（农业昆虫与害虫防治专业论文）粘虫迁飞型转为居留型的关键时期和调控基础.pdf

图目录 图1 1a t 和a s t 对一点粘虫可能作用的与迁飞和生殖相关的靶标部位以及信号传递路径l l 图l 一2 技术路线1 7 图2 1 不同日龄迁飞型粘虫峨饥饿2 4h 后产卵前期的变化2 l 图2 2 不同日龄居留型粘虫蛾饥饿2 4h 后产卵前期的变化2 2 图2 3 不同日龄迁飞型粘虫蛾饥饿2 4h 后总产卵量的变化2 3 图2 - 4 不同日龄居留型粘虫蛾饥饿2 4h 后总产卵量的变化2 4 图2 5 不同日龄迁飞型粘虫雄蛾饥饿2 4h 后求偶前期的变化2 8 图2 6 羽化后o 3 0 h 内不同时间段饥饿处理对粘虫产卵前期的影响2 9 图2 7 羽化后o 3 0 h 内不同时长饥饿处理对粘虫产卵前期的影响3 0 图2 - 8 羽化后粘虫蛾在0 2 4b 内不同时段内的取食量3 l 图3 11 日龄迁飞型粘虫蛾不同温度处理后的产卵前期一3 8 图3 21 日龄迁飞型粘虫蛾不同光周期处理后的产卵前期3 9 图3 3 不同日龄迁飞型粘虫蛾低温处理2 4h 后产卵前期的变化4 0 图3 4 不同日龄居留型粘虫蛾5 处理2 4h 后产卵前期的变化4 1 图3 5 不同日龄迁飞型粘虫蛾光照处理后产卵前期的变化4 2 图3 _ 6 不同日龄居留型粘虫蛾长光照处理2 4h 后产卵前期的变化4 3 图3 7 不同日龄迁飞型粘虫蛾低温处理2 4h 后产卵量的变化4 4 图3 8 不同日龄居留型粘虫蛾5 处理后产卵量的变化4 5 图3 9 不同日龄迁飞型粘虫蛾光照处理2 4h 后产卵量的变化4 6 图4 11 日龄饥饿对卵巢发育级别的影响5 7 图4 21 日龄饥饿对粘虫蛾中胸背纵肌干重的影响5 8 图4 31 日龄饥饿对粘虫飞行距离的影响5 9 图4 41 日龄饥饿对粘虫飞行时间的影响5 9 图4 5j hi 标准样品保留时间示意图6 1 图4 6j hl i 标准样品保留时间示意图6 1 x i j i 表目录 表1 1 迁飞型与居留型分化具有敏感时期的种类4 表2 1 不同日龄迁飞型粘虫蛾饥饿处理2 4h 后的产卵历期、交配率及成虫寿命2 6 表2 2 不同日龄居留型粘虫蛾饥饿处理l # l 委k 羹埴薛啦澎蠢藜蟹型雨嘉鹜一一一一。，n i 蓼g 。：壁竺粤器嚣嚣靖慕西醛e 而甄匏j m l 舶蓁剥蠢麓型，蓦蒜剿嚣魁烈鑫羹一r s n y p m s s 1 9 95 ，1 0 5 - 1 1 6 1 1 2 l e ek y ，c h 啪b e r l i nm e ，h o m d y s k ifm ，b i ol o g i c a la c t j v 耐o fm 孤击啦口j 眈， a l l a t o t r 。p i n - l j k ep e p t i d e s ，p r e d i c l e dp r o d u c t so fti s s u e - s p e c i f i c 柚dd e v e l o p m e m a l l y r c g u l a t e d a i t e m a t i v e l ysp l i c e dm r n a s p 倒 d 哪2 0 0 2 ，2 3 ：1 9 3 3 1 9 4 1 1 1 3 l 。e sa d ，n l ee n d o c r i n ec o n t r 0 10 fp o l y m o r p h i s mi na p h i d s 如v 眺6 ，口胞且妇r 加。三0 1 9 8 3 ， 1 ：3 6 9 - 3 7 7 、 1 1 4 l e w i st ，1 h ew m 盯a l l dm 船sf i i g l l t so f功声删印协口爿硎明西肋 1 9 6 4 ，5 3 ：1 6 5 - 7 0 1 1 5 l s ，j i 锄gr j ，c m x ，a l l at 0 1 r o p i c 蛐da l l a t o s t a 士i c 扯廿v n i e si ne x t so f b r a 抽如dt 1 1 e e 施c t so f 蚴砌j 科船a n a t o 仃0 p i n 帅d 脑靴妣口s “缸a l l a t o s t a 曲o n j u v e n i l eh o m cs y n t h e s i s 英文缩略表 英文缩写 a s t a t c a c d n a d e p c e d t a j h j h a j h a m t j h e 腼h m r n a p b s p o p r p h p l c r q _ p c r i u r _ p c r s d s s q r t - p c r v g 英文全称 a i l a t o s t a n n a a l o t m p i n c o r p o r aa l i a t a c o m p l e m e n t a r yd e o x ”i b o n u c l e i ca c i d d i e t h y lp y r o c a r b o n a c e e t i l y l e n e dl i a m i n et e t r a a c e t i ca c i d j u v e n i l eh o r m o n e j u v e n i l ch o r m o n e8 c i d j u v e n i l eh o n n 0 a c i dm e m y l t r a r l s f b r 勰e j u v e n i i eh o m l o n ee s t e r 醯e j u v e n i l eh 0 肌o n ee p o x i d eh y d r o l a s e m e s s e n g e rr i b o n u c l e | ca c i d p h o s p h a i e - b u 仃e r e ds a i i n e p r e - a v 谛o s 姑0 np c r i o d 中文名称 咽侧体抑制素 促咽侧体素 咽侧体 互补脱氧核糖核酸 焦碳酸二乙脂 乙二胺四乙酸 保幼激素 保幼激素酸 保幼激素酸甲基转移酶 保幼激素酯酶 保幼激素环氧化物水解酶 信使核糖核酸 磷酸盐缓冲液 产卵前期 r e v e r s e p h a s e h i 曲p 。哟“”。 l i q “i d 反相高压液相色谱 d h f o m a t o 鲫h y r e a l - t i m eq u ”t i 诅t i ” p 0 l y ”。”。 c h a m 实时定量聚合酶链式反应 r e a c n o n r e v e r s et r m s c r i p t i o np o l y m e r ec h a i nr e a c t i o n 反转录聚合酶链式反应 s o d i 岫d o d e c y ls u l f a 十二烷基硫酸钠 s 。i - q “”i 诅t i v e 。8 。8 。妇“3 。i p t i o “ “d 半定量反转录聚合酶链式反应 v i t e o g e n i n 卵黄蛋白原 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业科学院或其它教育机构的学位或证 书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了 明确的说明并表示了谢意。 研究生签名：弓苏一萄 时间：勿咖6 月 矽日 关于论文使用授权的声明 本人完全了解中国农业科学院有关保留、使用学位论文的规定，即：中国农业科 学院有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩 印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业科学院可以用不同方式在不 同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 论文作者签名：3 名乙药 导师躲孀伽火，c 时间：? 矿l ，舌年名月? 护日 时间：伽厶年乡月影日 中国农业科学院博士学位论文第一章引言 测定c a 的合成活性，发现m 在三龄和四龄期尚可以检测到，但在末龄幼虫期合成率较低，此后稳 定下降直至无法检测。通过对幼虫最后两个龄期c a 台成率的研究，发现脑部在不同的时期通过不 同的途径来调节c a 合成j h ( g u ，1 9 9 5 ) 。同时研究表明a s t 除_ ，调控埘的合成速率外，对飞行个 体体内的能源物质的积累也有显著的促进作用。在大多昆虫的中，主要通过a s t 的释放来抑制小 滴度。咀及刺激中肠酶的活性来促进能源物质的吸收和积累( f l l s e ，1 9 9 9 ) 从而为昆虫充足的能源物 质，保证飞行的顺利进行。同时，a s t 在此过程中抑制卵黄蛋白的发生。然而，当飞行开始后， 体温迅速上升，当将虫体从低温转移到高温时，虫体内的j h 水平快速上升( c l i s s o n 1 9 9 0 ) 。 图1 1 a t 和a ”对一点粘虫峨可能作用的与迁飞和生殖相关的靶标部位以及信号传递路径f ig2 p o s s i h l e 嘴e b 亿r 划l 龇埘佃( a s 砷呻da l l 呦“砷岫a t ) 讯舳础t 妒“聊细a d u l 协， 辨s o c l a l c d w i m m 铲“l o n 帅d ，0 r 他掣。d u c “o ns o l i d l h c s 阼p m 辨n tk n o w n p 棚1 w a y s h p “h 静埘衄 w h i i e b r o k e n i i n 嚣晰p u i n i v e b a 赞d o n i 砌b n n a t i 。n 丘o mo t h e rs p c c i 岱t a g ：k m l i n 缸a b d o m 如a i g 蛐g l i o 喵v n c ：v e n t m l 眦r v e 咄d 目前己从烟草大蛾射豳批口s 艘岫中提纯出了有活性的 俅之为m 蚍s e _ a t 研究结果表明，该 纯化后物质对成虫的c a 有着明显的促进作用，而对烟草天蛾的幼虫和蛹没有影响。相关研究结果 说明，m a 眦e - a t 的活性可能仅对鳞翅目昆虫的成虫有救。p e i e r 删) 0 0 ) 等从一点粘虫体内分离克隆 到了编码a t 基因的c d n a 序列，通过对六龄幼虫至5 日岭成虫体内的臌达情况的研究，结果表明 甲 x 中国农业科学院博士学位论文 第二章关键时期的确定 阶段( 目龄) 饥缓处理对粘虫蛾生殖行为的影晌进行了较为系统的研究，现总结如下。 2 2 材料与方法 2 2 1 实验虫源及饲养方法 虫源来自田间采集的越冬代粘虫成虫经室内繁殖l 、2 代粘虫蛾。实验共设两种不同的密度处 理( 罗礼智，1 9 9 5 ) ，分别为1 0 头，瓶( 9 x 1 3 c m ) 和1 头，瓶( 9 1 3 c m ) ，处理均从幼虫孵化后( 1 0 h ) 开始。 幼虫采用3 0 5 0 c m 高的玉米苗饲养，温度为2 3 士1 ，光周期为l 1 4 ：d l o 湿度为7 0 r h 左右。 每日更换饲料，直至幼虫停止取食为止。幼虫老熟时，在玻璃瓶内加入含水量1 0 1 5 的土粒供 其化蛹，选择蛹重为0 - 3 o 4 9 的成虫做试验材料。其中。单头饲养的为散居型( 居留型) ，1 0 头，瓶 饲养的为群居型( 迂飞型x 罗礼智等，1 9 9 5 a c ) 。 2 2 2 关键时期的确定 成虫期不同发育阶段饥饿处理方法本实验中成虫的发育时期均是从成虫刚刚羽化开始计 时，饥饿处理时间分别是羽化后l 6 日龄，饥饿处理时间为2 4 h 。 x 中国农业科学院博士学位论文 第二章关键时期的确磋 i ： ；o ；童 鏊奏5 岬 雕l 翼焉皂 岜望 日q i u 羁l 器挂l ；剐 譬 薹圭 1 n 萋霪t 爨 j ii i s h # ! ；i = # 8 篓i z l 撮瞪鼙酾引葡衔戮型薹副孙摹i 鬟晶剐鹊铂型噩荫塞 芒境t 拦i 商i 蠹善 毒h 需群# g 蕈“啊；垂蠹蒜掣黪麓释u 自剐蕊l i 菩 晤嚣拿黻釉筹箩蓄i 錾司l 荤墼ju _ 罐s # * 掣； z 犁萄 标准误，c k l 为迁飞型对照，c k 2 为居留型对照，每个柱上具有不同字母的为d u n c 眦多重比 较差异显著( o 0 5 水平) ：饥饿处理统计蛾数从左到右依次为1 5 、1 6 、1 6 、1 3 、1 4 、1 3 、1 3 、1 6 对 da 诅鼬p 陀s c n t e d 嬲m 啪s e t h cc k li st h cm i g r a t o r yc o m r o i ，t 1 1 ec k 2i st i cn o n - m i 辨c o r yc o n 劬1 b 璐s h a r i n g t 1 1cs 哪e l c t t c r s 眦n o ts i 印i 6 c 明廿y d i 氐姗ta 主5 l e v e ib y d m r t n c s 锄p l cs i z c 劬m l 曲t o n g h t i s l 5 1 6 1 6 ，1 3 ， 1 4，1 3 ，1 3 d 1 6p a i 喝r p c c t i v c l y 2 3 3 交配率 迁飞型粘虫饥饿对迁飞型粘虫蛾的交配能力也有一定的影响，并和饥饿日龄密切相关f 表 2 1 ) 。1 日龄饥饿处理对粘虫成虫的交配率有促进作用。1 日龄饥饿后的粘虫成虫的交配率增加为 83 3 3 ，高于迁飞型对照，并且和居留型对照的交配率接近。1 日龄后饥饿处理成虫交配率随处 理 日龄逐渐降低，2 4 日龄成虫交配率和迁飞型对照没有很大的差异，6 日龄粘虫蛾的交配率最 低，为5 0 。 2 4 中国农业科学院博士学位论文 第二章关键时期的确定 居留型粘虫饥饿对居留型粘虫成虫的交配率有一定影响( 表2 2 ) 。l 3 日龄饥饿处理的粘虫 的交配率均为8 0 左右，与居留型对照没有明显差异。但4 、5 、6 日龄饥饿处理成虫的交配率比 较低，分别为“，6 3 、5 6 4 4 和6 2 。 2 3 4 成虫寿命 迁飞型粘虫不同日龄饥饿对迁飞型粘虫成虫的寿命没有显著的影响( 表2 1 ) 。1 日龄饥饿后 雌成虫的寿命低于迁飞型对照的1 4 5 天但差异不显著( 尸 0 0 5 ) 。2 6 日龄饥饿处理的雌成虫和 迁飞型对照差异也不显著( p o 0 5 ) 。不同曰龄处理后，饥饿处理雄蛾的寿命和迁飞型对照差异均不 显著( p o 0 5 ) 。 居留型粘虫饥饿处理对居留型成虫的寿命也有一定的影响( 表2 - 2 ) ，羽化后l 3 日龄进行 饥饿处理，对雌蛾寿命影响不显著 o 0 5 ) 。但4 6 日龄饥饿处理，雌虫寿命显著下降。并与对 照差异显著( p o 0 5 ) ，5 、6 日龄饥 饿处理，雄蛾寿命显著短于对照畔0 0 5 1 。 3 3 结果分析 3 3 1 处理条件的确定 低温处理条件的虫产卵量酌纂。舅“酗翳扎銎墼靼列，睢羹卧弱蹦塑藤器翟黑矍嚣l 蘩 i 。i i 。窝鞠“鬟i ；墓旧名隹渊埋坷4 盈博i = 薹毫 “i ”：埋渖项博超弋珥蚕蝴d 柚础翔影柏 封委蠡? 下降再蠹器e 嚣| ；_ 目；。畦i 萎 瞄轧器”挞爹矗；釜，；i 羹谨硝塞i 誉喇霎抚刚一科氡 氧番骑蠹攀i 锑澎囊够醴“h ；h ”l 薹耋蒌印垂也可促进雄 娥的性成熟提前，导致求偶前期显著 缩短。m d n e i l ( 1 9 8 6 ) 认为求偶前期的延长是迁飞昆虫典型的特征。王玉正等( 2 0 0 1 ) 指出粘虫雌、雄 峨在求偶以前是生殖滞育的，求偶行为的发生是迁飞行为终止的重要标志，并根据雌雄虫求偶前 期和性反应期的长短对粘虫的迁飞型和居留型进行了划分。 l 曰龄饥饿处理后迁飞型粘虫蛾的产卵前期显著缩短，雄蛾求偶前期也显著缩短。说明1 日龄饥饿处理导致具有迁飞倾向粘虫的发育方向改变，由迁飞转向生殖。产卵量等数据也说明。1 日龄饥饿处理对迁飞型粘虫的作用在生殖上是积极的。蟋蟀朋础g ，y f f mc o ，舯删w 长翅型的产 卵量低于短翅型，但新羽化长翅型成虫去翅后产卵量显著增加o 孤a k a ，1 9 9 3 ) 。并且在食物有限的 情况下，去翅长翅型雌虫比短翅型雌虫产生更多的卵，可能是由于前者将飞行肌组织解离的营养 用于卵的生成。未去翅的长翅型雌虫取食量低于去翅和短翅雌虫。这些研究结果表明。长翅型成 虫将从食物中获得的能量主要用于飞行肌的发育和身体的维持，其次才是生殖；而短翅型将能量 用于产卵和延长寿命。羽让后去翅的长翅型成虫飞行胍解离，并几乎将能量都用于生殖( 1 锄立k 毛 1 9 9 8 ) 。结果预示着成虫羽化后能量分配和“此消彼长”现象在翅型分化中起着关键的作用。证明环 境因子刺激之后，使成虫发育的方向改变，发育的重点由飞行系统发育转向生殖系统。但是并未 研究不同去翅时闺对长翅型成虫产卵量和飞行能力的影响。本文中1 日龄饥饿处理后产卵量增加， 和蟋蟀中的这种结果相类似，即1 日龄饥饿后粘虫飞行肌解离，几乎将所有的能量都用于生殖。 并且在生理上也得到了一定的证实。即1 日龄饥饿处理后粘虫卵巢发育加速，飞行肌提前降解( 张 蕾，待发表) 。然而，其它日龄的处理却看不到类似的影响。罗礼智等( 1 9 9 9 ) 通过研究不同日龄飞 行对生殖的影响。发现只有1 日龄飞行有显著缩短产卵前期，增加产卵量的作用。此外，在成虫 期不同日龄低温、光照处理对迁飞型粘虫生殖影响的实验中也发现( 张蕾，待发表) ，只有1 日龄 中国农业科学院博士学位论文 第三章关键时期起作用的主要环境因子 萼 羲 址； 主 一m 不理 3 3 2 产卵前期 低温处理迁飞型粘虫产卵前期低温处理日龄的不同对迁飞型粘虫成虫的产卵前期有显著 的影响( 图3 - 3 ) 。实验表明，1 日龄迁飞型粘虫蛾5 处理后，成虫产卵前期显著短于迁飞型对照 ( p 0 0 5 ) 。1 目龄低温处理成虫个体问 的产卵前期前后相差仅有4 天，而对照的相差有8 天之多。因此，1 日龄低温处理不仅缩短了成 虫的产卵前期，而且也增加了成虫产卵的整齐度。和其它日龄低温处理结果相比，1 日龄低温处 理后迁飞型成虫的产卵前期最短( 7 天) ，并显著( p ( o 0 5 ) 低于对照的9 4 天及其它日龄低温的产卵 前期。6 日龄低温的成虫产卵前期最长。为1 0 9 天，和迁飞型对照粘虫的产卵前期差异显著 ( p o 0 5 ) 。这些结果表明，只有1 日龄( 羽化后0 2 4 h ) 低温处理才会使成虫的产卵提前。低温日龄 推迟延迟成虫产卵。 2 o 8 6 4 2 o 中国农业科学院博士学位论文第三章关键时期起作用的主要环境因子 h 躁 墟 器 牝 1 0 ckld1d2d3d4d5d6cl(2 处理日龄 t r e a t - e n ta g e 国3 4 不同日龄居留型拈虫蛾5 处理2 4 h 后产卵前期的变化f i 昏3 4t h cp m o v i p o s i t i o n p e 一0 d o f l l l e n o n - m i g 哪m y 肛明胛埘t n o 血s foilowing 24h 仃咖锄t 砒5 a td i 丘h 舶td 8 粥o f p o s t - e m e r 9 0 n c e 图中cki为迁飞型对照，ck2为居留型对照每个柱上具有不同字母的为dunc蛐多重比较差异显著(o05水 平1；低温处理统计峨数从左到右依次为19、16、16、15、14、14、14、19对 d a t a 晰p r c s 即t c d 鹊m s e t h c c k l j s t l e 耐g r a t o f yc o n 咖l ，t h c c 】( 2 i s t h en o n - m j g 叫o r yc 曲酬b a r s s h 盯i “gm e samc k t c e r sa r en o ts i 印i n c 柚t l y d i 腑地n t “5 l c v c ib yd m r l ：抽e 锄p l cs i 嚣骱ml c nt o g h ti s1 9 ， 16，16，15，14。14，14a d1 9p a i 陪，r c s p e c t i v c l y百 显著的影响(图3-5)。实验表明，1日龄迁飞型粘虫蛾24h光照处理后成虫产卵前期显著短于迁 飞型对照(po05)。1日龄24 h长光照处理成虫个体间的产卵前期前后相差仅有5天而对照的相差有7天之多。因此，1曰龄24h长光照处理不仅缩短了成虫的产f_前期而且也增加了成虫产卵的整齐度。和其它日龄光照处理结果相比，1日龄24h光照处理后迁飞型成虫的产卵前期最短，并显著(p(o05)低于对照的及其它日龄低温的产卵前期。6日龄低温的成虫产卵前期最长，和迁飞型对照粘虫的产卵前期差异显著(po05)。这些结果表明，只有1日龄(羽化后o24h)低温处理才会使成虫的产卵提前。低温日龄推迟，延迟成虫产卵。486420 中国农业科学院博士学位论文 第三章关键时期起作用的主要环境因子 i 羹 萋盘 ckld1d2d3n4d5 图3 6 不同日龄居留型粘虫蛾长光照处理2 4 h 后产卵前期的变化f i 9 3 - 6n cp 陀o v i p i 曲n pc南do f t h e n - m i g 眦o r ym 明即嘲m o t i l sf o l l o w i n g 2 4hl i g h ta td i 腩咒n td 8 y so fp o s 呦h g c n 图中ckl为迁飞型对照，ck2为居留型对照每个拄上具有不同字母的为dunc蛐多重比较差异显著(005 水平)光照处理统计蛾数从左到右依次为i9、16、16、13、14、13、13和19对 d a 诅唧p r e 辩n t e d 鹤m 锄士s e t h c c k li s t h c m i g r a t o r yc o n 呐i ，t l l c c k 2 i s 也c n o n m i 鲫t o r y c o n 们1 b 粥s h a r i n g t h es a m e i c n c f s a r c n o ts i 酗m c 蛐t l y d i f r 就n t a t5 i c v e l b y d1僦ne s 娜p l e 跫的m i e r t o 曲t i s 1 9 ，1 6 ，1 6 ，1 3 ，1 4 ，1 3 ，1 3and1 9p a j 阽，m s p e n i v e l x3 3 3 产卵量 低温处理迁飞型粘虫产卵量5 处理对粘虫蛾的产卵量有显著的影响，影响的程度随日龄 而异。1 日龄成虫5 处理2 4 h 后的产卵量显著( p o 0 5 ) 高于迁飞型对照( 图3 7 ) 。表明低温刺激有促进产卵的作用，导致成虫的产卵量增加。从不同低温处理日龄的影响作用来看( 图3 7 ) 1 日龄 低温处理的成虫产卵量最高比迁飞型对照的高出52，且差异显著口o05)，并分别比2、3、4、5和6日龄低温的粘虫高出22、49、5l、63和107且和2、3、4、5、6、日龄低温处 理的差异显著( p 0 0 5 ) 。2 日龄低温处理的成虫产卵量仅次于1 日龄低温处理的产卵量，比迁飞型 对照的高出25，且差异显著(po。05)。并且，低温处理后粘虫产卵量的大小也显现出和处理层龄的相关性。随着处理日龄的延迟，粘虫的产卵量也逐渐的下降。6日龄的产卵量壤低，和迁飞型对照粘虫的产卵量的差异不显著俨 o 0 5 ) 。不同日龄光照处理对雄蛾的寿命的影响差异也不显著( p o 0 5 ) 。 兰 i 瓮 l l 毒 i 璺 i 鬲 誉 差 i 墨 l 毯 竺2 旨曼凸茸百墨裘兰口要=口8ijl矗锡冀-尝：lp3薯 茸t言110j器d|一幽一-是u暮目鼋g尝芒11pa口甍p哪点pi善一目珥1与基l点量口-。童一甚蠕毒一昌口8奇。墓冒自言罢_譬uu告一量c8b暑鱼甚菩sii苦otu 一繁n。o)摊吲眯槲铎譬恻媳善u旨。最g茸蚪叵恃扭喊士妊i带g巴嗤弹雌m翠露状啦瓣崧耳螺最廿赫壮i豫譬岳皿群牛坩匿靛副跚暑f状)lu莨耐p壬靛爱u cl&：一 三鲞譬一 告一 noo文o一80叶小一 帆n 嗜f c n 心 一n o 喝吧啦 晕窜0l薯 遣黾一 at$蕞口一 目目= 告曼 * 景一 告。n 承是一 e军吨兰 o求n口一 讲竹毫；一 皇m 一 异 鲁6 i 岩。h 蒜n 6 - o 誉；0 6 螽一06崞篙n霜 一n i n “ 叶h n t $ 譬 hc帚霹 l口 o c 暑 * 卜l | 昏一 n h 日o h 审豫珥甘难豫珥葺i * 瞄杈 1 6 f 遐器扎 l口-”i 3磬口w5n 叮础氧 h ) l u 麓利舳哩 一业u 靛剐p 蝴 峰颦铡州8j暑告。djo*奢=d皇省lp葛p蚺苫葛。暑_占暑矗皇u一耋oj口，罂蛩e_ljo专。置羔=一皇盖兽一p_益旦口嚣-兰舳ul苫昌polj盖兽曼。dl言羔一一。=摹工 船韶q餐瞄讣赋能，疑s器k餐诅看葛削馥p协餐茸与|剥r坩禽皿匣悻一-c懈 m回鞯薛馘槲g旺世翟餐皙嚣米褂攮 杖秘晕扑书尊避扑德爿哑岳 il 高 “ il l 萋i蠹 n 岫 ! i l 是 难豫茸懂越*阻杈，黑迟器钆君姬上磊剐馥匮米董爿器刊r坩禽叮匿恃叶n样 首立。茸一芸一摹n篇萑t h召写u唔_县竺。口苗hu琶i叠m喜 宣p。口110jg-【v-胃q量竹+舞u目善芒ii puou端日是点udlq舞誊m一暑3lq口一h上eja-o苫ii甚qoiu一loub趸8；善h一翌u善一县暑ubo_*岛鼍q置*ii)iuuiih簧窨o)摊吲*球删鄙量蚓讯毒。量。最g甘廿匿罂忙球靶，坩(v誓掣蜂+露氓靶耩赫科盎搭采帏糍擘轼g廿吐群牛坩匪靛副l昌哩最受u匿按副p剁采一叫u廿函 = 一 l c h 与i 9 n 一 4善景i z 9 9 9 导0 1 葛n 三h 墨盆0 9 o 臂；= 0 0 6 l 菩鼙9 9 n 91 0千冀吼 一葛c i = 一 术叶g 罱。芊8叶 三。平e t = ii毒冀一 8一千cn心一 g一是【 等镕口”n n o d = 霹。千9= 。q e 一 诤心o o o 噼 享寸。小 霉啦n 啦* 督峨斟避难礁 科世 将瞄杈 努喀蓉札 86咎u#差殳占吾宣譬一置h苗m置凝帐怛譬嚣一柱口聊封 n ) i u 匿簧科阻唾 一罐u 匪莨剐，蛆 嶂霉捌州 口笛盏-q皂：nod j0娶ip荟=若lp葺p2：嚣g葛，暑鼻矗竽一皇ojel孽霉o苫矗lm占昌j0看e皇：一誊晶暑ip暑饕5昌譬兰呐善_量-号ijad暑要*。dl言上_nc皇上l工 难豫斟毽瞄*暖杈，器避置k当悭i矗雕文pn譬茸嚣张缸噢鑫口窿悟z-n样 h吸鞯薛馘州g旺世翟罨言掣水褂攮 议皋罩扑*擘俚扑毒葛哑牛 中国农业科学院媳士学位论文 第三章关键时期起作用的主要环境因子 3 4 讨论 在本章的研究中发现，低温刺激会对糙虫的产卵前期产生显著作用。本实验中，通过对不同 日龄的粘虫成虫进行低温处理，发现低温对粘虫生殖的影响表现出处理时问的差异性。从本实验 的研究结果来看，低温对粘虫成虫生殖产生显著的影响。羽化后1 日龄( 羽化后o 2 4 小时) 对迁飞型粘虫成虫进行低温处理，导致秸虫产弗静期显著缩短。而在2 6 日龄内进行同样的处理则对产 卵前期没有显著影响。和产卵前期显著缩短相对应的是1 日龄低温处理后迁飞型粘虫产卵量的显 著增加。但是1 日龄之后，产卵量随着处誊薹漕嘤一勾壤罂毒耀。 茎| 1 ：l 甩m 堪甥棚每悟i 甜诉国 鬟戮桃酣；淄灞淄憎美蚕肼匕邑鍪噙美菊警税恤鲥辨辎孙# 涩。嚅 i 蓑靼擎艮宝书引蚤妻幕 酥靖委批呱搋鲥托酬攀= ，饥饿时间为羽化后0 2 4h ( 1 日龄) 。饥饿2 4 h 后，再用5 蜂蜜水喂养，直至试验结束。另外一组用作对照：对照成虫羽化后每日喂予蜂蜜水 饲养，喂饲期间每天更换蜂蜜水。 4 2 3 卵巢级别的确定 分别将饥饿处理结束后2 4h 、4 8h 、7 2h 、9 6 h 、1 2 0h 、1 4 4h 雌蛾腹部与胸部分离出来，置 于装有清水的培养皿中，剪开腹部体壁，在清水中取出卵巢，清除上面粘附的脂肪体等组织，在 双筒显微镜下观测卵巢发育情况，并根据林昌善等( 1 9 9 0 ) 卵巢发育级别分类法来确定卵巢的发育 级别 4 2 4 飞行肌干重和飞行能力测定 分别对1日龄饥饿处理成虫和对照成虫的飞行肌干重进行测试，所用的测试粘虫蛾是饥饿处 理结束后2 4h 、4 8h 、7 2h 、9 6h 、1 2 0h 、1 4 4h 的成虫。所测定的飞行肌为中胸背纵肌。它是粘 虫胸部最大的一块肌肉其发育和降解与成虫的卵巢发育或生殖状态密切相关( 罗礼智，1 9 9 6 ) 。 测定时，先将成虫杀死，然后放在5 0 6 0 下烘干4 8h 至恒重后再用注射针将中胸背纵肌从胸 部分离(江幸福等，2 0 0 5 ) ，最后用精确度为1 ，1 0 0 0 0 的电子天平称重。 飞行能力的测定与飞行肌干重的测定相对应。测试成虫为饥饿处理结束后2 4h 、4 8h 、7 2h 、 9 6h 、1 2 0h 、1 4 4h 的成虫。测试时先用乙醚将虫体麻醉，除去胸腹连接处的鳞片和毛以后用 5 0 2 胶( 北京化工厂出品) 连接于吊环上，然后再连接到飞行磨的吊臂上。该飞行磨与可自动记录测 试昆虫的飞行时间、距离的飞行数据微机采集系统相连接( 江幸福等，1 9 9 8 ：l u o 酣口，2 0 0 1 1 。测 试温度为 x 中国农业科学院博士学位论文 * 卜椎魁轻一1 日龄饥饿o f p o s t e e r g e n c e 图4 31 日龄饥饿对粘虫飞行距离的影响 fig4-3ncnightdi啦ncebymcl呐msofm踟删招砒d碾。崩ndays a 晒g a f v a 士i o n f o r 2 4 ha t d a y l of 图中数据为平均数标准误(照。每个柱上具有不同字母的为卜测验比较差异显著o0，本平b统计娥鼓从左 到右依次为1 6 8 和1 4 0 d 砒a 眦p 瑚e n t c d 髂m 啪s e b 邮s h 盯m gl l l cd i 啪n t l e 批聘呲s i 鲥矗c 卿l yd i 脏r c n t 砒5 l c v c lb y 卜n c s锄plcs 泌o f h u 。l g c r n m l c n i o n g h t k 16s卧d1 4 0 苦辱匿曹 啦一08对恩 ck1 日龄饥饿o fp o s t e _ e r g e n c e国4 4i 目龄饥饿对粘虫飞行时阃的影响 fi944t h cn i g h td u 嘣l o b yt h c moth5o f 麒j 妒d ，d f a t d i 船r e n td a y sa r c rs c a r v 砒i o nf o r 2 4ha td a ylo f p 0 乖e m c r g c n c c 图中数据为平均数标准误(舾)，每个柱上具有不同字母的为卜测验比较差异显著(005水平)；统计蛾敬从左到右依 次为1 6 8 和1 4 0 d a t aa r c p w s c n t c da s m c 叩士s eb a f ：s s h 甜i n g 廿1 c d i 恐r c n c i c “e 幅a r cs i g | l l 疗c 矾c l yd i 彘r e n t at5 i e v c i b yt i e 5 tt h cs a m p i e s i o f h u “g c rf m m 1ent 0r i 曲ti s1 6 8 帅d1 4 0 蚰s m m 0 0 中国农业科学院博士学位论文 第四章关键时期的影响作用机制的研究6 h1 8 h 4 8 h7 2 h 9 6 h1 2 0 h 1 4 h 168h羽化后时期 s t a g ea f t e r e m e r g e n c e图4 8 对照和1 日龄饥饿粘虫不同日龄雌蛾血淋巴中j hl 的滴度f i g 4_8jhiti打c aidihtdayinmignnorym碍阳m衄con01危malcadult柚dfanales t a r v e d 砒d a y l 图中数据为平均数标准误毋。每组点上具有不同字母的为卜测验比较差异显著(005水平)：每个点上三次 重复每个重复由3 0 头成虫的血淋巴组成，n = 3d 砒aa r ep r e s c f l t e d 踮m c s e b 郴曲州“g 血cd i 仃c r e n t l甜crs眦si印i鼬mnyd i 胁c n ta t5 l c v c ib yt - t c s t e a c h d岫point化pted t l l r t i m 骼，c a c hm p e a t n 他n tw a sc o m p o s c db yt i l i n y a d u 址n = 3对血淋巴中j h 的影响 相比较血淋巴中j h i 滴度的变化，j h l i 的变化则现得较为规律。从图4 _ 9 中可以看出，在对照粘虫中，在羽化初6 h 的迁飞型对照粘虫血淋巴中未检测到i i 的存 在，但在羽化后18h m i i 的滴度己经开始有所上升。在羽化后4 8 h 迅速达到一个峰值，之后迅速下降，至羽化后9 6 h j h i i 的含量仍然维持在一个较低的水平。但在羽化后7 2 h 粘虫雌蛾血淋巴中 的jhii的滴度仍然略高于羽化后18h的粘虫。羽化后96hii的滴度开始上升，在1“h迅速升至最高峰值，1 6 8 h开始略有下降。对比1日龄饥饿处理后粘虫血淋巴中mii滴度的变化，和对 照的差异较为明显。羽化后48h粘虫的jhii的滴度显著高于迁飞型对照。但之后迅速下降。然后平缓上升至羽化后96h。从羽化后96h之后迅速上升，及至羽化后羽化后120h达到高峰，之后迅速下降。可以看出羽化后48120h期间，饥饿粘虫的jhii的滴度均显著(p005)高于迁飞型对照。羽化后144h，饥饿粘虫的ii的滴度显著(p o 0 5 ，图4 2 ) ，成虫在处理后 9 6h 背纵肌肌干重开始下降，至饥饿后1 2 0h ，处理成虫背纵肌干重显著低于对照( p 0 0 5 ) 。此后 处理和对照成虫背纵肌干重的差异显著性一直保持到观测结束时即饥饿结束后1 4 4h ，此时处理 蛾背纵肌干重仍显著低于对照( p 0 0 5 ) 。结果表明1 日龄饥饿处理后的粘虫b 行肌发育受抑制，降 解加速。 x 中国农业科学院博士学位论文 第四章关键时期的影响作用机制的研究 48 4 处理后时问 h o u r sa f t e rt r e a t m e n t 图4 21 日龄饥饿对粘虫蛾中胸背纵肌干重的影响 f i g 妻垂；i 专；量j & ；基高蠢i 鳝警量薹l | l 一；i 譬杂；茹| e 型l 警 v j 专霉f 童童jj ，、q ! i 善i 辩! 垂馨鼋l r ? 导； i 妻董雾垂i ；l 函“；岩 现配 o 2 m ol ，ln a o h 1 s d s ( 6 ) 溶液i ( 提质粒用) 5 m o l ，l 乙酸钾 6 0 m l 冰乙酸 1 1 5 m l 水 2 8 5 m l ( 7 ) m g c l 2 ( 制备感受态细胞用) 0 2 m o l l ( 8 ) t r i s 乙酸( t a e ) 电泳缓冲液：5 0 x 浓贮存液( 每升) ；2 4 2 9t r i s 碱；5 7 1 m l 冰乙酸；l o o m l0 5 m o l ，l e d t a ( p h = 8 0 ) ，使用时稀释为lx ( 9 ) 6 x 的凝胶加样缓冲液( 贮存液) ：o 2 5 溴酚蓝；0 2 5 二甲苯青f f ：4 0 ( w ，v ) 蔗糖水溶液。4 保存。 5 3 仪器设备 ( 1 ) p c r 仪，德国e p p e n d o r f ( 2 ) 凝胶成像系统e a g l ee y es y s t e m ，美国s t i 认g e n e 公司 ( 3 ) 摇床d 2 5 0 ，美国n b s 公司产品 ( 4 ) 德国台式低温离心机e p p e n d o r f 5 4 实验方法 5 4 1 粘虫蛾脑组织的解剖 选取3 0 头羽化后3 5 天的粘虫成虫，连前足将其头部取下，浸泡在o 9 的生理盐水中在 解剖镜将脑取出。脑部汇总后直接提r n a 或用液氮处理后置于一7 0 冰箱中备用。箱中备用。 x 中国农业科学院博士学位论文 第四章关键时期的影响作用机制的研究 4 3 4 粘虫血淋巴中保幼激素滴度 粘虫血淋巴内j 的h p l c 分离条件及种类由于j h 为萜烯类亲脂性化合物，因此在洗脱 的过程中，如果洗脱液的洗脱力较差，会导致部分组分粘至于色谱柱中而无法洗脱出来，加乏其 洗脱峰的响应值较低。因此采用甲醇中添加微量的四氢呋喃或nn 一二甲基甲酰胺的方法，或是 用乙腈来作为洗脱有机溶剂的方法和提高柱温的方法来提高柱效。最后选择洗脱能力较强的乙 腈来代替甲醇进行洗脱。得到的较优分离条件为流动相乙腈：水= 8 0 ：2 0 ，流动相速度为o 8 m l m i n ， j h i 、i i 的保留时间分别为：1 6 5 1 0 m i n ，2 0 5 l l m i n ( 图4 5 图4 6 ) 。在这种条件下，可以得到对 粘虫血淋巴中j h 较为理想的分离效果( 图4 - 7 ) 。 w 怕_ t _ a e 册州m 啊m 讲 愚 、 7，e，k“ 1 h 1 如 女 出 女 5 d 图4 5j hi 标准样品保留时间示意圉 f i g4 - 5 丁h er c t c n t i o n 吐m co f j hi v 旧 柚q 忙a b 矾( 州l 哺d 旺础阱 履 f f f 7 、 、| 一一、一+ ! 二二= ，一一 -!j! 图4 6j h 【i 标准样品保留时间示意图 f i g4 6n cr c l c n t i o nt i m co f 川i i 6 1 x 中国农业科学院博士学位论文 第五章a t 基因的克隆与鉴定 5 ) 沉淀与4 0 灿2 x g a l 和4 0 皿2 0 i p l g 混匀涂布l b 固体平板( 含有1 0 0 峙m l a m p ) ， 正面向上放置半个小时；6 1 待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿3 7 培养1 2 1 6 h 。 5411质粒dna提取应用碱裂解法分离d n a实验步骤：( 1 ) 挑转化后的单菌落，接种到5 m l 含有氨苄青霉素的l b 培养液，于3 7 剧烈振摇下培养 过夜； (2)将1 5 m l 培养物倒入1 5 m l 离心管用离心机于4 以最大转速离心l m i n ，将剩余培养 物离心后，沉淀溶于5 0 的甘油中，一2 0 保存；( 3) 离心结束后，尽可能吸干培养液；( 4)将细菌沉淀重悬于1 5