（农药学专业论文）厌氧纤维分解菌的分离、筛选及与农药相关性研究.pdf

摘要 在严格的厌氧条件下，从双季稻区水牛的 粪便和胃残渣中共分离了2 3 0 个 标样， 得到 1 1 5 0 个菌株。 通过对这些菌株降解滤纸速度的 观察， 筛选出了3 株 纤维素分解能力较强的 细菌. 其中以3 0 1 号菌株分解纤维素能力最强， 将1 . 7 x 1 0 c f u / m l的 菌液 1 m l加入到含有滤纸的9 m l的2 号培养液中 培养，分解粗滤纸 5 0 % 只需3 d ，而使其全部分解也只 需 7 d 。 通过 j s m - 6 3 6 0 电镜4 x 1 0 倍放大 观 察此细菌为圆椭圆形，其直径为 2 2 5 m n 左右。 初步测定3 0 1 号菌株的最佳培养条 件和培 养方法为:在3 7 厌氧条件下， 3 0 1 号菌株最佳培养液为2 号培养液，最佳培养时间 是7 d ,最佳p h值是7 . 5 0 取3 0 1 号菌株取 l m l 菌液 ( 1 . 7 x 1 0 c f u / m l ) 加入到含有滤纸条和不同 浓 度的9 m 1 含农药培养液中培养， 观察菌株降 解滤纸速度， 农药在低浓度( o . l m 醉 、 0 . 2 m g / l ) 下对厌氧纤维分 解菌降 解纤维素的活力影响不大。除草剂 ( 节嗜磺隆 和丁草胺) 在低浓度下甚至对其活力有一定的促进作用。 而在高 浓度 ( 0 .4 m g / l , 0 . 8 m g / l , 1 . 6 m g / l ) 下杀 菌剂 ( 井冈 霉素和稻瘟清) 几乎能 完全抑制厌氧纤维 分 解菌的活性;杀虫剂 ( 三哇磷和杀虫双)对其也有明显的抑制作用;而除草剂对 厌氧纤维分解菌的活力几乎无影响。 对3 0 1 菌株酶活力 进行测定，以 微晶 纤维素 作底物酶活力最高， 滤纸作 底 物酶活力次之，c mc ( 梭甲基纤维素钠)作底物酶活力相对较低。同时，其产 酶高峰期在第4 d至第 7 d ，其中以第 7 d 最高，在第 8 d开始下降。 测定3 0 1 菌株对稻草叶、稻草杆和滤纸降 解活 性，其降 解稻草叶、 稻草 杆 和滤纸活性较高，其中又以降解滤纸速度最快。放入试管中培养前后称其干重， 3 d降解了5 6 . 3 3 %, 7 d降解了 9 7 . 0 0 %;稻草叶次之， 3 d降解t 2 0 . 9 8 %, 7 d 降解 了6 5 . 9 0 %;相对而言，稻草杆较慢 3 d降解 了6 . 9 9 %, 7 d 降解了2 6 . 1 9 %. 关键词:厌氧培养，纤维分解菌，分离，农药，稻草，酶活，降解 ab s t r a c t 2 3 0 s t r a i n s o b t a i n e d fr o m i s o l a t i n g 1 1 5 0 s a m p l e s s e l e c t e d fr o m r u m i n a l r e s i d u e s o f b u ff a l o s u n d e r t h e s t r i c t l y a n a e r o b i c c o n d i t i o n s , t h e f a e c a l a nd e f f i c i e n t c e l l u l o l y t i c b a c t e r i a a r e s e l e c t e d a f t e r a k e e n o b s e r v a t i o n o n t h e s e s t r a i n s e ff e c t t o d e g e n e r a t e t h e f i l t e r p a p e r . n o .3 0 1 i s f o u n d t o b e t h e m o s t c o m p e t e n t . l m l o f t h e n 0 .3 0 1 fl u i d ( 1 .7 x 1 0 c f u / m l) w a s p o u re d a n d m ix e d w ith 9 m 1 o f th e s e c o n d m e d iu m , i t c a n d e g e n e r a t e h a l f o f t h e fi l t e r p a p e r i n 3 d a y s a n d t h e w h o l e p i e c e o f p a p e r i n 7 d a y s . i t t u rns t o b e a c i r c l e o b l o n g s t r a i n w h e n ma g n i fi e d 4 0 0 0 0 t i m e s b y j s m- 6 3 6 0 , t h e r a d i u m i s 2 2 5n m. o p t i m u m f e r m e n t i o n c o n d i t i o n s f o r 3 0 1 w e r e s t u d i e d . a c c o r d i n g t o t h e r e s u l t , t h e b e s t f e r me n t i o n c o n d i t i o n a s f e l lo w: u n d e r 3 7 0 c t h e s t r a i n o f 3 0 1 wa s i n t h e 2 - l i q u i d m e d i u m a n d t h e o p t i mu m d a y s wa s 7 , t h e o p t i m u m p h w a s 7 .5 . l m l o f t h e n o . 3 0 1 ( 1 . 7 x1 0 c f u / m l ) t h a t o b t a i n e d w h e n i s o l a t i n g fr o m t h e b u ff a l o s f a e c a l w a s p o u r e d a n d mi x e d w i t h 9 m1 o f t h e me d i a , w h i c h h a v e d i ff e r e n t p e s t i c i d e , d i ff e r e n t c o n c e n t r a t i o n a n d t h e f i l t e r p a p e r . t h e r e s u l t s h o w e d t h a t t h e d e c o m p o s i n g o f t h e fi l t e r p a p e r w a s d i ff e r e n t a s m e d i a w a s c h a n g e d , t h e r e w a s l i t t l e e ff e c t o n t h e a n a e r o b i c c e l l u l o l y t i c b a c t e r i a u n d e r t h e l o w c o n c e n t r a t i o n ( 0 . l m g / 1 , 0 . 2 m g / 1 ) o f p e s t i c i d e , e v e n h e r b i c i d e c o u l d i m p r o v e t h e a b i l i t y o f t h e s e u n d e r t h e l o w c o n c e n t r a t i o n . f u n g i c o u l d r e s t r a i n t h e a b i l i t y t o d e c o m p o s e t h e fi l t e r p a p e r a n d i n s e c t i c i d e a l s o c o u l d d o , b u t t h e h e r b i c i d e w o u l d n o t e ff e c t t h e a b i l i t y o f t h e a n a e r o b i c c e l l o l y t i c b a c t e r i a u n d e r t h e h i g h c e n t r a g e ( 0 a m g / l - - 1 . 6 m g / l ) . t h e c e l l u l a s e o f 3 0 1 w a s e x a mi n e d . t h e y i e l d o f c e l l u l a s e w a s h i g h . a m o n g t h e t h r e e c e l l u l a s e s , t h e m o s t y i e l d o f c e l l u l a s e i s m i c r o l i t e c e l l u l o s e , t h e s e c o n d y i e l d o f c e l l u l a s e i s f i l t e r p a p e r . t h e l o w e s t y i e l d o f c e l l u l a s e i s c m c . t h e f a s t i g i u m o f y i e l d c e l l u l a s e i s 4 t o 7 ; t h e m o s t i s 7 . i n t h e e i g h t h , t h e y i e l d c e l lu l a s e w a s d r o p p i n g . t h e a b i l i t y t h a t d e g e n e r a t e s t h e l e a v e s o f s t r a w , t h e r o d s o f s t r a w a n d t h e f i l t e r p a p e r w a s s t u d i e d , w h i c h w a s h i g h , a m o n g t h e t h r e e b a s e , t h e m o s t s p e e d o f w h i c h w a s t h e f i l t e r p a p e r , 5 6 . 3 2 5 7 % w a s d e g e n e r a t i n g i n t h r e e d a y s a n d 9 6 . 9 9 9 9 % w a s d e g e n e r a t i n g i n s e v e n d a y s ; t h e s e c o n d s p e e d o f w h i c h wa s t h e l e a v e s o f s t r a w , 2 0 . 9 8 1 3 % w a s d e g e n e r a t i n g i n t h r e e d a y s a n d 6 5 . 9 0 0 4 % w a s d e g e n e r a t i n g i n s e v e n d a y s ; t h e l o w e s t w a s t h e r o d s o f s t r a w , 6 .9 9 0 3 % w a s d e g e n e r a t i n g i n t h r e e d a y s a n d 2 6 . 1 9 1 6 % w a s d e g e n e r a t i n g i n s e v e n d a y s . key w ords a n a e r o b i c c u l t u r e d ; c e l l u l o l y t i c b a c t e r i a ; i s o l a t i n g ; p e s t i c i d e ; s t r a w ; a c t iv i t y o f c e l l u l a s e 独 创 性 声 明 本人声明 所呈交的论文是我个人在导师指导 下进行的研究工作及取得的研 究成果。 尽我 所知， 除了 文中特别加以 标注和致谢的 地方外， 论文中不包含其他 人己 经发表或撰写过的研究成果， 也不包含为获得湖南农业大学或其它教育机构 的学 位或证书而使用过的材料。 与 我一同 工作的同 志对本研究所做的任何贡献均 己在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研 究 生 签 “ ; 刘全胜 时 0 1 : 2 csp ,j 年翻 夕 日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解湖南农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即:学校有权 保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅， 可以采用影印、 缩印或 扫描等复制手段保存、 汇 编学位论文。 同 意湖南 农业大学可以 用不同 方式在不同 媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研 究 生 签 名 : 刘全股 时 间 :z e e ;f - 年 月夕 日 导 师 签 名 : 衡 超 苍时 间 :; .0 r年; 月 / 么 日 h u舌 纤维素是植物的主 要成分，构成了 植物干物质的 1 / 3 - 2 / 3 。同时，纤维素是 世界上最丰富的可再生资 源，据测算， 地球表面每年因光合作 用合成的物质中， 纤 维 素 约占6 % ， 达2 2 0 亿t itl e 然 而， 这 种资 源的 大 部 分 是 作 为 废弃 物 而 被 抛弃 掉或作为燃料用， 其中，自 然界中有机固体废弃物一半以上的成分是纤维素和半 纤维素， 即造成资 源浪费， 又 污染 环境。 随 着人民的生活水平的日 益提高 和人口 数量的持续增长， 粮食问 题己 成为当 今的主要话题。 若能将这些纤维素废弃 物经 微生物转化为简单的糖类或蛋白 质类等产品， 即可以解决环境污染， 又可以作为 饲料， 解决粮食危机。 随着水稻高产施肥技术的发展和复种指数的提高， 我国大 部分地区 稻田 施肥存在 “ 重化肥， 轻有机肥” 的倾向， 长期偏施化肥， 单位化肥 的增产量日趋下降，土壤肥力退化，更严重的是造成地下水污染问题 日益突出。 秸 秆还田具有良 好的 培肥改 土的 作用， 但同 时因为 秸秆分解速度慢而给后茬作物 生长带来很大的影响。 若能在稻草上接种纤维分解菌， 可加速稻草秸秆在田间的 软化和分解，提高土壤肥力，在农业生产上有着重要的意义。 目 前国内外对微生物分解转化纤维素的 研究极为重视 1 - 3 0 1 ， 挖掘纤维素酶产 生菌的资源，不断地分离和选育纤维素酶高产菌株是一项重要而有意义的工作。 反 色动物能有效的利用纤维性植物， 依靠的 是瘤胃中存在的 大量的 瘤胃 微生物。 本实验的目的在于通过分离、筛选双季稻区牛的粪便与胃残渣中厌氧纤维分解 菌， 找出纤维素酶活力较高的优良菌株， 为促进田间稻草快速腐烂， 分解有机垃 圾，纤维素饲料化等提供理论依据和实践基础。 第一章 文献综述 1 、纤维素及纤维素酶的研究概况 纤维素是植物残体中 最丰富的 部分， 它是由0 ( 1 - 4 ) 键的 葡萄糖单 元所组 成 的长链状大分子。 通常一条链中含有 1 0 0 0 0多个葡萄搪分子， 其葡萄糖亚基排列 紧密有序， 形成类似晶体的不 透水的网状结构， 以及分子间结合不甚紧密、 排列 不整齐的无定形区域( 2 1 。纤维素是一切植物的主要成分，几乎占植物干重的 1 / 3 - 2 / 3 1 3 1 ， 他在植物性饲料中占很大的比 例。 除了 草食动物能 利用其中的一部分 外， 杂食性动物大部分不能直接利用。同时， 纤维素这一巨大可再生资源的有效 利用对 解决环 境污染， 食品短缺， 能源危机具有重大 现实意义。 因此， 加强植 物 性饲料， 尤其 是纤维 性饲料的利用， 利用纤维素酶来分解和转化纤维素， 是开发 饲料资源， 发展畜牧业的一大课题， 而纤维素酶类添加剂的开发则是解决这一问 题的 有 效 途 径4 1 纤维素是世界上最丰富的原料之一，利用纤维素酶，通过微生物发酵将农 副产品 和工业 废料中的纤维素材料转化成糖和蛋白 质， 有可能改 变依靠农业生产 的传统方法， 成为饲料、发酵工业原料和人类食品的新来源，同时还可用以处理 废物、 消除公 害、 保护环境15 3 。 纤维 素酶来 源广泛，一些真菌、细菌、放线菌等 在 一定条件下均可产生纤维素酶， 但自然界的野生菌株所产生的纤维素酶活力都 比 较 低 (s1 纤维素酶是降 解纤维素生 成葡萄 糖的一组酶的总称。目 前普遍认为，完全 降解纤维素至少需要 3种纤维素酶，分别是:内切葡聚糖酶( e n d o - 1 , 4 - 0 - d - g l u c a n a s e , e c 3 . 2 . 1 . 4 ) 作用于纤维素分子内 部的 非结晶区，随即水解p - 1 , 4 糖昔键，将纤维素分子截短，产生大量带非还原性末端的小分子纤维素;外切 葡聚搪 纤维二糖水解酶( e x o - 1 , 4 - 0 - d - g l u c a n a s e , e c 3 . 2 . 1 . 9 1 ) 作用于纤维素 线状分子末端，水解0 - 1 , 4 - 搪昔键， 每次切下一个纤维二 糖分子;0 一 葡萄搪 昔酶( 0 一 1 ，4 - g l u c o s i d a s e , e c 3 . 2 . 1 . 2 1 ) 将纤维二 糖水解成葡萄糖分子( 7 1 2 、纤维素酶的来源 2 . 1 、微生物来源 能 分泌纤维素酶的 微生物主要有霉菌、 担子菌等真菌，也包括细菌、 放线 菌和一些原生动物。 目 前， 人们研究的 纤维素 酶主 要来自 细菌和丝状真菌。 主 要 有纤维粘菌、 生抱纤维粘菌和纤维杆菌等， 但由 于细菌分泌的纤维素酶量少( 低 于0 . 1 克/ 升) ， 同时产生的酶属胞内 酶或者吸附于细胞壁上， 故很少用细菌作 纤维素酶的生产菌种，但近年来一些国家利用纤维杆菌深层通气培养生产此酶， 效果较好。对于利用微生物生产纤维素酶的研究开展的较早。美国的r e e s e ，日 本外山 信男、 福本寿一郎等分别对绿 色木霉、 康氏 木霉、 黑曲 霉产纤维素酶作了 较详细的研究; w i l k e 综述了 纤维素 酶的来 源， 认为绿色木霉的产率 最高 .目 前饲用纤维素酶，主要源于绿色木霉、李氏木霉、根霉、青霉、反当动物 ( 瘤胃 细菌、真菌) 、嗜纤细菌、 产黄单抱菌、侧抱菌等，其中绿色木霉应用最为广泛。 对已知纤维素酶产生菌进行诱变是增加产酶微生物菌种的一条有效途径。 这方面 的研究较多: 1 9 7 1 年m a n d e l s 等通过绿色木霉q m 6 a 获得了q m 9 1 2 3 ， 其活力比青 株高一倍:1 9 7 3年前苏联报道，绿色木霉以硫酸二乙酷为诱变剂，可提高生产 纤维素酶的能力; 美国陆军 n a l i c k 研究所由1 4 0 0 株自然界真菌进行筛选得到纤 维素酶活力最强的李氏木霉 q m 6 a以后，通过诱变得到 q m 9 1 2 3 . q m 9 4 1 4 , n e v a l a i n v e 报道将李氏木霉 q m 9 4 1 4 用 m n n g处理后所得变异株 v t t d - 7 8 0 8 5 ，活 力在一定条件下提高了 2 - 3倍; 上海植生所纤 维素酶组以 野生木霉 a g 3 . 3 0 0 2 和拟康氏木霉为出发菌株，经物理、化学因子诱变，获得了高活力菌株 e a 3 - 8 6 7 和 n 2 - 7 8 ;中国科学院 微生物研究所纤维素酶组获得了康氏木霉的白色变种 a s 3 . 4 2 9 0 和a s 3 . 4 0 0 1 ; 康氏 木霉c p - 8 3 2 9 8 ， 等等。 2 . 2 、动物性来源 反当动物依靠瘤胃微生物可消化纤维素，因此可以利用瘤胃液获得纤维素 酶的 粗酶制剂。 如扬国宇 们 较系统的阐述了 瘤胃 微生态体系中， 细菌、 真菌、 纤 毛虫及其纤 维素酶系 统对植物细胞壁纤维素进行的消 化: 张晓华ls 1 等报道了 一个 厌氧中 温分 解纤维素的 瘤胃梭菌新种。 另外、 也可利用组 织培养 法获得所需要的 微生物 。 2 . 3 、生物工程来源 生物技术的发展，使饲用纤维素酶的来源有所拓宽，产酶微生物菌种日益 增多。 迄今， 人们己 从四十多种细菌和数种真菌中克隆到了 纤维 素酶基因， 同时 构建了 这些酶的基因 文库，其中一些酶的基因己 在大肠杆菌和酵母中得到了表 达。 因此将己 克隆到的 基因同 高效表达基因的启动子和染色体起始位点融 合则可 表达， 且表 达量 增加; 同时， 利用基因工程手段对纤维素酶分子进行改造， 使其 活性提高耐受性增强。 这方面己有报道， 如巴斯德研究所利用热纤棱菌提供的基 因来源， 通过定点突变技术， 在大肠杆菌中表达纤维素酶基因的同时，得到了一 种新的纤维素酶。 由于李氏 木霉 产量高， 同时李氏 木霉可作为 外源 基因的 表达系 统，即作为新的基因工程受体菌。如将黑曲霉的 h g基因在李氏木霉中表达，可 提高纤维素酶活 力; 同 时， 利用基因失 活技术控制不必要的酶活 性， 并调 节某些 酶的活性比 例， 此外， 通过对有关启动子的 研究， 可根据需要进行调控。 如删除 调控葡萄糖阻遏作用的纤维素酶 ( c b h i ) 启动子的有关核营酸片段， 可保证在葡萄 糖积累的情况下纤维素酶启动子的活性。另外、由于木霉居中李氏木霉和黑曲霉 产纤维素酶的能力强， 故近些年己有了对这两个远属间的基因能否相容性遗传和 表达的 研究。 艾云 灿等通过改良 常规方 法成功地获得了两属间具有纤维素酶系杂 种优势的稳定重组单体 a t h - 1 3 7 6 ，从而为降低产酶或菌体培养成本提供了新的 途 径 。 3 、纤维素酶的研究进展 3 . 1 、国内外纤维素酶的 研究概况 1 8 5 0 年 mi f s c h e r l i c h 观察到了微生物分解纤维素的现象: 1 9 0 6 年， s e i l l i e r e 在蜗牛的消化液中发现了能分解天然纤维素的纤维素酶;1 9 4 5年在微生物中发 现了纤维素酶，此后，纤维素酶的研究和应用便逐步受到世界各国的普遍关注。 对 其 研究 先 后 经 历 了 三 个 阶 段 f ill : 第一 个 阶 段是8 0 年 代 前， 主 要 利 用 生 物 化 学 的 方法对其进行分离纯化; 第二个阶段是利用基因工程的方法对其酶的 基因进行 克隆和一级结构的测定;第三个阶段是 1 9 8 8 年至今，主要利用生物学及蛋白质 工程的方法对纤维素酶分子结构及功能进行的研究。 纤维素复合酶不是多种酶作用的简单累加，而是多种酶间的协同作用，在 国外多把纤维素复合酶应用于高 纤维， 低能量， 低成本的日 粮中， 特别是在以 大 麦为基础的日 粮中 所取得的 效果己得到了 肯定0 2 1 。国 外从7 0 年代起， 就开始较 系统的研究纤维素酶类作为 饲用添加剂用于饲料工 业。 同时， 日 本、 丹麦、 美国、 巴 西、 印度及俄罗 斯等有许多关于纤维 素酶应用于酒精生产的报道， 应用好的 丹 麦等国家原料出酒 率提高了1 - 3 % ，以 黑麦为原 料可达5 % 1 3 1 。 我国 于1 9 7 8 年才 成立了纤 维素酶大协组， 从采土样、 分离、 筛 选、鉴 定菌种开始， 此后才逐步开 始菌种的诱变选育、 分离纯化及酶性质的 研究; 近十 年也进 行了 开发性研究， 并 运用到饲料中， 取得了 一定的效果， 但由于纤维素酶活性不高， 用量过大， 来源 有限，致使生产成本过高而应用受限。 二十世纪八十年代后，由于酶的生产技术 和菌种筛选、 分子生物学的发展及生物技术取得了突破性进展， 酶活力单位提高， 单位酶活力的生产成本不断下降， 纤维素酶的应用研究才得以迅速展开， 从而使 纤维素酶更好地开发以及获得更广、 更高效稳定的产酶微生物及其在饲料中的应 用出 现了 新的前景 4 1 3 . 2 、纤维素酶的分子生物学研究进展 对于纤维素酶分子结构及纤维素酶基因结构的研究报道， 国外( 以木霉纤维 素酶为研究的基点) 开展的较早。尤其是对李氏木霉体系的研究深入，已克隆到 了c b h i , c b f i i i , e c i , e c ii i , b g 五个基因，并 测定了 这些基因的核昔酸序列， 其中有些基因已 在大肠 杆菌和酵母中 得到了表达 1 4 。 但对于绿色木霉的 研究 直到 九 十年代初仅有c b h i 基因克隆的报道。王 建荣、张曼夫 i.i 利用李氏 木霉的基因 序列同源片段做探针， 构建了绿色木霉基因文库，并克隆了c b h i , c b h i i 基因， 并对其基因结构进行了研究。 目前对一些纤维素酶的基本结构和活性部位己基本 弄 清， 且已 有百 余个纤维素酶的 基因组分得到了克隆 和表达， 并不断地有新的组 分 得到了分离、纯化，包括p 一 葡萄糖昔酶( 1 b 。为了 适应工业化生产的 需要，纤 维素酶的研究除了 趋向于高产、 耐受性强的菌种， 高 效酵母表达的系统外， 纤维 素酶基因还用于构建高效纤维素分 解工程菌。 随着木霉分子生 物学研究的深入， 对于木 髯转化系统的构建日 趋成熟。 木霉作为外源基因的 表达系 统将会引起广泛 的关注。 如比 利时根 特大学遗传研究室用细菌来源的质粒构建裁体， 在聚乙二醇 和氯化钙作用下， 把目 的基因( 或d n a 片 段) 引入受体原生质体， 经过再生和选择 获得了 转化 ， 门 。 另 外， 对于瘤胃 微生态区系中的纤维素分 解菌群的遗传改造也将 是纤维素酶分子生物学研究的一个重要领域。 4 、纤维分解菌的研究概况 能分解纤维素的 菌株很多，如细菌( 纤维杆菌 ) 、真菌( 木霉属、青霉属、 曲 霉属) 和放线菌等， 但研究最多且酶活相对较高的多为木霉属。要高效降解纤 维素必须选育酶活 较高的菌株o e l 。 纤 维分解菌在自 然界中广泛存在， 即有厌氧型 的， 也有好氧型的纤维分解菌， 不但在土壤中存在， 在动物的胃， 肠里也能找 到， 同时土 壤中的纤维分解菌的许多产物也是产甲 烷细菌的底物。 单位有机质产甲 烷 气体的产气量的变化趋势与厌气纤维素分解菌数量的变化有着同样的规律， 即样 品厌氧纤维素分解菌数量较多 时， 其单位有机质产气量也相 对较高， 具有一 致的 消长规律， 有较多的厌氧纤维素分解菌以沉积岩中纤维素类物质为主的有机质为 底物代谢产生了较多的小分子有机物质， 更易被其后的生物产甲烷过程利用， 对 生物产甲 烷过程起着积极促进作用，是沉积环境中生物产甲烷过程的重要部 分. 厌氧纤维素分解菌是 气源岩生物产甲 烷过程的重要参加者， 对生物气的形成 起着重要作用， 。 纤维分解菌可以从土壤、 腐烂植物和难青 贮植物原料， 如收获 后的玉米秸、向日 葵秸及禾本 科秸秆制备的青贮料中 分离出来(m l 同时，纤维分解菌也大量存在于动物的胃、肠里面，对于反当动物和一些 家畜的生存具有重要的意义。 如反色动物的瘤胃是机体营养转化的重要器官， 消 化和分解植物中的纤 维和半纤维是其中 纤维分解细菌的主要功能。 细菌通常是单 细胞的，大小从 0 . 5 -3 . 0 p m ，由于体积小，细菌具有较大的比表面积，能使物 质快速进入细胞。 因此， 细菌往往比 真菌多得多， 一些芽泡 杆菌由 于能产生较厚 的 抱子， 可以 抵御高 温、 辐射及化学灭菌作 用” 。 大量研究证明， 在堆肥高 温期， 主 要微生物是 链霉菌和微单胞杆菌， 其中8 7 % 的高温菌属于 杆菌属 2 1 ， 一 些细菌 如:假单胞菌属、杆菌居中的芽抱杆菌、枯草杆菌、地衣球菌。另外，深黄纤维 弧菌、普通纤维弧菌、纤维杆菌、荧光假单胞杆菌、 瘤 胃球菌等均具有纤维素分 解能力。堆肥过程中，真菌有激发作用， 而放线菌则能在较长时间维持这种分解 活 性。 特别 在堆肥过 程的后期， 由 于易 利用和较易利用的有机物逐渐消耗， 仅剩 下木质素等极难分解的物质， 微生物之间的竞争也日趋激烈， 能在一定程度上分 解木质素， 并产生 抗生素的放线菌逐渐占 优势。 放线菌通常由许多细胞菌丝缠绕 在 一 起， 像 真 菌一 样， 老 们可 以 在高 温 阶 段、 降 温 阶 段 和 熟 化 阶 段出 现， 放 线 菌 数量相对较多， 以 致于 在堆 肥表面肉 眼可见: 放线菌很少利用纤维素， 但它们能 容易地利用半纤维素， 并能在一定 程度上改变木质素的 分子结 构， 继而分解溶解 的木质素 2 8 . 2 7 7高温放线菌可以 从自 然界中 许多地方分离出来 2 7 ， 如: 沙子、 成 熟堆肥 、马粪和果 园土中。主要包括:诺卡 氏菌属 ( n o c a r d i a ) 、链 霉菌属 ( s t r e p t o m y c e s ) 、 高温放线菌 属( t h e r m o a c t i n o m y c e s ) 、小 单胞菌 属【 26 7 。因此， 尽管由 于放线茵繁殖慢其降 解纤维素和木质素的能 力不及真菌， 但因为在不利的 条件下， 放线菌能形成有芽抱细菌2 6 ， 与真菌相比较耐高温 和各种酸碱度， 所以 在高温阶段放线菌对分解木质素和纤维素起着重要的作用 2 . 2 4 1 。 大多数木质素降 解放线菌是好氧菌， 但也有一部 分厌 氧菌2 7 ) ， 特别当堆 肥温度升至5 5 以 上时， 木质素厌氧分解速度提高 2 r 7 5 、瘤胃纤维分解菌的研究进展 反当动物能有效的利用纤维性植物，依靠的是瘤胃中存在的大量的瘤胃微 生物，包括细菌、原虫及真菌。 在纤维物质的分解利用过程中，细菌和真菌发挥 了b o % 的作用， 原虫 起平衡控制作 :m n ) 。 对于以 低质粗饲料为主要日 粮的反当家 畜而言， 瘤胃纤维分解菌 r c b ) 在宿主动物的营养供给方面起 了极其重要的作用。 因此，研究者们对于瘤胃微生物的生理、生化功能进行了大量的研究工作。 5 . 1 、瘤胃纤维分解菌的种类 瘤胃中存在的细菌、真菌及原虫均具有纤维分解利用的能力，然而，根据 它们在宿主动物体内的相对数量及在纯培养过程中消化不同类型纤维的活力， 研 究者们认为在瘤胃纤维分解作用中起主要作用的 r c b 有以下三种: 产唬泊酸纤维 分 解 菌 ( f i b r o b a c t e r s u c c i m o g e n e s ) ， 黄 色 瘤 胃 球 菌 ( r u m i n o c o c c u s f l a v e f a c i e n s )，白 色瘤胃 球菌( r u m i n o c o c c u s a l b u s ) 。 这三种菌在营养需要、 粘附纤维等方面 有相同的 特征， 而区别于 其它的瘤胃 微生物。另外， 还有一 部 分 r c b 称 之 为“ 次级 纤维 分解 菌 ” .例 如 ，溶 纤 维 丁酸 孤 菌 ( b u t y r i v i b r i o f i b r i s o l v e n ). 长芽 肥梭菌( c l o s t 工 i d i 二1 o n g i s p o r i u m ) ， 湖头棱菌 ( c l o s t r i d i u m l o c h e a d i i )，它们对纤维降 解也起到一定的 作用，但 与主要的纤维分解菌有许多不同 之处 :3 q 表 1 :瘤胃纤维分解菌的作用比较 t a b l e l : c o m p a r e t h e a c t i o n o f c e l l u l o l y t i c b a c t e r i a f r o m r u m i n a l 特征 典型的种类 对纤维物质 的粘 附作用 纤维酶的 主要作 用位点 营养 游动性 主要 f i b r o b a c t e r s u c c i n o g e n e s r u m i n o c o d d u s f l a v e f a c i e n s r u m i n o c c u s a 1 b u s 通过多糖包被大量的粘附于 纤维物质 细胞表面 次要 b u t y r i v i b r i o f i b r i s o l v e n c l o s t r i d i u m l o n g i s p o r i u m c l o s t r i d i u m l o c h e a d i j 极少量发生粘附作用 细胞外 专一，主要是纤维素 不游动 多方面的、主要是糖类 游动或不游动 注:资 料来自 于p a u l j . w e i m e r ( 1 9 9 6 ) ( _ 3 5 . 2 ,瘤胃纤维分解菌的营养需要 大部分瘤胃细菌利用碳水化合物发酵产生的单糖和双糖作为生长介质，尽 管它们利用纤维素的能力有限， 但仍可利用一小部分的这类糖。 然而， 产唬拍酸 纤维分 解菌和瘤胃 球菌只能利用纤维紊和它的水解产物一 纤维糊精作为唯一的 生长介质; , , 。另 外， r c b 的许多种 类都 需要维生素b 族中的 一种或多 种维生素用 于生长r m 。 例如， 白 色瘤胃球菌需要生物素、 毗哆醇， 对氨基苯甲 酸对其的生长 也有一定的刺激作用，其它的一些菌种还需要叶酸、核黄素、硫胺素。 r u m i n o c o c c u s f l a v e f a c i e n s 与前者有相同的维生素需要( s c o t t h . w . 1 9 6 5 ) . 对于 r c b的矿物质需要进行了为数不多的几个 研究， 发现， k , n a , c a , 磷酸 盐为 纤维分解菌所需要， 并且研究发 现 f e , z n ” 对纤维分 解有一定的刺激作用 ( m a t t u r i a . s . 1 9 7 2 ) 。 早在5 0 年 代， a l l i s o n 等人的研究就发现， v f a 中的 某 些生长因子可促进瘤胃纤维分解菌的活力， 以后的研究证实， 异构酸是 r c b 所需 或必需的营养成分。异构酸， 也即支 链脂肪酸( b a n c h e d - c h a i n f a t t y a c i d ) ，主 要有异丁酸、异戊酸、 2 一 甲 基丁酸、直链的一 n戊酸和带碳环的苯乙 酸等，它 们 主要来 自于颁氨酸、 亮氨酸、 异亮氨酸、 脯氨酸经氧化脱氨基和脱梭基反应的生 成 物 f9 5 . 3 , 瘤胃 纤维分解菌降解纤维的过程 5 . 3 . 1 , 瘤胃 纤维分解菌对纤 维物质的粘附作用 分解纤维的微生物首先附 着于待消化的底物进行消化。 c h e n g 等和k u d 。 等 ( 1 9 7 7 , 1 9 8 7 . 1 9 9 0 ) 研究结 果显示出菌体对底物的紧密附着对纤维消 化是绝对必 需的。细菌和原虫通常在反色动物采食后 5 m i n即与植物组织相粘附( b o n h o m m e , 1 9 9 0 ) ， 这种粘附作用通过粘附力或受体的特殊作用过程以及物理， 化学力( 如范 德华力) 来完成( p e l l 和s c h o f i e l d , 1 9 9 3 ) 。在粘附 作用的同时. 糖蛋白 多糖 包被粘附的 r c b ，这种包被既保护了r c b 免受原虫的吞噬作用，同时又使得纤维 分解酶不被瘤胃中存在的蛋白酶所分解.而且保证了纤维分解产物一 纤维糊精为 r c b 所利用 5 . 3 . 2 , 瘤胃 纤维分 解菌的消化进程 无论是牧草还是谷物饲料，最容易消化的成分位于植物的内部。所 以，瘤 胃微生物的消化过程总是从暴露的内部组织开始“ 由里及表” 的进行消化， 但对于 表皮完整的饲料，细菌或真菌的进攻就极其艰难。对于整株牧草.细菌和真菌只 能通过其叶面上气 孔进入( c h e n g 等， 1 9 8 0 , 1 9 8 3 , 1 9 8 4 ) a k . j . c h e n g ( 1 9 8 0 ) 的一项研究结果向我们展示了r c b 的消化进程:利用电镜观察发现， 细菌的粘附 和增殖首先发生在新鲜豆科牧草的气孔部位， 并且由此逐渐向里侵入， 侵入的细 菌又进一步粘附在叶片细胞间的表面上，并且产生出大量的被多糖包被的菌落， 随着细胞壁被细菌消化破坏.细 胞内菌落的形成， 这些细胞即 被细 菌侵入 3 7 5 . 3 . 3 、 纤维素酶在动物体内的作用 机理. 纤维素酶是降解纤维素生成葡萄糖的生物催化剂，其在饲料中的应用机制 主要有以下几方面。 其一、 摧毁植物细胞壁，释放胞内养分植物细胞壁主要 是由纤维素、半纤维素和果胶组成。而由木霉、曲霉等制备的纤维素酶制剂、可 破坏细胞壁， 使细胞内容韧溶解出 来， 再由复合酶中的 蛋白 酶和淀粉酶等进一步 降解， 增加吸收率、 同时也增加了非淀粉多糖的消化进而提高了多纤维原料的利 用率。其二、 补充动物内源酶的不足，激活内源酶的分泌成年家畜分泌的消 化酶一般能满足其机体的 需要， 但幼龄畜禽、 病态和应激态下酶的分泌量明显不 足。另外，反当动物瘤胃中， 虽有一些分解纤维素的微生物存在，可以分解一定 量的纤维素， 但产生的纤维素酶量有限， 使纤维素的消 化吸收受到一定程度的限 制， 而添加纤维素 酶制剂可明显提高动物对纤维素的利用率， 同时， 对于其它单 胃 动物而言， 可以 改善消化道环境， 以 激活胃蛋白 酶。 其三、 减轻或消除饲料抗 营养因 子的 影响抗营养因子的存在， 降低了动物对饲料养分的 利用率， 从而 降低了 饲料 利用率。 果胶、 半纤维素 和 p - 葡聚糖和戊糖部分溶解在水中 产生粘 性， 增加了 动物胃 肠内容物的粘度， 对内 源酶来说是一个屏障、 缩短了 饲料通过 胃肠道的时间，降低厂营养物质的同化作用， 导致饲料吸收率降低、而添加纤维 素酶可降低 粘稠度，促进内 源酶的扩散， 增加养分的消化吸收。 5 . 4 ,瘤胃纤维菌降解纤维的限制因素 植物细胞壁含有 4 0 - 5 0 % 的纤维素和 2 0 -3 0 % 的半纤维素.所有这些均靠 r c b的发酵作用，在我们研究如何提高纤维降解之前，第一步应允弄清是什么因 素在影响瘤胃 纤维分解。 植物细胞壁本身的结 构是影响纤维物质消化的主要限制 因素。 r c b 降解纤维的限制因素， 一方面来源于瘤 胃的内环境， 主要是其中的 p h 值及 温度的影响，有资料表明， r c b 对于低p h 值很敏感， 三种主要的r c b 在p h 1 5 0 . 4 0 x 1 0 6 . 5 8 1 5 0 . 4 0 x1 0 7 . 0 4 8 0 . 4 0 x 1 0 7 . 5 3 7 0 . 4 0 x 1 0 8 . 0 7 1 5 0 a o x 1 0 8 . 5 1 2 1 5 0 . 4 0x 1 0 9 . 0无无0 9 . 5无无0 3 、小结与讨论 3 . 1 、从牛的粪便中分离得到 3 0 1号菌株为一株纤维分解能力较强的菌株，其最 适培养液为2 号 培养液，最适培养条件为p h : 7 .0 - 7 . 5 , 3 7 下厌氧培养。 3 . 2 、细菌降解纤维素的过程是通过粘附作用进行的，细菌首先附 着于待消化的 底物， 然后进行消 化， 这与c h e n g 等 和 k u d o 等 ( 1 9 7 7 , 1 9 8 7 , 1 9 9 0 年) 研究结 果以及b o n h o m m e 的研究结果相一致。 3 3 ,国内外学者已 从动物体内分离到大量纤维分 解菌 t - 1 5 ， 但所取动物材料中， 以稻草作为主要饲料的材料尚未见专门报道。 特别是本研究中的动物材料所生长 的环 境是多 年的双季稻区， 动物材料内的纤维分解菌己 形成特定的 株系， 具有典 型 性和代表 性，可作为亚热带内 陆地区双季稻区纤 维分解菌的 候选样株。 3 . 4 、本研究中所采用的动物材料在长期的取食、 消化过程中，其体内 的纤维分 解菌受特定的环境影响，已形成特有的 “ 生活型” 。这种 “ 生活型”的特点是所 分解的材料水分含量较高，残留重金属，残留农药， 纤维化程度高， 而且年周期 取食稻草的时间长，数量多。 3 . 5 、在南方，相对黄牛及其他人工饲养的草食动物，以个体计水牛消耗的富含 纤维的草料更多， 消化强度更大。 南方水牛的对纤维的消化实际上具有消化场体 积大， 消化速度快，消化能力强的特点，因此， 其纤维分解菌势必有其相应的适 应性， 从理论上分析，本研究的纤维分解菌，有可能是分解能力较强的纤维分解 菌，但有待进一步试验。 3 . 6 、本试验从瘤胃中所分离出的厌氧纤维分解菌，其使滤纸完全断裂所用时h 1 为 7 d ，与文 献1 5 5 研究结果中活性真菌使滤纸完全断裂时间一致， 而强于部分非 活 性 真菌 ; 本 试 验 所 分 离 筛 选出 的 厌 氧 纤维 分 解菌 其 产 菌 数 量为2 .8 x 1 0 7 c f u /m l , 与文献有关报道圆结果相比，其产菌数量高于 报道研究结果。说明 该分离筛选 出的菌株有可能是分解能力较强的纤维分解菌。 3 . 7 、环境污染的重要物质之一是有机垃圾，而有机垃圾中的木质素难以降解。 瘤胃微生物对有机垃圾有很强的降解能力， 据研究， 在适宜条件下， 接种瘤胃微 生物的 厌氧流反 应器中， 挥发 性固体 转化