临床检验基础的现状和特点.ppt

绪论,一、临床检验基础的现状和特点古代:感官检查（如：尿液中世纪）17世纪:荷兰Leeuwenhoek发明显微镜,20世纪末以来:自然科学基础学科与医学基础学科结合电脑化、自动化、微量化,21世纪：现代信息网络技术（远程诊断）与系统生物工程（包括分子生物学）、临床医学结合。,最常用的临床检验，借助先进的检测技术，对来自离体的血液、尿液、粪便以及分泌物和排泄物等标本进行理学、化学、病原学和显微镜形态学的检查，,以简便、快速的检测结果，基本满足临床医学检验筛检疾病的需求。,临床检验现代特征：1从手工自动化、电脑化检测,2（pointofcaretest，POCT）,床边检测,3试剂批量、配套、专业和多样化,4.检验方法标准化如：1966年，成立国际血液学标准化委员会（InternationalCommitteeforStandardizationofhematology,ICSH，源自1963年欧洲血液学协会标准化委员会）5全面质量保证人员和物质检验分析前：标本的采集、储存和转运过程尤为重要。现认为，管理好这两个环节，可降低70%的检验差错率。,(1)标本采集原则保持离体标本质和量的完整性,（2）避免非疾病因素的干扰生理变异：第一类：不能控制的生理变异年龄和性别对检验影响为长期效应第二类：相对能控制的生理变异，如食物、药物、情绪、状态、体位和标本采集时间等，对检验的影响多为短期效应。1）饮食因素：刚进食、禁食、饮酒、吸烟2）药物因素：方式、浓度,二、临床检验基础的应用目的1为疾病诊断和鉴别诊断提供实验室检测客观依据2.为疾病疗效监测和预后判断提供动态变化依据3.为预防疾病提供检测依据4.为科学研究提供医学检验基本数据、基本检验方法和操作技能。,三、学好临床基础检验的基本要求1掌握检验基础理论2掌握检验实验技能3熟悉检验方法学评价4了解检验项目参考值红细胞计数(RBC)参考值男性：(4.05.5)1012/L女性：(3.55.0)1012/L5熟悉检验项目临床意义,血液标本采集,血液标本采集和抗凝剂选择全血：临床血液学检查：血细胞计数、分类血浆：临床生化检查（内分泌激素测定等）；血栓与止血的检查血清：除纤维蛋白原等凝血因子外，其他成分与血浆基本相同，多数临床化学和临床免疫学检查。,一、采血方法静脉采血法(venipunctureforbloodcollection)皮肤采血法(skinpunctureforbloodcollection)真空采血法(vacuumtubeforbloodcollection，负压采血法)。定量、安全、转运方便.封闭式采血,无需容器转移，减少溶血。真空定量贮存试管适于不同的检验项目,真空采血容器色泽及应用范围,【方法学评价】皮肤采血：易溶血、凝血和可能混入组织液，重复性差。开放式采血：操作环节多、不规范，易污染。封闭式采血：操作规范，安全性、重复性好。,【质量控制】血标本采集是分析前质量控制重要环节。1患者2采血静脉采血：止血带压迫时间宜小于1min,3溶血4血标本处理原则及时运送检测。保存：温度和有效时间5实验结果分析采样时：年龄、性别、饮食、药物、时间,二、抗凝剂选择1.乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraaceticacid,EDTA）盐Na2C10H14O8N2+Ca2+aC10H12O8N2+2Na+2H+特点：对血细胞形态、血小板计数影响很小（但影响血小板聚集）。根据国际血液学标准化委员会(ICSH)1993年文件建议，血细胞计数用EDTA-K2作抗凝剂（EDTA-K2-2H2O1.52.2mg/ml血液）。,2草酸盐（sodiumoxalate）：对凝血V因子保护功能差，影响凝血酶原时间测定；草酸盐与凝血酶钙结合后形成的沉淀物，影响自动凝血仪的使用；高浓度钾或钠离子易使血细胞脱水皱缩，草酸铵使血细胞膨胀。,3肝素(heparin)加强抗凝血酶III（antithrombinIII,AT-III）灭活丝氨酸蛋白酶的作用，从而阻止凝血酶形成，阻止血小板聚集等作用，抗凝力强。用量（152.5）U/ml血液。但常可引起白细胞聚集，并使血涂片在罗氏染色（Romanowskysstaining）时产生蓝色背景。,4枸橼酸盐枸橼酸钠(trisodiumcitrate)，能与血液中的钙离子结合形成螯合物，从而阻止血液凝固。2Na3C6H5O7+2Ca2+2CaC6H507-+6Na+抗凝力较弱。抗凝比例19。多用于临床血液学检查、血液保养（毒性小）。,血液涂片制备和细胞染色,一、血液涂片制备厚薄适宜（与血量多少、推片速度有关），头体尾明显：细胞分布要均匀血膜边缘整齐（留一定空隙）,二、血液细胞染色（一）瑞氏染色法(Wrightsstain)1瑞氏染料酸性染料伊红（eosin,E-）碱性染料亚甲蓝（methyleneblue,M+；又名美蓝）组成复合染料。甲醇：溶解美蓝和伊红ME；固定细胞的形态；提高对染料的吸附作用。,2染色原理物理吸附、化学亲和3pH值的影响细胞各种成分多属蛋白质，由于蛋白质系两性电解质，所带电荷随溶液pH而定。在偏酸时正电荷（H）增多，易与伊红结合，染色偏红。在偏碱时负电荷增多，易与美蓝或天青结合，染色偏蓝。染料贮存时间愈久，染色效果愈好。染液贮存，必须加塞，以防止甲醇挥发和被氧化成甲酸。加入甘油,防止甲醇挥发，染色清晰。,（二）姬姆萨染色法姬姆萨染液：由天青、伊红组成。,【方法学评价】1.血涂片制备手工推片法:血量少、操作简单、重复差。,2.血液细胞染色瑞氏染色法：最经典、最常用瑞氏-姬姆萨复合染液：取长补短,观察红细胞的形态及分布obseveerythrocyteformanddistribution观察白细胞形态observeleukocyteform观察血小板的形态observeplateletform观察有无寄生虫observeparasite,第二章血液一般检验,第一节红细胞检验红细胞（redbloodcell；erythrocyte）起源于骨髓造血干细胞（colonyformingunit-spleen，CFU-S）红细胞的主要生理功能：通过胞内的血红蛋白来实现的。,一、红细胞计数(redbloodcellcount，RBC)【检测原理】1手工显微镜法2血液分析仪法利用电阻抗和（或）光散射原理,红细胞计数,2ml稀释液充分混匀10ul血液充池、静止镜下计数计算：RBC/L=N510106200,Neubauer计数盘,3mmWBCWBCWBCWBC1mm,【方法学评价】1手工显微镜法2血液分析仪法为目前主要临床检验细胞计数方法变异系数（coefficientofvariation,CV）小。,【质量控制】1手工法误差来源包括：标本、操作、器材、固有误差（计数域误差）2仪器法严格按操作规程；定期作室内和室间质控。,【参考值】成年：男性(45.5)1012/L女性(3.55.0)1012/L新生儿(6.07.0)1012/L。,【临床意义】1生理性变化(1)年龄与性别的差异(2)精神因素(3)剧烈体力运动和劳动(4)气压降低(5)妊娠中、后期,2病理性变化（1）红细胞和血红蛋白量减少：在临床最常见于各种原因的贫血。1）急性、慢性红细胞丢失过多：如各种原因的出血。2）红细胞寿命缩短：如各种原因的溶血3）造血原料不足4）骨髓造血功能减退,（2）红细胞增多1）原发性红细胞增多：见于真性红细胞增多症、良性家族性红细胞增多症等。2）继发性红细胞增多：常见于可以引起低氧血症的疾病：心血管病、肺疾病、异常血红蛋白病。肾上腺皮质功能亢进（库欣病），可能与皮质激素刺激骨髓使红细胞生成偏高有关、药物肾上腺素、糖皮质激素、雄激素等。(3）相对性红细胞增多,二、血红蛋白(hemoglobin,Hb或HGB)测定（一）血红蛋白分子结构及成分色素：亚铁血红素原卟啉和铁原子组成的一种结合物，合成受-氨基-酮戊酸合成酶（-aminolevulinicacidsynthetase）、血红素本身和Fe2+的调节。蛋白质：珠蛋白,血红蛋白的结构constructionofhemoglobin,卟啉卟啉Fe卟啉卟啉珠蛋白,在正常状态，机体有99%Hb的铁原子呈Fe2+状态，称为还原Hb,1%的Fe3+为高铁血红蛋白，只有亚铁状态的Hb才能与氧结合，此时称氧合血红蛋白。,(二)血红蛋白的合成血红蛋白的合成受激素的调节。红细胞生成素：促-氨基-酮戊酸（-aminolevulinicacid，ALA）生成与铁的利用，促血红素和Hb的合成；雄激素：在人体不同生长时期，Hb种类与比例不同。,【检测原理】血红蛋白形式：氧合血红蛋白（oxyhemoglobin）碳氧血红蛋白（carboxyhemoglobin）高铁血红蛋白（hemiglobin，Hi）其他衍生物,1氰化高铁血红蛋白（hemiglobincyanide,HiCN）测定法吸收波峰：540nm2其他测定法：叠氮高铁血红蛋白法（hemiglobinazide,HiN3）碱羟血红蛋白测定法沙利（Sahli，已经淘汰）血红蛋白测定法,【方法学评价】1966年，ICSH氰化高铁血红蛋白测定法作为国际标准参考方法。HiCN法简便、显色快而稳定。可检测除硫化血红蛋白（sulphonhemoglobin,SHb）外的各种血红蛋白。氰化钾（potassiumcyanide，KCN）有剧毒十二烷基硫酸钠血红蛋白（sodiumdodecylsulfate,SDS）测定法：除SHb外，血液中各种Hb均可与低浓度SDS作用，生成SDS-Hb棕红色化合物。吸收曲线波峰在538nm，波谷在500nm，肩峰在560nm。无公害。破坏白细胞，不适于同时用于有白细胞计数和Hb测定的血细胞分析仪上使用。,叠氮高铁血红蛋白（HiN3）测定法：具有与HiCN测定法相似的优点，HbCO转化慢。碱羟血红蛋白(AHD575)测定法沙利法为传统血红蛋白测定法，已淘汰。,【质量控制】血标本、方法、器材、采血部位【参考值】成年：男性120160g/L女性：110150g/L新生儿：170200g/L老年（70岁以上）：男性：94.2122.2g/L女性：86.5111.8g/L【临床意义】与红细胞计数相似，但对贫血程度判断的准确性优于红细胞计数。,三、红细胞形态检查【方法学评价】虽然血细胞分析仪广泛用于全血细胞计数，但观察血涂片可用于估计相应血细胞数量，因而显微镜细胞数量和形态的观察现常作为对仪器分析质控的参考对照。注意：如果血片制作不良和染色不佳，常使细胞鉴别发生困难，甚至导致错误结论。,【质量控制】选择细胞分布均匀的区域：红细胞堆积棒状穿钱状：细胞过于密集但如果在血涂片较薄的区域出现：可能是红细胞外附有异型球蛋白注意完整的检查顺序,观察红细胞observeerythrocyte,色素colour大小size形态shape异常结构abnormalstructure,正常红细胞normalerythrocyte,redcellobservedunderelectricmicroscope,【临床意义】1.红细胞大小不一（1）小红细胞(microcyte)：6m（2）大红细胞(macrocyte)：10m。常见于巨幼细胞性贫血、溶血性贫血、恶性贫血等。（3）巨红细胞(megalocyte)：15m,（4）红细胞大小不均(anisocytosis)：同一患者红细胞之间直径相差一倍以上。如大达12m，小仅2.5m。常见于严重的增生性贫血，巨幼细胞性贫血时尤为明显。,2.红细胞内血红蛋白含量改变（1）正常色素性(normochromic)：见于急性失血、再生障碍性贫血、白血病等。（2）低色素性(hypochromic)：见于缺铁性贫血、珠蛋白生成障碍性贫血、铁幼粒细胞性贫血，某些血红蛋白病。（3）高色素性(hyperchromic)：最常见于巨幼细胞性贫血。（4）多色性(polychromatic)：刚脱核而尚未完全成熟的红细胞，体积较大。正常人外周血占1%左右。尤见于溶血性或急性失血性贫血。（5）细胞着色不一（anisochromia）：双形性贫血（dimorphicanemia）,多见于铁粒幼红细胞性贫血。,5红细胞形状改变（1）球形红细胞(spherocyte)：见于遗传性和获得性球形细胞增多症（如自身免疫溶血性贫血或直接理化损伤如烧伤等）。,（2）椭圆形红细胞(elliptocyte)：见于遗传性椭圆形细胞增多症、大细胞性贫血；偶见于缺铁性贫血、骨髓纤维化、巨幼细胞贫血、镰形细胞性贫血。正常人血液约占1%。,（3）靶形细胞(targetcell)：常见于各种低色素性贫血、尤见于珠蛋白生成障碍性贫血、HbC病，及阻塞性黄疸、脾切除后。,（4）口形红细胞(stomatocyte)：常见于口形红细胞增多症，小儿消化系统疾患引起的贫血及酒清中毒、某些溶血性贫血、肝病。,（5）镰形红细胞(sicklecell)：镰状细胞贫血（HbS-S，HbS-C），在缺氧的条件下，可有大量镰状红细胞。,（6）棘红细胞(acanthocyte)：见于遗传性或获得性-脂蛋白缺乏症；于脾切除后、酒精中毒性肝脏疾病、尿毒症。棘红细胞应与皱缩红细胞（也称锯齿状红细胞）区别（crenatedcell,echinocyte）。,（7）新月形红细胞（meniscocyte）：见于某些溶血性贫血（如阵发性睡眠性血红蛋白尿症），其意义不明。正常人无。,（8）泪滴形红细胞（teardropcell）：可能是细胞内含有Heinz小体或包涵体所致。见于贫血、骨髓纤维化症，偶见正常人。,（9）缗钱状红细胞(rouleauxformation)：见于血浆中纤维蛋白原和免疫球蛋白增高性等疾病。（10）裂红细胞(schistocyte)：红细胞碎片（cellfragments），有各种形态如刺形(burr)、盔形(helmet)等。见于弥漫性血管内凝血、微血管病性溶血性贫血、重型珠蛋白生成障碍性贫血、巨幼细胞性贫血、严重烧伤。正常人2%。（11）红细胞形态不整(poikilocytosis)在某些感染或严重贫血时多见，最常见于巨幼细胞性贫血。,（12)有核红细胞(nucleatederythrocyte)即幼稚红细胞。正常时，1周之内婴幼儿血片中可见到少量有核红细胞，在成人为病理情况。1）溶血性贫血：最常见。表明骨髓有良好的调节功能。2）造血系统恶性疾患或骨髓转移性肿瘤：见于各种急、慢性白血病及红白血病。3）脾切除后,4红细胞内出现异常结构（1）嗜碱性点彩红细胞（basophilicstipplingcell）：重金属损伤细胞膜使嗜碱性物质凝集。嗜碱性物质变性，血红蛋白合成过程中，原卟啉与亚铁结合受阻，以铅的作用最为明显，常作为铅中毒诊断筛选指标。,（1）豪焦小体(HowellJollysbody)：又称为染色质小体。见于脾切除术后、无脾症、脾萎缩、脾功能低下、红白血病和某些贫血患者；在巨幼细胞贫血时更易见到。（2）卡波环(Cabotring)：现认为可能是胞质脂蛋白变性，常与豪焦小体同时存在。,（3）寄生虫：疟原虫、微丝蚴、杜利什曼原虫感染时可见红细胞质内相应病原体。,四、血细胞比容测定血细胞比容（hematocrit,Hct，Ht,HCT或packedcellvolume,PCV）,离心后血液分层layerafterbloodcentrifugated,血浆plasm血小板platlet白细胞whitecell还原血红蛋白reducedhemoglobin含氧红细胞oxygenredcell,【检测原理】1Wintrobe法2.微量法（microhematocrit）3血液分析仪法Hct=RBC红细胞平均体积（MCV）,【方法学评价】1手工法手工测定血细胞比容的方法较多，如折射计法、粘度法、比重测定法、离心法和放射性核素法（最准确，ICSH定为参考方法）。温氏法（Wintrobe法），已属淘汰之列。微量离心法：WHO定为首选常规方法。2血液分析仪法目前常用方法。注意：当患者为红细胞增多症或血浆渗透压异常时，仪器法常会出现误差。,【质量控制】1.手工法避免以下因素：抗凝剂量不准确，混匀不充分，离心速度不够。2.血液分析仪法注意Hct是否与红细胞计数和红细胞平均体积测定值的相关性。,【参考值】Wintrobe法：男性0.40.54女性0.370.47微量法：男性0.470.04女性0.420.05【临床意义】1用于计算红细胞3个平均指数2评估血浆容量稀释浓缩程度,五、红细胞平均指数红细胞平均容积（meancorpuscularvolume,MCV），指每个红细胞平均体积的大小，以飞升（fl）为单位红细胞血平均红蛋白含量(meancorpuscularhemoglobin,MCH)，指每个红细胞内平均所含血红蛋白的量，以皮克（pg）为单位红细胞平均血红蛋白浓度(meancorpuscularHemoglobinconcentration,MCHC)，指平均每升红细胞中所含血红蛋白浓度（g/L）。,1手工法对同一抗凝血标本同时作红细胞计数、血红蛋白测定和血细胞比容测定。（1）每升血液中红细胞体积HctMCV=（fl）每升血液中红细胞个数RBC（2）每升血液中血红蛋白含量HbMCH=（pg）每升血液中红细胞个数RBC（3）每升血液中血红蛋白含量HbMCHC=每升血液中血细胞比容Hct,2血液分析仪能直接导出MCV的值，再结合仪器直接测定的RBC和Hb，计算出MCH和MCHCMCH=Hb/RBCMCHC=Hb/RBCMCV,【方法学评价】1.MCV血液分析仪设定的MCV值最大域值是360fl，可能包含红细胞团块，当红细胞凝集如冷凝集综合征可引起MCV假性增高；严重的高血糖症（葡萄糖高于600mg/L）可引起红细胞肿胀，使MCV假性增高。仪器法CV小于1%，手工法CV在10%左右。2.MCH高脂血症或白细胞增多症因血浆浊度增加而使MCH假性增高。3.MCHC手工法MCHC的测定受到Hct（血浆残留或出现异常红细胞）和Hb（高脂蛋白血症、白细胞增多症）的影响。,【质量控制】1.手工法红细胞计数、血红蛋白、血细胞比容的测定必须用同一抗凝血标本，且所测定的数据必须准确。2.血液分析仪法必须注意红细胞3个平均指数之间及与红细胞计数、血红蛋白、血细胞比容测定3个指标之间的相互关联性。3.用于XB分析法或浮动均值法血液分析仪的质量控制：MCHC是最为稳定的指标；任何一个参数如有3次3%,或连续五次有2%3%的变异，即表明仪器失控。用浮动均值法进行质控，每天标本60份。,【参考值】手工法：MCV8092fl；MCH2731pg；MCHC：320360g/L。血液分析仪法：MCV80100fl；MCH2734pg；MCHC：320360g/L,贫血的红细胞形态学分类,红细胞平均值必须结合血液涂片来观察红细胞形态才能得出较为准确的诊断。,六、红细胞体积分布宽度红细胞体积分布宽度(redbloodcellvolumedistributionwidth,RDW)由血液分析仪根据红细胞体积的直方图导出，反映所测标本中红细胞体积大小的异质程度，常用变异系数（CV）表示。它比血涂片上红细胞形态大小不均的观察更为客观和准确。【检测原理】,【方法学评价】仪器法测定了数万个红细胞后，由直方图导出RDW，更准确、更客观地反映红细胞体积的异质性的程度。但MCV值只反映红细胞平均体积大小，不能代表红细胞之间体积的差异。【质量控制】RDW结果判断应结合临床及红细胞直方图的变化，同时分析RDW异常是否是由于红细胞碎片、红细胞凝集或双相性红细胞引起。【参考值】成人：11.6%14.6%,【临床意义】1进行贫血形态学新的分类1983年Bessman提出用MCV和RDW作为贫血的形态学分类的新指标，如果配合红细胞直方图，则更有助于判断贫血的病情和疗效。2.缺铁性贫血（irondeficiencyanemia,IDA）的筛选诊断和疗效观察RDW增大：对缺铁性贫血诊断的灵敏度达95%以上，但特异性不强。3.鉴别诊断缺铁性贫血RDW一般增高，而轻型-珠蛋白生成障碍性贫血RDW一般正常。,七、网织红细胞（reticulocyte,Ret）计数晚幼红细胞脱核后到完全成熟红细胞间的过渡细胞，其胞质中残存非变性嗜碱性物质核糖核酸（ribomucleicacid，RNA），经煌焦油蓝（brilliantcresylblue）等活体染色后，嗜碱性物质凝聚成蓝黑色颗粒，颗粒与颗粒连缀成线而得名。体积通常一般为79m。,Heilmyer根据其发育阶段把它分为5型，ICSH分为4型（无Heilmyer0型）。,【检测原理】1普通光学显微镜法用活体染色（煌焦油蓝等染液）方法显示红细胞内网状结构2网织细胞计数仪法用荧光染料（如吖啶橙、派若宁-Y、噻唑橙）使含RNA的网织红细胞着色，用流式细胞仪（flowcytometry，FCM）计数并计算出网织红细胞的百分比。3血液分析仪法原理与网织细胞计数仪法相似。,【方法学评价】1普通光学显微镜法试管法操作简便，重复性较好，为手工参考方法；玻片法取血量少，染色时间偏短，结果偏低，适宜于床边采血操作。显微镜法受主观因素影响多，耗时费力。,Miller窥盘,2网织细胞计数仪法流式细胞术网织红细胞计数可客观地将网织红细胞分成高荧光强度网织红细胞（highfluorescentratio，HFR）、中荧光强度网织红细胞（middlefluorescentration，MFR）、低荧光强度网织红细胞（lowfluorescentratio，LFR），荧光强度越高，网织红细胞越幼稚。对于化疗、放疗及移植患者治疗过程的监测、骨髓造血功能的分型有临床价值。,3血液分析仪法最新血液分析仪，采用流式细胞法也可对Ret作分类计数，并提供与网织红细胞相关的多个参数：红细胞绝对值（Rct）网织红细胞百分比（Rct%）网织红细胞平均体积（meanreticulocytevolume,MCVr）网织红细胞血红蛋白分布宽度（reticulocytehemoglobindistributionwidth,HDWr）网织红细胞血红蛋白浓度（reticulocytehemoglobinconcentration,HCR）网织红细胞平均血红蛋白浓度（meanr