（内科学专业论文）1型糖尿病大鼠肾小球smad1的表达及坎地沙坦干预研究.pdf

目录 1 鼎攀煳y 18 0 17 0 0 中文摘要“1 英文摘要3 研究论文1 型糖尿病大鼠肾小球s m a d l 的表达及坎地沙坦 干预研究 前言6刖舌o 材料与方法7 结果15 附图18 附表“2 8 讨 仑3 0 结论3 4 参考文献3 4 综述s m a dl 与糖尿病肾病3 8 致谢4 5 个人简历4 6 中文摘要 1 型糖尿病大鼠肾小球s m a d l 的表达 及坎地沙坦干预研究 摘要 目的：通过应用链脲佐菌素诱导1 型糖尿病大鼠模型，观察糖尿病大 鼠肾小球s m a d l 的表达水平，同时给予坎地沙坦干预，探讨s m a d l 与糖 尿病肾病早期肾小球系膜基质积聚的关系，及坎地沙坦的肾脏保护作用机 制。 方法：1 雄性w i s t a r 大鼠3 6 只，随机选取1 2 只为正常对照组( n c 组) ，其余2 4 只禁食1 2 h 后，一次性腹腔注射链脲佐菌素( s t r e p t o z o t o c i n ， s t z ) 5 5 m g k g ，诱导1 型糖尿病大鼠模型；注射3 天后随机血糖大于 1 6 7 m m o l l 者为造模成功；将糖尿病大鼠随机分为糖尿病组( d m 组， n = 1 2 ) 和坎地沙坦干预组( d m c 组，n = 1 2 ) ，d m c 组给予坎地沙坦 5 m g k g - 1 d 1 灌胃，n c 组和d m 组给予等容积生理盐水灌胃。2 干预1 2 周末，测量全部大鼠尾动脉收缩压( s y s t o l i cb l o o dp r e s s u r e ，s b p ) ，然后 置于代谢笼中收集2 4 h 尿液，记尿量，用于尿白蛋白排泄量( u r i n a r y a l b u m i ne x c r e t i o n ，u a e ) 、尿肌酐测定；全部大鼠称重，处死后留取血标 本，测定空腹血糖( f a s t i n gb l o o dg l u c o s e ，f b g ) 、血肌酐，计算内生肌酐 清除率( c r e a t i n i n ec l e a r a n c er a t e ，c c r ) ；切取左肾，去掉被膜后称重，光 镜和透射电镜观察肾小球形态学改变，免疫组化法观察肾小球i v 型胶原 ( t y p e l vc o l l a g e n ，c 0 1 i v ) 和s m a dl 的表达，并应用i m a g e p r op l u s 图 像分析系统对病理切片和免疫组化切片进行分析，包括测定肾小球平均截 面积( m e a ng l o m e r u l a ra r e a ，m g a ) 、肾小球内p a s 阳性染色面积以及 肾小球i v 型胶原表达阳性指数( p o s i t i v ei n d e x ，p i ) ；计算系膜基质分数 ( m e s a n g i a lm a t r i xf r a c t i o n ，m m f ) 即p a s 阳性染色面积肾小球平均截 面积，并根据公式 p k ( m g a ) 弛】计算肾小球平均体积( m e a ng l o m e r u l a r v o l u m e ，m g v ) ；迅速切取右肾微分离肾小球后置于7 0 c 液氮中冻存， w e s t e r nb l o t 检测肾小球s m a d l 的表达水平。 结果：实验结束时，n c 组、d m 组、d m c 组各存活l o 只、8 只、 8 只大鼠。1 f b g 、2 4 小时u a e 、肾重指数( k i d n e yw e i g h t b o d yw e i g h t ， 中文摘要 k w b w ) 、c c r ：与n c 组相比，d m 组和d m c 组大鼠f b g 、2 4 小时 u a e 、k w 倍w 、c c r 均显著升高( 尸 o 0 1 ，p 0 0 1 ) ；与d m 组相比， d m c 组大鼠除f b g 外，其余指标均明显降低( 尸 o 0 5 ) 。3 肾小球 病理形态学改变：h e 染色和p a s 染色均显示，与n c 组比较，d m 组大 鼠m g a 和m g v 显著增大( 尸 o 0 1 ) ；肾小球内p a s 阳性染色物质增多， 系膜区增宽，系膜细胞增生，m m f 明显增高( 尸 o 0 1 ) ；d m c 组上述 异常较d m 组均明显改善( p o 0 1 ) ，但尚未恢复正常。透射电镜显示： d m 组大鼠肾小球基底膜不均匀增厚，可见足突增厚、融合；d m c 组肾 小球基底膜增厚程度及足突融合程度均有所减轻。4 肾小球c o l = 1 v 的表 达：免疫组化结果显示，n c 组大鼠肾小球有少量c 0 1 i v 表达，d m 组大 鼠肾小球c 0 1 i v 表达明显增强( 尸 o 0 1 ) ；d m c 组较d m 组肾小球c 0 1 i v 表达明显减低( 尸 o 0 1 ) ，但较n c 组表达仍高( 脚0 1 ) 。5 i 肾小球s m a d l 的表达：免疫组化和w e s t e r nb l o t 检测结果示，n c 组大鼠肾小球几乎无 s m a d l 的表达，d m 组大鼠肾小球s m a d l 的表达明显增3 n ( p 0 0 1 ) ；d m c 组较d m 组肾小球s m a d l 表达减弱( 尸 o 0 1 ) ，但较n c 组表达仍高 ( p 0 0 1 ) 。6 相关分析示大鼠肾小球s m a d l 的表达与肾小球c 0 1 i v ( f o 8 8 5 ，p 0 0 5 ) 及肾小球m m f 呈明显正相关( r = 0 8 9 1 ，p 0 0 5 ) 。 结论：1 在糖尿病肾病发病的早期，大鼠肾小球s m a d l 的表达增加， 肾小球系膜基质积聚。2 大鼠肾小球s m a d l 的表达与肾小球i v 型胶原的表 达及肾小球系膜基质积聚程度呈显著的正相关关系，说明s m a d l 可能有促 进肾小球硬化的作用。3 经坎地沙坦干预后，糖尿病大鼠肾小球的病理改 变及功能损伤均得到改善，但血压没有明显变化，说明坎地沙坦具有独立 于降压以外的肾脏保护作用，这可能与抑制了肾小球s m a d l 的表达有关。 坦 关键词：糖尿病肾病；系膜基质积聚；s m a d l ；i v 型胶原：坎地沙 英文摘要 s t u d i e so nt h eg l o m e r u l a re x p r e s s i o no fs m a d li nd i a b e t i cr a t s a n dt h ep r o t e c t i v ee f f e c to fc a n d e s a r t a n a b s t r a c t o b j e c t i v e ：t h ep r e s e n ts t u d yo b s e r v e dt h eg l o m e r u l a re x p r e s s i o no f s m a dli ns t r e p t o z o t o c i n i n d u c e dd i a b e t i cr a t sa n dt h ei n t e r v e n t i o ne f f e c t so f c a n d e s a r t a nt oe x a m i n et h er o l eo fs m a dli nt h ed e v e l o p m e n to fm e s a n g i a l m a t r i x e x p a n s i o n i nt h ee a r l y s t a g e o fd i a b e t i c n e p h r o p a t h ya n dt h e m e c h a n i s mo fc a n d e s a r t a n sp r o t e c t i v ee f f e c t so nd i a b e t i ck i d n e y m e t h o d s ：t h i r t y s i xm a l ew i s t a rr a t sw e r er a n d o m l yd i v i d e di n t o2 g r o u p s ：n o r m a lc o n t r o lr a t s ( n cg r o u p ，n = 12 ) a n dt e s tr a t s ( n 2 2 4 ) t h et e s t r a t sw e r ei n d u c e dd i a b e t e s b y a s i n g l ei n t r a p e r i t o n e a li n je c t i o n o f s t r e p t o z o t o c i n ( s t z ，5 5 m g k g ) a f t e ra no v e r n i g h tf a s t t h r e ed a y sa f t e rs t z i n j e c t i o n ，t h er a t sw i t hb l o o dg l u c o s el e v e l sh i g h e rt h a n 16 7 m m o l 1w e r e c o n s i d e r e da sd i a b e t e s t h ed i a b e t i cr a t sw e r er a n d o m l yd i v i d e di n t od i a b e t i c m o d e lr a t s ( d mg r o u p ) a n dd i a b e t i cm o d e lr a t st r e a t e dw i t hc a n d e s a r t a n ( d m cg r o u p ) t h ed m cg r o u pw e r et r e a t e dw i t hc a n d e s a r t a n5 m g k g 1 d q a n do t h e rg r o u p sw e r et r e a t e dw i t ht h es a m ev o l u m eo fn o r m a ls a l i n e a f t e r12 w e e k so fi n t e r v e n t i o n ，s y s t o l i cb l o o dp r e s s u r e ( s b p ) w a sm e a s u r e db yt h e c u f f - t a i l e dm e t h o d ，a n da l lr a t sw e r ep l a c e di nm e t a b o l i cc a g e sf o r2 4h o u r st o c o l l e c tu r i n es a m p l e s ，w h i c hw e r eu s e dt od e t e r m i n eu r i n a r ya l b u m i ne x c r e t i o n ( u a e ) a n du r i n a r yc r e a t i n i n e t h er a t sw e r ew e i g h t e da n ds a c r i f i c e dt oc o l l e c t p l a s m as a m p l e sf o r t h ea s s a yo ff a s t i n gb l o o dg l u c o s e ( f b g ) ，s e r u m c r e a t i n i n e a n dc a l c u l a t ec r e a t i n i n ec l e a r a n c er a t e ( c c r ) g l o m e r u l a rh i s t o p a t h o l o g yw a s o b s e r v e d b ym i c r o s c o p e a n dt r a n s m i s s i o ne l e c t r o n m i c r o s c o p e t h e e x p r e s s i o n o ft y p e l vc o l l a g e n ( c o l i v ) a n ds m a d li ng l o m e r u l iw e r e d e t e r m i n e db yi m m u n o h i s t o c h e m i s t r y r e s u l t sw e r ea n a l y s e db yi m a g e - p r o p l u si m a g e a n a l y s i ss y s t e m ，i n c l u d i n gt h em e a s u r e m e n to fm e a ng l o m e r u l a r a r e a ( m g a ) ，p a sp o s i t i v es t a i n i n ga r e ai ng l o m e r u l ia n dp o s i t i v ei n d e x ( p i ) o ft y p ei vc o l l a g e ne x p r e s s i o ni ng l o m e r u l i ；m e s a n g i a lm a t r i xf r a c t i o n ( 1 v l m f ) 3 英文摘要 ( t h er a t i o no fp a sp o s i t i v es t a i n i n ga r e at oa v e r a g es e c t i o na r e ao fg l o m e r u l i ) w a sc a l c u l a t e d m e a ng l o m e r u l a rv o l u m e ( m g v ) w a sc a c u l a t e db yt h e e q u a t i o n 1 3 k x ( m g a ) 3 2 】g l o m e r u l iw e r ei s o l a t e df r o mr e n a lc o r t i c e so fr a t s f o re x a m i n i n gt h ee x p r e s s i o no fs m a d lb yw e s t e r n b l o t t i n g r e s u l t s ：a tt h ee n do ft h ee x p e r i m e n t ，10r a t si nn cg r o u p 。8r a t si n d m g r o u pa n d8r a t si nd m cg r o u ps u r v i v e d 1 f b g2 4 h o u ru a e ，k i d n e y h y p e r t r o p h yi n d e x ( k i d n e yw e i g h t b o d yw e i g h t ，k w b w ) a n dc c ri nd ma n d d m c g r o u pw e r es i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e dc o m p a r e dw i t hn cg r o u p ( p o o1 ， 尸 0 01 ) a f t e rc a n d e s a r t a ni n t e r v e n t i o n ，a l lt h ea b o v ei n d i c a t o r sw e r e s i g n i f i c a n t l yd e c r e a s e dc o m p a r e dw i t hd mg r o u pe x c e p tf b g 俨 o 0 5 ) 3 p a t h o m o r p h o l o g i c a lc h a n g e so ft h eg l o m e r u l u s ：h ea n d p a ss t a i n i n gs h o w e dm a tt h em e a ng l o m e r u l a ra r e a ( m g a ) a n dm e a n g l o m e r u l a rv o l u m e ( m g v ) w e r es i g n i f i c a n t l ya u g m e n t a t e d 俨 o o 1 ) a n d t h e r ew e r ei n c r e a s e dp a s - p o s i t i v em a t e r i a l s ，e x p a n s i o no fm e s a n g i a la r e a h y p e r p l a s i ao fm e s a n g i a lc e l l si nd i a b e t i cg l o m e r u l ic o m p a r e dw i t hn c g r o u p a l s ot h em e s a n g i a lm a t r i xf r a c t i o n ( m m f ) w a ss i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e di nd m g r o u p 俨 o 01 ) t h ea b n o r m a lc h a n g e sw e r ea l l e v i a t e da f t e rc a n d e s a r t a n i n t e r v e n t i o nc o m p a r e dw i t hd m g r o u p ( 尸 o 01 ) ，a l t h o u g hn o tn o r m a l i z e d t r a n s m i s s i o ne l e c t r o n m i c r o s c o p e s h o w e da ni n c r e a s e d t h i c k n e s s o f g l o m e r u l a rb a s e m e n tm e m b r a n ea n dc o n f l u e n c eo ff o o tp r o c e s so fp o d o c y t ei n d i a b e t i cr a t s ；w h e r e a st h e s e sa b n o r m a l i t i e sw e r ep a r t l yr e l i e v e di nd m c g r o u p 4 t h eg l o m e r u l a re x p r e s s i o n o f c 0 1 i v = i m m u n o h i s t o c h e m i s t r y s h o w e dt h a tt h ee x p r e s s i o no fc o l - i vi nn cg r o u pw a s f a r t h i n g t h e e x p r e s s i o no fc o l i vi nd mg r o u pw a sh i g h e rt h a nt h a to fn cg r o u p ( p o o1 ) ；a n dt h ee x p r e s s i o ni nd m cg r o u pw a sl o w e rt h a nt h a to fd m g r o u p ( 尸 o 0 1 ) ，w h e r e a ss t i l lh i g h e rt h a nt h a to fn cg r o u p ( 尸 o 0 1 ) 5 1 1 1 e g l o m e r u l a re x p r e s s i o no fs m a dl ：t h ep r o t e i ne x p r e s s i o no fs m a dlw a s s i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e di nd mg r o u p ( 尸 o 01 ) ，w h i l ea l m o s tu n d e t e c t a b l ei n n c g r o u pb yi m m u n o h i s t o c h e m i s t r ya n dw e s t e r nb l o r i n g n l ee x p r e s s i o ni n d m cg r o u pw a sr e d u c e dc o m p a r e dw i t hd m g r o u p o o1 ) ，w h e r e a ss t i l l 4 英文摘要 h i g h e rt h a ni nn cg r o u p 俨 o 01 ) 6 c o r r e l a t i o na n a l y s i s ：t h eg l o m e r u l a r e x p r e s s i o no fs m a d lw a sp o s i t i v e l yc o r r e l a t e dw i t ht h eg l o m e r u l a re x p r e s s i o n o fc o l i v ( 间8 8 5 ，p 1 6 7 m m o l l 为糖尿病大鼠。2 4 只大鼠全部造模成功，被随机 平分为2 组，糖尿病组( d m 组) 和坎地沙坦干预组( d m c 组) ，每组 1 2 只。 2 2 药物干预治疗 d m c 组每日给予坎地沙坦5 m g k g 灌胃，n c 组和d m 组大鼠每日 给予干预组等容积生理盐水灌胃，共1 2 周。实验期间大鼠自由进食、饮 水，不使用胰岛素及其他降糖药物。 2 3 标本收集 干预1 2 周末，测定全部大鼠尾动脉s b p ，然后将大鼠放入代谢笼内 收集2 4 小时尿，记尿量，用于2 4 小时u a e 、尿肌酐测定；全部大鼠称 重，用3 戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后，颈动脉插管取血，分离血清，测 定f b g 、血肌酐，使用生理盐水反复灌洗双侧肾脏，取出后去掉被膜， 左肾称重后分别置于4 多聚甲醛固定留作苏木素伊红( h e ) 、过碘酸 雪夫试剂( p a s ) 染色及免疫组化检测，及4 戊二醛中待电镜下超微结 构分析；对右肾立即微分离肾小球后置于7 0 。c 液氮中冻存 3 】，用于w e s t e r n b l o t 检测。 2 4 观察和检汛 j 陀3 匕f i 标 2 4 1 一般情况 观察三组大鼠精神状态、毛色、进食量、尿量、体重等。 2 4 2 尾动脉s b p 测定：运用无创血压测量仪间接测量大鼠血压。测血 压前先将大鼠尾部加热5 分钟，然后用测量仪的尾套套于大鼠尾中上部， 打开开关自动充气加压，当加压至系统探测到脉搏波完全消失时，自动逐 渐放气减压，结束后仪器界面将显示收缩压、舒张压及平均动脉压，取收 缩压作为血压水平。每只大鼠连续测量3 次，取平均值。整个过程大鼠需 保持安静，在仪器显示尾动脉有规律搏动信号时开始测量。 2 4 3 k w b w 根据公式：k w b w = 左侧肾脏重量( m g ) 体重( g ) 进 行计算。 2 4 42 4 小时u a e 用放免法测定，具体步骤如下： 设非特异管一个，标准管七个及样品管。非特异管加零标准 2 5 0 9 l ，标准管七个每个加标准品5 0 9 l ，样品管加尿样2 0 0 9 l 。上述所 研究论文 有管均加1 2 5 i - a l b l 0 0 9 l 。除非特异管外所有管均加a l b 抗体2 0 0 9 l 。 上述各管摇匀后，3 7 c ，温育o 5 h 。所有管均加分离剂5 0 0 9 l 。充分 摇匀后，室温( 1 0 3 0 ) 放置1 5m i n ，离心3 5 0 0 r p m1 5m i n 。弃上清 液，在丫放射免疫计数器上测沉淀计数。结果处理以n t 、b t 计算 n b s 、s o 结合百分率，以b b o 计算标准及待测样品结合百分率，在半对 数坐标纸上绘制标准曲线，并查出样品值。 2 4 5 血尿生化指标测定 全自动生化分析仪测定f b g 、血肌酐、尿肌酐；计算c c r ( m 1 m i n l - k 9 0 ) = ( 尿肌酐每分钟尿量) 血肌酐体重( k g ) 】 2 4 6 光镜观察 已固定的肾脏组织梯度酒精脱水，石蜡包埋，制成4 9 m 厚病理切片， 分别进行h e 染色和p a s 染色。 h e 染色： h a r r i s 苏木素染色7m i n ，自来水冲洗多余的染液；1 盐酸酒精分化数秒钟，使细胞核呈紫蓝色，自来水中充分洗涤；1 氨 水中数秒，至返蓝；先自来水后至蒸馏水冲洗；l 伊红染色3m i n ； 常规梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。( 染色结果：细胞核呈 紫蓝色，细胞浆呈粉红色，基底膜、胶原纤维及肌纤维呈红色。) p a s 染色：切片常规脱蜡脱水；1 过碘酸水溶液染色1 0m i n ， 蒸馏水洗去过碘酸；入s c h i f f 试剂染色15m i r a o 5 亚硫酸氢钠处理 2m i n x 3 次后，流水洗5 m i n ；苏木精复染细胞核；水洗，脱水，透明， 封片。( 染色结果：细胞核呈蓝色，基底膜呈红色，。肾小球系膜基质呈红 色，胶原纤维、肌纤维及细胞浆呈红色。) 肾组织病理图像分析：应用i m a g e p r op l u s 专业图像分析软件对病理 切片( x 4 0 0 倍下) 进行图像分析。每张p a s 染色切片随机选择l o 个正切 的肾小球，测定m g a 及。肾小球内p a s 阳性染色面积，计算m m f 即p a s 阳性染色面积肾小球平均截面积，均取平均值作为每个标本的m g a 和 m m f ，并根据公式m g v = 1 3 k x ( m g a ) 引2 计算m g v t 4 1 ，1 3 = 1 3 8 ( 形态系数) ， k = i 1 ( 大小分布系数) ；最后进行统计分析。 2 4 7电镜观察 处死大鼠，取出肾脏，将肾组织标本( 切割成1 1 1m m 3 ) 立即放 入4 戊二醛固定液固定2h 后换成0 0 5 m o l l 磷酸盐缓冲液，1 锇酸室 研究论文 温固定1h 。依次经5 0 丙酮、7 0 丙酮、8 0 丙酮、9 0 丙酮各1 5 m i n ， 纯丙酮1 0 m i n x 2 次进行脱水。氧化丙烯透明1 0 m i n x 3 次。氧化丙烯 与e p o n 8 1 2 工作液等量混合，浸透肾组织块。新鲜配制的e p o n 8 1 2 工 作液包理肾组织5h 。包埋的组织块逐渐加温( 6 0 ) ，使之聚合变硬。 切片机制成l g m 半薄切片，o 5 美蓝溶液染色5m i n ，光学显微镜观察 定位，后切成0 3 x 0 2m m 3 的锥状体。超薄切片机制成5 0 0 a o 的超薄切 片，置于铜网火棉胶薄膜上。2 醋酸铀( p h4 2 ) 室温下初染3 0m i n ，再 以枸橼酸铅室温下复染2 0 m i n 。在电子显微镜下观察肾小球基底膜的厚 度、系膜基质及足突变化情况，并摄像。 2 4 8 免疫组织化学检测( s p 法) 石蜡切片4 9 m ，常规脱蜡至水。3 h 2 0 2 室温孵育1 5m i n ( 灭活 内源性过氧化物酶) ，蒸馏水冲洗，p b s 洗5 m i n x 3 次；o 1 胰酶室温 消化1 5m i n ，p b s 洗5 m i n x 3 次；1 0 正常山羊血清室温封闭1 5m i n ， 滴加一抗4 孵育过夜，抗体稀释度c 0 1 i v 为l ：1 0 0 ，s m a d l 为1 ：2 0 0 ； p b s 洗5 m i n x 3 次；滴加相应的生物素标记的二抗，3 7 孵育3 0m i r a p b s 洗5m i n x 3 次，滴加辣根过氧化物酶( h r p ) 标记的工作液三抗， 3 7 。c 孵育3 0m i n ；p b s 洗5m i n x 3 次；d a b 显色5 m i n ，自来水冲洗 终止显色；苏木精复染1m i n ，水洗，1 盐酸酒精分化，脱水，透明、 封片；镜下观察结果：阳性部位为棕黄色着色，阴性对照用p b s 代替 一抗，肾小球i v 型胶原表达采用半定量分析，即每张切片随机选取l o 个正切的肾小球( x 4 0 0 倍下) ，根据着色情况计算p i ，p i = 阳性信号面积 阳性强度，求和，取平均值。阳性信号面积计算方法：阴性无着色o 分，染 色区 1 5 着色4 分；阳性强度计算方法：阴性无着色o 分，弱阳 性1 分，中等阳性2 分，强阳性3 分。 2 4 9w e s t e m 印迹法检测肾小球s m a d l 蛋白表达 2 4 9 1 相关试剂配制 2 4 9 1 13 0 丙烯酰胺贮液：丙烯酰胺1 4 5 5 克和n ，n 甲叉双丙烯酰胺 o 4 5 克加双蒸水定容至5 0 m l ，滤纸过滤，棕色瓶4 保存 2 4 9 1 24 mh c l ：3 6 盐酸4 0 5 m l 加双蒸水定容至1 0 0 m l 2 4 9 1 31 5m 嘶s h c l ( p h8 8 ) 研究论文 i h s 1 8 1 6 9 4 mh c l 调p h 至8 8 ，加双蒸水定容至1 0 0 m l ，4 。c 保存备用 2 4 9 1 4 0 5m i r i s h c l ( p h6 8 ) t r i s 6 0 6 9 4 mh c l 调p h 至6 8 ，加双蒸水定容至1 0 0 m l ，4 。c 保存备用 2 4 9 1 51 0 a p s 1 0 0 m g 过硫酸铵，用l m l 双蒸水溶解，使用前新鲜配制。 2 4 9 1 61 0 s d s s d s1 0 9 ，双蒸水缓慢溶解，定容至1 0 0 m l ，常温保存。 2 4 9 1 7 5 电泳缓冲液( p h 8 3 ) t r i s 1 5 1 5 9 甘氨酸 7 2 0 5 9 s d s 5 9 双蒸水定容至1 0 0 0 m l ，用时稀释5 倍。 2 4 9 1 85 转移缓冲液 嘶s 1 5 1 5 9 甘氨酸7 2 0 5 9 双蒸水定容至8 0 0 m l ，用时取1 6 0 m l ，双蒸水稀释至8 0 0 m l ， 2 4 9 1 91 0 x t b s 漂洗液 嘶s 1 2 1 9 氯化钠40039 6 mh c l1 2 8 m l 双蒸水定容至5 0 0 m l ，用时稀释1 0 倍。后取1 x t b s 加o 2 5 2 4 9 1 1 01 0 x 丽春红染液 丽春红s2 9 三氯乙酸3 0 9 磺基水杨酸3 0 9 双蒸水溶解并定容至1 0 0 m l ，用时稀释1 0 倍。 2 4 9 1 1 11 0 分离胶1 0 m l 双蒸水40ml 3 0 a c r 3 3 m l 1 5mt r i s h c l 2 5 m l 1 0 s d s o 1 m l 1 2 1 0 a p s t e m e d 2 4 9 1 1 25 浓缩胶5 m l 双蒸水 2 8 2 m l 3 0 a c r0 8 3 m l o 5mt r i s h c l1 2 5 m l 1 0 s d s005ml 1 0 a p s0 0 5 m l t e