（农药学专业论文）苏云金芽孢杆菌的肠毒素及其安全性研究.pdf

独创性声明 本人声明，所呈交的学位( 毕业) 论文，是在指导教师的指导下，通过 我的努力取得的成果，并且是自己撰写的。尽我所知，除了文中作了标注和 致谢中已作了答谢的地方外，论文中不包含其他人发表或撰写过的研究成 果。与我一同对本研究做出贡献的同志，都在论文中作了明确的说明并表示 了谢意，如被查有侵犯他人知识产权的行为，由本人承担应有的责任。 学位( 毕业) 论文作者亲笔签名：掺、窖、函二日期：拈f z 8 论文使用授权的说明 本人完全了解福建农林大学有关保留、使用学位( 毕业) 论文的规定， 即学校有权送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文 的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。 学位( 毕业) 论文 指导教师亲笔签名 保密，在年后解密可适用本授权书。 口 不保密，本论文属于不保密。匹 、萃石日期：订j 谚 日期：矿f ，z 尹 福建农林大学博士学位论文 摘要 苏云金芽孢杆菌( b a c i l l u st h f 馏r e n s i s 简称b t ) 是一种昆虫病原细 菌，因其产生的毒素对多种害虫有特异的毒杀作用而发展成为一种成功的微 生物杀虫剂，广泛用于农林及卫生害虫的生物防治。b t 商业化应用已有6 0 多年的历史，多年以来，b t 制剂一直被认为是安全的生物杀虫剂，因为最初 认为它仅对鳞翅目昆虫有毒性，而对哺乳动物和非靶标生物无毒。但是，随 着对b t 研究的深入，每年都有新的菌株和毒素被鉴定出来，其杀虫谱也越来 越宽广。现在认为，b t 含有的多种毒素不仅对无脊椎动物节肢动物门的鳞翅 l f l 、双翅目、鞘翅目、直翅目、膜翅目、半翅目、等翅目等1 6 个目有毒性， 还对线性动物门、原生动物门、扁形动物门中的有些种类有杀虫活性，其中 也有一些对人及哺乳动物有害。这对“b t 仅对鳞翅目昆虫有毒性”的安全性 基础产生了很大冲击。另外，b t 与作为病原菌的蜡状芽孢杆菌( b a c i l l u s c c y e u s 简称b e ) 在形态、生理及基因组等很多方面具有高度的相似性。近年 发现b t 含有与蜡状芽孢杆菌具有很高的同源性的可能对人和动物有害的溶血 素及肠毒素等，这对b t 的安全性提出了新挑战。 采用已发表的蜡状芽孢杆菌肠毒素基因的序列设计三对特异引物 h b l l h b l 2 、b c e t l b c e t 2 和e n t l e n t 2 ，对1 6 株本室保存及4 5 株引自美国 芽孢杆菌遗传保藏中心( b g s c ) 苏云金芽孢杆菌进行了溶血素b l 、肠毒素t 和e n t 基因三种肠毒素基因的p c r 检测。结果表明，含有h b m 基因、e n t 基 因及b c e t 基因的b g s c 菌株分别占6 0 、4 4 4 及6 6 7 ，本室保存菌株含 有h b l a 基因、e n t 基因及b c e t 基因的比例分别为：1 0 0 、9 3 8 及6 8 8 。 将b t8 0 1 0h b a 基因、e n t 基因及b c e t 基因的p c r 产物回收纯化后测序，经 n c b i 网站在线的b l a s t 软件进行同源性分析，结果如下，h b l a 基因片段与已 福建农林大学博士学位论文 知的b t 、b c 等的h b l a 基因相应序列同源性为9 6 9 8 ；e n t 基因与已知的b t 、 b c 、炭疽芽孢杆菌( 昱a n t h r a c i sb a ) 相应基因序列的相似性一般在9 4 9 9 ，b e e t 基因与已知的b t 、b c 、丑m y c o y d e s 的b e e t 基因相应序列的同源性 多为9 6 9 9 。 分别提取b t8 0 1 0 的质粒d n a 及染色体d n a ，以o n t 基因片段制备探针， 通过s o u t h e r n 杂交法对o n t 基因进行定位。结果表明，b t8 0 1 0 的质粒d n a 没有杂交信号，而染色体d n a 有较强的杂交信号，说明o n t 基因定位于染色 体上。 克隆了苏云金杆菌8 0 1 0 、w b 9 、t s l 6 及6 a 1 的e n t 基因o r f 序列，将8 0 1 0 序列测序，8 0 1 0 的e n t 基因的o r f 序列共有1 2 8 1 个核苷酸，用在线b l a s t 软件对8 0 1 0 的e n t 基因序列进行同源性分析( h t t p ：w w w n c b i n l m ! i j ：g q ! ) 。结果表明，8 0 1 0 肠毒素e n t 基因序列与b ea t c c1 4 5 7 9 、c x 5 及 b a a m e s 等菌株的肠毒素序列都有很高的同源性，值得注意的是，与网上数据 库其它菌株的肠毒素基因序列相比较，8 0 1 0 的肠毒素基因在1 1 5 1 2 7 位置有 1 2 个核苷酸的缺失。 8 0 1 0e n t 基因o r f 可编码4 2 6 个氨基酸，对其多肽进行分析( h t t e ： w c b s d t u d k s e r v i c e s s i g n a l p 一3 0 ) 得知，其n 端的1 - - 2 6 为信号肽序列， 这也说明该蛋白为分泌性蛋白。该蛋白在第3 9 个氨基酸位置有“谷氨酰胺一 苏氨酸”的三个重复序列( q t q t q t ) 。此外，与b cc x 5 的肠毒素相比，该蛋 白在该位置缺失了2 个q t 的重复，该缺失是8 0 1 0 肠毒素蛋白与b cc x 5 肠毒 素蛋白的主要区别之一。将8 0 1 0 、w b 9 、t s l 6 、1 0 7 2 、6 a 1 的o n t 基因编码的 氢基酸序列与b ec x 5 的相应氨基酸序列用a n t h e p r o 软件进行比较，发现它 们之间有很高的相似性。本研究克隆的8 0 1 0 、w b 9 、t s l 6 、1 0 7 2 四个b t 菌株 的o n t 基因编码氨基酸序列除个别氨基酸差异外基本一样。与b ec x 5 相比， 主要差异在于b cc x 5 的氨基酸序列在3 9 4 2 位置多出q t q t 四个氨基酸，在 9 6 9 9 位置还有s w d k 四个氨基酸的差异。b e6 a 1 的氨基酸序列与其它相比 福建农林大学博士学位论文 差异相对较大，除了上述差异外，其序列在3 5 0 - - 4 1 0 位置有多个氨基酸与其 余的序列不同。 为检测肠毒素的毒性，用h d 2 、h d 9 两株肠毒素活性高的b t 菌株及w b 9 、 蜡状芽孢杆菌6 a i 对小白鼠进行了口服急性毒性试验。结果显示，所有四种 供试菌株的发酵上清液对小白鼠都没有不良影响，没有呕吐及腹泻等肠毒素 中毒症状出现；对试验小鼠进行解剖，也没有发现其心、肝、肺及肠等器官 有任何病症。 关于b t 肠毒素是否安全，还有许多工作要做，如肠毒素的分离纯化、不 同动物的毒性试验以及肠毒素的表达与调控( 如用根基因的调控作用) 等。 关键词：苏云金杆菌，肠毒素，基因检测，基因定位，基因克隆，安全性 福建农林大学博士学位论文 4 a b s t r a c t b a c i l l u st h u r i n g i e n s i s ( b t ) i saf a s c i n a t i n gb a c t e r i u m ，p r o d u c i n gan u m b e ro f t o x i n sw h i c hh a v es p a w n e daw h o l ei n d u s t r ya n df o r m st h eb a s i so fo v e r9 0 o f a l lb i o p e s t i c i d e sc u r r e n t l ys o l da r o u n dt h ew o r l d b th a sb e e ni nc o m m e r c i a lf o r o v e r6 0y e a r s f o rm a n yy e a r s ，i tw a sr e g a r d e da sa “s a f e ”b i o p e s t i c i d e ，谢t l l t o x i c i t yl i m i t e d t oaf e w l e p i d o p t e r aa n dn oi n d i c a t i o n s o fm a m m a l i a no r n o n - t a r g e ti m p a c t s b u tk n o w l e d g eo fb th a dr a p i d l ya d v a n c e d ；e a c hy e a rn e w s t r a i n sa n dt o x i n sh a v eb e e ni d e n t i f i e da n dt h ew h o l ep i c t u r eo fw h a tc o n s t i t u t e sb t h a sb e c o m em o r ec o n f u s e d w i t ht h ei s o l a t i o no fn e wb ts t r a i n sc 8 1 t l et h e d i s c o v e r yo fb ta c t i v i t ya g a i n s tag r e a t e rr a n g eo fo r g a n i s m s ，w h i c hw o r k e d a g a i n s to n eo ft h eo r i g i n a ls a f e t yt e n e t st h a tb tw a ss p e c i f i ct ol e p i d o p t e r a i na p u r i f i e df o r m ，s o m eo ft h ep r o t e i n sp r o d u c e db yb ta r ea c u t e l yt o x i ct om a m m a l s h o w e v e r i nt h e i rn a t u r a lf o r m ，a c u t et o x i c i t yo fc o m m o n l y - u s e db tv a r i e t i e si s l i m i t e dt oc a t e r p i l l a r s ，m o s q u i t ol a r v a e ，a n db e e t l el a r v a e b ti sc l o s e l yr e l a t e dt ob c e r e u s ，ab a c t e r i u mt h a tc a u s e sf o o dp o i s o n i n ga n dt o 丑a n t h r a c i s ，t h ea g e n to f t h e d i s e a s ea n t h r a x af e ws t u d i e sh a v eb e e nc o n d u c t e do nt h e c h r o n i ch e a l t he f f e c t s ， c a r c i n o g e n i c i t y , o rm u t a g e n i c i t yo f b t p u b l i cc o n c e r no v e rb ts a f e t yi si n c r e a s i n g t h e p r e s e n c e o fh e m o l y s i nh b l a ( h b t a ) ，e n t e r o t o x i nt ( b e e t ) a n d e n t e r o t o x i n ( e n t lg e n e sf r o m4 5s t r a i n so f 丑t h u r i n g i e n s i s ( f r o mb g s c ) a n d l 6 s t r a i n so fb t h u r i n g i e n s i s ( f r o mo u rl a b ) h a v eb e e nd e t e c t e dr e s p e c t i v e l yb y p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ( p c r ) t h er e s u l t ss h o w e dt h a t6 0 b ts t r a i n s o f b g s cc o n t a i n e dh b l ag e n es e q u e n c e s 6 6 7 a n d4 4 7 o ft h e mc o n t a i n e db e e t a n de n tg e n e ss e q u e n c e sr e s p e c t i v e l y t h e s es t r a i n sf r o mb g s ci n c l u d e4 4 h s e r o t y p e s ，4 4s e r o v a r s t h e r e f o r e ，t h ee n t e r o t o x i ng e n e sw e r ep r o v e dp r e s e n t e x t e n s i v e l yi n 且t h u r i n g i e n s i ss t r a i n s s e q u e n c i n ga n da n a l y s i so ft h eh b l a ，b e e t 福建农林大学博士学位论文 5 a n de n tg e n ef r a g m e n to f8 0 1 0s h o w e dt h a tt h ef r a g m e n to f h b l aa n db c e tg e n ei s 9 6 - 9 9 i d e n t i c a lt ot h es i m i l a rg e n eo fb e ，t h ef r a g m e n to fe n tg e n ei s9 4 - 9 9 i d e n t i c a lt ot h es i m i l a rg e n eo f b eo rb a p l a s m i d d n a a n dc h r o m o s o m a l d n a o f 8 0 1 0 w a se x t r a c t e d t od e t e r m i n e t h e l o c a l i z a t i o no fe n tg e n e b o t ho ft h e mw e r eb l o n e do n t oas h e e to fn y l o n m e m b r a n e ( h y b o n dn 十) r e s p e c t i v e l y , a n da l l o w e dt oh y b r i d i z ew i t h ap r o b e s p e c i f i c t oe n t g e n e t h er e s u l t i n d i c a t e dt h a te n tg e n eo f8 0 1 0i si nt h e c h r o m o s o m e t h eo r fo f e n tg e n ef r o mb t8 0 1 0 ，w b 9 ，t s l 6 ，1 0 7 2a n db e6 a 1h a v eb e e n c l o n e da n ds e q u e n c e d a n a l y s i sb yb l a s to n l i n es h o w e dt h a te n tg e n eo f8 0 10i s v e r y h i g hh o m o l o g o u sw i t ht h ek n o w ne n t e r o t o x i ng e n eo fbc e r e u sa n d 丑 a n t h r a c i s t h ep r e d i c t e da m i n oa c i ds e q u e n c eo ft h e s eb ts t r a i n sw a sa n a l y z e dt o u n d e r s t a n dt h ep r o t e i n t h er e s u l ts h o w e dt h a tt h en t e r m i n a lp o r t i o n ，w h i c h c o n s i s t so f2 6a m i n oa c i dr e s i d u e s ，a p p e a r e dt ob eas i g n a lp e p t i d es e q u e n c e ；t h e p r o t e i n h a sa r e p e a t i n g g i n t h r s e q u e n c e a r o u n dr e s i d u e 4 0 s e q u e n c e c o m p a r i s o n sr e v e a l e dt h a tt h e r ei sh j 【g hh o m o l o g o u sb e t w e e n4b ts t r a i n sa n db c c x 5 t h em a i nd i f f e r e n c eb e t w e e n8 0 1 0a n db ec x 5i st h a tt h e r ea r e4a m i n oa c i d s ( g l n - t h r - g l n t h r ) d e l e t e da r o u n dr e s i d u e4 0i nt h ep r o t e i no f8 0 1 0a n ds e v e r a l a n o t h e ra m i n oa c i d sa d d e di nt h ep r o t e i no f b cc x 5 f o u rs t r a i n s ，h d 2a n dh d 9 ，w h i c ha r eh j g he n t e r o t o x i na c t i v i t yt e s t e dw i t h t o wc o m m e r c i a l l ya v a i l a b l ek i t ( b e c t - r p l aa n dv i as l i s a ) ，b tw b 9a n db c 6 a 1w e r eu s e df o rr a ta c u t eo r a lt o x i c i t yt e s t i n gw i t hh i g hd o s e so ff e r m e n tf i l t e r t h er e s u l ts h o w e dt h a tt h e r ew a sn od i s c e m i b l ed i f f e r e n c ei nt h eb e h a v i o ro r c o n d i t i o no fa n yo ft h ea n i m a l sd u r i n gt h et r i a l ，n o ri l l - e f f e c t si np a t h o l o g yo f t h e i r i n t e r n a lo r g a n s i ti sn o tc o n f i r m e dw h e t h e rb te n t e r o t o x i ni ss a f eo rn o t t h e r ea r es t i l ls o m e 福建农林大学博士学位论文6 q u e s t i o n st of u r t h e rr e s e a r c h ，s u c ha st h es e p a r a t i o na n dp u r i f i c a t i o no f e n t e r o t o x i n ， t o x i c i t yt e s t i n gf o rd i f f e r e n ta n i m a l s ，t h ee x p r e s s i o na n dr e g u l a t i o no fe n t e r o t o x i n g e n e i n b t k e yw o r d s ：b a c i l l u st h u r i n g i e n s i s ，e n t e r o t o x i n ，g e n ed e t e c t i o n ，g e n el o c a t i o n ， g e n ec l o n e ，s a f e t y 福建农林大学博士学位论文 第1 章前言 苏云金芽孢杆菌( b a c d l u st h u r i n g i e n s i s 简称b t ) 是一种昆虫病原细菌，因 其产生的毒素对多种害虫有特异的毒杀作用而发展成为一种成功的微生物杀 虫剂，广泛用于农林及卫生害虫的生物防治。b t 商业化应用已有6 0 多年的历 史，多年以来，b t 制剂一直被认为是安全的生物杀虫剂，因为最初认为它仅 对鳞翅目昆虫有毒性，而对哺乳动物和非靶标生物无毒。但是，b t 的发展很 快，每年都有新的菌株和毒素被鉴定出来，其杀虫谱也越来越宽广。现在认 为b t 不仅对无脊椎动物节肢动物门的鳞翅目、双翅目、鞘翅目、直翅目、膜 翅目、半翅目、等翅目等1 6 个目有毒性。还对线性动物门、原生动物门、扁 形动物门中的有些种类有杀虫活性( r a j a m o h a ne t a l ，1 9 9 8 ) 。这对“b t 仅对 鳞翅目昆虫有毒性”的安全性基础产生了很大冲击。b t 转基因作物已大量商 品化种植，快速发展的转基因植物引发了几次有关转基因食品安全性的全球 大讨论，加深了公众对安全与风险的理解。对b t 制剂的安全性也有了新的认 识，媒体开始置疑b t 对于哺乳动物和环境是否真的没有负面影响，原来那些 呼吁用b t 制荆全面替代化学农药的组织，现在也开始声明b t 的安全性的确 需要进一步的评价( t r a v i s ，2 0 0 0 ) 。最近，有关芽孢杆菌对哺乳动物的病原 性的关注越来越多，部分是因为其中有些种类会引起人类不同的感染。蜡状 芽孢杆菌( b a c i l l u sc e r e u s 简称b e ) 以前被认为与炭疽杆菌相比是无毒的， 但最近认为它能引起中度食物中毒及伤口感染( d r o b n i e w s k i ，1 9 9 3 ) ，是人 和动物的条件致病菌。而且b t 与作为病原菌的b c 在形态、生理及基因组等 很多方面具有高度的相似性。随着对b t 毒素研究的深入，近年发现b t 含有 福建农林大学博士学位论文 与b c 的肠毒素与溶血素具有很高的同源性的可能对人和动物有害的溶血素 及肠毒素等，这对b t 的安全性提出了新挑战。 1 苏云金芽孢杆菌概述 1 1 分布与分类 苏云金芽孢杆菌是一种土壤细菌，在伯杰氏细菌鉴定手册第九版中 被列为第二类第十八群，革兰氏阳性，芽孢杆菌属的一种( 中国科学院微生 物研究所，1 9 8 4 ) 。1 9 0 1 年，日本细菌学家石渡( s i s h i w a t a ) 从患病的家蚕幼 虫上得到了一种杆状芽孢细菌，并在1 9 0 5 年发表的另一报告中称之为“猝倒 芽孢杆菌”。但直到1 9 1 1 年b e r l i n e r 从德国苏云金地区谷仓中患病的地中海 粉螟幼虫体内分离到另一株类似的细菌之后，1 9 1 5 年才正式将此昆虫病原细 菌命名为苏云金芽孢杆菌( b a c i l l u s t h u r i n g i e n s i s ) 。1 9 3 8 年，第一个苏云金芽 孢杆菌商品制剂s p o r e i n e 在法国问世，并在地中海粉螟的防治中得到了应用 ( 戴莲韵等，1 9 9 7 ：鲁松清，1 9 9 9 ) 。 b t 广泛分布于世界各地，从热带雨林到北极冻土带，从昆虫尸体、植物 表面、贮藏物或尘埃、污水到土壤中都有b t 存在，而土壤为微生物的大本营， 是其分布最为丰富的生境。据估计，目前世界上已有6 0 0 0 0 余个b t 分离株 ( b o u c i 8 sa r i dp e n d l a n d ，1 9 9 8 ) 。 苏云金芽孢杆菌的分类主要根据鞭毛抗原的血清型和生理生化特性的不 同进行亚种的划分，由于无鞭毛亚种的出现，人们又采取了营养细胞的酯酶 型，作为辅助分类方法。一些新的分类方法如r a p d 、a p p c r 等已应用于b t 和蜡状芽孢杆菌分类中( 李扬等，1 9 9 6 ) 。自1 9 6 2 年开始用鞭毛抗原的血清学 反应将苏云金芽孢杆菌划分为6 个血清型以来，1 9 7 2 年又将其分为1 2 个血清 立塑! ! ! ! 坠兰塑主兰垡笙苎 9 型，1 5 个血清亚种；1 9 8 1 年为1 9 含血清型，2 5 个血清亚种；1 9 9 2 年为3 4 个血清型，4 3 个血清亚种；1 9 9 4 年为4 0 个血清型，5 4 个亚种；1 9 9 6 年为5 5 个血清型，6 8 个血清亚种；目前有8 2 个血清型，8 4 个血清亚种( 表i i ) ( 喻 子牛，1 9 9 0 ：关雄，1 9 9 7 ：戴莲韵等，1 9 9 7 ：l e c a d e te t 占，1 9 9 9 ) ，其中 1 0 个血清型亚种来自于中国( 李长友，2 0 0 1 ) 。 表1 1 苏云金芽孢杆菌的血清型及其皿种( z e i g l e r ，私人通讯) t a b1 1b ts e r o t y p e sa n ds u b s p e c i e s a l e s t i 3 a ，3 c a m a g f e n s f s2 9 a n d a o u s y e n s i s s 黾 日s t u r e e n s i s 5 3 a z o r e n s l s 6 4 如l e a r i c a 4 8 b r a s i l e n s f s3 9 c a 扭e t o u n 3 2 c a n a d e n s e s 5 a ，5 c c h a n p a y s y s4 6 c o l m e r i 2 1 c o r e a n e n s y s 2 5 d a k o t a 1 5 d a 吻s t a d i e n s y s l o a ，i o b o n t o m o c i d u s s u b t o x i c u s6 f i n i t i m u s 2 f u h u o k a e n s i s 3 a 3 d ，3 e g a l l e r i a e 5 a ，5 b g r a c i o s o 目s i s6 6 g u i y a n g i e n s i 4 3 m g o4 4 m o b t e r r o y m o r r i s o n f m u j u n a v a r r e n s s n e o e o n e n s # s n i g e r i e n s i s n o v o s i b i r s k o s t r i n i a e o s m a l d o c r u z i p a k i s t a n i p a m a n y o l e n s i s p i n g l u o n s i s p i r e n a i c a p o l o m e n s i s p o n d i c h e r i e n s i s p u l m e n s i s n o n g s e n i r o s k i l d e n s i s s e o u l e n s j s s h a n o n g i e n s f s s i l o 2 8 a ，2 8 b 8 a 。8 b 4 9 5 0 2 4 a ，2 4 b 8 b 8 d 2 4 a ，2 4 c 8 a ，8 c 3 8 1 3 0 b 6 0 5 7 5 4 2 0 a ，2 0 c 6 5 5 6 4 5 3 5 2 2 2 6 福建农林大学博士学位论文 h u a z h o n g e n s i s i b e r c a i n d i a n a i s r a e l e n s i s j a p o n e n s i s j e g at h e s a n j i n g h o n g i e n s i s k e n y a e k i m k o n k u k i a n k u m a m t o e n s i s k u r s t a k i k y u s h u e n s i s l e e s i s o n d r i n a m a l a y e n s i s 4 0 5 9 1 6 1 4 2 3 2 8 a 。2 8 c 4 2 4 a ，4 c 5 2 3 4 1 8 a 1 8 b 3 a ，3 b ，3 c 1 1 a 1 1 c 3 3 l o a ，l o c 3 6 s o o n c h e o n s o t t o d e n d r o l i m u s s u m i y o 曲i e n s i s s y l v e s t r i e n s i s t h o m p s o n l t h u r i n g i e n s i s r o c h i g i e n s i s t o g u c h i n i t o h o k u e n s ：s t o l w o r t h i t o u m a 3 7 0 f f i v a z e n s i s r at i s l a v i e n s i s w u h a n e n s i s x i a g u a n g i e n s i s y u n n a n e n s ，s z h a o d o n g e n s i s 4 l 4 a ，4 b 3 a 3 d 6 1 1 2 1 1 9 3 1 1 7 9 1 1 a 1 1 b 6 7 4 7 n o n e 5 1 2 0 a 。2 0 b 6 2 随着研究的深入，人们一方面在系统完成某国家、某地区和某气候带的 b t 资源调查，另一方面也侧重于极端生态环境( 如海洋、极地等) 中b t 菌株 的分离( i r i a r t ee l a l ，1 9 9 8 ；k i me t a l ，1 9 9 8 o h b a e t a l ，2 0 0 0 ；m a e d ae t a l ， 2 0 0 1 ) ，因此，随着新的b t 菌株的分离，新的血清型及亚种也会被鉴定出来， b t 的种类将会越来越多。 1 2 作用方式与活性谱 苏云金杆菌的侵染方式是“病从口入”，毒素通过胃毒作用使昆虫致死。 除了毒素对敏感昆虫造成毒血症外，该菌还可以由消化道侵入到昆虫体腔中， 通过大量繁殖而引起败血症。b t 能产生对多种昆虫或其他无脊椎动物有害的 毒素，这些毒素是苏云金芽孢杆菌杀虫的核心，有的是蛋白质，有的是小分 福建农林大学博士学位论文 子物质；有的在细菌营养生长期产生，有的在芽孢形成期产生；有的分泌到 细胞外，有的贮存在细胞内。目前已知的b t 毒素大致可分为4 类：( 1 ) 杀虫晶 体蛋i ! i ( i n s e c t i c i d a lc r y s t a lp r o t e i n s ，i c p s ) ，也称6 内毒素( d e l t a - e n d o t o x i n ) ， 于芽孢形成期在菌体的端或两端形成。b t 的杀虫力大多或完全依赖于i c p s ( 依昆虫而定) ( s c h n e p f e t a ，1 9 9 8 ) ，它的形状、结构和大小均与其毒力有 着密切关系：( 2 ) 苏云金素，亦称b 外毒素，热稳定外毒素，是部分苏云金芽 孢杆菌分泌到体外的具有热稳定性和广谱杀虫作用的一类核苷类物质，对蝇 类幼虫、夜蛾科和鞘翅目害虫有很好的毒杀作用：( 3 ) 芽孢，既是病原，又是 毒素，当中肠受伴孢晶体损伤后，活芽孢便萌发成营养体，穿透肠壁进入血 液，并在那里大量繁殖，使害虫患败血症死亡；( 4 ) v i p s ( v e g e t a t i v ei n s e c t i c i d a l p r o t e i n s ) ，b t 营养生长期分泌的一种很有应用前景的杀虫蛋白。它从对数生长 中期开始分泌，直到稳定前期达到最高峰( e s t r u c he t a l ，1 9 9 6 ：w a r r e n e t a l ， 1 9 9 8 ) 。 自2 0 世纪初发现b t 对节肢动物f q ( a r t h r o p o d a ) q b 的鳞翅目( l e p i d o p t e r a ) 昆虫有活性以来，一直把它局限在这个目的范围之内。1 9 7 7 年发现对双翅目 ( d i p t e r a ) 的蚊和蚋有活性以后，打破了人们固有的观念，也启迪人们去筛 选有新活性的菌株。1 9 8 3 年发现了对鞘翅目( c o l e o p t e r a ) 有活性的菌株，继 而发现了对螨类( a c a r i n a ) ( 1 9 9 0 ) 、虱目( s i p h o n a p t e r a ) ( 1 9 9 3 ) 、同翅目 ( h o m o p t e m ) ( 1 9 9 3 ) 、膜翅目( h y m e n o p t e m ) ( 1 9 9 3 ) 、直翅目( o r t h o p t e r a ) ( 1 9 9 4 ) 和毛蠓科( p s y c h o d i d a e ) 等1 6 个目的昆虫有活性的菌株。伴孢晶体 蛋白的生物活性还不仅仅局限在节肢动物门中。1 9 8 8 年发现了对线形动物门 ( n e m a t o d a ) 中动植物寄生线虫有活性的菌株；1 9 8 9 年发现了对原生动物门 ( p r o t o z o a ) 中的鞭毛虫、变形虫和草履虫等有活性的菌株：1 9 9 0 年发现了对 福建农林大学博士学位论文 扁形动物门( p l a t y h e l m i n t h e s ) 扁虫( t r e m a t o d a ) 中的吸虫有效的菌株。这样， 已发现b t 的伴孢晶体蛋白至少对无脊椎动物中4 个门和节肢动物门中1 6 个 目3 0 0 0 种的有害生物有活性( g l a r ee ta 1 ，2 0 0 0 ) 。 1 3 工业化生产 b t 制剂与化学农药相比，具有对人畜安全、杀虫谱特异、成本低、作用 方式完全不同于现有的化学农药、害虫不易产生抗性、易于工业化生产及不 污染环境等优点，在农业、林业和卫生害虫的防治上得到了广泛应用。b t 制 剂是全球应用最广泛的生物杀虫剂，占全球生物农药总销量的9 0 以上 ( p o w e l la n dj u t s u m ，1 9 9 3 ) 。许多国家如美国、日本、比利时、法国、英国、 瑞士、德国、中国等纷纷投入大量人力、物力竞相研究和开发。目前美国的 d up o n t 公司、e c o g e n 公司、m o n s a n t o 公司、b m t 公司、a b o t t 制药公司、 m y c o g e n 公司、日本的东亚合成化学公司、住友化学药品公司、盐野义制药 公司、协和发酵工业公司、大冢化学药品公司、日本农药公司、日本烟草公 司、久保田公司、德国的拜耳公司、比利时的生物化学制品公司以及丹麦的 n o v o 公司等都加入到研究与开发b t 的行列中。1 9 9 8 年初，已有近2 0 0 种b t 产品登记注册，涉及到1 0 多个b t 血清亚种，其中主要有b t k ( b tk u r s t a k i ) 、 b t i ( b ti s r a e e n s i s ) 、b t a ( b ta i z a w a i ) 、b t m ( b tm o r r & o n i ) 、b t t ( b t t e n e b r i o n i s ) 等( s e h n e p fe ta 1 1 9 9 8 ；n a k a m u r aa n dd u l m a g e ，1 9 9 8 ) 。代表 性的b t 制剂主要有d i p e l 、f o r a y 、t h u r i e i d e ( 肌k u r s t a m ) ；v e c t o b a c 、m o s q u i t o a t t a c k 佃ti s r a e l e n s 括) 及m t r a k ( b t f p n e b r i o n m ) 等。1 9 8 5 - - 1 9 9 5 年，北美广泛 应用b t k 制剂防治舞毒蛾( l y m a n t r i ad i s p e r ) 和云杉卷叶蛾( c h o r i s t o n e u r a 加加i f e r a n a ) 等森林害虫。据估计，在美国东部应用b t k 制剂防治舞毒蛾的面积 福建农林大学博士学位论文 达到1 7 0 万h a ( r e a r d o na n dw a g n e r ，1 9 9 5 ) ，在加拿大的安达略湖，1 9 8 5 - - 1 9 9 4 年间加拿大应用b t k 制剂防治舞毒蛾的面积约有2 5 万h a ( c h a r e s t1 9 9 6 ) 。 另外，b t 制剂在中国、澳大利亚、俄罗斯及新西兰等国也有广泛的应用。 2 苏云金芽孢杆菌的活性成分 b t 包含了各种类型的菌株，每一种都含有不同类型和数量的毒素，这些 毒素是苏云金芽孢杆菌杀虫的核心，有的是蛋白质，有的是小分子物质；有 的在细菌营养生长期产生，有的在芽孢形成期产生；有的分泌到细胞外，有 的贮存在细胞内。主要有6 一内毒素，包括c r y 蛋白和c y t 蛋白；外毒素， 包括口一外毒素、1 3 一外毒素、y - # f 毒素和不稳定外毒素；溶血素、非溶 血素及肠毒素等。近些年又发现其营养期产生的杀虫蛋白v j p ( v e g e t a t i v e i n s e c t i c i d a lp r o t e i n ) 蛋白。正因为苏云金芽孢杆菌产生大量的各种类型的毒素， 才使它具有杀虫活性。但是，在某些条件下，有些毒素对非靶标生物也有一 定毒性。 2 16 一内毒素 6 一内毒素又称伴孢晶体、晶体毒素，是使害虫致死的主要毒素。它形 成于芽孢形成期，晶体在孢子成熟、细胞裂解后释放到环境中。敏感昆虫吞 食了这些晶体后，晶体在昆虫碱性肠液中溶解，被中肠内蛋白酶水解，转变 成为6 5 - - 7 0 k d 带有n 一末端的具有杀虫活性的毒性多肽分子。毒素与昆虫 中肠上皮细胞表面的特异受体结合，在细胞膜上形成孔洞，干扰细胞的渗透 平衡，并引起细胞肿胀甚至裂解，从而导致昆虫幼虫停止进食而最终死亡( 喻 子牛，1 9 9 0 ) ，截止到2 0 0 5 3 ，已分离到3 1 5 个杀虫晶体蛋白基因( f u l ll i s to f d e l t a - e n d o t o x i n s h t t p ：w w w 1 i f e s c i s u s s e x a c u k h o m e n e i l c r i c k m o r e b t t o x i n 福建农林大学博士学位论文 s 2 h t m l ) 。敏感昆虫主要有鳞翅目、双翅目和鞘翅目的幼虫，但不是所有的 晶体对这三个目中的所有种都有毒效。 c r y 蛋白的研究广泛而深入，其特异的化学性质和独特的作用机制，以 及人和哺乳动物消化器官的酸性环境，使得c r y 蛋白具有高度的安全性，大 量的对非靶标生物的试验也证明了这一点，这也是b t 大规模应用的基础。 c y t ( c y t o l y s i n s ) 蛋白又称溶细胞毒素，首先在苏云金芽孢杆菌以色列亚种 ( b a c i l l u st h u r i n g i e n s i ss u b s p i s r a e l e n s i s ，简称b t i ) 的伴胞晶体中被发现 ( g u e r c h i c o f f e ta 1 ，2 0 0 1 ob t i 所产生的伴胞晶体由多种杀虫晶体蛋白构成， 其中包括有4 种c r y 蛋白，分子量在7 2 1 3 4 k d 之间。除此之外，还存在一 种蛋白，这种蛋白分子量较小，仅有2 7 k d 左右，并且与c r y 蛋白没有多大 的同源性。尤其不同于c r y 蛋白的是，这种蛋白具有广泛的溶细胞活性，在 体外能够引起无脊椎动物和脊椎动物的细胞发生溶解，甚至能引起高等哺乳 动物红细胞的溶解，即具有溶血活性。因此，它被称之为