（农药学专业论文）hplcms法对5种中药材中有机磷农药多残留检测研究.pdf

华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文 是否保密 杏 如需保密，解密时间年月 日 ， 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已 经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位 或证书而使用过的材料，指导教师对此进行了审定。与我一同工作的同志对本研究 所做的任何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意。 研究生签名：自畚茹心时间：砂细年石月多日 学位论文使用授权书 本人完全了解“华中农业大学关于保存、使用学位论文的规定”，即学生必须 按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印刷版 和电子版，并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保 存、汇编学位论文。本人同意华中农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传 播学位论文的全部或部分内容。 注：保密学位论文在解密后适用于本授权书。 学位论文作者鲐习域孙鲐艺傣 签名日期：z 形年石月写日签名日期：7 刀f o 年6 月尹日 高效液相色谱串联质谱法检测5 种中药材中有机磷残留量 目录 摘要要。1 a b s t r a c t 2 第一章文献综述5 1 农药残留概述5 1 1 中药材中农药残留研究意义5 1 2 中药材中农药残留种类5 1 3 中药材中农药残留特点6 1 4 农药残留危害8 1 5 国内外限量标准对比8 1 5 1 我国限量标准8 1 5 2 国外限量标准1 0 2 农药残留检测方法1 0 2 1 农药残留前处理技术1o 2 1 1 提取溶剂的选择1 0 2 1 2 提取与净化1 1 2 2 检测技术15 2 2 1 薄层色谱l5 2 2 2 毛细管电泳15 2 2 3 超临界流体色谱1 6 2 2 4 气相色谱1 6 2 2 5 高效液相色谱1 6 第二章栀子中有机磷农药残留量检测18 1 栀子中有机磷农药残留量检测方法1 8 1 1 试验材料18 1 2 仪器与设备18 1 3 试剂与药品1 9 1 4 有机磷农药溶液的配置方法2 0 1 5 试验方法2 0 1 5 1 提取方法2 0 华中农业大学2 0 1 0 届硕士研究生学位论文 1 5 2 净化方法2 0 1 5 3 液质检测分析条件2 0 1 6 定性方法和定量方法。2 2 1 6 1 定性依据2 2 1 6 2 定量方法2 2 2 结果与讨论。2 4 2 1 色谱条件的选择2 4 2 1 1 流动相的选择2 4 2 1 2 流动相流速的确定2 4 2 1 3 色谱柱温度的选择2 4 2 2 质谱条件的选择2 4 2 3 有机磷农药标准物质的色谱图。2 5 2 4 提取溶剂对回收率的影响2 5 2 5 净化方式的选择2 7 2 5 1 活性炭净化对回收率的影响2 7 2 5 2s a x 阴离子交换柱净化2 8 2 5 3c a r b p s a 柱净化31 2 6 线性关系和检出限3 3 2 7 回收率和精密度一3 3 3 小结3 4 第三章高效液相色谱与质谱联用法检测中药材中有机磷农药残留量3 6 1 玄参中有机磷农药的残留检测3 6 1 1 材料与方法3 6 1 2 结果与讨论3 6 1 2 1 线性关系和检出限3 6 1 2 2 回收率和精密度3 7 2 车前草中有机磷农药的残留检测3 8 2 1 材料与方法3 8 2 2 结果与讨论3 8 2 2 1 线性关系和检出限3 8 2 2 2 回收率和精密度：3 9 3 甘草中有机磷农药的残留检测4 0 h 高效液相色谱串联质谱法检测5 种中药材中有机磷残留量 3 1 材料与方法4 0 3 2 结果与讨论4 0 3 2 1 线性关系和检出限4 0 3 2 2 回收率和精密度4 1 4 金银花中有机磷农药的残留检测4 2 4 1 材料与方法4 2 4 2 结果与讨论4 2 4 2 1 线性关系和检出限4 3 4 2 2 回收率和精密度4 3 5 j 、结4 4 第四章中药材样品的基质效应4 5 1 基质效应产生原因4 5 2 基质效应的测定一4 5 2 1 萃取后添加待测成分4 5 2 2 柱后输注待测成分4 6 3 中药材中有机磷农药基质效应测定4 6 4 基质效应的消除4 6 5 小结4 7 第五章总结4 8 参考文献4 9 致谢5 3 附录1 样品中有机磷农药的添加色谱图5 4 附录2 攻读硕士学位期间发表的学术论文。5 8 i i i r 高效液相色谱串联质谱法检测5 种中药材中有机磷残留量 摘要 农药的使用大大提高了农作物的产量，但一些负面影响也随之而来。中药材做 为一种特殊的作物，在治疗疾病方面具有突出的效果，其需求量也在不断增大。市 场出售的中药材多数为人工种植，在种植过程农药的使用不可避免的会造成中药材 的污染，因此，中药材中农药残留检测方法的研究和建立具有非常重要的意义。目 前，文献中报道较多是机氯类农药残留研究，而其他类型农药残留检测方法较少报 、n 追。 本文以栀子为研究对象，对其中有机磷农药残留的提取、净化方法进行了探索， 建立了栀子中有机磷类农药同时测定的液相色谱串联质谱分析法，并将其应用于玄 参、车前草、甘草和金银花中有机磷农药残留检测，以进一步探讨了该方法的适用 性，主要研究结果如下： 1 在液相色谱串联质谱检测方面，通过对质谱条件、色谱柱、流动相及洗脱梯 度等条件的摸索，建立了以甲醇和0 1 甲酸水溶液为流动相，电喷雾正离子选择监 测模式检测有机磷农药残留的分析方法。结果表明：在选定的液相色谱和质谱条件 下，1 1 种有机磷农药可以得到较好的分离和对称、尖锐的峰形。 2 以栀子为研究对象，对适宜的提取溶剂、净化方法进行了筛选，建立了采用 乙腈提取，c a r b p s a 固相萃取柱结合活性炭净化，液相色谱串联质谱检测有机磷农 药残留的方法。在5 0g g k g 、1 0 0g g k g 、2 0 0g g k g3 个水平上进行添加回收试验， 添加回收率范围分别为8 4 o 9 8 7 、8 9 7 1 0 4 7 、8 8 3 1 0 3 3 ；相对标准偏 差分别为2 4 9 4 、1 6 8 2 、2 1 9 3 ；在1 2 5 2 0 0 0 l 范围内线性良好， 相关系数为0 9 9 7 1 0 9 9 9 9 ；方法检出限为2 2 0 斗g k g 。 3 本文将有机磷农药残留方法应用于玄参、车前草、甘草和金银花等四种中药 材中有机磷农药的残留检测，以检测该方法的适用性。得到的试验结果较好，说明 该方法的适用范围较广。 4 试验采用萃取后添加待测成分( p o s t e x t r a c t e da d d i t i o n ) 的方法分析五种中药 材基质对有机磷农药的基质效应，结果表明：5 种中药材基质对1 1 种有机磷农药的 响应值都有影响，多数影响表现为基质抑制。 关键词：有机磷农药；残留；中药材；固相萃取；液相色谱一质谱联用；检测 r 华中农业大学2 0 1 0 届硕上研究生学位论文 a b s t r a c t t h e a p p l i c a t i o no fp e s t i c i d e sh a sb e e np l a y i n gav e r yi m p o r t a n tr o l ei na g r i c u l t u r e i t g r e a t l yi m p r o v e st h eo u t p u to fc r o p s a tt h es a m et i m e ，s o m ed a m a g e sc a m e c h i n e s e h e r b a lm e d i c i n e ，a sas p e c i a lp l a n t ，c o n t r i b u t e sal o ti np e o p l e sh e a l t h t h er e q u i r e m e n t o fc h i n e s eh e r b a lm e d i c i n eh a db e e ng r o w i n g ；r e s u l t a n t l yt h ec u l t i v a t i o no fc h i n e s e h e r b a lm e d i c i n e se x p a n d e d b e c a u s ep e s t i c i d e sa r e a p p l i e dt oab r o a dv a r i e t yo fc h i n e s e h e r b a lm e d i c i n e st or e d u c el o s sf r o mi n s e c t s ，c h i n e s eh e r b a lm e d i c i n e sh a v ea h i g hr i s k o fc o n t a m i n a t i o no fp e s t i c i d e s t h u s ，i ti sv e r yi m p o r t a n tt o s t r e n g t h e nt h es t u d yo n d e t e r m i n a t i o no f p e s t i c i d er e s i d u e si nc h i n e s eh e r b a lm e d i c i n e s i nt h i s t h e s i s ，w ed e v e l o p e d am e t h o df o r d e t e c t i n gt h e m u l t i - r e s i d u eo f o r g a n p h o s p h o r u sp e s t i c i d e si ng a r d e n i aj a s m i n o i d e s w eo p t i m i z e dt h ee x t r a c t ，c l e a n u pp r o c e d u r e s ，a n dt h e nd e v e l o p e dam e t h o df o r t h es i m u l t a n e o u s d e t e c t i o n g o r g a n p h o s p h o r u sp e s t i c i d e si ngj a s m i n o i d e sb yl i q u i dc h r o m a t o g r a p h yt a n d e mm a s s s p e c t r o m e t r y t h ed e t e c t i o nm e t h o dw a sa p p l i e dt ot h eo t h e rf o u rc h i n e s eh e r b a l m e d i c i n e s ( s c r o p h u l a r i an i n g p o e n s i s , p l a n t a g oa s s i a t i c al i n n ，g l y c y r r h i z au r a l e n s i s f i s c ha n dl o n i c e r aj a p o n i c at h u n b ) f o rt h ed e t e r m i n a t i o no fo r g a n p h o s p h o r a t e p e s t i c i d e sr e s i d u e t h em a i nr e s u l t sw e r es u m m a r i z e da sf o l l o w s ： 1 w eo p t i m i z e dt h em s m ss y s t e m ，c h o s et h es u i t a b l el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y c o l u m n , m o b i l ep h a s ep r o g r a ma n de l u t i o np r o g r a m m e t h a n o la n da q u e o u ss o l u t i o n ( c o n t a i n i n g1 m e t h a n o i ca c i d ) f o rm o b i l ep h a s ea n ds e l e c t e di o ns c a nm o d ew e r eu s e d ， f o rt h er e s i d u ea n a l y s i so fo r g a n p h o s p h o r u sp e s t i c i d e si nc h i n e s eh e r b a lm e d i c i n e s t h e r e s u l t ss h o w e dt h a t11 o r g a n p h o s p h o r u sp e s t i c i d e sc a l lb ew e l ls e p a r a t e di nt h es e l e c t e d c o n d i t i o n s 2 t h ea u t h o re s t a b l i s h e dah p l c m s m sm e t h o df o rt h es i m u l t a n e o u s d e t e r m i n a t i o no f11 o r g a n o p h o s p h o r u sp e s t i c i d e s i ng a r d e n i aj a s m i n o i d e se l l i s o r g a n o p h o s p h o r u sp e s t i c i d ew e r ee x t r a c t e db ya c e t o n i t r i l ef r o mg a r d e n i aj a s m i n o i d e s e l l i ss a m p l e sa n dc l e a n e du pw i t hc a r b p s ac a r t r i d g ea n da c t i v a t e dc a r b o n ，t h e nw e r e d e t e c t e db yh p l ct a n d e mm s m s t h ea v e r a g er e c o v e r i e so f11 o r g a n o p h o s p h o r u s p e s t i c i d e sa tt h ec o n c e n t r a t i o nl e v e l so f5 0p g k g ，10 0t x g k ga n d2 0 0l x g k gw e r ei nt h e 2 高效液相色谱串联质谱法检测5 种中药材中有机磷残留量 r a n g eo f8 4 0 - 9 8 7 ，8 9 7 - 1 0 4 7 a n d8 8 3 1 0 3 3 ，w i t h t h er e l a t i v es t a n d a r d d e v i a t i o n si nt h er a n g eo f2 4 9 4 ，1 6 8 2 a n d 2 1 - 9 3 ，r e s p e c t i v e l y t h el i n e a r r a n g e so f11o r g a n o p h o s p h o r u sp e s t i c i d e sw e r e12 5 2 0 0 0r , g k g ，a n dt h ec o r r e l a t i o n c o e f f i c i e n t sw e r e0 9 9 71 - 0 9 9 9 9 t h el i m i t so fd e t e c t i o nr a n g e df r o m21 t g k gt o2 0 g g k g 3 w ee x p a n d e dt h ea p p l i c a b l er a n g eo ft h em e t h o dw ee s t a b l i s h e dt oo ft h e d e t e c t i o no ft h er e s i d u e si n s c r o p h u l a r i an i n g p o e n s i s , p l a n t a g oa s s i a t i c al i n n , g l y c y r r h i z au r a l e n s i sf i s c ha n dl o n i c e r aj a p o n i c at h u n b ，as a t i s f a c t o r yr e s u l tw a s o b t a i n e di nt h ed e t e r m i n a t i o no fo r g a n o p h o s p h o r u sp e s t i c i d e si nc h i n e s eh e r b a l m e d i t i n e s 4 w ec o n d u c t e dt h ep o s t - e x t r a c t e da d d i t i o nt os t u d yt h ee f f e c t so fs a m p l em a t r i x e f f e c t so nt h er e s u l t so fd e t e r m i n a t i o n t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a to r g a n p h o s p h o m s p e s t i c i d e sw e r ei m p a c t e db yt h ef i v ec h i n e s eh e r b a lm e d i c i n e s t h em a j o r i t yo fe f f e c t s p e r f o r m e dw e a k e na f f e c t i o n s k e y w o r d s ：o r g a n o p h o s p h o r u sp e s t i c i d er e s i d u e s ；c h i n e s eh e b a lm e d i c i n e ；s o l i dp h a s e e x t r a c t i o n ；l i q u i dc h r o m a t o g r a p h yt a n d e m m a s ss p e c t r o m e t r y ；d e t e c t i o n 3 高效液相色谱串联质谱法检测5 种中药材中有机磷残留量 第一章文献综述 1 农药残留概述 1 1 中药材中农药残留研究意义 中医中药是我国传统优秀文化的代表。我国的中草药资源丰富，种类多达1 万种 以上，其中植物药有1l1 4 6 种，动物药有15 8 1 种，矿物药有8 0 种，3 2 0 多种为常 用药，总储存量达8 5 0 万吨( 张玉婷等，2 0 0 8 ；梁少梁，2 0 0 6 ) 。 近些年来，随着人们对化学药品毒副作用认识的深入以及植物药在许多慢性病、 老年性疾病方面的独特疗效和保健效果，中药材在人类健康方面的重要作用得以重 新认识，在消费者心目中的地位不断提升( 翟喜光等，2 0 0 3 ) 。由于中药材的需求 量越来越大，野生中药材已经远远不能满足市场的需求，目前市场上出售的中药材 多为人工种植。中药材种植者在中药材的种植过程中，为了防止中药材免受植物病 虫害侵害，提高中药材产量和质量，不得不施用农药；同时，大多中药材种植者缺 乏合理使用农药的知识，一些高毒高残留的农药被长期使用，造成了许多高毒农药 在中药材中的残留，这不仅关系到患者的健康，也严重制约了我国名贵中药材走向 国际市场( 张俊清等，2 0 0 3 ) 。发达国家对进口中药材制定了比较严格的质量标准， 除进行相关质量的检测之外，还对农药残留量最高限量做了明确的规定；超过农药 残留限量的中药材禁止进口，因此加强中药材中农药残留量的检测方法研究，不仅 关系到人们的用药安全，也对我国中药材出口有重要意义。 1 2 中药材中农药残留种类 中药材中农药残留非常普遍，尤其是有机氯农药，虽然各国都已明令禁止使用 该类农药，但是由于其化学性质稳定，不易分解，致使在禁止十余年后仍能在水域、 土壤和生物有机体内找到其残留( 黄海燕，2 0 0 1 ；蔡辛福节译，1 9 9 0 ) 。根据“九五 攻关课题“中药材质量标准规范化研究”和“十五”重大科技专项“创新药物和中 药现代化”中有机氯农药残留研究结果可以看出，中药材中有机氯农药残留检出率 高达9 0 以上( 薛健等，2 0 0 7 ) 。 我国禁止使用有机氯农药之后，有机磷农药被大量使用，其产量在我国农药中 也占有很高比例。( 万益群和李艳霞，2 0 0 5 ) 。有机磷农药的大量使用，包括国家 禁用的有机磷农药如甲胺磷等，导致中药材中农药残留超标，影响中药材质量，严 5 华中农业大学2 0 1 0 届硕上研究生学位论文 重者使患者蓄积中毒( 吴加仑等，2 0 0 7 ；洪奕和饶广杰，1 9 9 3 ) 。吴加伦( 2 0 0 7 ) 等对浙江道地药材白术、温郁金、贝母、杭白菊中有机磷农药污染的调查结果表明： 1 0 的杭白菊样品中检测出禁用农药甲胺磷，2 0 的白术样品中检测出毒死蜱，其 他两种药材在最小检测浓度范围内未检出有机磷农药残留。 2 0 世纪7 0 年代以来，由于有机氯农药相继被不同国家禁用或限制使用，同时抗 有机磷农药昆虫品种的日益增多，氨基甲酸酯和菊酯类农药的使用量逐年增加( 陈 笑梅等，2 0 0 7 ) 。随着这两大类农药使用剂量和使用范围的不断扩大，其在农作物 以及中药材中的残留及对人类和环境造成的毒害也越来越为人们所关注。由于这两 类农药属于低毒低残留农药，因此，建立一种简便、快速、高灵敏度的检测方法十 分必要。 我国规定了中药材生产过程中禁止使用的农药( 表1 1 ) ( 张俊清等，2 0 0 3 ；陈 君等，2 0 0 0 ) ，但由于农药本身物理化学特性较复杂，再加上一些混合药剂的使用， 经常会造成一些高毒、高残留农药在中药材中蓄积。 1 3 中药材中农药残留特点 近些年来，随着中药事业的发展，中药产品防病、治病的重要作用被重新认识， 有关中药材在农药残留等方面的研究也越来越受到人们的关注，根据有关文献报道 的结果可以总结出中药材污染有以下特点： i中药材中有机氯类农药污染程度较高，检出率较菊酯、有机磷和氨基甲酸酯类 农药高。陈冲等( 2 0 0 6 ) 对国内己报道的8 0 多种中药材有机氯农药残留量的统计分 析，结果表明：我国大部分中药材和中成药中含有六六六和滴滴涕，含量均在0 1p g 以下，但仍有部分药材中农药残留量严重超过国家现有标准。 i i 农药在同种药材的不同部位中的残留量也有较大的差异，一般叶和花中的残留 量较果实和根茎中的残留量大( 张炯炯等，2 0 0 6 ) 。 i i i 中成药和提取物中农药残留量一般较低。中成药生产过程中一般用水提取，多 数农药微溶或不溶于水，大多农药残留在药渣当中。 i v 残留农药易在人体内慢性蓄积。与粮食和蔬菜相比，中药材的相对摄入量少， 且中药材经过较多环节的加工和炮制，不易发生急性中毒事件，容易在人体内慢性 蓄积。 6 高效液相色谱串联质谱法检测5 种中药材中有机磷残留量 表1 1 中药材生产中禁止使用的农药种类 t a b l e1 - 1t h ef o r b i d d e np e s t i c i d e si nc h i n e s eh e r b a lm e d i c i n e s 7 华中农业大学2 0 1 0 届硕士研究生学位论文 1 4 农药残留危害 农药的大量使用在农作物上造成了不同程度的残留，人类长期摄入被农药污染 的水果、蔬菜及其他农产品，导致农药在人体内大量蓄积并造成急性中毒或慢性中 毒事件，对人类健康构成威胁。2 0 世纪8 0 年代，由于菜农违规使用甲胺磷，在上海、 北京等地发生多起食用蔬菜中毒事件。农药残留还会对我们赖以生存的淡水资源、 土壤环境以及有益生物造成威胁，从而对农牧业生产带来危害，影响人类的生存。 1 5 国内外限量标准对比 农药残留问题在2 0 世纪6 0 年代初就引起了国际社会的重视，各国管理部门对 粮食、水果、蔬菜等的农药残留量有明确的规定，并制定了严格的限量标准，一旦 食品中农药残留量超过此标准，将被禁止进口或流通。 由联合国粮农组织和世界卫生组织联合组成的农药残留专家联席会议，应国际 食品法典委员会下的农药残留法典委员会的要求，定期对农药可接受的日摄入量及 最大残留限量值进行评价。专家组根据农药的使用方式，在动植物体内的代谢数据、 环境影响等，负责制定农药残留限量和分析方法；依据可能引起的最大残留水平毒 理核心，专家组负责评价毒理和相关数据，基于评价的数据制定最大残留限量标准。 1 5 1 我国限量标准 随着国际天然药物市场的竞争日趋激烈，我国各相关部门对该行业的发展越来 越重视，但是，与发达国家相比，我国在中药材质量标准及农药残留标准等方面的 研究仍远远落后。 我国中药材现行质量标准为中国药典2 0 0 5 版，其中仅对六六六总量、滴滴 涕总量及五氯硝基苯三种有机氯农药的限量做了规定。2 0 0 4 年国家外贸部制定的 “药用植物及试剂的绿色行业标准 对农药残留限量的规定也仅涉及到六六六、滴 滴涕、五氯硝基苯和艾氏剂四个指标，其限量标准具体为：六六六0 1 m g k g ，滴滴 涕总量o 1 m g k g ，五氯硝基苯o 1m g k g ，艾氏剂0 0 2m g k g 。香港在中药材质量标 准方面则较中国药典具体，制定了有关有机氯农药残留限量的9 项标准( 关立忠等， 2 0 0 1 ) 。 高效液相色谱串联质谱法检测5 种中药材中有机磷残留量 表1 - 2 各国规定的中药材中农药残留限量标准 t a b l e1 - 2m a x i m u mr e s i d u el i m i t so fp e s t i c i d e si nc h i n e s eh e r b a lm e d i c i n e s r e g u l a t e db ys o m ec o u n t r i e s 农药名称i 瑁r 1 毛i 蕃石二堡堕詈票堑堕气导i i 西丽 六鬻量 叭 篡眈眈慧蕊 滴滴涕总量 艾氏剂 狄氏剂 异狄氏剂 五氯硝基苯 五氯苯胺 甲基五氯苯硫醚 甲氧滴滴涕 六氯苯 七氯( 含环氧七氯) 氯丹 硫丹 联苯菊酯 甲氰菊酯 氯氰菊酯 溴氰菊酯 氰戊菊酯 氯菊酯 除虫菊素类( 综合) 二硫代氨基甲酸酯 毒死蜱 对硫磷 甲基对硫磷 杀扑磷 马拉硫磷 甲基谷硫磷 毒虫畏 甲基毒死蜱 二嗪磷 乙硫磷 杀螟松 地虫硫磷 伏杀硫磷 甲基嘧啶磷 0 1 o 0 2 0 1 l - o 0 0 5 o 0 5 1 o o 1 o 0 5 o 0 5 3 o 0 2 0 1 0 o l 0 0 1 0 0 1 o 1 1 o 1 5 0 5 0 2 o 2 1 0 1 o 0 2 0 1 0 2 0 5 0 5 1 o 0 0 5 o 0 5 1 0 o 0 5 o 0 5 1 01 0 o 1 0 0 5 0 0 5 1 0 o 5 1 5 1 0 3 o 2 o 0 2 0 5 o 2 0 2 1 o 1 o o 5 o 1 0 5 2 o 0 5 o 0 5 o 1 4 0 o 1 0 0 5 0 0 5 3 o 1 0 0 5 1 5 1 o 3 0 2 0 0 2 0 5 0 2 0 2 1 0 1 o 0 5 o 1 0 5 2 0 0 5 0 0 5 0 1 4 o 敌敌艮 1 0 1 0 9 华中农业大学2 0 1 0 届硕上研究生学位论文 1 5 2 国外限量标准 上世纪9 0 年代开始，国际上一些使用中草药的国家开始关注出口到本国的中 药材中重金属及农药残留问题，相继制定了有关中药材中农药残留的限量标准。 韩国于2 0 0 4 年对中药材( 生药) 中的重金属、农药残留的标准( 草案) 由食品 医药安全厅进行公告，2 0 0 5 年再次修订了已经极为严格标准。在韩国中药材中重金 属和农药残留限量标准及检测方法( 韩国，2 0 0 6 ) 中，更是增加了一些农药在特定 中药材当中的限量标准。日本汉方协会于2 0 0 5 年6 月提出了农药残留的行业标准，而 在0 6 年重新制定的中药材农药残留标准中，涉及到了各大类农药共计八个指标。欧 盟药典第5 版规定了1 6 2 种有毒物质的限量，美国药典现已出至第3 0 版，大部分农药 残留指标与欧盟一致，表1 2 中列出了我国及各国中药材中农药的残留限量。 2 农药残留检测方法 2 1 农药残留前处理技术 中药材农药残留分析中，样品的前处理技术是残留分析的关键。由于农药的品 种繁多，且化学结构及理化性质各不相同，这就加大了农药残留检测的难度；另外， 中药材中成分非常复杂，其中许多成分对农药残留检测的干扰较大，致使中药材中 农药残留量的分析检测十分困难。前处理的目的就是将样品中的痕量农药提取出 来，并尽量减少其他组分的提取，同时采用适合的净化方法有效的除去提取出来的 杂质，以避免杂质对色谱柱和检测器的污染，减少对检测结果的干扰，保证结果的 准确。 农药残留分析通常需经过农药提取、样品净化、浓缩等预处理步骤：根据待测 物质和样品的性质及特点选择合适的提取溶剂和提取方法，将待测农药从固态样品 或液态样品中转移到易于净化和分析的液体状态，并选择适当的净化方法将待测农 药与提取液中的色素、油脂或其他天然物等杂质分离。 2 1 1 提取溶剂的选择 提取( e x t r a c t i o n ) 是指通过溶解、吸附或挥发等方式将样品中的残留农药分离出 来的操作步骤，通常也称为萃取。由于残留农药含量甚微( 痕量) ，提取效率的高 低将直接影响到分析结果的准确性。提取方案的选定主要是根据残留农药的理化特 性来定，但也需要考虑试样类型、样品的组分( 如脂肪、水分含量) 、农药在样品 中存在的形式以及最终的测定方法等因素。经典的提取方法为有机溶剂提取，要求 提取溶剂的极性与分析物的极性相近，也即采用“相似相溶”原理，使分析物能进 1 0 高效液相色谱串联质谱法检测5 种中药材中有机磷残留量 入溶液而样品中其它物质处于不溶状态。如用挥发分析物的无溶剂提取法，则要求 提取时能有效促使分析物挥发出来，而样品基体不被分解或挥发。提取时要避免使 用作用强烈的溶剂、强酸强碱、高温、及其它剧烈操作，以减少其后操作的难度和 造成农药损失。残留农药的提取方法多种多样，但基本上都是基于化合物的极性 溶解度或挥发性蒸汽压的理化特性而建立的。 提取溶剂的选择直接影响到提取效果及结果的准确性，其选择与溶剂性质、样 品特点、农药的特性以及农药在样品中的代谢情况等( 张卫国等，2 0 0 1 ) 有关。农 药的提取符合相似相溶原理，首先应考虑的是提取溶剂和农药的极性，极性较小的 有机氯农药选择极性相对较弱的有机溶剂，如石油醚、正己烷等；极性较强的有机 磷农药一般选用乙腈、丙酮等提取；为了提高提取效率，同时减少杂质量的提取量， 农药的提取可以选择单一提取溶剂，也可以选择混合溶剂，应根据具体样品及农药 性质选择；其次，农药残留分析属于痕量分析，因此对溶剂的纯度要求很高，应尽 量选择色谱级试剂，对杂质含量较多的溶剂应采用重蒸等方法加以处理后使用；另 外，提取溶剂的选择也要考虑其沸点，以避免其过多的挥发或引起不稳定农药的分 解( 农业部农药检验所，1 9 9 5 ) 。 2 1 2 提取与净化 常规的提取方法有捣碎法、索式提取法、震荡法、超声波法、消化法和浸渍法 等。常用的净化方法有柱层析法、化学处理法、液一液分配法、扫集共蒸馏净化法、 低温冷冻法等。这些方法操作简单，不需要贵重的仪器，在残留分析中仍发挥着重 要的作用。 近年来国内外在农药残留分析领域取得了重要的进展，出现了一系列新型高效 的样品前处理方法，如固相萃取、固相微萃取、超临界流体萃取、微波辅助萃取、 凝胶渗透色谱、基质固相分散萃取、加速溶剂萃取、免疫亲和色谱等技术。这些技 术使农药前处理简单化、微型化和自动化，已经逐渐取代了传统的提取方法，不断 被应用到农药的残留分析当中。现代农药残留技术的进步和发展使得提取净化的界 限十分模糊( 井乐刚，2 0 0 2 ) ，提取、净化常常可一次完成。 2 1 2 1 固相萃取( s o l i dp h a s ee x t r a c t i o n ，s p e ) 固相萃取技术( s p e ) 于2 0 世纪7 0 年代提出，是基于液相色谱理论的一种分 离、纯化方法，迄今已经发展为许多领域前处理的标准模式，商品化程度很高。1 9 6 2 年，a n t o n a h 等人首次采用固相萃取技术对样品进行净化，得到了较好的结果( 赵 利剑等，2 0 0 5 ) 。8 0 年代以后，国外将固相萃取技术应用于气相色谱法检测农药残 华中农业大学2 0 1 0 届硕士研究生学位论文 留量的样品前处理中。随着固相萃技术的发展，商品化的固相萃取小柱被逐渐应用 于医药、食品、环境分析等领域。 固相萃取的基本原理是基于样品在固相吸附剂和液相溶剂之间的分配系数，待 测物能被固体吸附剂所吸附取决于吸附剂表面的活性基团以及待测物与洗脱溶剂之 间的分子作用力，含有待测物的液体通过固相萃取柱时，目标化合物被固体吸附剂， 样品基体和干扰化合物则通过固相萃取柱与待测物分离，然后选用适当洗脱液将待 测物洗脱并收集，达到分离和富集目标化合物的目的( 王立等，2 0 0 1 ；s a i k i aa n d k u l s h r e s t h a , 19 9 9 ) 。 固相萃取的主要分离模式可以分为正相( 填料为极性) 、反相( 填料为非极性) 、 离子交换和吸附。固相萃取柱中的固定相与液相色谱中常用的固定相相同，只是粒 度上有所不同( n i g e la n ds i m p s o n ，2 0 0 0 ) 。正相固相萃取可以吸附非极性溶剂样品 中的极性化合物，所用的固定相吸附剂是极性的，目标化合物能否在吸附剂上保留， 取决于化合物与吸附剂表面的极性官能团之间的氢键，7 c 吼键，偶极偶极和偶极诱 导极等相互作用( c h e na n dw a n g ，1 9 9 6 ) 。；反相固相萃取柱中的固相吸附剂极性较 弱，能够吸附中等极性到非极性化合物。目标化合物与吸附剂之间的作用力主要是 范德华力或色散力( 胡笑形，1 9 9 8 ) 。 固相萃取有两种洗脱模式，一种是待测物与固相吸附剂之间的亲和力，比其与 所存在的基质间的亲和力更强，因而待测物被保留在固相吸附剂上，然后用一种对 待测物亲和力更强的溶剂洗脱；另一种是待测物与其所存在的基质间的亲和力较之 与固相之间亲和力更强，则待测物被直接洗脱，通常使用的是前一种洗脱方式。 现代固相萃取方法采用长约2 3c m 的聚丙烯小柱，内装各种填料。除了经典的 柱管式s p e 外，圆盘式s e p 的使用也日渐普遍。s e p 的填料种类繁多，包括吸附型 填料、化学键合相填料、离子交换剂、高分子聚合物等。除了这些与高效液相色谱 使用的固定相类似的填料外，限入性介质、分子印迹聚合物正在成为固相萃取的新 型固定相。s e p 所需样本量少，避免了乳化现象，回收率高，重现性好，而且便于 自动化操作，但由于s e p 多采用商品化小柱，价格较为昂贵。自美国w a t e r s 公司的 s e p p a k 投放市场后，s p e 技术取得很大进步，逐渐采用s p e 小柱取代传统的液液 分配( 董玉瑛等，1 9 9 9 ；g r e e na n d a b r a h a m ，2 0 0 0 ；c h i r o na n d a l b a ，1 9 9 3 ) 。各种c 8 、 c 1 8 、腈基、氨基丙基、氨基丙基键合硅胶、免疫亲和柱和其它特殊填料的萃取柱 相继得到应用。 1 2 高效液相色谱串联质谱法检测5 种中药材中有机磷残留量 2 1 2 2 固相微萃取( s o l i dp h a s em i c r o e x t r a c t i o n s p m e ) 2 0 世纪9 0 年代，固相微萃取技术首次被应用于农药残留检测中( p o p pa n d k a l b i t z ，1 9 9 4 ) 。该技术是在固相萃取技术基础上发展起来的，它利用待测物在基体 和萃取相