（动物营养与饲料科学专业论文）溶菌酶在肉鸡中的应用及作用机制研究.pdf

i i l j i l l l i l l i l l l l l l l l l i l l l l l l 硼 y 17 9 9 6 5 7 华中农业大学学位论文独创性声明及使用搜权书 学位论文 彳 如需保密，解密时间年月日 是否保密 r 一7 。 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他入已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书 而使用过的材料，指导教师对此进行了审定与我一同工作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意 研究蚴：刁嚼 时高：劲，。年多日 学位论文使用授权书 。 本人完全了解华中农业大学关于保存、使用学位论文的规定，即学生必须按照学 校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印刷版和电子版， 并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位 论文本人同意华中农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全 部或部分内容，同时本人保留在其他媒体发表论文的权力 注：保密学位论文( 即涉及技术秘密、商业秘密或申请专利等潜在需要提交保密的论 文) 在解密后适用于本授权书 黼张嘶锄娩搠结 签名日期：y 9 年矽印? j 日 签名日期：沙p 年f 月2 磊 注t 请将本表直接装订在学位论文的扉页和目录之间 溶菌酶在肉鸡中的应用及作用机制研究 目录 摘要i a 】j l s t r a c t i i 缩略语i i i 第一章文献综述1 l 溶菌酶简介。1 1 1 来源1 1 2 分类1 2 溶菌酶的作用机制2 2 1 直接杀菌机制2 2 2 非溶菌机制3 2 3 部分微生物对溶菌酶的敏感性4 2 4 溶菌酶的改性研究4 3 溶菌酶生产及定量方法6 3 1 生产方法6 3 2 定量方法7 4 相关的应用研究7 4 1 安全性研究7 4 2 稳定性8 4 3 在医疗行业中应用9 4 4 在食品行业中应用1 0 4 5 在饲料行业中应用1o 4 6 其它应用12 5 本试验研究目的、内容。1 2 5 1 研究目的1 2 5 2 研究内容l3 第二章溶菌酶对肉鸡肠粘膜形态、微生物数量及血氨浓度的影响1 4 l 材料与方法1 4 1 1 试验动物1 4 1 2 试验日粮1 4 1 3 试验分组l5 1 4 饲养管理l6 华中农业大学2 0 1 0 届硕士研究生学位论文 1 5 样品收集及处理16 1 6 指标检测方法1 6 1 7 主要仪器l7 1 8 数据分析1 7 2 结果与分析18 2 1 溶菌酶对4 2 d 肉鸡肠粘膜形态的影响。1 8 2 2 溶菌酶对4 2 d 肉鸡十二指肠食糜微生物数量的影响。1 8 2 3 溶菌酶对4 2 d 肉鸡空肠食糜微生物数量韵影响。1 9 2 4 溶菌酶对肉鸡血氨浓度的影响1 9 3 讨论2 0 3 1 溶菌酶对肉鸡肠粘膜形态的影响2 0 3 2 溶菌酶对肉鸡肠道微生物数量的影响。2 0 3 - 3 溶菌酶对肉鸡血氨浓度的影响。2 l 4 小结2 2 第三章溶菌酶对肉鸡免疫机能及i g f 1m r n a 表达的影响2 3 1 材料与方法2 3 1 1 试验动物2 3 1 2 试验日粮及分组2 3 1 3 饲养管理。2 3 1 4 样品收集及处理。2 3 1 5 主要试剂及仪器。2 4 1 6 指标检测方法。2 4 1 7 数据处理2 6 2 结果与分析2 6 2 1 溶菌酶对肉鸡免疫器官指数的影响2 6 2 2 溶菌酶对4 2 d 肉鸡血清新城疫抗体效价的影响2 6 2 3 溶菌酶对肉鸡细胞免疫因子的影响2 7 2 4 溶菌酶对肉鸡i g f 1m r n a 表达量的影响。2 7 ：；讨论：1 8 3 1 溶菌酶对肉鸡机体和体液免疫的影响2 8 3 2 溶菌酶对肉鸡细胞因子的影响一2 9 3 3 溶菌酶对肉鸡i g f 1m r n a 表达的影响3 0 4 ，j 、! 墙：；l 第四章溶菌酶对肉鸡养分利用率及生长性能的影响3 2 溶菌酶在肉鸡中的应用及作用机制研究 1 材料与方法3 2 1 1 试验动物。3 2 1 2 试验日粮及分组3 2 1 3 样品收集及处理3 2 1 4 指标检测方法3 2 1 5 数据统计分析3 3 2 结果与分析3 3 2 1 溶菌酶对肉鸡营养物质利用率的影响3 3 2 2 溶菌酶对肉鸡生产性能的影响。3 3 3 讨论3 5 3 1 溶菌酶对肉鸡营养物质表观利用率的影响3 5 3 2 溶菌酶对肉鸡生产性能的影响3 5 4d 、结3 6 第五章结语3 7 参考文献3 8 致谢4 8 附勇乏4 9 切片制作程序4 9 切片图片5 0 培养基组成5 l 溶菌酶确：肉鸡中的应用及作用机制研究 摘要 本试验旨在探讨溶菌酶对肉鸡生产性能的影响并简要探讨其作用机制。通过与 抗生素作比较，选择肠道粘膜绒毛高度、隐窝深度、食糜微生物数量、血氨浓度、 免疫机能、组织i g f - im r n a 表达量、养分利用率及生产性能作为评价溶菌酶效果 的指标。试验分对照组、抗生素组及2 个剂量( 1 5 0g 厂r 和3 0 0g t ) 溶菌酶组，饲 喂玉米豆粕型粉料，自由采食和饮水，分两阶段地面平养。试验结果如下： ( 1 ) 与对照组相比溶菌酶可改善肉鸡十二指肠及空肠肠粘膜绒毛高度及隐窝深 度，有利肉鸡肠道健康；溶菌酶可减少肉鸡十二指肠、空肠内容物大肠菌类和梭菌 的数量( 氏o 0 1 ) ，对双歧杆菌和乳酸菌无明显影响( 胗0 0 5 ) ；溶菌酶可极显著降 低肉鸡血氨浓度( 尸 0 0 5 ) 。 ( 2 ) 与对照组相比，溶菌酶在一定程度上降低肉鸡免疫指数和新城疫抗体水平； 每吨配合饲料添加3 0 0 9 溶菌酶可显著降低脾脏i l 1 pm r n a 水平( 尸 o 0 5 ) 。 ( 3 ) 与对照组相比，不同添加量溶菌酶可分别提高肝脏i g f - im r n a 水平1 2 5 和1 0 4 ( 尸 o 0 5 ) ，对胸肌i g f - 1m r n a 水平有提高的趋势，但无显著差异( 胗0 0 5 ) 。 ( 4 ) 与对照组相比，溶菌酶对各阶段( 0 3 w 、4 6 w 及0 - 6 w ) 肉鸡平均日采食 量无显著影响( 胗o 0 5 ) ；每吨配合饲料添加3 0 0 9 溶菌酶对0 - 3 w 及4 6 w 两阶段肉 鸡的平均日增重均有显著提高( p o 0 5 ) ；整个试验阶段溶菌酶均极显著提高了肉鸡 平均日增重和料重比( p o 0 1 ) ，使用溶菌酶与使用抗生素在平均日采食量、日增重 及料重比方面未表现出明显差异( 胗o 0 5 ) 。 综合各试验指标表明，饲料中添加溶菌酶可以得到与抗生素相同的抗茵促生长 的效果，可以代替抗生素在肉鸡日粮中应用。 关键词：肉鸡；溶菌酶：食糜微生物；免疫指标；i g f - 1m r n a ；养分利用率 华中农业大学2 0 1 0 届硕士研究生学位论文 a bs t r a c t t h i sr e s e a f c ha i m e dt os t u d yt h ee f f e c ta n dt h em e c h a n i s mo fl y s o z y m ef e dt ob r o i l e r s t h em i c r o - o r g a n i s mc o u n t so ff r e s hd i g e s t aa r ea n a l y z e da si n d e x ，a n dt h er e s p o n s eo f r e l a t i v em r n ae x p r e s s i o no fs p l e n i ce y t o k i n e ，i g f - 1a n dt h ep e r f o r m a n c et ol y s o z y m e a n da n t i b i o t i c sa l ea l s oi n v o l v e di nt h i ss t u d y t h ee x p e r i m e n tc o n s i s to f4g r o u p si n w h i c ht h eb r o i l e r sw e r ef e db a s a ld i e t s ，b a s a ld i e t sw i t ha n t i b i o t i c sa n db a s a ld i e t sw i t h d i f f e r e n td o s a g e so fl y s o z y m er e s p e c t i v e l y ，a l lb r o i l e r sh a du n r e s t r i c t e da c c e s st o e x p e r i m e n t a ld i e t sa n dw a t e rt h r o u g h o u tt h ee x p e r i m e n t t h er e s u l t ss h o w e dt h a t ： ( 1 ) t h ef r e s hd i g e s t af r o mt h et r e a t e dg r o u ph a dl e s sm i c r o o r g a n i s mc o u n t ss u c ha s t h ec l o s t r i d i u ma n dc o l i f o r m st h a nc o n t r o lg r o u p v i l l o u sh e i g h to ft h eb r o i l e r sf e dw i t h l y s o z y m ea n da n t i b i o t i c sb e c o m eh i g h e rt h a nt h ec o n t r o lg r o u pa n dt h ec r y p td e p t h b e e o m e nd e e p e r ，w h i c hm e a nt h a tt h el y s o z y m ec o u l di m p r o v et h ei n t e s t i n a lh e a l t ho f b r o i l e r su n d e rt h ee x p e r i m e n t a ls i t u a t i o n t h el y s o z y m ea n da n t i b i o t i ca l s od e c r e a s et h e p l a s m ac o n c e n t r a t i o n so fa m m o n i a i nb r o i l e ri n4 2 加d a y ( p 0 0 5 ) ( 4 ) t h e l y s o z y m ea n da n t i b i o t i cd i dn o ta f f e c tt h ea p p a r e n td i g e s t i b i l i t yo f d i f f e r e n t n u t r i e n ti n4 2 d o l db r o i l e r s ( p 0 0 5 ) ，t h es a m ea st h ea d f i ( 尸 o 0 5 ) ，b u tt h el y s o z y m e i m p r o v et h ea d ga n dl o wt h ef gd u r i n gt h e4 2 de x p e r i m e n t c o m p a r e dw i t ht h ec h i c k s f e da n t i b i o t i c s ，t h ec h i c k sf e dl y s o z y m ed i dn o ts h o ws i g n i f i c a n td i f f e r e n c e si nt e r m so f f i n a lp e r f o r m a n c e ( 胗0 0 5 ) g e n e r a l l y ，t h er e s u l t sf r o mt h ee x p e r i m e n td e m o n s t r a t e dap o t e n t i a lo fl y s o z y m et o b eu s e da sas u b s t i t u t ef o ra n t i b i o t i c si nb r o i l e rd i e t s k e y w o r d s ：b r o i l e r s ，l y s o z y m e ，d i g e s t am i c r o - o r g a n i s m , i m n l u n ef u n c t i o n , i g f - l m r n a ，a p p a r e n td i g e s t i b i l i t yo fn u t r i e n t i l 溶菌酶在肉鸡中的应用及作用机制研究 缩略语 a b b r e v ia i t i o n s 英文缩写英文全称中文全称 a b b r e v i a t i o n s f u l le n g l i s hn a m ef u l lc h i n e s en a m e c d n a c f u d e p c d n l l p e d l a g h h e h l v 胁1 尼1 l p s m r n a n a g n a m p i a g e p r v 巾m r t - q p c r c o m p l e m e n t a r yd n a( 与r n a ) 互补的d n a c o l o n yf o r m i n gu n i t s 菌落形成单位 d i e t h y lp y r o c a r b o n a t e 二乙基焦磷酰胺 d e o x y r i b o n u c l e o s i d et r i p h o s p h a t e 三磷酸脱氧核( 糖核) 苷 e t h y l e n e d i a m i n et e t r a a c e t i ca c i d乙二胺四乙酸 g r o w t hh o r m o n e生长激素 h e m m o x y l i na n de o s i n苏木精和伊红 h u m a n i m m u n o d e f i c i e n c yv i r u s e s 人类免疫缺陷病毒 i n s u l i n l i k eg r o w t hf a c t o rl 胰岛素样生长因子l i n t e r l e u k i n 1 白细胞介素1 l i p o p o l y s a c c h a r i d e脂多糖 m e s s e n g e rr i b o n u c l e o t i d ea c i d信使核糖核酸 n - a c e t y lg l u c o s a m i n e n o 乙酰葡萄糖胺 n - a c e t y lm u r a m i ca c i d n - 乙酰胞壁酸 p o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s聚丙烯酰胺凝胶电泳 p s e u d o r a b i e sv i r u s 伪狂犬病病毒 r e v o l u t i o n sp e rm i n u t e 每分钟转数 r e a l - t i m eq u a n t i t a t i v e p o l y m e r i c 实时定量聚合酶链式反应 c h a i nr e a c t i o n s i g a s e c r e t e di m m u n o g l o b u l i na 分泌型免疫球蛋白 t n f - at u m o rn e c r o s i sf a c t o ra 肿瘤坏死因子 s ds t a n d a r dd e v i a t i o n 标准差 i i e l j n t e s t i n a li n t r a e p i t h e l i a l 肠上皮内淋巴细胞 l y m p h o c y t e 1 1 1 溶菌酶在肉鸡中的应用及作用机制研究 1 溶菌酶简介 1 1 来源 第一章文献综述 溶菌酶的名称来源于1 9 2 2 年，f l e m i n g 发现人的唾液、眼泪中存在一种可溶解 细菌细胞壁的酶，因其具有溶菌作用，命名为溶菌酶。后来发现溶菌酶广泛存在于 人和动物的多种组织、分泌液如眼泪、唾液中，某些植物、微生物中也广泛存在， 例如a u d y 等( 1 9 9 0 ) 对1 1 6 科4 1 0 种植物进行普查发现1 6 8 种植物中含有溶菌酶。 几种物质中溶菌酶的含量见表1 。 表l 不同来源物质溶菌酶的含量 存在部位 s p e c i e s 含量 o c i n t e n t 资料来源 s o u r c e j o h n s o n 等人在1 9 6 5 年首次通过x 射线分析出了溶菌酶的三维结构，它是最早被 测定其三维结构的酶，加上其小分子量，一直以来溶菌酶都作为蛋白研究的模型， 用于研究蛋白质的空间构象、酶动力学及其与分子进化、分子免疫间的关系( j e f f r e y e ta 1 ，1 9 8 1 ) ，及作为蛋白质热力学稳定性研究很好的模型( o h m u r ae ta 1 ，1 9 9 7 ) 。 目前已研究出人溶菌酶基因的克隆及在毕赤酵母中一套完整的表达操作程序( 王颖， 2 0 0 3 ) 。 国际酶学委员会根据其底物及作用特点又称其为酰胺酶或粘肽n - 乙酰基胞壁 酰水解酶，编号为e c3 2 1 1 7 ，与常见的蛋白酶、淀粉酶一样属水解酶系列。 1 2 分类 根据来源，一般将溶菌酶分c 型、g 型、无脊椎动物型、噬菌体、细菌和植物 来源溶菌酶。不同来源酶的分子量、氨基酸组成及酶特性各有不同，但三维结构显 示来源于共同的进化起源( w e a v e re ta l ，1 9 8 4 ) 。 华中农业大学2 0 1 0 届硕士学位论文 例如c 型溶菌酶是由1 2 9 个氨基酸残基组成的一条多肽链，含有4 对二硫键， 三维结构为较紧密的椭球形；g l u 3 5 、a s p 5 2 及t r p 6 2 残基是酶活性必需基团，同时 a s p l 0 1 、a r g l l 4 、t r p l 0 8 等残基对“底物酶复合物”的形成也起着重要作用( m u r a k i e ta l ，1 9 9 7 ) 。它广泛存在脊椎动物如哺乳动物、鸟、爬行动物及鱼类( p r a g e re ta l ， 1 9 9 6 ) 和无脊椎动物如昆虫、甲壳类( h i k i m ae ta l ，2 0 0 3 ；k y l s t e ne ta l ，1 9 8 9 ) ， 它们又可分为2 类：传统的( 即非c a 结合) 和c a 结合，后者发现与鸟类和哺乳动 物在种族发育上类似a 乳白蛋白( n i t t a k ，1 9 8 9 ) 。 2 溶菌酶的作用机制 2 1 直接杀菌机制 一般人认为，溶菌酶能切断肽聚糖中n 乙酰葡萄糖胺和n 乙酰胞壁酸之间的 b 1 ，4 糖苷键，破坏肽聚糖支架，从而细菌细胞在内部渗透压的作用下胀裂而死亡 ( b l a k ee ta 1 ，1 9 6 5 ) 关于其详细作用过程，m a t s u s h i m a 等人( 1 9 6 9 ) 认为催化过程中发生如下反应： 溶菌酶3 5 位的谷氨酸作为质子的供体，把质子传递给糖苷键的o 原子从而切断糖 的c 1 和糖苷的o 原原子间的结合键，使c l 成为碳阳离子，所生成的碳阳离子受 5 2 位的天冬氨酸负电荷的作用而呈稳定状态。由于碳阳离子的生成和0 5 间半氧锚 离子的生成，其糖结构都呈半椅子型，从而糖的c 2 c 1 o c 5 呈良好的平面结构排 列，同时来源于水分子的o h ，受阳碳离子的碰撞，h + 结合在谷氨酸3 5 上，从而完 成水解过程。v o c a d l o 等( 2 0 0 1 ) 也提出过共价催化的机制。 溶菌酶的作用机制的研究为后来酶制剂的机理研究提供了参考。 2 溶菌酶在肉鸡中的应用及作用机制研究 p a t h a r o - n a g n a m o r p a t hb p 镯o 舶捌o 七- h 软， 2 2 非溶菌机制 也有一些学者认为溶菌酶存在非溶菌的机制。l a i b l c 等( 1 9 8 5 ) 认为人溶菌酶的 非溶菌活性是导致细胞膜损伤而不水解肽聚糖，认为自溶素在溶茵酶抗口腔微生物 中发挥重要作用。b r o o k s 等( 1 9 9 1 ) 提出一种观点，溶菌酶在正常生理渗透压平衡 下溶菌酶并不杀灭敏感细菌，其发挥作用是在微生物被其它物质，如卵清蛋白或昆 虫血淋巴中多肽( b o m a n ，1 9 9 1 ) ，或动物血清中的补体( f l c s c h c r ，1 9 9 1 ) 杀死后， 参与去除细胞壁的作用。 h i s h a m 等( 1 9 9 6 ) 研究表明热变性使溶菌酶酶活性降低，但能提高其对阳性菌 的抗菌功能，表明溶茵酶的作用依赖其催化功能。h i s h a m 等在2 0 0 1 年定向诱变蛋 清溶菌酶，即以丝氨酸取代5 2 位的天门冬氨酸后，发现无催化活性，但微生物敏感 试验表明：其与蛋清溶菌酶同样可杀灭金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌，热处理后 3 华中农业大学2 0 1 0 届硕士学位论文 两者都对微生物失活，5 2 位的丝氨酸与单独的肽聚糖的亲和力未受影响，他首次提 供了一些遗传证据，即：溶菌酶的抗菌活性依赖于其胞壁质酶活性，抗菌活性是由 于其结构因素所致。 k t a u s 等( 19 9 8 ) 利用生物物理学技术如傅里叶变换红外光谱学、x 射线衍射及 微量量热法等发现：溶菌酶可通过静电结合内毒素( l p sa n dl i p i da ) 分子的带电基 团，结果导致酰基链僵化和多层结构的转变。溶菌酶结合内毒素后阻止内毒素与巨 噬细胞受体结合，抑制促炎症反应细胞因子的产生。内毒素和溶菌酶结合的摩尔比 值是3 ：1 。 2 3 部分微生物对溶菌酶的敏感性 杨露青等( 2 0 0 3 ) 在比较溶菌酶抑菌作用的检测方法时，曾选择3 种革兰氏阳 性球菌( 金黄色葡萄球菌、白色葡萄球菌和乙型溶血链球菌) 、2 种革兰氏阳性杆 菌( 枯草杆菌和蜡样芽胞杆菌) 、3 种革兰氏阴性菌( 大肠杆菌、奇异变形杆菌、 铜绿假单胞菌) 和1 种真菌( 白色念珠菌) 进行试验，其研究结果表明，相对于革 兰氏阴性菌和真菌的作用，溶菌酶对阳性菌效果较好，主要是阳性菌中溶菌酶的底 物肽聚糖含量较高：达到一定浓度( 2 5 0 0 0u m 1 ) 后，溶菌酶对革兰氏阴性菌也有 一定抑菌效果。 溶菌酶对阴性菌的作用也有报道。如b a r b a r a 等( 2 0 0 1 ) 报道溶菌酶、变性溶 菌酶及其衍生肽在高流体静压下可杀灭阴性菌。r a o 等( 2 0 0 8 ) 研究表明溶菌酶与 c h i t o o l i g o s a c c h a r i d e s ( c o s ) 联用更有效抗阴性菌如大肠杆菌，萤光假单胞菌等，肉品 货架寿命可延长1 5 天。 a g n i e s z k a 等( 2 0 0 6 ) 通过乙酰转移酶( o a c e t y l t r a n s f e r a s e ，o a t a ) ，细菌表层 肽聚糖o 乙酰化后，金黄色葡萄球菌( s t a p h y l o c o c c u sa u r e u s ) 可抵抗溶菌酶。通过 液相色谱及p c r 技术分析发现：只有在致病性的葡萄球菌中的胞壁酸才o 乙酰化( 如 sa u r e u s , se p i d e r m i d i s , & l u g d u n e n s i s 及其它) ，非致病的种属都敏感。将o a t a 基 因转移到敏感种菌中，这种菌也表现出抗性，表明o 乙酰化会导致微生物对溶菌酶 的抗性。 2 4 溶菌酶的改性研究 大部分g 菌对溶菌酶不敏感限制了溶菌酶的广泛使用。近年来研究人员通过大 量实验发现对溶茵酶进行适当改性或蛋白修饰，就可增强其向g 菌肽聚糖层的渗透 能力，溶菌酶即表现出对g 菌的抑制能力。这些研究主要集中于以下两方面： 4 溶菌酶在肉鸡中的应用及作用机制研究 2 4 1 化学修饰法 在溶菌酶的蛋白分子上结合某些含疏水性基团化学物质，如多糖( n a k a m u mc t a l ，1 9 9 2 ) 、脂酞基( h i s h a mc ta l ，1 9 9 3 ；h i s h a mc ta l ，1 9 9 4 ) 、疏水性肽( h i s h a m e ta l ，1 9 9 2 ) 等，增加溶菌酶的乳化能力，可使溶菌酶对g 。细菌具有抑菌作用。 n a k a m u r a 等( 1 9 9 2 ) 合成了一种溶菌酶葡聚糖聚合物，其乳化能力比天然溶菌酶强 3 0 倍。此外，h i s h a m 等( 1 9 9 2 ) 在溶菌酶的c 端接上了疏水性的五肽( p e n t a p e p t i d e ) ， 发现其对e e o l i 的杀菌能力显著提高。h i s h a m 等( 1 9 9 3 ) 发现用棕榈酸、豆蔻酸和硬 脂酸将溶菌酶酯酰化亦可改变溶菌酶对e e o l i 的杀菌能力，并且发现所结合的脂肪 酸的碳链的超长，对e e o l i 的杀菌能力越强。其中棕搁酸酰化的溶菌酶是最有潜力 的抑菌剂。a r i m a 等( 1 9 9 7 ) 研究表明，通过基因修饰即溶菌酶e d n a 的c 端1 2 9 位的l e u连接疏水肽 ( p h e v a l p r o ，p h e p h e v a l a l a p r o 及 p h e p h e v a l a l a 1 i e 1 i e p r o ) ，置入酵母表达载体，发现产物溶菌酶杀灭e c o l i 活性 随肽长度而增加，表明疏水肽在溶菌过程发挥重要作用。同时发现以丙氨酸取代3 5 位的谷氨酸后，溶菌酶消失了催化功能，显示了催化区域对融合了疏水肽的溶菌酶 也至关重要。 2 4 2 热法改性 h i s h a m 等( 1 9 9 6 ) 发现，在8 0 、p h7 2 时，溶菌酶会发生不可逆的变性，加 热3 0 m i n ，通过p a g e 及荧光光谱分析，酶表面疏水性及色氨酸残基增加。加热 2 0 m i n ，酶活性丧失，但其对革兰氏阴性菌ee o l i1 2 杀菌能力增强且有剂量依赖性， 对金黄色葡萄球菌作用无差异，但对革兰氏阳性菌无致死作用。首次提出了溶菌酶 的杀菌作用不依赖其酶活性这一观点，如变性酶溶菌酶二聚物，通过穿过膜也可使 细菌致死。 溶菌酶加热过程中游离s h 基的增加、荧光发射光谱发生变化及色氨酸基团会 暴露于极性环境，说明加热过程中溶菌酶三级构象发生了变化，内部疏水性基团的 外露造成其表面疏水性增强，从而使溶菌酶比较容易透过g 。菌外围的脂多糖层，进 入到其可以作用的肽聚糖层，分解肽聚糖引起细菌的死亡( 汪家琦，2 0 0 0 ) ，这也 是其热法改性的机理。 华中农业大学2 0 1 0 届硕士学位论文 3 溶茵酶生产及定量方法 3 1 生产方法 3 1 1 结晶法 早在1 9 4 5 年a l d e r t o n 等人就用膨土岩吸附和吡啶洗脱从鸡蛋清中得到了收率 高、结晶较好的溶菌酶：他们又改用直接结晶法( g o r d o n ，1 9 4 6 ) ，将含有5 氯化 钠的卵白调至卵白溶菌酶的等电点p h 9 5 ，加入溶菌酶晶种，获得其结晶品。 结晶法操作简单，可应用于卵白溶菌酶结晶品的工业生产，并使产品的成本大 大降低，但也存在一些缺点，如溶菌酶在p h 9 5 的缓冲液中其活性会受影响，同时 该法不能用以分离微量的溶菌酶。 3 1 2 离子交换法( i o n e x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h y ) 离子交换法是利用溶液中各种带电粒子与离子交换剂之间结合力的差异进行物 质分离的技术，具有简便、高效、成本低及可自动化连续操作的优点，因此一直以 来都是溶菌酶生产所常用的方法。l i 等( 1 9 8 6 ) 用d u o l i t e 4 6 4 从蛋清溶液中分离 溶菌酶，可使溶菌酶的回收率高达9 0 ，同时该法适合于连续自动化操作。d u r a n c e 等( 1 9 8 8 ) 也采用d u o l i t e - 4 6 4 从未被稀释的蛋清溶液中可同时分离溶菌酶和抗生素 蛋白。b a y r a m o g l u 等( 2 0 0 7 ) 用壳聚糖甲基丙酸烯离子交换法( c h i t o s a n g p o l y ( m a a ) ) 提取鸡蛋清溶菌酶，效果较好，用h p l c 鉴别纯度达9 4 。林亲录等( 2 0 0 2 ) 采用 树脂纯化溶菌酶，但其得率与酶活都不太理想。 3 1 3 超滤法( u l t r a f i l t r a t i o n ) 超滤技术与传统的生化分离技术相比主要的优点是产品产量高，该技术可以很 好地通过调节系统而获得高产量和高纯度的产品，产品甚至可直接用于临床治疗。 g h o s h 等( 2 0 0 0 ) 报道采用中空纤维超滤系统可从蛋清干粉中分离溶菌酶。溶菌酶 选择性透过膜，而其他大分子的蛋清蛋白质被膜所截留，改进系统的液体动力学可 增加溶菌酶透过量，从而获得较高的收率。c h i a n g 等于1 9 9 3 年报道过使用超滤与亲 和色谱相结合的二步分离纯化方法，效果较好。姜馗( 2 0 0 5 ) 曾研究比较了热处理 法、离子交换法和超滤法从蛋清中提纯溶菌酶的效果，结果表明，热处理法得到的 溶菌酶的纯度和收率远低于离子交换法，采用离子交换法在一定条件下可得到较好 活性和收率的溶菌酶( 1 0 0 纯度和8 6 6 收率) 。 3 1 4 基于亲和力的分离技术 如固定金属亲和层析，是指蛋白质分子能够与金属离子发生亲和反应并与之结 6 溶菌酶在肉鸡中的应用及作用机制研究 合，可吸附纯化蛋白质。i v a n o v 等( 2 0 0 1 ) 报道该法可使蛋清蛋白质的回收率大于 9 5 。再如亲和过滤法( a f f i n i t yf i l t r a t i o n ) ，h e 等( 2 0 0 2 ) 报道采用一个多步亲和过 滤工艺过程纯化溶菌酶可使溶菌酶的产率可从6 1 提高到9 6 。 随着科学技术的发展，预计一些蛋白提取分离技术也将更成熟，新的技术也将 不断出现。 3 2 定量方法 目前报道很多分析方法：如琼脂扩散法、琼脂糖火箭电泳( q i n ，1 9 9 8 ) 、比色 法、共振散射等，不同方法各有优缺点。 在中国，目前溶菌酶的定量都参照2 0 0 5 年中国药典的比浊法，其给定酶单 位的定义为：在2 5 、p h 值为6 2 的条件下，于4 5 0 n m 处每分钟引起溶酶小球菌 体溶液吸光度下降0 0 0 1 所需要的酶量为一个酶活力单位( u ) 。此法应用最广泛， 但其存在低灵敏度，变异系数大等一些缺点。 目前这些方法的理论都基于测定完整细胞或细胞壁悬浊液浊度降低或测定从细 胞壁中游离出来的分解产物含量。但实际上酶的作用底物溶酶小球菌都呈不均匀状 态，即发生的是固液相的反应，如廖问陶等( 2 0 0 7 ) 通过原子力显微镜观察发现， 在试验其他条件一致，仅提高溶菌酶浓度的情况下，得到了差异较大的溶菌试验结 果：溶菌酶酶浓度提高对底物溶壁微球菌的裂解程度反而降低。可能原因是因为随 着蛋白质浓度的提高，在有盐存在的情况下，蛋白分子之间有可能形成聚集体，甚 至结晶析出，溶菌酶作为研究蛋白晶体的一种模式蛋白，对其在盐溶液中结晶和聚 集已有广泛的报道( g e o r g a l i s e ta l ，1 9 9 7 ) 。 上述这些方法都难以准确测定反应速度。在1 9 5 9 年，h a m a g u c h i 等人用水溶性 多糖类物质乙二醇甲壳质( g l y c o lc h i t i n ) 为作用底物测定酶话，确立了以均匀状态 的物质为作用底物测定溶菌酶活性的新方法。t u r n e r 等( 1 9 7 9 ) 建立了人工合成的 着色聚糖底物的比色法，相对准确。这些方法值得目前的研究工作者们借鉴，溶菌 酶的检测方法也还有待进一步探讨。 4 相关的应用研究 4 1 安全性研究 早在1 9 9 0 年意大利和法国在酒类做过溶菌酶的毒性测试，1 9 9 8 年3 月被f d a 认定为g r a s ( g e n e r a l l yr e c o g n i z e da ss a f e ) ，u s d a 认为其成分是安全的，2 0 0 0 年 8 月欧洲批准溶菌酶可以在酒类中使用。 7 华中农业大学2 0 1 0 届硕士学位论文 c e r v e n 等( 2 0 0 8 ) 研究w i s t a r 鼠口服人重组溶菌酶的毒性试验发现，每天每千克 体重按3 6 0 m g 或3 6 m g 饲喂2 8 天，结果发现鼠血液参数及尸体剖检无异常，表明溶菌 酶对鼠是安全的。y a n 等( 2 0 0 8 ) 对海洋微生物来源的溶菌酶的毒性研究实验表明， 给w i s t a r 鼠按1 0 ，o 5 ，0 2 5g k g 体重灌胃溶菌酶9 0 天，l d 5 0 为每千克体重4 5 3 0m g 。 与对照组生理盐水相比，三种剂量的溶菌酶对鼠的血液指标及器官指数无显著差异， 研究中未发现器官的病理变化，结果表明此溶菌酶在给定试验剂量下是安全的。 溶菌酶在饲料行业中对畜禽的毒性研究报道未见，还有待研究。 4 2 稳定性 4 2 1 对温度的稳定性 m a n a s ( 2 0 0 6 ) 研究发现溶菌酶对热比较稳定，1 0 0 下1 1 分钟活性损失不大。 a m a l 等( 2 0 0 4 ) 年研究喷雾干燥生产溶菌酶的稳定性发现其不同处理下贮存活性如 下表。关于喷雾干燥下不同辅料对溶菌酶活性的影响，w e n d y 等( 2 0 0 8 ) 做过研究， 他们发现混合辅料如甘露醇，海藻糖等较单一辅料更好地稳定酶的活性，其原因是 可形成非结晶产物。 表2 溶菌酶不同处理下贮存活性( m 士s d ，n = 3 ，2 0 w ) t a b l e2e n z y m a t i ca e t i v i t yo fl y s o z y m es a m p l e sp o s t - s t o r a r e ( 2 0w e e k s l 处理。p r o c e s s 活性，a e t i v i t y 4 1 22 0 3040 6 0 1 ) 百分数相对于新鲜样； 2 ) p 0 0 5 。p 0 0 0 l ( 资料来源：a m a l ae t a l ，2 0 0 4 ) d a t aa 佗e x p r e s s e d 罄p e r c e n t a g eo f c o r r e s p o n d i n gf r e s hs a m p l