（内科学专业论文）磁性纳米四氧化三铁联合环孢素a防治小鼠急性移植物抗宿主病.pdf

p r e v e n t i o no fm o u s ea c u t eg r a f t - v e r s u s - h o s t d i ! ；e a s e 1 一 n a n o p a r t i c l e t l i s e ab ym a t 乏n e t l co i 。f e 3 0 4e 3 u 4 c o m b i n e dw i t hc y c l o s p o r i na ad i s s e r t a t i o ns u b m i t t e dt o s o u t h e a s tu n i v e r s i t y f o rt h ea c a d e m i cd e g r e eo fm a s t e ro fm e d i c i n e b y z h o u y i n g s u p e r v i s e db y p r o f e s s o rc h e nb a o a n s c h o o lo fc l i n i c a lm e d i c i n e s o u t h e a s tu n i v e r s i t y 2 01o 研究生签名：同褪 东南大学学位论文使用授权声明 东南大学、中国科学技术信息研究所、国家图书馆有权保留本人所送交学位 论文的复印件和电子文档，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。本人 电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。除在保密期内的保密论文外，允许论 文被查阅和借阅，可以公布( 包括刊登) 论文的全部或部分内容。论文的公布( 包 括刊登) 授权东南大学研究生院办理。 研究生签名： 中义摘嘤 中文摘要 磁性纳米四氧化三铁联合环孢素a 防治小鼠急性移植物抗宿主病 东南大学医学院附属中大医院血液内科 研究生周颖导师陈宝安 目的：探讨磁性纳米材料f e 3 0 4 ( m n p ) 联合免疫抑制药物坏孢素a 对于小鼠 异基因骨髓移植( a l i o - - b m t ) 后移植物抗宿主病( a g v h d ) 的抑制作用及对环 孢素a 的血药及组织浓度有无影响，为磁性纳米材料f e 3 0 4 ( m n p ) 是否可作 为环孢素a 的载体应用于急性移植物抗宿主病提供依据。 方法：用主要组织相容性抗原( m h c ) 完全不合的纯种近交系小鼠f 供鼠：雄性 c 5 7 b l 6 ( h 一2 b ) 鼠；受鼠：雌性b a l b c ( h 2 d ) 鼠】建立a l l o b m t a g v h d 动 物模型，随机分5 组：环孢菌素a 组、f e 3 0 4 ( m n p ) 组、环孢菌素a + f e 3 0 4 ( m n p ) 联合用药组、空白对照组以及照光未移植组。观察各组小鼠骨髓移植 后a g v h d 的出现情况及血、心、肝、脾、肺、肾、脑中环孢菌素a 浓度。 结果：移植后小鼠出现典型的a g v h d 症状，未用a g v h d 预防方案的移植小 鼠( 第4 组) 及用f e 3 0 4 ( m n p ) 预防的移植小鼠( 第3 组) 死亡高峰在移植后 第1 3 1 5 天，死亡率1 0 0 。用环孢菌素a 及环孢菌素a + f e 3 0 4 ( m n p ) 预 防的第l 、2 组小鼠a g v h d 症状减轻，平均生存时i b j m s t ) 较第4 组显著延长 ( 分别延长5 5 ，7 5 d ，p 9 9 7 ，批号：2 0 0 2 0 1 3 5 2 。 ( 7 ) 磁性纳米四氧化三铁( m n p ( f e 3 0 4 ) ) ：东南大学生物医学工程系。在使 用前将纳米粉粒用灭菌水溶解，超声混匀，制备成饱和溶液。 ( 8 ) 环孢素：田可胶囊，华北制药生产，为1 1 个氨基酸组成的环状多肽，胶 囊为桃红色胶囊，内含黄色或浅黄色的油状液。 ( 9 ) c s a 单克隆全血浓度标准曲线盒：2 9 0 4 8 q 1 0 0 美国雅培公司。 ( 1 0 ) c s a 全血浓度质控盒：3 5 2 0 1 q 1 0 0 美国雅培公司。 ( 11 ) c s a 全血浓度试剂盒：4 0 5 7 6 q 1 0 0 美国雅培公司。 ( 1 2 ) 稀释缓冲液：4 6 6 5 5 m 1 0 2 美国雅培公司。 ( 1 3 ) c s a 全血细胞溶解n - 4 0 5 7 6 q 1 0 0 美国雅培公司。 ( 1 4 ) c s a 全血蛋白沉淀剂：4 0 5 7 6 q 1 0 0 美困雅培公司。 2 实验方法与步骤 2 1 实验器械准备 玻璃器皿：经去污剂漂洗、单蒸水冲洗、置于干燥箱内烘干后泡酸过夜， 单蒸水冲沈后1 5 0 。c 烤箱中干烤4 h 。使用前经高温高压蒸汽消毒，放入4 2 - - - 4 5 烤箱中烘干备用。 塑料和橡胶制品：初次使用的橡胶帽和橡皮塞，浸于0 5 m m o l l 的n a o h 溶液中煮沸3 0 m i n ，自来水冲洗后再放入0 5 m o l l 的h c i 溶液中煮沸3 0 m i n ， 用自来水冲洗后再用单蒸水冲洗( 再次使用的，只需用去污剂漂沈干净) ，烘干。 高温高压灭菌后放入4 2 。c - - - 4 5 烤箱中烘干，备用。 2 2 受鼠预处理t b i ( 第0 天) 1 4 东南人学硕j j 学位论文 6 5 只作为移植受鼠的( b a l b c ) 雌性小鼠，分为5 组，分别以3 苦味酸溶液从 第1 至第l o 只分别标号。预处理t b i 前6 天丌始饮用含红霉素( 2 5 0 m g l ) 和庆大 霉素( 3 2 0 m g l ) 的无菌水，并持续至移植后2 周，进行肠道净化。预处理t b i ( 第 o k ) 当日将( b a l b c ) 雌性小鼠固定于照射架后装入特制清洁级塑料包装箱内， 送至江苏省肿痛医院放疗中心接受6 0 c oy 全身辐照( 总剂量：8 g y ；照射野： 3 6 c m x 3 6 c m ；照射时间：1 0 9 6 分；剂量率：7 3 c g y m i n ；照射源与动物之间距离 5 0 c m ) 。 2 3 制备移植细胞 采用颈椎脱位法将供鼠c 5 7 b l 6 j 小鼠处死，7 5 乙醇浸泡消毒5 m i n 后， 在超净工作台内无菌切取股骨、胫骨及脾脏，剪丌股骨、胫骨两端骨骺，用注 射器吸取r p m i1 6 4 0 培养液反复冲洗骨髓腔，2 0 0 目金属网过滤制备单细胞悬 液，离心后去上清，裂解红细胞后用不含血清的r p m i1 6 4 0 培养液洗涤两次， 细胞计数并调成所需细胞浓度备用( 1x1 0 8 m 1 ) ，台盼蓝染色活细胞数 9 5 。 将脾脏剪成小块后在2 0 0 目金属网上用注射器针芯轻轻研磨，同时用r p m i 1 6 4 0 液冲洗过滤成单细胞悬液，离心后去上清液，0 8 3 n h 4 c i 溶解红细胞， 用不含血清的r p m i1 6 4 0 培养液洗涤两次，细胞计数并渊整细胞浓度为1 x 1 0 8 m l ，台盼蓝染色活细胞数 9 5 。 2 4 受鼠移植过程 受鼠b a l b c 小鼠在全身照射后6 8h ，接受骨髓移植( 经尾静脉输注骨 髓和脾细胞悬液共0 2m l 只) 。 2 5 实验动物分组 小鼠共分5 组，第1 3 组各15 只，第4 、5 组l o 只，分别给予不同的a g v h d 预防方案： ( 1 ) c s a ：c s a1 5m g k g d 。腹腔注射，从移植后+ l 天开始用药，当小鼠 的胃肠功能逐渐恢复后，改为c s a 5m g k g 一d 1 灌胃； ( 2 ) c s a + f e 3 0 4 ( m n p ) ：c s a1 5m g k g1 d 。腹腔注射，从移植后+ 1 天开始 用药，当小鼠的胃肠功能逐渐恢复后，改为c s a5m g k g d 一灌胃；f e 3 0 4 ( m n p ) 6 0 0m g k g d 一腹腔注射，从移植后+ 1 天丌始用药，当小鼠的胃肠功能逐渐 恢复后，改为灌胃： 实验材料j 方法 ( 3 ) f e 3 0 4 ( m n p ) ：f e 3 0 4 ( m n p ) 6 0 0m g k 季1 d 。1 腹腔注射，从移植后+ 1 天开 始用药，当小鼠的胃肠功能逐渐恢复后，改为灌胃； ( 4 ) 空白对照组( 即移植后未用药防治g v h d ) ： ( 5 ) 照光后未予骨髓移植。 3 观察指标 3 1 一般情况，g v h d 积分 观察小鼠的生存期，计算生存率。观察各移植组小鼠质量、体型、体位、 毛发、腹泻、死亡情况。根据腹泻、皮炎、肝脏、体重下降等情况观察有无a g v h d 并予以临床a g v h d 评分，g v h d 判定标准：外周血白细胞计数 l 1 0 9 l 且伴 有食欲下降，体重下降，皱毛，弓背，嗜睡或活动减少，脱毛，腹泻，出血或 粘膜炎症等表现。病理检查可见肝、肠、皮肤等组织淋巴细胞浸润，正常组织 结构破坏，伴有局灶性出血等改变。按照c o o k e 等的移植小鼠临床g v h d 症状 的评估标准评估小鼠a l l o b m t 后的g v h d 积分，其评估标准为：( 1 ) 体重下 降 2 5 为2 分；( 2 ) 无 弓背为0 分，静止时弓背为1 分，严重弓背影响行动为2 分；( 3 ) 活动j 下常为 0 分，轻微活动减少为1 分，明显活动减少为2 分；( 4 ) 体毛f 常为0 分，轻 微打皱为1 分，明显打皱难梳理为2 分；( 5 ) 皮肤完整为0 分，鼠爪尾脱皮1 分，全身明显脱皮、裸露为2 分。 3 2 血常规监测 移植后每次取3 只小鼠，隔天眼球后采血，放于白细胞稀释液稀释，常规 计数白细胞。 3 3 病理检查 取濒死小鼠活杀取肝、小肠、皮肤等制各石蜡切片，常规苏木精一伊红染色， 观察a g v h d 病理表现。 3 4 环孢素浓度测定 3 4 1 t d x f l x 血药浓度监测仪方法学研究 t d x f l x 血药浓度监测仪是应用荧光偏振( f l u o r e s c e n c ep o l a r i z a t i o n ) 技术和 竞争结合免疫分析( c o m p e t i t i v eb i n d i n gi m m u n o a s s a y ) 方法与散射能量衰减法 ( r a d i a t i v ee n e r g ya t t e n u a t i o n ，r e a ) 获得待测药物的浓度。荧光偏振免疫分析 1 6 东南人学颂l ：学位论文 ( f l u o r e s c e n c ep o l a r i z a t i o ni m m u n o a s s a y ，f p i a ) 技术是8 0 年代初发展起来的，目 前发达国家应用非常普遍。荧光偏振免疫分析( f p i a ) 及散射能量衰减法( r e a ) 使得分析结果更准确、更精密、更灵敏，并具有可靠的特异性。该法是基于待测 物c s a 和联结了荧光部分的c s a 示踪物与特定抗体有限受体结合位点的竞争性 结合。药物与抗体结合即结合荧光体，抗体复合物中抗体释放荧光体，引起偏振 度下降，而下降程度与样品中c s a 浓度相关。 3 411 仪器检查校正 按照操作手册对仪器做温度、光路、吸量检查。 ( 1 ) 温度检查：将2 0 个空比色杯放入分析转盘上。锁紧分析转盘，放入全 自动荧光偏振免疫分析仪内，关上门。选择输入温度检查程序。约1 5 分钟后， 测试完成，各项测试结果期望值应为：空比色杯温度：3 9 7 - - 一4 0 7 。缓冲液体 温度：3 4 5 , - 一3 5 5 。测试过程中，仪器自动向空比色杯加入缓冲液，有液体的 比色杯温度：3 3 5 - - 一3 4 5 。 ( 2 ) 光系统检查：选择输入光系统检查程序。查看“荧光计标准测试盘”内 环标签的“增益值”是否与仪器的显示的值一样。否则修改之。将“标准测试 盘”紧锁放入t d x 仪器内，关上门。输入运行开始程序，约5 分钟后，测试完 成。查看数值是否在仪器规定的范围内。规定范围：平均密度：1 0 6 0 0 4 - 1 2 ， 密度范围： 6 0 0 ，平均偏振：4 7 5 1 5 ，偏振范同： = 2 5 。 ( 3 ) 吸量检查：将样品杯和空比色杯各2 0 个放入分析转盘上。将缓冲液翻 转2 - - 3 次，以确定混合均匀，用微量取样器每一样品杯加入7 5 u l 的缓冲液。 锁紧分析转盘，放入t d x 仪器内，关上门。选择输入吸量检查的程序。大约l o 分钟可测试完毕，测试过程中，仪器自动向空比色杯加入缓冲液。核对测试结 果判断：1 、2 、3 号比色杯的比例值应介于：0 9 5 1 0 5 之间，1 6 2 0 号比色 杯的平均广度值应在4 0 0 0 - - - 1 0 0 0 0 之问。 3 4 1 2 样本测定 轻柔倒置装有样品的管子，晃动至少5 次，以便混匀。避免过度摇动产生泡 沫，否则，放置等泡沫消散。在含有5 0u 1 的细胞溶解液( c s a 专用) 离心管中， 精密加入经混匀的样本1 5 0 u l ，充分混匀，于振荡器振荡2 m i n ，再加入蛋白沉淀 齐l j 3 0 0u l ，于振荡器上振荡2m i n 后，放入高速离心机中，以1 00 0 0r m i n 1 速度离 实验材料j j 方法 心5m i n ，离心后，打开盖，立即倾上清液于转盘上的样品杯中，以防挥发，放入快 速血药浓度测定仪中测定。 3 4 1 3 标准曲线 分别吸取标准曲线项下的各浓度标准样品一份，按样本测定的测定方法制作 标准曲线。标准曲线合格的判断标准为均方差根( r m s e ) 小于等于1 0 ，且各浓 度点的极差( p e r r ) 均在一2 o + 2 0 以内。同时符合这两个条件的标准曲线视 为可用做样本的测定。在开启新试剂盒时，先进行低、中、高质控的测定，当低、 中、