（农药学专业论文）农抗95123高产菌株的选育.pdf

农抗9 5 1 2 3 高产菌株的选育 摘要 农抗9 5 1 2 3 是一种新型大环内酯类类化合物，是一种高效、低毒、广谱的杀虫 抗生素，在农业生产中具有良好的应用，具有广阔的市场前景。本试验对9 5 1 2 3 生 产菌株进行了一系列的物理化学诱变并建立了原生质体制备、融合及再生的最佳条 件，在此基础上应用基因组重排技术，展开了对农抗9 5 1 2 3 的高产菌种育种工作。 通过对原始菌株进行分离复壮，获得一株遗传性能较为稳定的出发菌株d o r - 9 0 ( 效价2 0 4 9 u g m 1 ) ，经过一系列诱变获得菌株u l 3 3 ( 高产菌株，效价31 3 2 u g m 1 ) 和d 7 ( 长势良好但效价很低) ，并通过硫酸链霉素和庆大霉素抗性平板筛选，得到 了y 3 4 ( s t r + g e n - ) 菌株和z 1 8 ( s t r g e n + ) 菌株。 以u l - 3 3 为出发菌株进行原生质体制备条件探索，试验结果显示菌株u l 一3 3 原 生质体制备的最佳条件为2 5 0 m i 三角瓶装有3 0m 1 含0 5 甘氨酸的y e m e 培养基， 孢子悬液接种，2 8 ，2 0 0 r m i n 培养4 2 h ；3 0 0 0 r r a i n 收集菌丝体，并用浓度为1 0 3 蔗糖溶液清洗2 次；在溶菌酶浓度为3 m g m l 的p 缓冲液悬浮菌丝体，3 0 。c 下酶解 6 0 m i n ，原生质体制备完成。原生质体在p e g l 0 0 0 浓度为4 0 时，融合率最高。 以y 3 4 ( s t r + g e n ) 、z 1 8 ( s t r g e n + ) 、d 7 ( 长势良好但效价很低) 和a a 7 3 2 ( 实 验室原始保存菌株) 为亲本进行基因组重排育种研究，结果显示随着重排的深入， 重组群体中高产菌株的出现频率增加。通过连续五轮基因重排，融合效率可达4 2 1 ( 趋于稳定) 并筛选获得高产菌株f 5 4 1 ( 效价4 7 8 5 u g m 1 ) ，其发酵效价较原始菌 株u l - 3 3 提高了5 2 8 ，且经过连续五次传代，结果显示该菌株稳定性良好。 关键词：农抗9 5 1 2 3 ；诱变育种；原生质体；基因组重排 本课题由武汉天惠生物工程有限责任公司资助 华中农业大学2 0 0 9 届硕士学位论文 a b s t r a c t a g r i c u l t u r a la n t i b i o t i c9 512 - 3i san e wm a c r o l i d ec o m p o u n d s ，w h i c hi sp r o d u c e da 1 1 i g h p e r f o r m a n c e 1 0 wt o x i c i t y , b r o a d s p e c t r u ma n t i b i o t i c si n s e c t i c i d a lb yf e r m e n t a t i o n t h e ya r et h em o s te f f e c t i v ea g r i c u l t u r a lp e s t i c i d e sa n da n t i p a r a s i t i ca g e n t s ，a n dw i d e l y u s e di nv e t e r i n a r ya n da g r i c u l t u r a lf i e l d s i nt h i sp a p e r , o p t i m i z a t i o no fs t r e p t o m y c e s a v e r m i t i l i sc a r r i e do u tt h r o u g ha n a l y s i so fr e s i s t a n tm u t a t i o na n dg e n o m es h u f f l i n ga f t e r e s t a b l i s h e dt h ep r o t o p l a s tp r e p a r a t i o nc o n d i t i o n s as t a b l ea n dh i g h - y i e l d i n gs t r a i nd o r - 9 0w a so b t a i n e df r o mp r i m i t i v es 仃a i nb ys t a b l e e x p e r i m e n t a t i o n o b t a i n ss t r a i nu l 3 3a n dd 7a f t e ras e r i e so fm u t a g e n e s i s ，a n d c e l e b r a t e sm a g n a m y c i nr e s i s t a n tp l a t es c r e e n i n gt h r o u g ht h es u l f u r i ca c i dc h a i nm i l d e w e l e m e n t , o b t a i n ss t r a i ny 3 4a n ds t r a i nz 18 r e s u l t ss h o w e dt h a tc o n d i t i o n sf o r p r o t o p l a s tp r e p a r a t i o n f o r s t r e p t o m y c e s a v e r m t i t l i sw e r ef o l l o w i n g t h e3 0 m ly e m em e d i a ( p l u so 5 g l y c i n e ) i n2 5 0 m lf l a s k i n o c u l a t e dw i t hs p o r es u s p e n s i o na n di n c u b a t e da t2 8 。cf o r4 2 ho nar o t a r ys h a k e ra t 2 0 0 r p m m y c e l i aw e r ep e l l e t t e dt h r o u g hc e n t f i f u g a t i o na t3 0 0 0 9a n dw a s h e dw i t h1 0 3 s u e r o s e m y c e l i aw e r er e s u s p e n d e dw i t hpb u f f e r ( c o n t a i n4 m g m ll y s o z y m e ) a n d i n c u b a t e da t3 2 。cf o r6 0 m i nt or e l e a s ep r o t o p l a s t 4 0 p e g10 0 0w a ss u i tf o rp r o t o p l a s t f u s i o n a st h ep a r e n tc a r r i e so nt h eg e n o m et e a mt a k ey 3 4 ，z 1 8 ，d 7a n da a 7 3 2t o r e a r r a n g et h eb r e e d i n gr e s e a r c h ，f e r m e n t a t i o na n a l y s i ss h o w e dt h a tt h er a t i o so fs t r a i n s w i t hh i g ha v e r m e c t i np r o d u c t i o ni n c r e a s ew i t ht h ef u r t h e rs h u f f l i n g a f t e rf i v er o u n d r e c u r s i v ef u s i o n ，t h ef u s i o nr a t er e a c h e d4 2 1 a n dt h es y s t e mw e r es t a b l e t h es t r a i n f 5 - 4 1w a so b t a i n e d ，w h i c hc a np r o d u c e4 7 8 5j - t g m l i tw a si n c r e a s e d5 2 8 m o r et h a n t h eo r i g i n a ls t r a i nu l 3 3 s u b c u l t u r ee x p e r i m e n ti n d i c a t e dt h a tt h ef 5 4 1w a sg e n e t i c a l l y s t a b l e k e yw o r d s ：a g r i c u l t u r a la n t i b i o t i c9 51 2 - 3 ，m u t a t i o nn e e d i n g ，p r o t o p l a s t , g e n o m es h u f f l i n g i i 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文 如需保密，解密时间年 月日 是否保密 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已 经发表或撰写过的研究成果，也- e 包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位 或证书而使用过的材料，指导教师对此进行了审定。与我一同工作的同志对本研究 所做的任何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意。 研触张风舳帆冲年岁月，s 日 籼黼鲐沙私摊名：彬 签名日期：、川年( 月l ( 日签名日期：刃刀年厂月厂日 农抗9 5 1 2 3 高产菌株的选育 1 日看 1 1 生物农药 生物农药是具有农药特性的用来防治病、虫、草等有害生物的生物活体及其产 生的生理活性物质和转基因产物。按其来源和性能，生物农药有以下三个类别： 微生物农药，包括细菌、真菌、病毒和原生动物等制剂。农用抗生素，农用抗生 素包括杀虫抗生素、杀菌抗生素和除草抗生素。生化农药( 又名特异性农药) ，如 昆虫信息素、昆虫生长调节剂等。严格的说，还应包括转基因植物，它们本身即能 达到治病杀虫的效果( 康卓，2 0 0 1 ) 。与传统的化学农药相比，生物农药具有对人畜 和非靶标生物安全，环境兼容性好，不易产生抗性，易于保护生物多样性，来源广 泛等优点。 为了满足可持续发展的需要，国家有关部门已经加大了高效低毒、无毒生物农 药的开发力度，为开创中国农药行业发展新局面奠定了基础。近年来，国内一些非 农药行业的上市公司及许多科研院所和高等学校已加入到开发高效低毒、无毒生物 农药的行列，为我国生物农药的快速发展创造了有利条件。我国在8 6 3 高技术计划 和2 0 1 5 年中长期科技规划中，均将生物农药列为重点攻关项目。可以相信，我国生 物农药行业一定能在不远的将来全面崛起，而无公害生物农药的广泛应用，将在农 业的可持续发展和生态环境免遭破坏等发面做出巨大贡献，增强我国农产品的竞争 力。对于我国这样一个农业大国来说，大力开发和使用无公害生物农药，有着广阔 的市场和光明的前景。 1 2 农用杀虫抗生素 农用抗生素是指由细菌、真菌和放线菌等微生物在发酵过程中产生，能够抑制 危害农作物的有害生物的次级代谢产物( 沈寅初和张一宾，2 0 0 0 ) 。按防治对象通常 分为杀菌农用抗生素、杀虫农用抗生素、除草农用抗生素、植物生长调节剂等。 1 9 9 5 年在荷兰海牙召开的第1 3 届国际植物保护大会上，提出了“造福全人类 的可持续发展 的植物保护方针。鉴于此，2 0 世纪7 0 8 0 年代开始，在化学农药品 种更新换代的同时，生物源农药研究与开发也有长足进步，特别是杀虫抗生素成了 新型生物源农药的新亮点。由于其防效高、杀虫谱广、毒性相对低、对环境影响小 等特点，目前已在水稻、棉花、蔬菜、果树、烟草、花卉等多种作物上施用，在牲 畜、宠物体内外寄生虫的防治上也显示了它的优越性( 陆自强等，2 0 0 2 ) 。 华中农业大学2 0 0 9 届硕士学位论文 国内外报道的杀虫抗生素品种甚多，其中研究与开发较为成功的有以下几种。 1 2 1 阿维菌素( a v e r m e o t i n ) a v m ( 图1 2 ) 在国外主要用于农作物和园艺作物昆虫的防治( m c k e l l a e t a 1 ，1 9 9 6 ) ，特别是对小菜蛾、棉铃虫等效果明显，并且与目前常用的农药不表现交 叉抗药性，因此其在农业上的重要性越来越受到关注( 许建平等，1 9 9 6 ；许再福， 1 9 9 5 ；张敏恒，1 9 9 8 ) 。1 9 8 5 年，在澳大利亚首次将阿维菌素应用于动物杀虫药( t a h i r e ta 1 ，1 9 8 6 ；d e c h a n e ee ta 1 ，1 9 8 8 ) ，但由于安全性等问题a v m 在动物上的使用不及 i v l v l 广泛。在我国，a v m 只用于农药( 程伯瑛，2 0 0 0 ) 。 a v e r m e c f i na l a a v e r m e c f i na l b a v e r m e c t i na 2 a a v e r m e c f i na 2 b a v c r n a e c f i nbl a a v e r r a e c f i nb i b a v e r r a e c t i nb 2 a a v e r m e c f i nb 2 b x - - y c h = c h c h - c h c h 2 c h ( 0 h ) c h 2 - 一0 h ( o h ) c h = c h c h c h c h 2 一i c h ( o h ) c h z - c h ( o h ) 图1 2 阿维菌素b h 结构 f i g 1 2s t r u c t u r eo fa v e r m e c t i nb i a 1 。2 。2 伊维菌素( i v o r m o c t j n ) 为提高a v m 的稳定性，降低a v m 的毒性，m e r c k 公司合成了m ( c h a b a l ae t a 1 ，1 9 8 0 ) ( 图1 3 ) ，与a v m 相比，i v l v i 稳定性好，毒性更小，更适合应用于动物 上。1 9 8 1 年，i v m 作为动物抗寄生虫药首先在法国上市，之后w m 迅速成为使用 最广泛的抗寄生虫药，也是目前使用最为广泛的阿维菌素类药物。到1 9 9 7 年，m 在9 0 多个国家注册的制剂己达2 3 种( m c k e l l a r ，1 9 9 7 ) ，适应于多种动物在不同情 况下使用( 洪波，1 9 9 8 ；韩谦，1 9 9 7 ；陈西钊，1 9 9 6 ：c a m p b e l la n db e n z ，1 9 8 4 ) 。 除此之外，i v i v i 还被用于防治人的盘尾丝虫和人螨虫病( b r o o ke ta 1 ，2 0 0 2 ) 。1 9 9 6 年，全球用过i v l v l 的人达6 0 多万( m c k e l l a re ta 1 ，1 9 9 6 ) ，在我国，i v l v l 已经作为 兽药广泛应用( 许春林和方廷松，2 0 0 2 ) 。 2 贴|苗：；|豇耋l r ：差| & ：l | 砒址：il：墨|h h h h 农抗9 5 1 2 3 高产菌株的选育 h f 图1 3 伊维菌素结构 f i 9 1 3s t r u c t u r eo fi v e r m e c t i 1 2 3 多拉菌素( d o r a m e c tin ) 1 9 9 3 年，美国辉瑞公司利用突变的阿维菌素链霉菌生物合成了d o r ( g o u d i e e ta 1 ，1 9 9 3 ) ( 图1 - 4 ) ，其最早于1 9 9 3 年在巴西和南非上市( v e r c r u y s s ee ta 1 ，1 9 9 3 ) 。 与i v m 相比，d o r 在动物体内的清除率较低、生物半衰期较长、生物利用率较高 ( a t t aa n d a b o s h i h a d a ，2 0 0 0 ；p e r e ze ta 1 ，2 0 0 2 ) ，而且d o r 注射剂刺激性小，可以进 行肌肉注射，给药方便，持效期更长，一次给药即可杀死动物体内的线虫和体外寄 生虫，不需要重复给药，因此在养猪业和宠物业上应用比较广泛。在我国，d o r 主 要用于对猪消化道线虫、猪消化道圆虫、猪疥瞒、猪间虫体传染、猪肺蠕虫、猪虱 及沙皮犬的蠕形螨病等寄生虫病的治疗，同时还应用于大型的规模化养殖场的寄生 虫病的预防，并取得较好的效果。 华中农业大学2 0 0 9 届硕士学位论文 d o r a m e c t j n o ， h 乒 图1 4 多拉菌素结构 f i 9 1 4s t r u c t u r eo fd o r a m e c t i n 1 2 4 塞拉菌素( s e la m e c tin ) 目前已商品化的s e l a m e c t i n ( 2 5 环己基2 5 脱( 1 甲基丙酸) 5 脱氧2 2 ，2 3 双氢5 肟基阿维菌素b 1 单糖衍生物) ( 图1 5 ) 是由d o r a m e c t i n 半合成改造得到的。由于它的 高效和安全性已经被允许用于宠物如猫、狗等的体内外寄生虫防治上。大牧羊犬对 伊维菌素有特异的毒性反应，而s e l a m e c t i n 对大牧羊犬则特别安全有效( p e r e ze t a 1 2 0 0 2 ) 。目前阿维菌素的衍生物中s e l a m e c t i n 的药效和安全性是最为理想的。 s e t a m e c t t n 7 0 ， h g ；l i o s , 图1 5 赛拉菌素化学结构式 f i g 1 5s t r u c t u r eo fs e l a m e c t i n 4 农抗9 5 1 2 3 高产菌株的选育 1 2 5 埃普利诺菌素( e p rin o m e c tin ) 虽然有些阿维菌素类药物在防治寄生虫方面发挥了巨大的作用，但是由于这些 药物在奶中残留量高，因而禁止用于泌乳期动物。鉴于此，1 9 9 4 - 1 9 9 6 年，m e r c k 公司从6 0 多种a v m 结构改造产物中，根据药物的临床疗效、药代动力学特征和药 物的奶血分配特性筛选出一种新的阿维菌素类药物e p r ( r a y m o n de ta 1 。1 9 9 4 ； s h o o pe ta 1 ，1 9 9 6 ) ( 图1 6 ) ，与其他阿维菌素类药物一样，e p r 对绝大多数线虫和 节肢动物昆虫有很强的杀灭作用，且活性较高；e p r 与其他a v m s 显著不同的是e p r 的奶血分配系数低( 0 1 7 ) 在奶中残留量低，应用于泌乳奶牛而无需休药期，此外， e p r 在肌肉中残留量低，应用于肉牛也不需要休药期( s h o o p e ta 1 ，1 9 9 6 ) 。在我国， e p r 也已被合成出来，现又被称之为乙酰氨基阿维菌素。 图1 6 埃普利诺菌素结构 f i g 1 6s t r u c t u r eo fe p r i n o m e c t i n 1 2 6 莫西菌素( m o x i d e c t i n ) 莫西菌素( 图1 7 ) 是一种链霉菌发酵产生的、半合成单一成分的大环内脂类抗 生素，是奈马菌素( y e m a d e c t i n ) 的衍生物。与其它大环内酯类抗寄生虫药的不同之处 在于它是单一成分，有着更广的驱虫活性和长效、安全等特性，且低剂量下就有很 强的抗线虫和节肢动物等体内外寄生虫活性。2 0 世纪8 0 年代中期才开始作为兽用 驱虫药使用，现己在日本商品化。在我国，该药广泛应用于多种动物的体内外寄生 虫病的治疗，对牛皮蝇、吸血虱、猪体内消化道线虫、肺线虫、马副线虫的幼虫等 均有较好的驱杀效果，目前临床上常用的剂型有浇泼剂、注射剂、胶丸、微球缓释 华中农业大学2 0 0 9 届硕士学位论文 剂等。 h ，c o c h i ， n h 图1 7 莫西菌素结构 f i g 1 7s t r u c t u r eo fm o x i d e e t i n 1 3 农用抗生素的发展及研究现状 c h ， ， 日本是世界上第一个大规模生产农用抗生素的国家，在农用抗生素的研究和应 用方面一直处于世界前列。国际上农用抗生素研究比较有特色的5 个机构中，日本 占3 家，分别是明治制药、北里研究所和理化研究所( 朱昌雄等，2 0 0 0 ) 。二十世纪 五十至六十年代后期，日本率先研制成功了用于防治水稻三大病害( 稻瘟病、纹枯病、 白叶枯病) 的抗生素一杀稻瘟菌素s 、春日霉素、多氧霉素和有效霉素，并实现了产 品的工厂化生产，推动了世界农用抗生素的发展。此后研制出的灭粉霉素、奈良霉 素、灭孢素、四抗菌素、米尔比霉素及双丙氨膦在工业化生产中都获得了成功。 美国从二十世纪六十年代开始在食用动物的饲料中添加抗生素，到九十年代作 为饲料添加剂的农用抗生素已超过其它各种类型的农用抗生素，与医用抗生素产量 持平。青霉素、四环素、泰乐菌素、链霉素、螺旋霉素等都曾作为饲料添加剂而使 用，此后又将多种抗生素用于植物保护( m i s r a ，1 9 8 6 ) 。 我国的农用抗生素研究起步于二十世纪五十年代。尹萃耘先生1 9 5 3 年从陕西径 阳分离到对棉花黄萎病有一定作用的“5 4 0 6 菌株，揭开了我国农用抗生素研究的 序幕。2 0 世纪7 0 年代开发出防治水稻纹枯病的井冈霉素，2 0 多年来经久不衰，近 几年来年产量达3 0 0 0 4 0 0 0 吨，防治对象也扩大到小麦、玉米等作物的纹枯病( 沈寅 初，1 9 9 6 ) 。此后相继开发和应用了农抗1 2 0 、公主岭霉素、多效霉素等农用杀菌抗 生素。进入2 0 世纪9 0 年代后，抗生素的研究开发进入一个新的研究发展高潮，中 6 农抗9 5 1 2 3 高产菌株的选育 生菌素、武夷菌素、宁南霉素等大批抗菌素得到开发，杀虫抗生素的研究开发也 得到迅速发展，先后成功开发了浏阳霉素、华光霉素、阿维菌素。 农用抗生素主要应用于防治农作物的病虫草害，产品要投放市场，因此必须要 考虑投入产出比。几十年来，人们研究开发了很多的农用抗生素，我国筛选到的农 抗菌种超过1 0 0 多种，其中完成室内测定和田间小区实验的品种有5 0 多种。但是很 多农用抗生素的生产化水平太低或成本太高，无法与众多的性质优良、价格低廉的 化学农药相竞争。我国生产农用抗生素的企业2 0 0 多家，除少数生产井冈霉素、阿 维菌素的企业有一定规模外，绝大部分为小企业，生产设备和条件差，资金和技术 力量不足，产品质量差，市场份额小，难于进一步发展。农用抗生素为微生物发酵 产品，产品质量受菌株及各种发酵条件的影响。部分工厂的发酵工艺技术还比较落 后，造成不同批次产品质量存在差异，达不到市场要求。此外，在农用抗生素研究 开发的过程中，工作侧重于菌种选育、发酵实验、防效改进，而对于中间环节的工 业发酵工艺和农药制剂加工技术研究重视不足，造成研究发现的具有应用前景的农 抗很多，但成功实现商品化的不多，而己商品化的制剂产品的理化指标和稳定性也 存在问题，如含水偏高、颗粒粒度大、悬浮率低、稳定性差等( 顾宝根，姜辉，2 0 0 0 ) 。 1 4 农用抗生素的研究趋向 1 4 1 筛选新的农用抗生素品种 通过大量的筛选抗生素产生菌，开发出具有新型结构的抗生素。样本采集范围 从土壤微生扩展到海洋微生物，同时采用新的筛选方法和筛选模型以筛选各种抗菌、 杀虫、除草的抗生素。 1 4 2 选育高产菌株 抗生素发酵单位是其能否实现工业化生产的关键，选育高产菌株是提高生长能 力的重要手段，是商业化发酵发展的基石，而且伴随整个发酵开发的全过程。菌株 选育方法包括自然选育和诱变育种。由于自然突变的频率低，突变的幅度不大，单 纯依靠自然选育有很大的局限性。诱变育种则具有突变频率高，变异幅度大，高效 的优点。上海农药研究所在选出井冈霉素之初，发酵效价不到1 0 0 单位，经过反复 诱变育种，目前发酵效价己达3 0 0 0 0 单位，工厂生产稳定在2 0 0 0 0 单位以上，成本 大幅降低，使用面积逐年扩大( 曾广然，1 9 8 9 ) 。诱变方法除传统的物理和化学诱变 外，基因重组技术( 包括原生质体融合、转化和结合等) 以及基因工程等现代分子生 7 华中农业大学2 0 0 9 届硕士学位论文 物学技术已经广泛应用于菌种的选育。 1 4 3 优化发酵过程 微生物发酵过程的生产水平不仅取决于生产菌种本身的性能，还要赋以合适的 环境条件。在选育高产菌株的基础上，必须了解生产菌在发酵过程中的代谢变化规 律，及与发酵有关的参数及其影响，找到与之配套的培养基、培养温度、p h 、溶氧 等发酵条件，优化发酵工艺，使生产菌种处于产物合成的优化环境中，提高发酵单 位。四川抗菌素工业研究所褚以文( 1 9 9 9 ) 通过对多种多因素发酵培养基优化方法 的分析比较和运用，选择p l a c k e t t b u r m a n 法、限制性随机平衡法、响应面优化设计 法、均匀设计法和改良单纯型优化法研制出了微生物培养基优化程序o p t i 软件。 张嗣良等( 2 0 0 2 ) 在研究反应器物料流与微生物细胞代谢流的相关特性后，提出了 以细胞代谢流为核心的生物反应工程学的观点及基于参数相关的发酵过程多水平问 题研究的优化技术，并成功应用在青霉素、红霉素、金霉素、链霉素等发酵产品中。 1 4 4 改造农用抗生素的结构 通过化学方法改造已知的农用抗生素的结构或者以已知的农用抗生素为先导化 合物合成出新的农抗品种。如阿维菌素改造为伊维菌素、氨甲基或乙酰氨基阿维菌 素，使其药效提高，毒性降低( i k e d ae ta l ，1 9 9 3 ) 。以s t r o b i l u r i n 为先导化合物，英国 捷利康公司开发出了a z o x y s t r o b i n ，德国巴斯夫公司开发出k r e s o x i m - m e t h y l ，日本盐 野义制药公司开发出s s f 1 2 6 ，诺华公司开发出c g a 2 7 9 2 0 2 ( 柏亚罗，1 9 9 9 ) 。 1 5 农用抗生素产生菌的诱变育种 在微生物发酵工业中菌种通过诱变育种不仅可以提高有效产物的产量，改善生 物学特性和创造新品种，而且对于研究有效产物代谢途径、遗传图谱绘制等方面都 有一定的用途，归纳起来主要有以下几方面。 1 5 1 提高生产力 从自然界分离的抗生素产生菌的野生型菌株，生产能力通常很低，不能作为生 产菌种，但野生型菌种经过诱变选育后，生产能力往往可提高几十至几百倍。例如： 经过一系列的物化诱变处理，同时结合培养条件的优化，青霉素产生菌的生产能力 达到了4 6 0 0 0 5 3 0 0 0 u g m l ( 朱宝成等，1 9 9 4 ) 。同时，在其他抗生素( 如：链霉素、金 霉素、地霉素等) 产生菌的选育中也取得了巨大成绩。 农抗9 5 1 2 3 高产菌株的选育 1 5 2 合成新的抗生素产品 目前，大多数抗生素种类都是从生态学途径筛选获得。但随着抗生素产业研究 的不断深入随机筛选发现新抗生素的几率愈来愈低，通常需要筛选一万株以上才可 能得到一种新的抗生素。现有报道，有些微生物中可能存在在自然条件下不表达或 是极低水平表达的d n a 序列，而这些d n a 序列能在特定条件下被激活表达活性产 物。通过诱变和原生质体融合等方法可以激活这些d n a 序列，从而找到新的抗生 素种类( 顾觉奋，2 0 0 3 ) 。另外还可以通过诱变使一些本身不产抗生素的菌株生产抗 生素( 吕淑君等，1 9 9 6 ) 。第一个生物改造获得的抗生素去甲基金霉素是金霉素 产生菌经紫外线、氮芥诱变的形态突变株产生的。道诺霉素产生菌松链霉菌 ( s p e u c e t i u s ) 经n 亚硝基_ n 甲基脲烷处理获得株青灰色突变菌株产生亚德里亚 霉素。 1 5 3 减少杂质，提高抗生素纯度 抗生素产生菌产生的抗生素，往往不是单一的，而是多组分的混合物。通过诱 变育种可将其中有毒的或活性弱的组分除去，同时也可增加有效组分或添加新组分。 柱晶白霉素产生菌的野生型菌株的菌丝有一定的毒性，四川抗菌素工业研究所的孙 益等( 1 9 9 4 ) ，利用常规理化因子对其进行诱变处理，结果不但改造了菌株菌丝有毒 性的不良性状，而且还使得发酵产品中主组分a 3 的含量显著提高。青霉素发酵的 原始菌株产黄青霉w i s q 1 7 6 ( p e n i c i l l i uc h r y s o g e n u mw i s q 1 7 6 ) ，在发酵过程中产生 一种黄色色素，这种色素在发酵过程中很难去除，影响产品质量，通过菌种选育获 得无色素突变株，解决了产品质量问题( 施巧琴，吴松刚，2 0 0 2 ) 。 1 5 4 改进菌株发酵工艺特性 通过诱变选育还可以改善抗生素产生菌的某些特性( 例如菌落类型、产孢能力、 生活能力、遗传稳定性、菌丝生长速度、发酵液黏度、抗噬菌体等) ，以适应生产上 的设备和条件，并可简化发酵工艺条件，缩短发酵周期，增加设备以及原料的利用 率，降低生产成本。如在土霉素生产中因得到了减少泡沫的变异菌株，从而提高了 发酵罐的利用率；又如链霉素菌产生的金霉素发酵周期一般在1 7 0 1 8 0 h ，通过紫外 线和氯化锂复合诱变数代获得f 3 0 3 变株。该变株具有孢子萌发率高，同步性好， 代谢速度快等优点( 轩海连，2 0 0 3 ) 。 9 华中农业大学2 0 0 9 届硕士学位论文 1 5 5 用于研究推测抗生素的生物合成途径 在研究抗生素生物合成过程和抗生素形成的遗传机制方面，抗生素产生菌的诱 变也是一种非常有效的手段。人们在研究抗生素的生物合成途径时，利用一些常规 的人工诱变方法，使抗生素产生菌失去产抗生素或其中间体的能力，就可分离得到 抗生素生物合成的各种不同障碍型突变体。这些突变体能够积累某种中间代谢产物 或支路代谢产物，从分析产生菌和突变株的代谢产物的化学结构上的差异，找出这 些代谢产物在合成过程中的相互关系，可判断其生化反应的特性。在这些突变株中， 抗生素阻断型突变株( 亦称为抗生素零突变株) 便是常用来判明抗生素生物合成途 径有关基础理论研究的好材料( 郝勃等，1 9 9 8 ) 。例如顶头孢霉( c e p h a l o s p o r i u m a c e r m o n i u m ) 的头孢菌素c ( c p c ) 生物合成途径的阐述就是采用了若干这样的突变株。 同时，零突变株如发生回复突变往往能筛选到产抗生素能力大幅度提高的突变株， 这种迂回、跃进战略在抗生素高产菌株的选育方面也是非常有效的途径。廖爱芳等 ( 1 9 9 6 ) 对西索米星原生菌株t - 1 2 5 进行紫外线诱变后获得阻断型突变绿色菌株 7 2 5 ，利用7 2 5 对西索米星的生物合成途径进行了合理的推测( 廖爱芳等，1 9 9 6 ) 。 1 5 6 诱变与其他育种方法相结合 诱变育种与其他方法相结起来往往会使得育种效率大大提高。如：杂交育种是 将两个亲本的有利性状组合在一起而获得良种的育种方法。在杂交前先分别诱变两 个亲本，获得有利的突变型，然后再经杂交将有利的基因组合起来，比起单纯地将 原始亲本杂交更能得到理想的效果。除此之外，诱变还可获得各种类型的突变株， 除了可直接提高产量外，有的遗传研究工作中不可缺少的标记菌株，可应用于转化、 转导、融合重组等；同这些突变菌株也拓宽了微生物的遗传种质资源，丰富了基因 库的内容。 1 6 抗生素产生菌诱变育种技术研究进展 多年来对抗生素产生菌菌种改良工作主要集中在菌株生产能力的提高以及产生 新的抗生素等方面。所采用的方法大致经历了传统的诱变育种( 包括推理选育) 、原 生质体融合技术到基因工程技术。另外，离子注入( 陈宇等，1 9 9 8 ) 、激光等新的较 好诱变剂的发现及其连续培养技术( b u t l e re ta 1 ，1 9 9 6 ) 也逐渐在菌种改良中得到认 可，并取得了很好的效果。 i o 农抗9 5 1 2 3 高产菌株的选育 1 6 1 传统的诱变育种技术 传统的抗生素产生菌菌种改良所用的方法是通过诱变育种技术。它包括两个环 节：一是以合适的诱变剂处理大量而分散的微生物细胞悬浮液，在引起绝大多数细 胞致死的同时，使存活个体中的变异频率大大提高；二是设计一种有效的筛选方法 淘汰负变株，并把正变株中少数变异幅度最大的具有优良性状的菌株巧妙地挑选出 来。可以说目前工业上所用的高产菌株大部分都是通过这种方法获得的。目前这种 方法在抗生素菌种改良中仍是方便、经济有效的，尤其适用于对那些遗传背景、生 物合成途径还不甚清楚的抗生素产生菌；使用该法可以阻断不必要的酶活力，起到 解除负调控、增加基因剂量的作用，不仅可使抗生素产量得到提高，而且可能使其 利用原材料的成本得到降低。工业青霉素产生菌p e n i c i l l i u mc h r y s o g e n u m 采用该法 从1 9 5 0 年到现在使其产量提高两个数量级( b r u n od i e ze ta 1 ，1 9 9 7 ) 。 1 6 2 原生质体融合技术 原生质体融合就是将两个亲株的细胞壁分别通过酶解作用加以剥除，使其在高 渗环境中释放出只有原生质膜包被着的球状原生质体。然后将两个亲株的原生质体 在高渗条件下混合，由聚乙二醇助融，使它们相互凝聚，通过细胞质融合，接着发 生两套基因组之间的接触、交换、遗传重组，在再生细胞中获得重组体( 陶文沂， 1 9 9 7 ) 。自从1 9 5 7 年o k a d a 发现动物细胞易被灭活的仙台病毒诱导融合( o k a d ae t a 1 。1 9 5 7 ) 奠定了细胞融合的技术基础。1 9 7 5 年f e r e n z y 等首先报道聚乙二醇促使真 菌细胞融合以后，在酵母、霉菌、放线菌、细菌等多种微生物的种内、种间、属间 以至科间很快形成了实验体系，解除了许多技术障碍，原生质体的制备、再生和融 合条件得到相当大的改进，原生质体融合技术已相当成熟。原生质体融合技术在微 生物遗传育种实践中显示了广阔的前景。它不仅被用于改善菌种遗传性状，提高有 用代谢产物的产量，而且综合不同菌种的代谢途径，产生新的有用的代谢产物( 肖 信发，1 9 8 3 ) ，如成功的得到了种内、种间、属间甚至界间( j o n e se ta 1 ，1 9 7 6 ) 的融合 子。 1 6 3 重组d n a 技术改良抗生素产生菌 随机突变和筛选可以提高产量改进菌种的不良性状主要是满足了有关合成途径 的代谢物和一些辅助因子的需求，但是不能提高合成途径中一些特殊基因的过度表 达，而重组d n a 技术可以解决这个问题。重组d n a 技术在抗生素改良中的应用起 1 1 华中农业大学2 0 0 9 届硕士学位论文 始于7 0 年代。自从h o p w o o d 和c h a t e r 首次报道链霉菌宿主一载体系统克隆抗生素 生物合成基因以来( c h a t g re ta 1 ，1 9 8 3 ；f e i t e l s o n e ta 1 ，1 9 8 3 ；c _ i l l a n d h o p w o o d ，1 9 8 3 ) ，链霉菌 的分子生物学发展很快。已形成了以变铅青链霉菌为主的外源基因克隆表达系统； 随着链霉菌体系的分子克隆技术的发展，已形成大量应用的载体系列；对链霉菌基 因表达调控研究不断深入，已发现光秃基因c o l a 、w h i 等) 以及s i g m a 因子参与分化调 控。抗生素生物合成的分子遗传学研究也不断深入到目前为止，已有近3 0 余种抗生 素生物合成基因获得成功克隆和表达，生物合成及其机理的研究也已比较深入和全 面，尤其是对聚酮类抗生素的研究比较系统和详尽。在工业上所用的链霉菌主要侧 重于研究调控基因、自身耐药基因、抗生素生物合成基因以及产生杂交抗生素。重 组d n a 技术在抗生素产生菌改良中的应用分为两个方面：一方面是对抗生素生物 合成在基因水平的研究，使人们从基因结构和组成方面深入了解其生物合成机制， 有目的的对抗生素产生菌进行基因遗传操作，提高抗生素产量；另一方面改造抗生 素结构，产生新的抗生素。 与经典原生质体融合在每一代只有两个亲本进行重组相比，基因组重排育种具 有多亲本杂交的优势。其优点主要表现在： 1 基因组重排的对象是细胞内整套基因组，在许多情况下，参与次级代谢产物 生物合成的结构基因在染色体上成簇排列，但控制基因表达的调节基因则位于生物 合成基因簇外，因此将微生物整套基因组视作一个单元进行基因组重排更适合于微 生物级代谢产生菌的遗传改造( 朱林东，2 0 0 6 ) 。 2 基因组重排技术无需了解微生物的代谢途径、编码生物合成酶的基因以及基 因表达调控的知识，尤其适用于微生物代谢产物产生茵的遗传改造。 3 用于基因组重排的亲本为多个亲本以增加突变基因的来源，多个亲本原生质 体融合后的再生细胞不需要进行分离、筛选，而是直接用作下一轮原生质体融合的 次级混和亲本，如此循环数次，以达到迅速产生基因突变和重组的目的。 4 基因组重排技术简化了育种的步骤，缩短了周期，可对理化诱变不敏感的菌 株提供新的改良方法( 朱欣杰和程瑶，2 0 0 6 ) 。 1 7 抗生素产生菌诱变育种的筛选方法 在通过各种诱变方法改变菌株的遗传性状之后，如何将具有所要特性的菌种从 数量庞大的菌体族群中筛选出来，常是育种上至关重要也是最耗时费力的工作。目 1 2 农抗9 5 1 2 3 高产菌株的选育 前常用的方法有随机筛选和平板菌落预筛两大类。 1 7 1 随机筛选法 随机筛选法也称摇瓶筛选。该法主要是随机挑选平板上的菌落进行摇瓶筛选。 这种筛选方法的优点是：不管种子或发酵过程的生产条件、生理条件如何，都与发 酵罐大生产条件相近，可以模拟进行。摇瓶中的通气量可以通过调整转速、装量和 瓶内加档板等方法加以控制。但是在突变概率小的情况下，如果菌落挑取少了，很 难筛选到理想的突变株。为了筛选到优良菌株，就必须花费很大的人力物力和时间， 这就大大限制了筛选量，影响到高产菌株的筛选。 1 7 2 平板菌落预筛 在随机的突变群体中，有益突变率极低，为了获得高产或者具有优良特性的变 异株，大量菌株的筛选是十分必要的。平板菌落筛选实际上是摇瓶初筛前的一种预 筛，在平皿分离阶段就有目的地筛选所需要的菌株，可以淘汰掉低产菌株，在同样 的时间内大幅度地扩大有效筛选量，提高筛选工作效率。下面介绍几种平板菌落筛 选方法。 1 7 2 1 根据形态筛选突变株 部分微生物菌株经过诱变处理后，变异菌株的菌落形态与生理特性、生产性能 变化有一定的相关性，一般有这样的趋势： 原来具有较高发酵水平的菌种作为出发菌株时，由突变引起形态剧烈变化的菌 落是一些代谢严重失调的菌株，常常为负突变株占多数，而突变的高产菌株其菌落 形态往往在常态的正常范围内，因为它们的的遗传物质仅受到微小损伤，还保留了 正常代谢的基本功能。根据形态挑选的菌落，仍然具有随机性，但是在淘汰大量低 产菌株的基础上进行摇瓶筛选法获得高产菌株的概率比直接摇瓶筛选法大得多。 1 7 2 2 根据平板菌落生化反应筛选突变株 根据平板菌落生化反应筛选突变株，主要有透明圈法、变色圈法、生长圈法和 抑菌圈法。( 1 ) 透明圈法在分离水解酶产生菌时采用较多。在平板培养基中加入溶 解性较差的底物，使培养基混浊，能分解底物的微生物便会在菌落周围产生透明圈， 圈的大小可以初步反映该菌株利用底物的能力；( 2 ) 变色圈法对于一些不易产生透 明圈产物的产生菌，可在底物平板中加入指示剂或显色剂，使所需微生物能被快速 鉴别出来。根据变色圈的大小来判断目标产物的高低。( 3 ) 生长圈法通常用于分离 华中农业大学2 0 0 9 届硕士学位论文 筛选氨基酸、核昔酸和维生素的产生菌。检测菌是相对应的营养缺陷型菌株。将待 测菌涂布于含高浓度的检测菌并缺少所需营养物的平板上进行培养，若某菌株能合 成平板所缺少的营养物，在该菌的菌落周围便会形成一个混浊的生长圈。根据生长 圈的大小，可以判断产物的多少。( 4 ) 抑菌圈法是抗生素产生菌初筛的常用方法。 根据抑菌圈的大小，可以淘汰大量的低产菌株，提高突变株的筛选效率。 1 7 2 3 耐前体及其结构类似物突变株的筛选 根据已知的或可能的抗生素生物合成途径设计一些定向筛选具某些优良特性的 突变株，可以取得较好的效果。如3 氨基羟基苯甲酸( c t n ) 是利福霉素的芳香族前 体，3 脱氧d 阿拉伯庚酮糖酸7 磷酸( d a h p ) 合成酶是芳香族氨基酸和利福霉素的 生物合成中的关键酶，但芳香族氨基酸抑制该酶的活性，从而抑制了利福霉素的生 物合成，芳香族氨基酸抗性变种可以解除或部分解除芳香族氨基酸对d a h p 合成酶 的抑制作用，因此可以提高利福霉素的产量( 金志华等，1 9 9 5 ；2 0 0 4 ) 。陈春福等( 2 0 0 2 ) 根据组成林可霉素的两个部分m t l 和p h a 的合成起始物可能分别是葡萄糖和l 广酪 氨酸这原理，设计了高耐受葡萄糖和l - 酪氨酸诱导菌株的筛选方法，都取得了较好 的效果，筛选出的菌株对葡萄糖的耐受浓度从1 8 提高到2