（农药学专业论文）大豆中苯氧羧酸类除草剂多残留检测技术研究.pdf

摘要 本论文以大豆田间广泛施用的1 4 种苯氧羧酸类除草剂( 对氯苯氧丙酸、对氯苯氧乙酸、苯 氧丁酸、麦草畏、2 甲4 氯苯氧丙酸、2 甲4 氯苯氧乙酸、2 , 4 滴、3 , 4 滴、2 ，4 ，滴苯氧丙酸、2 , 4 ，5 涕丙酸、2 , 4 ，5 一涕、2 甲4 氯苯氧 一酸、2 ，4 滴苯氧丁酸、吡氟禾草灵酸) 为对象，系统研究了大 豆基质中苯氧羧酸类除卓剂的提取方法，通过选择衍生化试剂、优化酯化方法建立了g c e c d 和 g c m s 检测方法。 样品经过粉碎过筛，用乙腈- 5 0 m m o l l h c i ( 7 ：3 ，v v ) 提取，使用g p c 除去人分子的蛋白、 色素、油脂等杂质以及m a x 小柱进步净化处理。 在g c f l v l s 方法中使用三甲基硅重氮甲烷对目标分析物甲酯化，质谱系统采用e i 轰击源，s i m 模式进行参数采集，成功地对1 4 种苯氧羧酸除草剂进行了有效分离和定量确证。在1 0 、2 0 、1 0 0 f , g k g 三个添加水平上的平均回收率为7 8 8 9 4 f 3 ，相对标准偏差4 7 1 5 2 。检测下限为6 5 0 “g k g ，定量限分为2 0 1 7 0 h g k g 。 g c e c d 方法中用五氟溴苄酯化提高目标分析物的响应。对酯化条件及酯化产物的硅胶柱净 化除杂做了优化。通过程序升温使1 3 种苯氧羧酸除草剂( 除毗氟禾草灵酸之外) 的五氟溴苄酯 充分分离，1 3 种苯氧麓酸类除草剂在质量浓度5 1 0 0 9 9 k g 之间，与峰面积呈线性关系，相关系 数为0 9 9 5 4 0 9 9 9 3 ：在1 0 9 t g k g 和1 0 0 9 9 k g 两个水平的加标回收率均在7 0 以上，相对标准偏 差小于2 0 。方法的最低检测限为o 2 7 t , g k g ，定量限分别0 6 2 0 p g k g 。探讨并利j = | g c m s 对 g c e c d 色谱分离的具体条件做了确证。 关键词：苯氧羧酸除草剂，大豆，衍生化，气相色谱质谱，气相色谱一电子捕获检测器 a b s t r a c t i nt h i sp a p e r ，f o u r t e e np h e n o x y a c i dh e r b i c i d e si n c l u d i n g4 - c p p , 4 - c p a , p h e n o x y b u t y r i ca c i d ， d i c a m b a ，m c p p , m c p a ，2 , 4 - d ，3 , 4 d ，2 , 4 一d p , 2 , 4 ，5 碍2 ，4 ，5 - t , m c p b ，2 , 4 - d ba n df l u a z i f o pw e r e c h o s e n ，w h i c hw e r eu s e dal o ti ns o y b e a np l a n t i n g p r c - t r e a t m e n tc o n d i t i o nw a sc r i t i c a l l ye x a m i n e d t w om e t h o d si n c l u d i n gg c e c d a n dg c m sw e g ee s t a b l i s h e dt od e t e r m i n et h er e s i d u eo fp h e n o x ya c i d h e r b i c i d e si ns o y b e a n s a m p l ew a sg r o u n di n t op o w d e ra n dw e r ee x t r a c t e dw i t ha c e t o n i t r i l e 5 0 m m o l lh c i ( v o l u m er a t i o w a s7 ：3 ) ，f o l l o w e db yg p cc l e a n u p t h es o y b e a ne x t r a c tw a sf u r t h e rc l e a n e du pb ya n i o ne x c h a n g e c o l u m n f o rg c m sm e t h o d ，t h ee x t r a c tw a sm e t h y l a t e du s i n gt r i m e t h y l s i l y l d i z o m e t h a n e t h ed e r i v a t i v e w a sq u a n t i f i e db ye x t e r n a ls t a n d a r dm e t h o d m s ds y s t e ma p p l i e de 1r e s o u r c ea n ds i mm o d ef o rs i g n a l a c q u i s i t i o n r e c o v e r i e so ft h r e ef o r t i f i e dl e v e l s ( 0 0 1 ，o 0 2a n d0 1 m g k g ) r a n g e df r o m7 8 ，8 t o9 4 ，3 a n dr s df r o m4 7 t 0 1 5 2 l o dr a n g e df r o m6 u g k gt o5 叻g 瓜ga n dl o qw a s 2 0 1 7 0 ”g k g p e n t a f l u o r o b e n z y lb r o m i d ew a su s e df o rh e r b i c i d ed e r i v a t i o nf o rg c e c dm e t h o d 。t h ed e r i v a t i v e w a sf u r t h e rc l e a n e d u pw i t hs i a i c ag e lc o l u m nt or e d u c ea r t i f a c t s a v e r a g er e c o v e r i e so f2f o r t i f i e d l e v e l s ( o 0 1 a n do 1 m g k g ) w e r ea b o v e7 0 a n dt h ec o e f f i c i e n t so fv a r i a t i o nw e r el e s st h a n2 0 t h e l o da n dl o qw e r e0 2 - 7 “g k ga n do 6 - 2 0 t g k gr e s p e c t i v e l y i na d d i t i o n ，g c m sw a su s e df o r c o n f i r m a t i o uf o rt h es p e c i f i cc o n d i t i o no fs e p a r a t i o n k e y w o r d s ：p h e n o x y a c i dh e r b i c i d e ，s o y b e a n ，d e r i v a t i o n ，g c m s ，g c e c d 符号及缩写 英文缩写英文全称中文名称 g p cg e lp e r m e a t i o nc h r o m a t o g r a p h y s p es o l i d p h a s ee x t r a c t i o n g cg a sc h r o m a t o g r a p h y e c de l e c t r o nc a p t u r ed e t e c t i o n 凝胶渗透色谱 同相提取 气相色谱 电子捕获检测器 g c e c d g a s c h r o m a t o g r a p h y e l e c t m nc a p t u r ed e t e c t i o n 气相色谱- 电子捕获检测器 g c v l s g a sc h r o m a t o g r a p h y m a s ss p e c t r o m e t r y气相色谱一质谱检测器 h p l c h i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g e a p h y 高效液相色潜 m r l sm a x i m a lr e s i d u el i m i t s s n s i g n a lt on o i s e i d dl i m i to fd e t e c t i o n l i m i to fq u a n t i f i c a t i o n t m s c h n 2 t r i m e t h y s i l y l d i a z o m e t h a n e p f b b r p e n t a f l u o r o b e n z y lb r o m i d e i l 展大残留限量 信噪比 检测限 定量限 三甲基硅重氯甲烷 五氟溴苄 插图和附表清单 表1 1 部分苯氧羧酸除草剂的结构及大豆中各国限量要求 表3 1 流动相梯度 表3 2 苯氧羧酸类除草剂在高效液相色谱仪上的线性关系 表4 1 使用衍生化手段测定苯氧羧酸除草剂残留的部分文献总结 表4 2 主要的衍生化反应 表4 - 32 4 - d 、2 ，4 5 - t 、m c p a 的p f b 和甲酯化衍生物响应因子比较 表5 - 11 3 种苯氧菝酸除草剂线性范围及相关系数 表5 - 21 3 种苯氧菝酸除草剂的样品添加回收率、检测限和定量限 表5 313 种苯氧攘醣除草剂的定性离子和定量离子厦其s i m 采集模式下的分组情况 表6 1 14 种除草剂的选择离子和定量离子 表6 - 31 4 种苯氧羧酸除草剂线性范围及相关系数 。 表6 - 41 4 种苯氧羧酸类除草剂在大豆添加实验回收率、相对标 准偏差、以及检测限和定量限 表6 - 5 三种仪器检测方法的比较 图卜1 苯氧羧酸除草剂结构式 一 图2 1 技术路线示誊图 图3 - 11 4 种苯氧羧酸除草剂的紫c l 、扫描图谱 图3 21 4 种苯氧拨酸除草剂的液相分离色谱图 图4 1p f b b r 酯化的温度曲线 图4 2p f b b r 酯化的时间曲线 图4 3 氯化氢制备装置 图4 - 4 三氟化硼催化酯化反应的机理 图4 - 5f is c h e r 酯化反应机理 图4 - 6t m s c h n ，与援酸的酯化反应 图4 7t m s c h n ：甲酯化过程中可能出现的副反应 图4 - 8 三甲基硅重氮甲烷的副产物一三甲硅酯 图5 11 4 种苯氧羧酸除草剂的g p c 流出曲线图 图5 2o a s l sm a x 小柱洗脱曲线 图5 - 3 硅胶柱层析的流出曲线 图5 - 413 种苯氧羧酸除草剂标准品的p f b 酯图谱 图5 - 5 大豆阴性空白与样品添加图谱对照 图5 - 6 3 种苯氧羧酸除草剂p f b 酯的全扫描图谱 图5 7 1 3 种苯氧援酸除草剂p f b 酯的s i m 图谱 图5 - 8 大豆阴性空白样品和标准添加样品的s i m 图谱 5”他艘孙利怕卵 钓引 2伯”h抖撕盯勰招”“蛇三；! 图5 - 9m c p p 和4 - c p a 总离子流图及分子离子峰下的提取离子图 网5 - 1 0 二苯基二甲基聚硅氧炕结构( h p 一5 m s ) 图5 - i i 聚( 二甲基硅氧基) 聚1 ，4 一双( 二甲基硅氧基次苯基t 硅氧烷结构( d b 一5 m s ) 图6 11 4 种苯氧羧酸除草剂的甲酯化产物全扫描图谱和s i m 图谱 图6 - 2 样品添加的甲酯化产物s i m 图谱与大豆阴陛空白样品列照 4 3 4 3 4 4 4 8 4 8 独创性声明 y 9 3 8 6 6 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位或证书 而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示了谢意。 研究生签名： 瞄 帆娜f 年驴6j 6 日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复 制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、 传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 嚣豫互野导师签名：f 衰罗忍i 时间： 少彬占年。6 _ ，6 日 时间： 占。年厂月，日 中国农业大学坝1 学位论文第章文献综述 第一章文献综述 1 1 概述 1 ，1 1 世界除草剂使用发展趋势 随着作物转基因品种的种植越来越多的除草剂得到广泛应用。目前，从全球范围来看，除 草剂在农药市场上占据着半壁江山，越是发达的国家，除草剂的使用量越大，1 9 9 6 1 9 9 7 年世界 除草剂销售额达到1 6 5 0 0 百万美元，2 0 0 0 年上升到1 7 5 0 0 百万美元，专家预测2 0 1 0 年将达到2 2 0 0 0 百万美元，其中大豆中除草剂为2 7 0 0 百万美元，仅次予玉米、火小麦等作物。而且备国对除草 剂的使用都有增加的趋势。根据u s d a 国际农业统计服务中心调查数据表明”l ，茭国2 0 0 0 年在 化学农药的销售额中，除草剂所占的比例高达7 0 4 ，2 0 0 2 年美国2 0 个州7 1 7 0 万英亩大豆田有 9 9 使用了除草剂，同2 0 0 1 年相比，除草剂总用量增加了4 3 。 专家预测，全球范围内，除草剂在农药总量中的比例将由目前占农药总量的4 8 提高n 6 5 7 0 ，2 l 世纪将是除草剂飞速发展的时代。 1 1 2 大豆的基本情况 大豆中化学成分复杂，营养丰富，对整粒大豆而言，一般蛋白质、脂肪、灰分、碳水化合 物分别约占3 7 5 、2 1 o 、4 9 、3 3 9 。大豆中脂肪含量高的品种脂肪可达2 5 ，每克大豆脂 肪的热量可达9 3 8 6 卡，大豆油含亚油酸5 4 5 ，棕榈酸1 17 ，硬脂酸为3 5 ，油酸2 1 3 。大 豆蛋白质与其它植物蛋白质比较，所含的氨基酸较齐全，因此大豆是植物蛋白食品及榨油的主要 原料。 我国国内对大豆的需求主要来自两个方面，一是食用，生产豆腐和酱等；二是榨油，生产豆 粕和豆油。在这两方面中，就目前来看，2 0 0 0 年城乡人均豆制品消费量仅7 5 公斤左右，与2 0 0 1 年底颁布的中国食品与营养发展纲要( 2 0 0 1 2 0 l o 年) 中规定人均每年摄入1 3 公斤的豆类 产品的发展目标相比仍有很大差距，因此近年来食用大豆消费量维持稳步增长。自9 6 9 7 年度， 我国大豆进口量超过1 0 0 0 千吨以来，每年的进口鼍节节攀升。1 9 9 6 年以前，中国还是大豆净出 v i 国，大豆每年进口量不过1 0 0 万吨，进口量最高的1 9 8 1 年仅为5 6 8 万吨，到2 0 0 3 年进口量 达2 9 7 4 万吨，进口量占当年大豆产量的1 1 2 ；r 耳全球进口量的比例约为3 5 ，中国已成为世 界上最大的大豆进口国“1 。 由于大豆生跃季仃雨热同季，大豆田杂草种类繁多，危害严重。大豆田中的杂草会争夺十壤 水分、- k i i 养分、人豆生氏空间、光源。杂草的抗逆| 生强，是害虫或病原卤的中间寄主或越冬场 所，危害大显生k ，影j 】i 句人豆产鼙。杂草危害可使人豆减产达4 0 5 0 ，冈此在人旦田使川化学 除革技术已经得剑了各国的广泛认可平l l 重视。 中国农业人学 i ! l 。学位论史 第一章史献综述 1 1 ，3 苯氧羧酸除草剂的基本情况 苯氧羧酸类除草剂已有6 0 余年的历史，使用广泛，至今仍占有巨大的市场。以2 ，4 滴为例， 1 9 9 8 年销售额2 4 亿美元，1 9 9 9 年销售额1 2 亿美元，在世界农药排行榜位居3 5 位，除草剂排 行榜位居2 0 位。近年来，随着世界种植结构的调整以及部分新型高效除草剂冈为药害问题而淡 出市场，2 ，4 一滴的市场份额正在加大，销售回升迅速。2 0 0 2 年销售额高达32 5 亿美元，在世界 农药排行榜中上升至第1 0 位，在除草剂排行榜位居第4 位，仅仅次于灭生性除草剂草甘膦、百 草枯以及二甲戊乐灵，是【丛界上第二大选择性除草剂，也是世界第一大闹叶杂草除草剂”1 。 r r 1 、c o o h 图卜1 苯氧羧酸除草剂结构式 h m c h e a 公司( 先正达公司) 于1 9 4 2 年发现了2 ，4 一滴除草荆具有良好的除草活性，1 9 4 5 年以 后已有多家公司开发生产。苯氧羧酸类除草剂是在2 ，4 一滴结构基础上研制的( 结构通式见图1 1 ) ，共有2 0 个品种。常用产品有：2 ，4 滴( rl = c h 2r 4 = h ，r 2 = r s = c 1 ) 、2 ，4 ，5 一涕( r - = c h 2 ，r = r z = r a = c 1 ) 、 2 甲4 氯乙酸( r i _ r 。= c i t ：，r 。= h ，r 3 = c 1 ) 等。近年来开发的新品种很少，仅有b a s f 公司开发的2 个品种：高2 甲4 氯丙酸和高2 ，4 一滴丙酸，二者都属于旋光活性异构体”1 。目前在我国登记使用 的苯氧羧酸类除草剂，国内品种有1 6 种，国外品种1 9 种；混剂在总销售量中所占比例比较大。 国内生产的苯氧羧酸类除草剂品种主要有2 ，4 - 滴胺盐、2 ，4 - 滴钠盐、2 ，4 一滴_ 】酯、m c p a 、2 ，4 一 滴酸、喹禾灵、精喹禾灵”1 。 苯氧羧酸类除草剂是高效、内吸、具高度选择性的除草剂和植物生长调节剂，对植物有强烈 的生理活性。该类除草剂的作用机理属于激素型除草剂，在高浓度时具有毒杀作用，促使杂草茎 部组织增加核酸和蛋白质台成、恢复成熟细胞的分裂能力，从而促使细胞分裂、造成生长异常而 导致杂草死亡。杂草中毒症状与生长素物质的作用症状相似，被广泛用于水稻、玉米、小麦、大 麦、燕麦、牧草、高粱、甘蔗等禾本科作物田中，用来防除一年及多年生阔叶杂草、莎草及某些 恶性杂草，对禾本科杂草无效；低浓度时，往往促进生长，有防l l 落花落果、提高座果率、促进 果实生长、提早成熟、增加产量的作用，可作为植物生艮凋：转剂来减少落果、增大果实及延妖柑 桔的储存期对牧场和许多作物中( 如：稻田、小麦、火豆) 的阔叶杂草都有很好的效果”。其具 体的作j _ “机制目前还不是很清楚，有研究指出它影响氧化磷酸化的过程以及对线粒体的膜结构有 修饰作h | 。 中国农业犬学硕士学论文 第一章文献综述 在美国，2 ，4 滴是豆田施用的主要除草剂；在欧洲，农田中施 h 的除草剂绝人部分都是酸性 除草剂，2 ，4 - 滴和2 ，4 滴丙酸使用量为1 0 0 0 2 0 0 0 吨年；在瑞典，苯氧羧酸除草剂 总使， j ； 量的6 5 。 苯氧羧酸除草剂的极性特征使得它很容易溶解于地表水中，并迅速扩散，导致周嗣环境的人 面积污染进而严霞威胁人类健康。苯氧羧酸类除草剂本身中等毒性，其代谢产物( 特别是些卤 化物) 对人类和生物体会造成严重危害1 。研究表明可以引发人类软组织恶性肿瘤，对动物体表 现出胎盘毒性。经苯氧羧酸类除草荆处理的植物，往往会在体内蓄积着高浓度的硝酸盐或氰化物， 即被杀死的有毒杂草和有害植物中药物的固有毒性没有改变，极易引起食草动物中毒。当动物不 断采食经除草剂处理不久的植物时，因接触除草剂的剂量较高，在动物组织中可检出除草剂的残 留。 农药残留是随着农药大量生产和广泛使用而产生的，是指农业生产中旆用农药以后，一部分 农药直接或间接残存于谷物、蔬菜、果品、畜禽产品以及土壤和水体中。由丁样晶成分复杂，且 使用农药晶种繁多，不同农药的理化性质存在较大差异。随着施用农药种类的增多以及高效高活 性农药的广泛使用，农药多残留分析日趋朝着痕量方向发展，要求开发出回收率好、操作简便、 溶剂使用量少的萃取和净化方法。现代农药残留分析的主要课题是多残留分析，要求检出率和回 收率高、重现性好、检测限低，且操作简单易行。现今，以苯氧羧酸类化合物为代表的除草剂使 用后引起的药物残留问题越来越引起国际社会的关注。我国是个农产品生产和进出口大国，有效 控制和检测进出口粮谷中的除草剂残留，对保证我国的食品安全有着更为突出的重要意义。 1 2 苯氧羧酸除草剂的残留检测研究现状 鉴于苯氧羧酸类除草剂的潜在危害性，世界各国都在努力开发可靠、灵敏的检测方法来对不 同基质( 如土壤表层、饲料、地下水、粮谷、肉制品等) 中该类除草荆的残留量进行测定，并制 订了该类除草剂主要使用品种在食品中的最大残留限量( 表卜1 ) 作为农产品进出口的主要技术 壁垒之一。我国已经制订了粮谷中2 ，4 ，5 - t 、采草灵以及肉类食品中2 ，4 - 0 、m c p b 、m c p a 的国家 标准和出入境检验检疫行业标准“”“。 目前，苯氧羧酸类除草剂的残留检测方法主要有g c e c d ，g c m s ，h p l c u v ，l c m s d 等。也 有使用电泳技术以及酶免疫测定技术等手段米进行检测的报道。 12 1 苯氧羧酸除草剂检测的前处理技术 前处理的目的是最大可能地将目标化台物从样品基质中释放被出来，除去样品中的干扰物 质，使待测目标化合物溶于可进行分析的介质( 即转换成为可被检测的形式) ，在可检测的范嗣 内进行测定。主要包含四个方面：提取、净化、浓缩、衍生化。 3 中国农业人学硕，l 学位论文 第一章t 献综述 苯氧羧酸类除草剂极性很高，易溶丁- 水及水相溶液，解离状态难溶丁与水不混溶的有机溶剂。 为了将样品基质中的药物转移到有机相提取溶剂中，提取前通常使用p i1 3 的水溶液对样品进 行酸化处理抑制目标分析物的解离以便于在其未解离状态下移入有机溶剂中。 1 2 1 1 提取方法 超声提取( u l t r a s o n l ce x t r a c t i o n ) 超声提取时，样品必须在成为自由流体状态才会有最好提取效果，根据样品类型的不同而进 行优化。e p am e t h o d8 1 5 1 a 1 中介绍将3 0 9 土壤样品用浓盐酸或硫酸溶液预酸化后加入酸化的硫 酸氢钠溶液使混合物成为流体。加入提取溶剂二氯甲烷丙酮( 1 ：1 ，v v ) ，超声提取，静置厢 收集有机相。 超声提取操作简单、可以反复操作，提取时间短，速度快、效率高，可以同时提取多个样品， 但是超声提取可能会破坏基质和分析物之问的价键连接，是一种较强烈的提取方式比单纯的振 荡的能量高的多。对于易降解的分析物，超声会加速药物的降解，降低提取效率。另外，超声提 取通常要消耗大量的溶剂。 振荡提取( s h a k i n ge x t r a c t i o n ) e p am e t h o d8 1 5 1 a “”中介绍了使用振荡法提取土壤中的苯氧羧酸除草剂。称取适量样晶，加 到广口烧瓶中，用浓盐酸调整p h 至2 后，先用丙酮振荡提取2 0m i n ，测量回收溶剂的体积，再 次使朋同样体积的丙酮萃取1 次，然后使用8 0 m l 的乙醚进行提取。第3 次提取以后，回收总体 积应不少于添加量的7 5 ，否则需要增加提取次数。 振荡提取是简单、快速、有效的操作，不需要很多特别的设备，而且可以同时对多批次样品 进行提取，但是振荡提取是在室温、常压下进行的，对于和基质紧密结合的残留药物很难将其 从基质中释放出来，振荡提取一般耗时较长。 微波提取( m i c r o w a v e a s s i s t e ds o l v e n te x t r a c t i o n ，m a s e ) 微波萃取是将样品放入特别的容器中，使用微波能量对溶液进行加热，这种方法减少了溶剂 的消耗，提取操作时温度要高于室温，因此可能会造成对热敏感的目标化合物的热降解。 p a t s i a s d “等对7 种士壤中除草剂2 ，4 一d 、m c p a 、2 ，4 ，5 - t 、2 ，4 - d 丙酯、2 ，4 二氯苯酚、2 ，4 一d b 进行微波萃取，对m a s e 参数进行了优化，采用h p l c d a d 进行检测。5 0 n g g 水平的添加同收率 是8 9 1 0 8 ，5 0 0 n g g 添加同收率是8 4 9 9 。m a s e 中溶剂的选择非常重要，直接影响萃 取结果。非极性溶剂介也常数小，对微波透明或部分透明无法进行萃取分离。冈此在微波苹取时， 要求溶剂必须且有一定的极性，对待测组分有较强的溶解能力，对后续测定的干扰较少。常h 的 葶墩刺有：甲醇、乙醇、丙酮、乙酸、甲苯、：氯乙烷、乙腈等有机溶刹。h 苯、l 【i 己烷等。1 f 撇 ：! 里垒、业查兰竺：兰竺耋圣 兰：耋= 三鉴箜鎏 性溶剂萃取时必须加入一定比例的极性有机溶剂。此外，应考虑溶剂沸点阏素，挥发的溶剂在高 温高压下会爆炸，在使用时要注意安全。 m a s e 最佳参数除了萃取溶剂外，还包括萃取设备、萃取温度及萃取时间的选择“”“| 。在一般 敞开体系，溶剂沸点受大气压影响：在密闭容器中，由于内部压力可达到1 m p a 以上，此时溶剂 沸点比常压f 沸点高很多，热效率高，萃取效率随之大大提高。闲此在m a s e 中，样品与溶剂置 于密闭防爆的聚四氟乙烯容器中，且溶液所能达到的最高温度受容器材料耐压性的限制。操作中 要求控制溶剂温度使其不沸腾且在该温度下待测物不分解。 表卜1 部分苯氧羧酸除草剂的结构及大豆中各国限量要求“” 除草剂结构 c a s n 。 p k a m m r g m l s 国剐 m c c 卜o “” 7 0 8 5 1 9 o 3 7 8 一一一 m 嗽c g 墨一一 2 0 2 - 3 6 0 - 6，m叫 日本 “ m c p b 弋 “”“” 9 4 - 8 1 - 54 墨4一 一 c ( 卜一 。n u c r 上一 。n ， 、 9 4 7 5 1 9 4 2 6 8 6 9 3 3 5 9 1 7 1 2 2 8 8 3 2 7 3 48 0 1 9 7 3 2 0 2 8 6 3 1 3 5 830 0 3 3 0 7 - 3 9 - 9 9 3 7 6 53 1 4 9 3 7 2 1 3 ，1 0 0 0 2美国 0 0 5 韩国，日本 0 2美国 0 0 2 澳人利亚 0 0 5日本 1 0 荧国 1 日本 0 0 5欧盟 n d e 本 0 0 5 欧盟 籼一一一：一一 超临界流体苹取( s u p e r c r i t i c a lf l u i de x t r a c t i o n s f e ) 超临界流体萃取是利件j 处于超临界状态的流体为溶剂对样品中待测组分萃取的方法。s f e 密 度与液体相似，但是表面张力小，有良好的溶剂化能力，比液体有更大的扩散系数，比较容易渗 透到固体的缝隙中从而使萃取效率和速度提高。 最常用的超临界流体二氧化碳( c o ：) 是非极性溶剂。由于c o z 无毒、不易燃烧，不会造成污 染，而且相对来讲比较便宜，因而是其它提取方法无法相比的。在萃取极性化合物时候c 0 。具有 一定的局限性，应用时可以加入少量的改进剂( 如氨气、甲醇、二氧化氮等极性化合物) 来改善 萃取效果。 杨曼君”“添加1 0 4 0 m o l l 甲醇于二氧化碳中，在1 0 0 c 及压力4 4 2 a r m ( 大气压) 下可回收 尘埃中8 3 9 5 的4 种苯氧羧酸除草剂，说明添加甲醇可以提高极性农药的提取率。a n n es c h e y e r p t 日户”采用s f e 方法萃取火气中的2 ，4 滴等农药，经树脂材料富集直接用g c m s 2 检测。 m u r u g a v e r le ta l 。”尝试了对植物组织中的2 ，4 滴苯氧丙酸的酚类代谢物以及洋葱中吡氟禾草灵 丁酯和它的代谢物精禾草灵( 自由酸) 进行超临界提取。 1 2 2 净化方法 1 2 2 1 固相萃取和( s p e ) 固相微萃取( s p m e ) 固相萃取是利用固体吸附剂将液体样品中的目标化合物吸附，使其与样晶基质和干扰化合物 分离，然后用洗脱溶液将目标物洗脱，达到分离和富集目标化合物的目的。用于苯氧羧酸类除草 剂净化和富集的吸附型萃取柱主要有硅胶柱；分配型萃取柱r p cl + 、p r p 一1 、w o f a t i ty 7 7 苯基 桂：氨基柱等。通过调整酸度r p c ，。以及其它一些相似的反相吸附剂可以很好地对酸性药物进行 纯化分离。阴离子交换柱，如四离子交换剂( q u a t e r n a r yi o ne x c h a n g e r ，q a es e p h a d e xa 一2 5 ) 也 被用作提取苯氧羧酸类除草剂”“；一些混合型填料柱具有多种吸附功能，可以很好地实现对样 品基质中的酸性物质富集和净化。w a t e r s 公司2 0 0 2 年发表应用文章”使用w a t e r s 的o a s i sm a x 混合型填料小柱分析环境样品中的酸性除草剂，获得满意效果。 s p e 可方便地实现在线联用，可以对于水、尿等大体积的上样量在实现净化的同时进行很好 的浓缩。p r o v i n c e0 fb r i t i s hc o l u m b i a ，2 0 0 3 ”的报告描述了利用s p e 柱后重氮甲烷气相衍生化系 统对水中的酸性除草剂进行了有效检测。a n t o n i oe ta 严“对水中d i c a m b a 、2 ，4 - 0 、m c p a 、2 ，4 - d b 、 m c p p 、2 ，4 ，5 - t 、2 4 - d b 、m c p b 、2 ，4 ，5 - t p 比较了两种固相萃取柱的净化效果，阴离子交换一反相 键合硅胶c ，。枉和一种混合柱( 上部分是5 0 m g 非特异性吸附剂一碳黑，下面是7 0 m g 硅基强阴离予 交换剂s a d ；实验表明后者净化更为彻底。 b u t zp ta 1 检测水样中3 4 种苯氧羧酸类除草剂时，对两种蚓相革取柱填料r p c ，s 和 r p - p h e 进行了r 比较，其中2 6 种苯氧羧酸类除草剂可以在r p c - w 拄上得到很好的净化，衍生化产 物h jg ( 、f s 检测同收率可达刨7 0 以卜 中国农业大学硕 学位论文第一章文献综述 使用s p e 对大体积的水样进行处理的时候，强极性的苯氧羧酸分析物可能会破坏吸附填料的 价键，从而使回收率降低，检测f 限升高。近年来使用的分子印迹聚合物( m o l e c u l a r l yi m p r i n t e d p o l y m e r s ，m i p s ) ”9 1 ”1 作为s p e 的吸附剂可以弥补普通吸附剂选择性差的不足，可以重复使用多次， 较免疫吸附剂的稳定性好。m l p s 在对复杂环境、生物等体系中少量物质的富集分离以及药物的 纯化方面都表现出很好的应用前景。 另外，同相微萃取在处理水样、生物体液时表现出良好的适应性，可以实现在线联用以及固 相萃取衍生化。r o d r g u e z e ta l 。”等使用在线s p m e 萃取衍生化方法对水样中包括苯氧羧酸 类除草荆在内的酸性除草剂进行了气相分析。h e n r i k s e ne ta 户”使用氯丁酸盐对苯氧羧酸除草 剂进行衍生化并用s p m e 净化后使用g c m s 进行了分析。 1 2 2 2 凝胶渗透色谱( g e lp e r m e a t i o nc h r o m a t o g r a p h y ，g p c ) g p c 净化是基于分子筛的机理分离不同分子体积的净化方法。苯氧羧酸除草剂是一类分子量 1 8 0 3 2 7 的小分子物质，通过g p c 可以将其同大分子的蛋白、脂肪和色素等分离开来。m a r v i ne t a 。2 1 在分析脂肪和非脂肪食物中苯氧羧酸类除草剂的残目时使用了g p c 除杂净化。j o h n s o ne t a 产3 1 使用g p c 对蔬菜基质中的苯氧羧酸除草剂进行了净化，并用气质对酯化产物进行了分析。国 内卫峰”等也使用g p c 净化测定了粮谷中包括5 种苯氧羧酸类除草剂在内的1 2 种酸性除草剂的 残留量。 g p c 的最佳参数不仅包括溶剂、载体的选择，还包括合适的温度以及溶质的化学性质等。由 于农药是小分子化台物，可以与色素、油脂等火分子进行分离，同一化学结构类型的农药可以在 同一个时间段进行收集；在残留分析中使用广泛。g p c 柱子可以反复使用多次，容易实现自动化。 日本岛津开发了g p c g c m s 联用的自动化仪器，食品提取物通过g p c 净化后，目标分析物进入试 样捕集环路之后，注入g c 部分由色谱柱分离，最后进入m s 部分进行检测。g p c 净化时，一些与 目标农药分子相近的杂质分子会随着目标分析物一起被收集，无法实现分离，收集物往往需要附 加的净化步骤。 1 2 2 3 液液分配( 1 i q u i d q i q u i dp a r t i t i o n ，l l e ) 液液分配是利用目标化合物在不互溶的两种溶剂进行分配，目标化合物在两种溶质溶剂中的 分离程度取决于以f j l # 围f ：溶质的极性、离子强度、p h 、温度、共存溶质及其浓度、时问、 液体间混台接触的频率等。 出入境检验检疫行业标准一肉中m c p a 、m c p b “的测定中，用三氯甲烷和硫酸一水进行液液分 配实现了对目标分析物的净化。a g e m i a nh o ta 广“采刷萃取衍生化法对水中的酸性除草剂进行 了提取衍生，使用l l e 净化后进行了g c e c d 检测。c a t a l i n am ie ta l ”6 i 等使用季氨盐对水中苯 氧羧酸除草刑直接衍生化厉，采h | 液液分配除去杂质厉进行g c m s 测定。 中w 农业大学硕士学位论文 第一章文献综述 液液分配的优点是操作简单、成本低、效果盘丁；但是液液分配往往需要耗费大量的有害溶剂， 需要在防护罩中进行，对玻璃器皿的清洗要求也很高，很难自动化，操作人员劳动强度大，时间 较长，操作中易产生乳化现象。 12 24 柱层析( c ou m nc h r o m a t o g r a p h y ) 柱层析是在商晶化固相萃取小柱普及之前广泛使用的净化方法，柱的装填常常囡人而异，因 此重复性不如商品柱，但是对于有经验的实验者可以根据需要改变填料量和种类，至今在许多实 验室仍广泛使用。 l e ee ta j ”7 对水样中1 3 种酸性除草剂提取后使用硅胶柱层析进行了净化。p e s t i c i d e a n a l y t i c a lm a n u a l ”8 1 书中将甲酯化的苯氧羧酸衍生物使用f l o r i s i l 柱层析净化，然后进行色 谱测定，回收率令人满意。 12 3 检测方法 1 2 3 1 气相色谱( g c e c d ) 和气一质联用( g c m s ) 方法 苯氧羧酸类除草剂的挥发性很差，使用气相色谱检测之前需要衍生化。气相色谱凭借其不同 长度和内径的毛细管柱，具有高分离能力。常j | | 的衍生化试剂有重氮甲烷、三氟化硼、三氯化硼、 三甲基硅基重氯甲烷、氢氧化四丁基胺一碘甲烷。”“。重氨甲烷是高效的甲酯化试剂，酯化反 应几乎瞬时完成，但它毒性很强，制备时易发生爆炸，而且不能长期保存需现用现制备，现在 多使用三甲基硅基重氮甲烷替代。三甲基硅基重氮甲烷”1 。”较重氮甲烷更稳定且有商业产品i l j 售， 一般为乙醚或正己烷的2 m o l l 的溶液。该试剂虽然衍生化效率不如重氮甲烷，但是使用简单， 毒性较重氮甲烷大大降低。s a b r i a ”1 对目前主要使用的甲酯化衍生试剂做了评价，并使用甲酯化 技术测定了植物油中酚类物质的残留量。在甲酯化中也有使用硫酸或盐酸与甲醇的混台制剂对苯 氧羧酸类除草剂进行衍生化( 见e p am e t h o d8 1 0 0 ”“) ，衍生要求严格的无水的条件，酯化产物使 用正己烷或甲苯进行提取。 许多硅烷化试剂也用于羧酸类物质的衍生化。r o d r i q u z ee ta ( 2 0 0 4 ) “”对水样中8 种苯氧 羧酸除草剂采用s p m e 萃取硅烷化，6 c m s 检测限为0 ，1 0 4 n g m l 。r o d r i q u z ep f a ( 2 0 0 5 ) “7 1 使用自动液液微萃取技术对水体中5 种苯氧羧酸除草剂，采用n 一甲基三甲硅基三氟乙酰胺 ( m t b s t f a ) 进行硅烷化，定量限0 0 0 4 0 0 3 0 n g m l 。 五氟溴苄也是广泛使用于苯氧羧酸类除草剂的衍生化的试荆。五氟溴苄衍生化产物是高卣化 物，在e c d 上响应值较高“。使用该衍生化试剂的缺点是在e c d 上会出现人量干扰的干扰峰， 通常需对酯化产物进一步净化；使, q ts i m 测定模式是去除干扰的另外一个方法。每一个除草剂p f b 酯的基峰或次强峰都是五氟溴苄的离子峰 ( c 。f h ：) m z 1 8 1 ，对丁苯环上有其它取代基的笨氧 竣酸分子，分子离子峰m 一和( m p f b c o = ) 碎片离f 峰为中等强度”。b u t ze ta ，( 1 9 9 4 ) 建汪j 使j u 氘氟澳繁试制，对扶水中提取的3 4 种酸r t 除，0 剂( 包括1 0 种苯瓴段酸类除草刑 。山) 中国农业1 夫学硕i 学位论文第一章文献综述 衍生化，进行毛细管气相色谱一质谱进行检测的方法。通过对1 1 份饮刚水固相苹取测定回收率 发现，在l o o n g i 。的添加水平，其中2 9 种除草剂的回收率在5 0 以h2 6 种除草剂的回收率高 了二7 0 。v j n kp 。少”对表层水中的苯氧羧酸除草剂提取后采片j 五氟澳苄酯化，进行g c e c d 测 定，并对测定结果做了质谱确证。 b u t z 和s t a n ( 1 9 9 3 ) 尝试使用氯甲酸盐对苯氧羧酸类除草剂进行衍生化，将1 5 种苯氧羧酸 类除草剂衍生化为其对应的甲酯、乙酯、丙酯、丁酯衍生物，使用g c m s 和g c e c d 检测，达到 了很好的分离和检测效果。但是由于衍生化步骤繁琐，无法与烷基酯衍生化相媲美。 1 2 3 2 高效液相色谱( h p l c ) 和液一质联用( l c m s ) 方法 由于苯氧羧酸类除草剂的弱挥发性，适合使用液相色谱进行分离测定。采用气相色谱对该类 除草刘检测时需要将样品进行衍生化，这样不仅费时费力，而且影响方法的重现性和稳定性。使 h jh p l c 检测有时也进行衍生化处理，但是其衍生化的目的通常是为了提高检测灵敏度而不是改 变其色谱行为”。如使用a d a m ( 9 a n t h r y l d i a z o m e t h a n e ) 对2 ，4 一d 、m c p a 、m c p p 、m c p b 衍生化， 使用乙腈一水流动相在荧光检测器达到很好的分离效果，采用荧光检测器可以实现在极低的水平 卜i 测定该类除草剂的残留”。p a u l r l o c o n t o ( 1 9 9 1 ) ”“采用r p h p l c d a d 对水样中五种弱酸 性物质：二氯甲氧苯酸、2 4 - d 、2 ，4 ，5 - t 、三氯苯氧丙酸和地乐酚进行了分离和检测，回收率分 别为6 2 、1 0 1 、9 5 5 、9 1 4 、6 5 。 苯氧羧酸类除草荆极性高，p k a 分布在2 5 之间，在液相分析时需要调流动相的p h 值。可 以使用有机酸如醋酸、三氟乙酸或无机酸( 如磷酸) 等调节酸度。水体或空气等基质简单，使用 液相色谱对其进行检测会有满意的检测限和灵敏度“1p a t s i a se ta l ”。使用在线阎相萃取一液 相色谱分析的方法对水中的极性农药进行检测，检测限达到了3 0 一5 0n g g 。苯氧羧酸类除草剂的 紫外最大吸收范围是1 9 0 2 1 0 n m 在此吸收范围内溶剂干扰严重要对复杂基质如肉类、谷物等 样品中该类除草剂的残留分析达到良好的回收率或线性检测范围还是有难度的。 高度选择性是l c m s 联崩的优势，可以减少假阳性出现。i n c o r u i am a t t i n am j ( 1 9 9 1 ) ” 使用h p l c - m s 采用等度流动相一甲醇和含有苯氧乙酸的稀醋酸( 7 0 ：3 0 ) 完成了对水样中2 ，4 ，5 - t 、 2 ，4 - d 和三氯