微小，并曾在漫长的历史进程中与其他物 伴、共同生存的生命体之所以引起了人类的认真关注和细致分析，是因为 某些成员能够作为引起人类疾病，甚至是灾难性疾病的病原体，以及它们中的另一 些成员是能够引起众多与人类生活相关的其他物种疾病的病原体。迄今，在自然界 存在和可能存在的数千种病毒之中，已知至少有数十种病毒与人类疾病相关，而其 中如果说存在一类结构极其复杂，并可表现多种感染形式从而引起多种病理效应的 病毒的话，那么，这类病毒就是疱疹病毒 1 】。 疱疹病毒科是一群具有重要分子生物学意义和医学意义的有包膜的d n a 病毒， 广泛分布于自然界，约有1 0 0 余种，能够感染绝大部分的哺乳动物，部分甚至能够 感染冷血动物。整个疱疹病毒多呈球形，颗粒直径约为1 2 0 3 0 0 i u l l ，病毒体由4 种 结构成分组成，从内到外分别为最内层的核心，含一条线性双链d n a 基因组与病 毒d n a 结合蛋白；核心外直径约9 5 1 0 5 m 的二十面体核衣壳，由1 6 2 个壳微粒 组成；围绕在核衣壳周围的一层由球状蛋白组成的间层；间层外的一层表面布有糖 蛋白刺突的包膜。根据病毒的生物学特性和已知的d n a 序列，疱疹病毒又被分为 三个亚科，分别为0 【疱疹病毒、d 疱疹病毒和丫疱疹病毒，其中q 疱疹病毒繁殖最 快，y 疱疹病毒繁殖较慢。迄今为止，已知有8 种疱疹病毒可以感染人类，它们分 别是a 疱疹病毒亚科的l 型单纯疱疹病毒( h e 印e ss i m p l e xv i m st ) r p el ，h s v 1 ) 、2 型单纯疱疹病毒( h e 叩e ss i i i l p l e xv i m st ) ，p e2 ，h s v - 2 ) 、水痘一带状疱疹病毒 ( 、c e l l a z o s t e rv i m s ，v z v ) ，p 疱疹病毒亚科的巨噬细胞病毒、6 型疱疹病毒、7 型疱疹病毒以及丫疱疹病毒亚科的e b 病毒、8 型疱疹病毒即k a p o s i 肉瘤疱疹病毒。 单纯疱疹病毒( h e 印e ss i r i l p l e xv i m s ，h s v ) 根据血清型，分为h s v 1 、h s v 2 ，它 们具有较强的感染性，是最早被发现的疱疹病毒，也是被研究最深入的病毒之一。 h s v 1 是最早被分离的人疱疹病毒，人类是其唯一的宿主，世界各地约4 5 以上的 人曾感染过h s v - l ，几乎从所有的脏器和粘膜皮肤部位都能分离到h s v 1 。h s v - 1 感染主要通过人群与易感者之间的密切接触，无季节差异，主要感染口、眼、唇的 皮肤和粘膜以及中枢神经系统，偶见于外生殖器。h s v - 1 病毒通常以皮肤的上皮细 胞和粘膜上皮细胞作为入侵途径。当完全角质化的皮肤表层出现微小创口，角质形 成细胞暴露于病毒后，h s v - 1 得以进入机体并在表皮和真皮细胞内繁殖，不管是否 产生明显病理性损伤，病毒大量复制足以感染感觉神经和自主神经末捎，随着宿主 机体内免疫反应的产生，虽然病毒可以被大量清除，但是仍有部分病毒在神经细胞 中形成潜伏性感染，终生存在于人体内。虽然能检测到h s v - 1 抗体的许多人是无症 状的，但是在神经细胞中潜伏的病毒在许多条件下可以被再激活，再次感染神经细 胞突触附近的表皮细胞，从而启动新一轮的裂解性感染，对机体产生新一轮的病理 5 北京协和医学院中国医学科学院博士研究生学位论文 性损伤。正是因为h s v - 1 具有这种特殊的生物学性状感染、潜伏、再激活，使 得h s v 1 感染成为了临床治疗的难点。关于h s v - 1 形成潜伏感染以及再激活的机制 还未被完全阐明，虽已经有许多假设被提出，但其最终的阐明还有赖于从分子水平 上对h s v - 1 表达调控过程进行更为深入的了解。由于h s v 1 复杂的生物学特性，因 此它已被作为研究蛋白定位、神经系统突触连接、胞膜结构、真核基因表达调控的 模型和工具。 h s v - 1 的基因组是1 5 2 k b p 的线性双链d n a ，由d n a 长片段单一序列( u n i q u e s e q u e n c eo fl o n gc o m p o n e n t ，u l ) 和d n a 短片段单一序列( u n i q u es e q u e n c eo fs h o r t c o m p o n e n t ，u s ) 组成，长、短片段单一序列两端分别带有长倒置重复序列( r e p e a t s n a n “n gn l eu l ，i 也) 和短倒置重复序列( r e p e a t sn a l l 如n gt h eu s ，r s ) 【2 】。h s v 1 的基因组至少编码8 4 个蛋白，病毒以级联反应的方式表达病毒蛋白 3 ，4 】，根据基 因表达时序的不同，病毒基因被分为立即早期基因( n 基因) 、早期基因( 基因) 和晚期基因( 丫基因) ，基因的转录需要a 基因的表达，仅基因和基因的表达对 于结构蛋白 蛋白的表达是必须的，根据表达是否依赖病毒d n a 的合成，) ，基 因可被进一步分为) _ 7 和归基因，病毒在细胞内完成各组分的合成后，装配形成新 的病毒颗粒，通过裂解释放子代病毒，感染新的宿主细胞。 2 0 余种间层蛋白构成了h s v 1 的特殊结构，包绕着核衣壳存在于病毒核衣壳与 病毒包膜之间。h s v - 1 间层蛋白包括：v p l 2 l 3 6 ) 、v p l l 1 2 l 4 6 ) 、v p l 3 1 4 ( u l 4 7 ) 、v p l 6 ( u l 4 8 ) 、v p 2 2 ( u l 4 9 ) 、i c p o 、i c p 4 、v h s ( m ev i d o nh o s ts h u t o f r p r o t e i n ) ( u l 4 1 ) 以及u s 2 、u s 3 、u s l o 、u s l l 、u l l l 、u l l 3 、u l l 4 、u l l 6 、u l l 7 、u l 2 1 、 u l 3 7 、u l 5 1 、u l 5 6 5 7 。许多间层蛋白以高拷贝数存在( 1 0 0 呲5 0 0 个颗粒) ，如： v p l 3 1 4 ( u l 4 7 ) 、v p l 6 ( u l 4 8 ) 、v p 2 2 ( u l 4 9 ) ；也有拷贝数相对低的蛋白( 1 0 0 1 5 0 个颗粒) ，如i c p o 、i c p 4 ，两者亦是q 蛋白，在病毒的生长增殖过程中主要发挥基 因表达调控的功能。研究证明许多间层蛋白对h s v 1 复制生长有着重要的意义，如： v p l 6 、v p l 2 、u l 3 7 。间层蛋白v p l 6 与v h s 是相对研究较深入的两种间层蛋白。 病毒感染细胞后，v p l 6 通过与细胞因子0 c t l 、宿主细胞因子1 ( h o s tc e uf i a c t o r1 ， h c f l ) 结合形成诱导复合物 8 ，9 】，识别仅基因上游调控序列特有的t a a t g a 凡盯元件 发挥反式激活作用诱导5 个h s v 1 立即早期蛋白感染细胞多肽( i n f e c t e dc e u p 0 1 y p e p t i d e s ，i c p s ) i c p 0 、i c p 4 、i c p 2 2 、i c p 2 7 、i c p 4 7 的表达【2 】。v h s 是一种m r n a 特异性的r n a 酶，能引起宿主细胞蛋白质合成的快速关闭，并在病毒基因从头合成 前就能降解宿主细胞m r n a 【1 0 】。 v p 2 2 是一种在h s v - 1 中以高拷贝数存在的间层蛋白( 2 4 0 0 个病毒颗粒) ，在a 疱 疹病毒中有较高的同源性。h s v - lv p 2 2 由长为9 0 6 b p 的沈锣基因编码，含3 0 1 个氨 基酸( a m i n oa c i d ，a a ) ，感染细胞内的v p 2 2 被高度翻译后修饰，包括核苷酸化修饰、 a d p 核糖基化修饰 1 1 】、磷酸化修饰( 至少两种细胞激酶：酪蛋白激酶i i 和蛋白激 6 北京协和医学院中国医学科学院博士研究生学位论文 酶c ，病毒蛋白激酶u l l 3 ) 1 2 ，1 3 】。v p 2 2 约为3 5 l ，而磷酸化的v p 2 2 约为3 8 l 。 尽管v p 2 2 不携带核定位信号，但是v p 2 2 能分布于细胞核，p o m e r a n z 等研究表明v p 2 2 的细胞定位分为3 个时相 1 4 】：5 h p i ( h o u r sp o s ti n f e c t i o n ) 分布于细胞质，9 h p i 从细 胞质进入细胞核，1 3 h p i 分布于细胞核。v p 2 2 不仅对h s v 1 结构的形成具有支持作用， 还表现出一个多重功能蛋白分子的特性。目前已经明确的，v p 2 2 至少能与v p l 6 、 g e 、g d 、u s 9 、u l 4 6 这5 种h s v - 1 蛋白结合，还能与m 盯1 、n mi 从( n o m u s c l em y o s i n i i a ) 、微管( m i c r o t l l b u l e ，m t ) 这3 种细胞蛋白结合。v p 2 2 与v p l 6 的转录激活域相 互作用 1 5 】；v p 2 2 可通过v p l 6 与v h s 形成相互作用的复合物，同时v p 2 2 v p l 6 复合 物对v h s 的表达具有重要的支持意义 1 6 】。v p 2 2 与包膜糖蛋白g d 、g e 的相互作用 1 7 ， 1 8 ，可能促进病毒的装配过程。体外实验观察到v p 2 2 与t a f i ( 组蛋白乙酰转移 酶抑制剂的亚基) 结合后，v p 2 2 能抑制影心i 促进核小体形成的功能，并且t a f i 也能阻断v p 2 2 与d n a 的非特异性结合；但在体外实验中v p 2 2 并不影响组蛋白乙酰 转移酶抑制剂抑制组蛋白乙酰转移酶p 3 0 0 或p c a f ( p 3 0 0 c b pa s s o c i a t e df a c t o r ) 的 活性 1 9 。v p 2 2 具有典型的m t 相关蛋白的特性，能与细胞骨架m t 结合，并且能稳 定m t 并使其高度乙酰化 2 0 ；此外，v p 2 2 还能与构成肌动蛋白细胞骨架的动力蛋 白n mi i a 相互作用【2 1 】。v p 2 2 与细胞骨架m t 或n mi i a 间的相互作用可能与病毒的 包装、出膜及病毒的运输有密切的关系。通过某种还未阐明的机制，v p 2 2 能在细胞 间进行转导 2 2 。此外，在h s v - 1 感染的细胞中v p 2 2 能与m i 矾a 结合并将n 1 f 讯a 转 导到未感染的细胞 2 3 】。通过构建表达不同v p 2 2 缺失突变体的质粒及构建表达不同 v p 2 2 缺失突变体的重组h s v - 1 ，研究者们陆续定位了v p 2 2 的功能域，2 1 3 3 0 1 a a 能 在细胞质聚集 2 4 】，1 0 8 2 1 2 a a 可与m t 结合【2 4 】，1 7 4 3 0 1 a a 能与有丝分裂期的染色 质结合【2 4 】，1 6 0 2 1 2 a a 可与v p l 6 结合【2 5 】，1 9 牝1 2 a a 能在细胞核内聚集成点状【2 5 ， 8 1 1 9 5 a a 起到细胞间的转导功能 2 6 】，1 5 9 2 6 7 a a 可与细胞骨架结合并能重塑细胞骨 架 2 6 】，8 l 一1 2 1 a a 与2 6 7 3 0 1 a a 能分布于细胞核【2 6 】。研究者利用缺失觇彳9 基因的重 组h s v 1 感染细胞，研究v p 2 2 对h s v 1 生长复制的影响时发现 2 7 】，与野生型h s v 1 相比，感染v e r o 细胞后重组h s v 1 的生长复制能力没有明显的改变；但感染m d b k 后，重组h s v 1 的生长复制能力却明显降低。缺失沈4 9 基因的重组h s v 1 感染v e r o 细胞后，病毒蛋白的合成普遍延迟 2 7 。 h s v i 的a 基因包含的、仅4 、a 力、以7 和卅7 ，它们编码的蛋白产物分别称为 i c p o 、i c p 4 、i c p 2 2 、i c p 2 7 和i c p 4 7 。h s v 10 【蛋白是对细胞和病毒的基因表达都 具有调节作用的调控蛋白，因此对于真核基因表达调控的研究，a 基因是主要的研 究对象。h s v 1 仅基因的转录出现在病毒d n a 复制之前，a 基因的表达并不依赖其 它病毒蛋白的从头合成，这为我们的研究提供了极大的方便。已有的研究资料表明 i c p 0 、i c p 4 、i c p 2 2 、i c p 2 7 这四种0 【蛋白对h s v 1 基因的表达具有非常重要的意 义。i c p 4 是被广泛研究的h s v - 1 蛋白之一，实验早已证实i c p 4 是激活基因和) ， 7 北京协和医学院中国医学科学院博士研究生学位论文 基因转录的必需蛋白【2 8 】；随后实验表明i c p 4 能抑制包括自身基因的病毒基因的表 达 2 9 】；但是i c p 4 的转录激活与转录抑制的具体作用机制还未被完全阐明。i c p 4 以同源二聚体的形式与d n a 序列结合，但是i c p 4 与特异d n a 序列结合并非是其 发挥转录调控功能的必要条件。i c p 4 能特异地与转录因子t b p 、t fi ib 以及t a f 2 5 0 等结合 3 0 3 2 】。随后研究发现，在转录的早期i c p 4 通过募集t f d 到t a t ab o x 而促进基因的转录【3 3 】。从i c p 2 7 的结构上看，i c p 2 7 羧基端的2 6 2 5 2 1 a a 为转录 激活结构域，4 3 4 5 1 2 a a 为转录抑制结构域，在4 8 3 5 0 8 a a 为一锌指基序。而在氨 基端存在一个作为核输出信号的富含亮氨酸的序列( 7 1 5 a a ) 以及能与i 斟a 结合 的r g g 盒结构( 1 3 9 1 5 5 a a ) 3 4 ，3 5 】。i c p 2 7 在基因转录后发挥的作用逐渐被发现， i c p 2 7 可能抑制m r n a 的剪接 3 6 ，3 7 ；i c p 2 7 不但能与m r n a 结合，还能将成熟 的m r n a 从细胞核运输到细胞质 3 4 ，3 8 】。对i c p 2 2 在基因转录调控方面的研究没 有i c p 4 和i c p 2 7 相关研究深入透彻。在某些啮齿类动物细胞和人类细胞中，i c p 2 2 对i c p 0 以及) ，基因的表达是必要的【3 9 】；在h s v 感染过程中，r n a 聚合酶i i 的最 大亚基p 两种正常的磷酸化形式i ia 和i io 被耗竭，产生一种异常的磷酸化形式( i i i ) ，虽然不清楚这种异常磷酸化的p 是如何产生的，但是与其它缺陷病毒株相比， i c p 2 2 缺陷株产生的i ii 明显减少 4 0 】；此外，近来研究表明，i c p 2 2 在体外转录报 告系统中表现出强烈的转录抑制作用【4 1 】。 i c p o 由7 7 5 个矩组成，3 个外显子分别位于1 1 9 a a 、2 0 2 4 1 a a 、2 4 2 7 7 5 a a 。 其主要的功能区有：位于1 1 6 1 5 6 a a 之间的环指区，富含半胱氨酸和组氨酸，结构 与锌指结构相似，能结合z n 2 + 【4 2 4 4 】；位于4 7 4 5 0 9 a a 的核定位信号 4 5 】；位于其 羧基端的6 1 7 7 1 1 a a 因为对自身的氨基酸序列有较高的亲和力，因此可以介导i c p o 形成稳定的二聚体以及寡聚体 4 6 ，4 7 ；位于其羧基端的5 9 4 6 4 6 a a 与泛素特异性蛋 白酶u s p 7 相互作用 4 8 5 0 】。虽然i c p 0 只含7 7 5 个龃，但其电泳迁移率相当于1 0 0 0 个a a 5 1 5 3 】，主要原因为高保守的外显子3 中含有大量的脯氨酸【5 2 】。迄今为止， 一系列的证据表明i c p 0 是一个多功能的蛋白分子。i c p 0 的主要功能是激活h s v 1 、) ，基因的表达【5 4 ，5 5 ，以及其它病毒基因和细胞基因的表达 2 9 ，5 6 5 8 。此外， i c p 0 在促进h s v 从潜伏期激活的过程 5 9 6 1 】与在调控裂解性感染与潜伏性感染平 衡的过程中起着重要的作用 6 2 。i c p 0 能够定位于细胞核内的n d l 0 ( n u c l e a r d o m a i n 1 0 ) 结构域 6 3 】，n d l 0 的主要成分是早幼粒白细胞白血病蛋白体( p r o m y e l o c y t i c l e u k e m 试p m l ) 及s p l o o ，虽然n d l o 的确切功能并不清楚，但已经发现它是许多 转录激活因子聚集的场所【6 4 】，而越来越多的资料也支持细胞的n d l o 具有抵御病 毒基因表达的功能，如小泛素化相关修饰物( s m a l lu b i q u i t i n r e l a t e dm o d i f i e r ， s u m o ) 修饰的p m l 和s p l o o 能够抑制病毒基因的表达 6 5 ，6 6 】，而干扰素能上调 p m l 和s p l o o 的表达 6 7 】，但i c p 0 则会阻止s u m o 对p m l 和s p l 0 0 修饰及严重 破坏n d l o 的结构 6 8 】，i c p 0 还能拮抗p m l 对h s v - 1 基因表达及病毒复制的抑制 8 北京协和医学院中国医学科学院博士研究生学位论文 作用 6 5 】。i c p 0 是目前已知的唯一一个含有两个e 3 泛素连接酶功能域的蛋白质， 这两个e 3 连接酶功能域在i c p 0 分子中的位置不同，各自行使其连接酶的功能 6 9 】。 i c p 0 的第一个泛素连接酶功能域为h u l 1 ( h e 印e s v i m su b i q u i t i nl i g a s e1 ) ，位于外 显子3 的羧基端( 5 4 3 “8 0 a a ) ；i c p 0 的第二个泛素连接酶功能域为h u l 2 ( h e 甲e s v i m su b i q u i t i nl i g a s e2 ) ，位于环指区( 1 1 6 1 5 6 a a ) 。i c p o 的羧基端还能与 细胞内的泛素特异性蛋白酶u s p 7 作用。i c p o 与u s p 7 的相互作用对于i c p 0 的活 性是重要的，将i c p o 第6 2 0 位a a 突变，使其不能与u s p 7 相互作用，会降低i c p 0 的活性 7 0 】。i c p 0 与u s p 7 的结合在体外可以保护i c p o 不进行自身泛素化，有利于 增加i c p o 的稳定性【7 l 】。i i 类组蛋白去乙酰化酶( 1 1 i s t o n ed e a c e t y l t r a l l s f e r a s e s ，h d a c ) 4 、5 、7 通过其氨基端与i c p 0 相互作用，而此作用能抵抗h d a c 氨基端导致的相 关转录抑制活性 7 2 。i c p o