（内科学专业论文）定量检测中长dna片段在大肠癌诊断中的意义.pdf

原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研 究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人 或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集 体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人承担。 学位论文作者：桶砂翼日期：汐f 。年岁月纠日 学位论文使用授权声明 本人在导师指导下完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属郑州大学。 根据郑州大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部 门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权郑州 大学可以将本学位论文的全部或部分编入有关数据库进行检索，可以采用影印、 缩印或者其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。本人离校后发表、使用学 位论文或与该学位论文直接相关的学术论文或成果时，第一署名单位仍然为郑 州大学。保密论文在解密后应遵守此规定。 学位论文作者： 粕乡霁 日期：2 0f o 年，月引日 郑州大学2 0 1 0 届硕士毕业论文摘要 定量检测粪便中长d n a 片段在大肠癌诊断中的意义 硕士研究生杨少宾 导师李建生 郑州大学第一附属医院消化内科 河南郑州4 5 0 0 5 2 摘要 背景和目的 近年来，随着人民生活水平不断提高，饮食结构西方化，我国大肠癌的发 病率呈现逐年升高趋势，发病率已占到常见肿瘤的第四位。大肠癌的预后与病 变累及的范围直接相关。其五年生存率，局限于肠壁者为9 0 ，淋巴结受累者 为6 8 ，而发生远处转移者仅为1 0 。因此，通过对普通人群进行筛查可以提 高腺瘤性息肉和早期腺癌的诊断率，经结肠镜下切除息肉或手术切除，能显著 降低大肠癌的发病率和死亡率。目前常用的大肠癌筛查方法包括粪便隐血试验、 钡灌肠气钡双重造影、乙状结肠镜、结肠镜及仿真结肠镜等。粪便d n a 检测是 一种近年来新兴的非侵入性大肠癌筛查技术，它具有较高的敏感性和特异性， 且无需特殊肠道准备。2 0 0 8 年3 月美国癌症协会发布了最新的大肠癌早期诊断 的筛查和监视指南，2 0 0 9 年2 月美国胃肠病学院亦更新了大肠癌筛查指南，均 将粪便d n a 检测列为推荐的筛查方法之一。目前常用的粪便d n a 检测方法是 a p c 、k r a s 、p 5 3 基因突变、微卫星不稳定性以及d n a 甲基化等多项指标联 合检测，费用昂贵，不利于推广应用。为了降低成本，国外有学者采用定量检 测粪便中长d n a 片段的方法诊断大肠癌，但国内尚未见报道。本文应用荧光定 量p c r 技术检测了3 0 例大肠癌患者及3 0 例正常对照者粪便中的长d n a 片段， 以探讨该项技术的在大肠癌筛查中的可行性。 材料与方法 选取2 0 0 9 年5 月至2 0 0 9 年9 月郑州大学第一附属医院收治的3 0 例大肠癌 患者为研究对象，均经内镜或手术病理证实。其中男性1 7 例，女性1 3 例，男 t 郑州人学2 0 1 0 届硕士毕业论文摘要 女之比为1 3 1 ：l ，最大年龄8 2 岁，最小年龄2 1 岁，平均年龄5 7 2 7 士1 3 5 6 岁。 另选择3 0 例年龄匹配的全结肠镜检查阴性者为正常对照组。其中男性1 5 例， 女性1 5 例，男女之比为1 ：l ，最大年龄7 9 岁，最小年龄3 2 岁，平均年龄5 4 2 3 士1 2 8 3 岁。病例入选标准：( 1 ) 不伴其他部位肿瘤，( 2 ) 留取标本前未经任何治疗，( 3 ) 收集粪便前5 天内未进行任何侵入性操作，包括结肠镜、灌肠等。粪便标本于 术前或内镜检查前收集，收集后立即送至实验室，分装后置7 0 。c 冰箱保存备用。 按q i a a m pd n a s t o o lm i n ik i t ( q i a g e n ，德国) 说明书提取粪便中的总d n a 。提 取出来的d n a 保存在2 0 0 9 l 的a e 缓冲液中，并置于2 0 。c 冰箱中。参照文献的 人特异性的a l u 序列引物进行荧光定量p c r 扩增检测。实验结果应用s p s s l 7 0 统计软件处理。标准曲线制作应用直线回归法，各组间率的比较采用f 检验， 各组间检测数值的比较采用秩和检验( w i l e o x o n 法) 。检验结果以尸 0 0 5 ) 4 粪便中长d n a 片段检测大肠癌的敏感性显著高于粪便隐血试验( 4 6 6 7 v s2 6 6 7 ，p = 0 0 3 1 ) 。 结论 1 荧光定量a l up c r 检测粪便中长d n a 片段诊断大肠癌是简便、可行的 方法。 2 粪便中长d n a 片段含量与肿瘤发生部位有关，而与性别、年龄、肿瘤 大小及d u k e s 分期等均无关。 3 与粪便隐血试验相比，具有更高的敏感性。 4 荧光定量a l up c r 检测粪便中长d n a 片段的方法具有成本低的优势。 关键词：大肠癌粪便长d n a 片段a l u 郑州大学2 0 1 0 届硕士毕业论文 a b s t r a c t q u a n t i f y i n gh u m a nl o n gd n a i ns t o o lo f c o l o r e c t a ic a n c e rp a t i e n t s p o s t g r a d u a t ey a n gs h a o b i n s u p e r v i s o r l ij i a n s h e n g d e p a r t m e n to fg a s t r o e n t e r o l o g y , t h ef i r s ta f f i l i a t e dh o s p i t a l ，z h e n z h o uu n i v e r s i t y , z h e n g z h o u4 5 0 0 5 2 ，h e n a n ，c h i n a a b s t r a c t b a c k g r o u n da n do h e c t i v e i nr e c e n ty e a r s ，p e o p l eo fo u rc o u n t r ye n j o yah i g h e rs t a n d a r do fl i v i n g ，b u tt h e i n c i d e n c eo fc o l o r e c t a lc a n c e r ( c r c ) i n c r e a s e sg r a d u a l l yb e c a u s eo ft h ew e s t e r n i z i n g o fd i e th a b i t n o w , c r ch a sb e e nt h ef o u r t hm o s tc o m m o nc a n c e ri no u rc o u n t r y i t s p r o g n o s i sd e p e n d so n ，t h er a n g ei n v o l v e d f i v e - y e a rs u r v i v a li s9 0 i fc r c i s d i a g n o s e dw h i l es t i l ll o c a l i z e d ( i e ，c o n f i n e dt ot h ew a l lo ft h eb o w e l ) ，b u to n l y6 8 f o rr e g i o n a ld i s e a s e ( i e ，d i s e a s ew i t hl y m p hn o d ei n v o l v e m e n t ) ，a n do n l y10 i f d i s t a n tm e t a s t a s e sa r ep r e s e n t s oc r c s c r e e n i n gi nt h ea v e r a g e r i s kp o p u l a t i o nc a n r e d u c et h ei n c i d e n c ea n dm o r t a l i t yo fc r ct h r o u g ht h ed e t e c t i o no fe a r l y - s t a g e a d e n o c a r c i n o m a sa n dt h ed e t e c t i o na n dr e m o v a lo fa d e n o m a t o u sp o l y p s t h e c o m m o nu s e dt e s t si nc r cs c r e e n i n gi n c l u d e sf e c a lo c c u l tb l o o dt e s t ( f o b t ) ， d o u b l e - c o n t r a s tb a r i u me n e m a ( d c b e ) ，f l e x i b l es i g r n o i d o s c o p y ( f s i g ) ，c o l o n o s c o p y , a n dc o m p u t e dt o m o g r a p h i cc o l o n o g r a p h y ( c t c ) i nt h el a s td e c a d e ，s t o o ld n a t e s t - an e wn o n i n v a s i v et e c h n o l o g yo fc r c s c r e e n i n gh a sb e e nd e v e l o p e d ，w h i c hh a s l l i g hs e n s i t i v i t ya n ds p e c i f i c i t y , a n dr e q u i r e sn os p e c i a lb o w e lp r e p a r a t i o n s a m e r i c a n c a n c e rs o c i e t y ( a c s ) p u b l i s h e dt h el a t e s tg u i d e l i n e so fs c r e e n i n ga n ds u r v e i l l a n c ef o r t h ee a r l yd e t e c t i o no fc o l o r e c t a lc a n c e ra n da d e n o m a t o u sp o l y p si nm a r c h2 0 0 8 a m e r i c a nc o l l e g eo fg a s t r o e n t e r o l o g y ( a c g ) a l s ou p d a t e dt h eg u i d e l i n e sf o r i i i 郑州大学2 0 1 0 届硕士毕业论文 a b s t r a c t c o l o r e c t a lc a n c e rs c r e e n i n gi nf e b r u a r y2 0 0 9 s t o o ld n at e s th a sb e e no n eo ft h e r e c o m m e n d e ds c r e e n i n gm e t h o d sa c c o r d i n gt ot h et w og u i d e l i n e s t h em a r k e r so f s t o o ld n at e s ti n c l u d e s2 1s e p a r a t ep o i n tm u t a t i o n si nt h ek r a s ，a p c ，p 5 3g e n e s ； m i c r o s a t e l l i t e i n s t a b i l i t y ；d n am e t h y l a t i o n ，a n d s oo n t oa c h i e v ea d e q u a t e s e n s i t i v i t y , am u l t i t a r g e td n a s t o o la s s a yi sr e q u i r e d b u ti ti st o oe x p e n s i v et ob e w i d e l yu s e d i no r d e rt or e d u c et h ec o s t so fc r cs c r e e n i n g ，s o m ef o 俪印s c h o l a r s h a v ed e t e c t e dc r cw i t hq u a n t i f y i n gh u m a nl o n gd n ai ns t o o l ，w h i c hh a sn o tb e e n r e p o r t e di no u rc o u n t r y t h e r e f o r e ，w eq u a n t i f i e dh u m a nl o n gd n a i ns t o o lf r o m3 0 c a s e so fc o l o r e c t a ic a n c e ra n d3 0n o r m a lc o n t r o l sw i t hf l u o r e s c e n tq u a n t i t a t i v ep c r t os t u d yt h ef e a s i b i l i t yo ft h i st e c h n o l o g yi nc r c s c r e e n i n g m a t e r i a l sa n dm e t h o d s 6 0c a s e si n c l u d i n g3 0c r ca n d3 0n o r m a lc o n t r o l sw e r er a n d o m l ys e l e c t e df r o m t h ep a t i e n t si nt h ef i r s ta f f i l i a t e dh o s p i t a lo fz h e n g z h o uu n i v e r s i t yf r o mm a yt o s e p t e m b e r , 2 0 0 9 a l lt h ed i a g n o s e sw e r ev e r i f i e db yp a t h o l o g y t h ea v e r a g ea g eo f t h e3 0p a t i e n t sw i t hc r cw a s5 7 2 7 + 1 3 5 6 ( r a n g e ，2 1 8 2y r ) ，a n d1 7o ft h e3 0 p a t i e n t sw e r em e n t h er a t i oo f m a l e t of e m a l ew a s1 31 ：1 a m o n g3 0c a s e so f n o r m a l c o n t r o l si n c l u d e d15m a l e sa n d15f e m a l e s ，a n dt h er a t i oo fm a l et of e m a l ew a s 1 ：1 1 1 1 eo l d e s ta g ei s7 9y e a r so l dw h i l et h ey o u n g e s ti s3 2y e a r so l da n dt h ea v e r a g e a g ei s5 4 2 3 + 1 2 8 3y e a r so l d i n d i v i d u a l sw e r ee x c l u d e di fa n yo ft h ef o l l o w i n g c o n d i t i o n sa p p l i e d ：( 1 ) p e r s o n a lh i s t o r yo f , o rc o e x i s t e n tc a n c e r ；( 2 ) a c t i v et h e r a p y w i t hc h e m o t h e r a p yo rr a d i a t i o nt h e r a p y ；( 3 ) a n yi n v a s i v eo p e r a t i o n , s u c ha s c o l o n o s c o p yo re n e m a s t o o ls a m p l e sw e r ec o l l e c t e db e f o r ec o l o n o s c o p yo rs u r g e r y f r o mt h e6 0p a t i e n t s 1 1 1 es a m p l e sw e r es e n tt ot h el a b o r a t o r yi m m e d i a t e l ya n ds t o r e d i nar e f r i g e r a t o rs e ta t 一7 0 t o t a ld n aw a se x t r a c t e df r o ms t o o ls a m p l e sw i t h q i a a m pd n a s t o o lm i n ik i t ( q i a g e n ，g e r m a n ) d n aw a sf i n a l l ye l u t e di n2 0 0m b u f f e ra ea n ds t o r e da t 一2 0 ( 2 p r i m e r ss p e c i f i cf o rt h eh u m a na l us e q u e n c e sw e r e u s e dt oa m p l i f ys e q u e n c e s 一2 4 5 b pi n s i d ea l ur e p e a t s ，a n dt h eh u m a nl o n gd n ai n s t o o lw a sq u a n t i f i e d s t a t i s t i c a lt e s t sw e r ed o n eu s i n gs p s si7 0s t a t i s t i c a ls o f t w a r e l i n e a rr e g r e s s i o nm e t h o dw a su s e dt oc r e a t es t a n d a r dc u r v e 矿t e s tw a su s e dt o c o m p a r et h es e n s i t i v i t i e so ft h et w os c r e e n i n gm e t h o d s w i l c o x o ns i g n e d - r a n kt e s t w a su s e dt oc o m p a r et h eh u m a nl o n gd n al e v e l so fd i f f e r e n ts t o o lg r o u p s i v 郑州人学2 0 1 0 届硕士毕业论文 a b s t r a c t r e s u l t s 1 a m o n g6 0s t o o ls a m p l e s ，5 9c a s e so f h u m a nl o n gd n aw a sq u a n t i f i a b l e 2 t h el o n gd n aw a ss i g n i f i c a n t l yh i g h e ri ns t o o l sf r o mc r c p a t i e n t st h a nf r o m n o r m a lc o n t r o l s ( m e d i a n ，8 4v s 4 9 n g gs t o o l ；p = 0 0 0 1 ) a tal o n gd n ac u t o f fo f 15 0 n g gs t o o l ，s e n s i t i v i t yf o rc r cw a s4 6 6 7 ，a n ds p e c i f i c i t yw a s10 0 3 1 1 1 el o n gd n aw a ss i g n i f i c a n t l yh i g h e ri nd i s t a lc r cs t o o l st h a nf r o m p r o x i m a lc r c ( 2 81 5 n g gv s 7 5 2 n g g ；p = - 0 0 0 8 ) ，a n dw a s n o ti n f l u e n c e db yg e n d e r , a g e ，t u m o rs i z e ，o rd u k e ss t a g e 4 t h es e n s i t i v i t yo fl o n gd n af o rc r cw a ss i g n i f i c a n t l yh i g h e rt h a n f o b t ( 4 6 6 7 v s 2 6 6 7 ，p = 0 0 31 ) c o n c l u s i o n s 1 f l u o r e s c e n tq u a n t i t a t i v ea l up c ri sas i m p l em e t h o dt oq u a n t i f yh u m a nl o n g d n ai ns t 0 0 1 2 t h el o n gd n ai ns t o o lw a si n f l u e n c e db yt u m o rs i t e ，a n dw a si n d e p e n d e n to f g e n d e r , a g e ，t u m o rs i z e ，o rd u k e ss t a g e 3 t h es e n s i t i v i t yo fl o n gd n af o rc r cw a ss i g n i f i c a n t l yh i g h e rt h a nf o b t 4 q u a n t i f y i n gh u m a nl o n gd n a i ns t o o lw i t hf l u o r e s c e n tq u a n t i t a t i v ea l up c r h a st h ea d v a n t a g eo fl o w e rc o s tc o m p a r e dw i t ho t h e ra p p r o a c h e st oa s s a yl o n gh u m a n d n ai ns t 0 0 1 k e y w o r d s ：c o l o r e c t a lc a n c e r s t o o l l o n gd n aa l u v 郑州大学2 0 1 0 届硕士毕业论文 目录 目录 前 言1 材料与方法3 结果1 l 讨论15 小结18 参考文献19 综述粪便d n a 检测诊断大肠癌的研究现状及进展2 2 英文缩略词表4 1 致谢4 2 个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果4 3 v i 1 前言 定量检测粪便中长d n a 片段在大肠癌 1 前言 诊断中的意义 硕士研究生杨少宾 导师李建生 郑州大学第一附属医院消化内科 河南郑州4 5 0 0 5 2 大肠癌是最常见的恶性肿瘤之一。据美国癌症协会估计，2 0 0 9 年美国人中 共诊断出大肠癌1 0 6 ，1 0 0 例，同时有4 9 ，4 2 0 人死于大肠癌，其发病率和死亡率 在常见肿瘤中均排第三位【l 】。近年来，随着人民生活水平不断提高，饮食结构西 方化，我国大肠癌的发病率也呈现逐年升高趋势，发病率已占到常见肿瘤的第 四位【2 】，仅次于肺、胃、肝癌。2 0 0 5 年，大肠癌已占到上海市恶性肿瘤发病率 的第二位f 3 】。据估计，我国每年新发大肠癌病例高达4 0 万。 大肠癌的预后与病变累及的范围直接相关。其五年生存率，局限于肠壁者 为9 0 ，淋巴结受累者为6 8 ，而发生远处转移者仅为1 0 【4 1 。大肠癌中8 5 以上起源于腺瘤性息肉，而腺瘤性息肉发展为腺癌的时间间隔可长达5 - 2 0 年【5 】。 因此，通过对普通人群进行筛查可以提高腺瘤性息肉和早期腺癌的诊断率，经 结肠镜下切除息肉或手术切除，能显著降低大肠癌的发病率和死亡率【6 j 。 目前常用的大肠癌筛查方法包括粪便隐血试验、钡灌肠气钡双重造影、乙 状结肠镜、结肠镜及仿真结肠镜等【7 j 。粪便隐血试验是最常用的筛查大肠癌的方 法，主要优点是非侵入性、检测简单、价格便宜、病人易于接受，其缺点是无 法区别良恶性病变，敏感性和特异性欠佳，需反复多次检查才能达到一定的敏 感性，且易受某些食物及药物干扰，尤其是化学法的假阳性率较高。乙状结肠 郑州大学2 0 1 0 届硕士毕业论文1 前言 镜可以检查同时进行治疗，具有检查速度快、简便、易于耐受的优点，但只能 检查远端大肠，国内应用较少。结肠镜可以检查全结肠，并可直视下观察病变 并进行取材和治疗。它结合病理学被视为大肠癌诊断的金标准，常用于其他筛 查方法阳性时的进一步确诊。其缺点是侵入性，病人耐受性差，需要严格清洁 肠道准备，且需具备一定的设备和技术条件，费用较贵，并有肠道穿孔的风险。 钡灌肠气钡双重造影可以对全结肠进行检查，但不能活检或息肉切除，易受肠 道清洁状态的影响，并且发现病变后仍需结肠镜检查以确诊，常用于替代某些 不能耐受结肠镜检查的患者。仿真结肠镜优点为有较高的病人接受率，但价格 昂贵，对设备及技术要求高，同样受肠道清洁状态的影响，无法进行活检病理 检查，发现病变后仍需结肠镜检查才能明确诊断。 粪便d n a 检测是一种近年来新兴的非侵入性大肠癌筛查技术，与上述传统 筛查方法相比，它具有以下优势哺j ：l 、特异性强。粪便d n a 检测可以针对已知 的发生于大肠癌的特异性的基因突变或甲基化，其它消化道疾病很少引起假阳 性结果；2 、较高的敏感性，与粪便隐血试验相比，敏感性明显提高，因为d n a 从大肠癌和腺瘤细胞的脱落是持续性的，而大肠癌和腺瘤出血通常是间歇性的； 3 、非侵入性，检查方便，病人易接受，无需特殊肠道准备，饮食不影响检测结 果。2 0 0 8 年3 月美国癌症协会发布了最新的大肠癌早期诊断的筛查和监视指南 例，2 0 0 9 年2 月美国胃肠病学院亦更新了大肠癌筛查指南【1 0 】，均将粪便d n a 检 测列为推荐的筛查方法之一。 目前常用的粪便d n a 检测方法是a p c 、k r a s 、p 5 3 基因突变、微卫星不 稳定性以及d n a 甲基化等多项指标联合检测【1 1 。1 5 1 。在美国，大样本的研究显示， 第一代粪便d n a 检测试剂盒( p r e g e n p l u s ) 诊断大肠癌和腺瘤的敏感性分别 为5 2 和1 8 ，特异性为9 5 ，而检查费用约需4 9 5 美元，不利于推广应用。 我国大肠癌发病率呈逐年上升趋势，但限于经济等原因，筛查工作尚未普遍开 展，所以有必要寻找一种更适合我国国情的筛查方法。本文应用荧光定量p c r 技术扩增a l u 序列定量了3 0 例大肠癌患者及3 0 例正常对照者粪便中的长d n a 片段，以探讨该项技术的在大肠癌筛查中的可行性。 2 郑州大学2 0 1 0 届硕十毕业论文2 材料与方法 2 材料与方法 2 1 材料 2 1 1 研究对象 选取2 0 0 9 年5 月至2 0 0 9 年9 月郑州大学第一附属医院收治的3 0 例大肠癌 患者为研究对象，均经内镜或手术病理证实。其中男性1 7 例，女性1 3 例，男 女之比为1 3 1 ：l ，最大年龄8 2 岁，最小年龄2 1 岁，平均年龄5 7 2 7 士1 3 5 6 岁。 另选择3 0 例年龄匹配的全结肠镜检查阴性者为正常对照组。其中男性1 5 例， 女性1 5 例，男女之比为1 ：l ，最大年龄7 9 岁，最小年龄3 2 岁，平均年龄5 4 2 3 士1 2 8 3 岁。病例入选标准：( 1 ) 不伴其他部位肿瘤，( 2 ) 留取标本前未经任何治疗，( 3 ) 收集粪便前5 天内未进行任何侵入性操作，包括结肠镜、灌肠等【1 5 】。粪便标本 于术前或内镜检查前收集，收集后立即送至实验室，分装后置一7 0 冰箱保存备 用【1 6 1 。 2 1 2 组织病理学诊断 级) ； 2 1 2 1 诊断标准【1 7 】 ( 1 ) 大肠癌组织学类型： 1 ) 乳头状腺癌； 2 ) 管状腺癌( 根据癌细胞和腺管结构又可分为高分化、中分化和低分化三 3 ) 粘液腺癌： 4 ) 印戒细胞癌； 5 ) 未分化癌； 6 ) 腺鳞癌； 7 ) 鳞状细胞癌。 ( 2 ) d u k e s 分期标准： a 期癌瘤浸润深度未穿出肌层，且无淋巴结转移； b 期癌瘤已穿出深肌层，并可侵入浆膜层、浆膜外或直肠周围组织尚能完 3 郑州大学2 0 1 0 届硕士毕业论文 2 材料与方法 整切除，但无淋巴结转移； c 期癌瘤伴有淋巴结转移： c 1 期癌瘤伴有肠旁和系膜淋巴结转移； c 2 期癌瘤伴有系膜动脉结扎处淋巴结转移； d 期癌瘤伴有远处器官转移，或因局部广泛浸润或淋巴结广泛转移而切除 后无法治愈或无法切除者。 2 1 2 2 诊断结果 ( 1 ) 大肠癌组织学类型检测结果见表2 1 ； ( 2 ) 大肠癌发生部位检测结果见表2 2 ； ( 3 ) 大肠癌肿瘤大小检测结果见表2 3 ； ( 4 ) 大肠癌d u k e s 分期结果见表2 4 。 表2 1大肠癌组织学类型结果 4 郑州大学2 0 1 0 届硕士毕业论文2 材料与方法 表2 3 大肠癌肿瘤大小检测结果 肿瘤大小 4 e r a 合计 例数 1 41 6 3 0 百分比( ) 4 6 6 7 5 3 3 31 0 0 表2 4 大肠癌d u k e s 分期结果 d u k e s 分期a 期b 期c 期d 期不详合计 例数4 61 05 53 0 百分比( )1 3 3 3 2 0 3 3 3 31 6 6 71 6 6 71 0 0 2 2 方法 2 2 1 粪便中总d n a 的提取 1 8 】 2 ) 2 0 。c 普通低温冰箱( 海尔，青岛) 3 ) 电子天平( 常熟市金羊砝码仪器有限公司) 4 ) f i n n p i p e t t e 加样器( 芬兰) 5 ) 台式普通离心机( 江苏中大仪器厂) 6 ) 台式超低温高速离心机( h e r a e u s ，德国) 7 ) 电热恒温水箱( 上海宝磊仪器有限公司) 8 ) 液体快速混合器( 江西医疗器械厂) 9 ) 刮匙 2 2 1 2 主要试剂 1 ) 冰( 自备) 2 ) 无水乙醇( 洛阳昊华化学试剂有限公司) 3 ) q i a a m pd n a s t o o lm i n ik i t 试剂盒( q i a g e n ，德国) ，包括以下试剂： 5 郑州大学2 0 1 0 届硕士毕业论文 2 材料与方法 a ) 缓冲液a s l b ) 缓冲液a l c ) 缓冲液a w l d ) 缓冲液a w 2 e ) 缓冲液a e f ) i n h i b i t e x 药片 曲蛋白酶k h ) q i a a m p 旋转圆柱 试剂的准备： ( 1 ) a s l 缓冲液：使用前通过摇动充分混合a s l 缓冲液。如果形成沉淀， 放置在7 0 的水浴中直至完全溶解。 ( 2 ) a l 缓冲液：使用前通过摇动充分混合a l 缓冲液。如果形成沉淀，放 在7 0 。c 的水浴中直至完全溶解。不要将蛋白酶k 直接加入到a l 缓冲液中。 ( 3 ) a w l 缓冲液：a w l 缓冲液是浓缩的，第一次用之前加入2 5 m l 的无水 乙醇，每次用前应充分混合。 ( 4 ) a w 2 缓冲液：a w 2 缓冲液是浓缩的，第一次用之前加入3 0 m l 的无水 乙醇，每次用前应充分混合。 2 2 1 3 提取步骤 1 ) 用刮匙将冰冻的粪便分割成小块，称取2 0 0 m g 粪便放入2 m l 离心管中， 并把离心管放入冰中。要注意直至第2 步缓冲液a s l 加入，溶解标本后，标本 才能解冻，否则标本中的d n a 会被破坏。 2 ) 加入1 6 m la s l 缓冲液，持续涡流振动l m i n 或直至粪便均质化。 3 ) 10 0 0 0 9 离心2 m i n 使粪便微粒形成沉淀。 4 ) 吸取1 4 m l 上清液放入2 m l 离心管中，并丢弃沉淀。 5 ) 加入i n h i b i t e x 药片l 片，立即持续涡流振动l m i n 或直至药片完全悬浮。 室温下孵化悬浮液l m i n ，使p c r 抑制物被吸附在i n h i b i t e x 药片上。 6 ) 1 0 0 0 0 9 离心9 m i n ，沉淀粪便微粒及吸附在i n h i b i t e x 药片上的抑制物。 7 ) 离心后立即吸取全部的上清液放入1 5 m l 离心管中并丢弃沉淀。全速离 心标本3 m i n 。 8 ) 吸取2 5 1 x l 的蛋白酶k 放入一个新的2 m l 离心管中。 6 郑州大学2 0 1 0 届硕士毕业论文2 材料与方法 9 ) 从第7 步产物中吸取6 0 0 9 l 上清液放入装有蛋白酶k 的2 m l 离心管中。 1 0 ) 加入缓冲液a l6 0 0 i t l ，涡流振荡1 5s 。 11 ) 7 0 。c 孵化1 0 r a i n 。简单离心，以移除离心管盖内壁的液体。 1 2 ) 加入6 0 0 1 t l 无水乙醇溶解，涡流振荡混合。简单离心，以移除管盖内壁 的液体。 1 3 ) 在q i a a m p 旋转圆柱提供的2 m l 收集管贴上标签。小心吸取第1 2 步产 生的溶解液6 0 0 1 t l 放入q i a a m p 旋转圆柱中，注意不要触及边缘。盖紧盖子， 1 0 0 0 0 9 离心2 m i n 。把q i a a m p 旋转圆柱放入一个新的2 m l 收集管中，丢弃含有 滤出液的收集管。如果离心后溶解液没有完全通过圆柱，再次离心直至q i a a m p 旋转圆柱变空。 1 4 ) 小心打开q i a a m p 旋转圆柱，再次放入第1 2 步产生的溶解液 6 0 0 9 l ，1 0 0 0 0 9 离心2 m i n 。把q i a a m p 旋转圆柱放入一个新的2 m l 收集管中，丢 弃含有滤出液的收集管。 1 5 ) 重复第1 4 步放第三次溶解液于旋转圆柱中。 1 6 ) 小心打开q i a a m p 旋转圆柱，加入缓冲液a w l5 0 0 r t l 。盖上盖子，1 0 0 0 0 9 离心2 m i n 。把q i a a m p 旋转圆柱放入一个新的2 m l 收集管中，丢弃含有滤出液 的收集管。 1 7 ) 小心打开q i a a m p 旋转圆柱，加入缓冲液a w 25 0 0 1 t l 。盖上盖子，1 0 0 0 0 9 离心6 m i n 。丢弃含有滤出液的收集管。 1 8 ) 把q i a a m p 旋转圆柱放入一个新的2 m l 收集管中，丢弃含有滤出液的收 集管。1 0 0 0 0 9 离心2 m i n 。 1 9 ) 把q i a a r n p 旋转圆柱放入一个新的贴有标签的1 5 m l 离心管。小心打开 q i a a m p 旋转圆柱并吸取2 0 0 9 l 缓冲液a e 直接加到q i a a m p 膜上。盖上盖子， 室温孵化1 m i n ，然后10 0 0 0 9 离心2 m i n 以洗提d n a 。 2 0 ) 将洗提出的d n a 分装后一2 0 。c 保存备用。 2 2 2 荧光定量p c r 2 2 2 1 主要仪器 1 f i n n p i p e t t e 加样器( 芬兰) 2 ) 台式普通离心机( 江苏中大仪器厂) 7 郑州大学2 0 1 0 届硕+ 毕业论文 2 材料与方法 3 ) 实时荧光定量p c r 扩增仪( r o c h el i g h t c y c l e r2 o ) 2 2 2 2 主要试剂 1 ) 人类基因组d n a ( p r o m e g a ，美国) 2 ) t e 溶液( 1 0 m mt r i s h c l ，p h8 0 ，l m me d t a ) 3 ) r e a l m a s t e r m i x ( s y b rg r e e n ) 荧光定量p c r 试剂盒( 天根生物) ，包括： r e a l m a s t e r m i x ( 2 5 x ，含r o x 内参染料) 2 0 x s y b rg r e e ns o l u t i o n 注意：第一次使用前把2 0 x s y b rg r e e ns o l u t i o n 室温下平衡并彻底混匀， 将12 5 1 a l 的2 0 x s y b rg r e e ns o l u t i o n 加入到1 0 m l 的2 5 xr e a l m a s t e r m i x 中。 4 ) 去离子水( 天根生物) 2 2 2 3引物合成 根据参考文献进行引物合成【19 1 。 上游引物为57 a c g c c t g l i a a t c c c a g c a c l v r 3 。 下游引物为5 t c g c c c a g g c t g g a g t g c a 3 。 扩增目标序列为a l u 序列中长2 4 5 b p 的基因片段。 2 2 2 4p c r 反应体系组成：见表2 5 所示。 表2 5p c r 反应体系组成 成份体积 r e a l m a s t e r m i x ( s y b rg r e e n ) 1 0 p m o l l 的上游引物 l o p m o l l 的下游引物 d n a 模板 去离子水 总计 1 1 2 5 p l 0 5 m 0 5 p l 1 p l 至2 5 1 a l 2 5 山 8 2 材料与方法 4 0 s ，共2 3 个循环， 2 2 3 标准曲线的制作 本研究的核心技术为荧光定量p c r 技术。荧光定量p c r 技术，是指在p c r 体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个p c r 进程，最后通过标 准曲线对未知模板进行定量分析的方法。荧光定量p c r 具有以下优点：特异性 好；线性关系好、线性范围宽：操作简单、安全、自动化程度高；速度快、高 通量。 荧光定量p c r 主要分为：1 非特异性荧光定量p c r ：如s y b rg r e e ni 染 料法：2 特异性荧光定量p c r ：如t a q m a n 法( 荧光探针法) 、b e a c o n 法( 分 子信标法) 、f r e t 法( 双杂交探针法) 等。本实验采用的是s y b rg r e e ni 染料 法。与其他几种方法相比其优点有：实验设计简单( 仅需上、下引物，不需要 设计探针) ；无需设计多个探针即可检测多个基因，通用性好；成本低；且能够 进行熔解曲线分析检验扩增反应的特异性。 c t 值：荧光定量p c r 扩增过程中，每个反应管内扩增产物的荧光信号达到 设定的阈值所经过的扩增循环次数。研究表明，每个模板的c t 值与该模板的起 始浓度的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，c t 值越小。利用已知起始浓度 的标准品可作出标准曲线，因此只要获得未知样品的c t 值，即可从标准曲线上 计算出该样品的起始浓度。 为了定量粪便中的长d n a 片段，将人类基因组d n a 用t e 溶液1 0 倍系列 稀释为0 0 0 1 n g 、0 0 1 n g 、0 1 n g 、l n g 、1 0 n g 作为定量标准品，将待测的粪便d n a 和系列稀释的人类基因组d n a 置于同一实验中进行反应，用稀释的人类基因组 d n a 构建标准曲线，然后再将待测的粪便d n a 的c t 值带入到标准曲线方程， 计算出粪便d n a 的起始浓度。 本实验中，每次反应均设标准品和阴性对照。每个样品两个重复。 2 2 4 粪便隐血试验 每一例标本均采用粪便隐血半定量双联法试剂组( q c b i o ，上海) 进行粪 9 2 2 5 统计学处理 实验结果应用s p s s