（动物营养与饲料科学专业论文）不同木聚糖酶基因在毕赤酵母中表达及酶学特性研究.pdf

顾士学位铅文不同本聚糖酶基因在毕赤酵母中表达及酶学特性研究 摘要 0 一l ，4 木聚糖酶( e c3 2 1 8 ) 是降解木聚糖的关键酶，能大幅度提高半 纤维素物质的利用效率，因此广泛应用于饲料、造纸和食品等工业。但木聚 糖酶的单位产量较低，是限制木聚糖生物转化的主要因素之一，而构建基因 工程菌是提高酶产量的有效途径之。本文亚克隆了黑曲霉f 2 6 木聚糖酶 a n x 的e d n a 和褐色高温单孢菌t f 木聚糖酶t f x 基因，分别在毕赤酵母 g s l l5 中表达，筛选阳性重组子，并对重组子的表达产物进行了酶学特性研 究，主要结果如下： 根据己克隆的木聚糖酶a n x 和t f x 基因的酶切图谱及表达载体p p i c 9 k 的多克隆位点( m c s ) ，相应地设计了两对含限制性酶切位点的表达引物： 5 a n x 0 4 e ( e c o r ) 3 a n x 0 4 e ( n o t i ) 和5 t f x 0 4 e ( e c o r i ) 3 t f x 0 4 e ( n o t i ) 。分别 以含木聚糖酶基因的p g e m 圆一te a s y a n xv e c t o r 和p g e m 圆te a s yt f x v e c t o r 质粒为模板进行p c r 扩增，获得相应的两端带有限制性酶切位点的 d n a 片段，其大小分别为6 5 9 b p 和1 0 3 7 b p 。将以上两个d n a 片段分别与 p g e m 一te a s yv e c t o r 质粒连接获得亚克隆重组质粒p o e m 固te a s ya n x e v e c t o r ( 简称a n x e ) 和p g e m te a s yt f x ev e c t o r ( 简称t f x e ) 。a n x e 和t f x e 经e c o r i 和n o t i 双酶切后分别与经相同酶双酶切的表达质粒 p p i c 9 k 连接，获得的重组表达质粒p p i c 9 k a n x e 和p p i c 9 k c t f x e ，它们 经酶切线性化后分别导入毕赤酵母g s l l 5 中。快慢斑筛选得到的重组子经甲 醇诱导后测定培养液中木聚糖酶活性，从而获得a n x 基因的阳性表达子 9 k a n x e 0 1 、9 k a n x e 0 2 和t f x 基因的阳性表达子9 k t f x e ，它们产生的 木聚糖酶活性依次是2 9 1 u m l 、1 8 8 5 u m l 和1 9 5 5 u m l ，分别是出发菌株黑 曲霉f 2 6 的8 3 3 、5 4 o g a 褐色高温单孢菌t f 的1 4 倍，在r b b 一木聚糖 平板上也形成明显的透明圈。 对两株重组毕赤酵母9 k a n x e 0 1 和9 k t f x e 分泌的木聚祷酶酶学特性 研究表明，9 k a n x e 0 1 的分子量为1 2 6 1 k d a ；最适反应p h 为50 ；在p h 3 0 ， 6 0 和7 0 体系中仍具有较高木聚糖酶活性，分别是p h 5 0 的9 2 o ，9 57 和9 3 2 ，但在p h 4 0 体系中酶活性出现一低谷，相对酶活性为7 4 7 ；最 i 硕士学位论义币同术聚糖酶基因在毕赤酵母中表达及酶学特性研究 适反应温度为5 0 。| c ，在6 0 。c 时也具有较高酶活，为5 09 c 的9 4 2 ，在7 0 和8 0 时酶活性明显下降，分别是5 0 的4 7 8 i l j3 7 7 。9 k t f x e 的分子 量为3 8 8 k d a ，最适作用p h 电是5 0 ，且在p h 9 0 处又出现一酶活峰，但不 管是在酸性环境还是在碱性环境，酶活一性的下降幅度要比9 k a n x e 0 1 明显： 它的最适反应温度较前者高，为6 0 ，5 0 体系中相对酶活也较高，为6 0 的9 06 ，但在7 0 。c 时酶活性显著下降，为6 0 。c 的2 1 o ，8 0 时几乎无 酶活。在动物消化道生理温度4 0 时，9 k a n x e 0 1 和9 k t f x e 产的木聚糖酶相 对酶活分别是7 1 o 和6 0 1 。从液体木聚糖酶的热稳定性而言，9 k a n x e 0 1 和9 k t f x e 产的木聚糖酶在5 0 。c 处理l m i n 、3 m i n 和5 m i n 后，酶存活率分别为1 0 0 、 8 9 5 、8 9 5 和9 7 7 、9 7 7 、9 3 2 ；6 0 处理l m i n 、3 m i n 和5 m i n 后酶存活 率分别为8 9 6 、5 0 8 、5 0 8 和9 7 7 、8 8 6 和7 5 0 ：但当处理温度上升到 7 04 c 痢i8 0 处理i m i n 后( 除9 k t f x e 在7 0 。c 处理l m i n 还具有较高酶活外) ，两者 酶活性均迅速下降，分别为自然酶活的4 3 矫 j1 7 左右，但延长处理时间对酶活性 的影响甚微。 关键词：黑曲霉；褐色高温单孢菌；b 一1 ，4 一木聚糖酶；基因亚克隆：毕赤 酵母；表达；酶特性 i i 致谢 值此论文完成之际，谨向我的导师孙建义教授多年来的言传身教表示真挚 的感谢。导师在我三年的求学生涯中倾注了大量心血。导师的严谨治学态度、 深厚学术造诣和求实科学精神是我终生受益的宝贵财富，并时刻激励我不断前 进。 本论文能按期顺利地完成，离不开许多老师和同学的大力支持和热心帮 助。首先要感谢许梓荣教授多年来对我学业的指导、生活上的帮助和积极人生 观的树立。感谢李卫芬副研究员在论文完成过程中给予的细心指导帮助及生活 上的照应。感谢赵华成、肖竟、付亮剑、陈艳、许雅香、吕文平、王建枫、周 绪霞、高惠、井明艳、陆平、刘明启、潘林、许英蕾、付石军、訾乃涛等同学 在实验中给予的启发和莫大的帮助。感谢贾仁清老师对我学习生活的关心帮 助，感谢所里提供优良的学习和工作条件。 同样要感谢和我一起学习和生活的同窗邵明丽、朱金銮、金海丽、陶新、 王淑彩、林文学、关荣发、唐胜球、谢黎红等同学给我带来快乐和帮助。 最后感谢我的家人给予巨大支持和帮助，我以此论文献给他们，谨表深深 地谢意。 时光飞逝，转眼间研究生阶段的学习生活匆匆而过，美丽的华家池、严谨 治学的导师和可爱的同学都将成为我记忆中一道完丽的彩虹，祝大家万事如 意，幸福安康。 崩赛住 2 0 0 4 年5 月于杭州华家池 硕士学位论文第一章前言 第一章前言 木聚糖是植物细胞壁中的主要结构非淀粉多糖，含量仅次于纤维素，约占 细胞干重的7 3 5 ( j o s e l e a ue a 1 ，1 9 9 2 ：w h i s t l e fp a 1 ，1 9 7 0 ：w o n g e ca ，1 9 8 8 ) 。木聚糖可降解成木糖和液体燃料等各种有用物质，是- - 种# e 有潜力的可利用生物资源。因此，迫切需要开发各种经济实用技术来提高木聚 糖的利用效率。微生物木聚糖酶能水解木聚糖生成长度各异的木寡糖，对半纤 维素降解起着关键作用( b i e l y ，1 9 8 5 ) 。木聚糖酶能大幅度提高木质纤维素物质的 利用效率，在饲料工业、食品工业和造纸工业中具有巨大的应用前景( c o u g h l a n e ta i ，1 9 9 3 ) 。然而，目前利用生物酶解法降解木聚糖的成本较高，是限制其生 物转化的主要因素之一。因此，如何提高木聚糖酶单位产量是当前迫切需要解 决的关键问题。寻找潜在的木聚糖酶产生菌、诱变菌株和构建基因工程菌等方 法都是提高木聚糖酶生产水平的有效途径。 第一节木聚糖酶系的多态性及协同作用 术聚糖是带有多种取代基的复杂多糖，其主链由b d 吡喃型木糖残基通 过b - d - 1 ，4 一糖苷键组成( j o s e l e a ue t a l ，1 9 9 2 ) 。但也有报道指出，海藻中木聚糖 含有b - 1 ，3 一糖苷键( d e k k e re t a l 1 9 7 6 ) ，在海草类植物如掌形爪状骨针草中也 发现了混合有8 1 ，3 - 糖营键与e - 1 , 4 一糖菅键的木聚糖( b a r r y e ta t 1 9 4 0 ) 。主链 和支链上携带有各种不同的取代基团，一般为0 乙酰基( 0 a c e t y l ) 、a l 阿 拉伯呋哺糖基( d l a r a b i n o f u r a n o s y l ) 、a 一1 , 2 一葡萄糖醛酸( 一l ，2 - l i n k e d g l u c a r o n i c ) 或4 - o 一甲基葡萄糖醛酸( 4 一o - m e t h y l g l u c u r o n i ca c i d ) ( b i e l y , 1 9 8 5 ) 等。由于木聚糖结构不均一性，它的彻底降解就需要多种特异性木聚糖酶系的 协同作用( 图1 1 ) 。现已有报道许多微生物产的木聚糖酶是多酶复合物。如在 黑曲霉中，现已知有5 种不同特性的木聚糖酶( j o h ne ta 1 ，1 9 7 9 ) ，在粪堆梭菌、 链霉菌3 1 3 7 、脱叶链霉菌、木霉e 5 8 、里氏木霉、气单孢菌和微紫青霉等微生 物中也至少有3 种以上的木聚糖酶存在( o h k o s h ie ta 1 ，1 9 8 5 ：t a k e n i s h i 酊d ， 1 9 7 3 ；y o s h i k a e ta 1 ，1 9 8 i ) 。这些木聚糖酶系统中每种木聚糖酶除了各自发挥特 异性作用外，同时，它们之间又存在协同增效4 仁j n ( w o n ge t a l ，1 9 8 8 ) 。b i e l y 等 ( 1 9 8 6 ) 发现乙酰木聚糖需要在乙酰木聚糖酶和内切木聚糖酶的共同作用下才 硕士学位论文 第一章前言 能彻底降解，且由乙酰木聚糖酶降解而来的乙酸能增强内切木聚糖酶对术聚糖 主链的进攻，而内切木聚糖酶产生短链乙酰木聚糖又是乙酰木聚糖酶的良好底 物。嗜热单孢菌( t h e r m o m o n o s p o r a f u s d a ) 能产生内切木聚糖酶、目- 木糖甘酶、 一l 一阿拉伯呋喃糖营酶和乙酰木聚糖酶。b 木糖甘酶促进内切木聚糖酶对木 聚糖的降解，减轻终产物对内切木聚糖酶的抑制，同样，。- l 一阿拉伯呋喃糖苷 酶与内切术聚糖酶相互作用促进阿拉伯木聚糖的水解( b a c h m a n ne t a l ，1 9 9 1 ) 。 图1 1 木聚糖结构及其降解酶系 第二节木聚糖酶的分类 根据疏水簇分析( h c a ，是一种比较氨基酸同源性的灵敏方法，用于推 断蛋白质分子结构、功能和进化方面信息) ，木聚糖酶可分成两个家族：f 家族 和g 家族，分别对应于家族1 0 和1 1 ( g i l k e s e ta 1 ，1 9 9 1 ；h e n r i s s a te t a l ，1 9 9 7 ) 。 g e o r i s 等( 1 9 9 9 ) 将家族1 1 的内切木聚糖酶分为6 个主要组：3 个真菌组、2 个革兰氏阳性组、1 个革兰氏阴性组。s a p a g 等( 2 0 0 2 ) 采用单因子分析方法 ( 其组内的酶序列之间呈高度同源性) 将木聚糖酶分为a 、b 、c 、i 、i i 、i i i 、 i v 等7 个组，其中最大两组( i 和i i i ) 又进行了亚组分类，分别为【a 、i b 和 i c 以及i i i a 和i i i b 。组i 、i i 、i i i 主要为真菌木聚糖酶，组i 和i i 主要是来自 a s c o m y c e t a 和b a s i d i o m y c e t a 的木聚糖酶，且组i 中大多数木聚糖酶的d i 为碱 性，而组i i 的多为酸性：组i i i 主要为厌氡真菌木聚糖酶，而革兰氏阴性厌氧 细菌一产琥珀酸丝状杆菌产生的两种木聚糖酶x y c a 和x y c b 也归为组i i i ； 硕士学位论文 第一章前言 组i v 中仅包含2 个木聚糖酶，分别为来自cc a r b o n u m 的x y l 3 和来自ps a p i t i s 的x y n a ：组a 、b 、c 则主要为细菌木聚糖酶，组a 主要包含放线菌科、芽 孢杆菌科和严格好氧革兰氏阳性菌产生的木聚糖酶：组b 和组c 非常接近，主 要有来自瘤胃的梭菌和瘤胃球菌等厌氧菌产生的木聚糖酶。严格好氧的革兰氏 阳性菌荧光假单孢菌和混合纤维弧菌分别产生的木聚糖酶x y l e 和x y l a 从序列 同源上与其他革兰氏阳性菌差距较远，而与真菌的组i 非常相似，因此将它们 归为i c 亚组。 第三节木聚糖酶的结构 了解酶基本结构及其与功能关系是研究酶分子的关键环节。然而迄今为 止，有关木聚糖酶详细结构的资料还十分有限。木聚糖酶蛋白质分子是由功能 域、非功能域和连接区域组成，功能域迸一步被区分为催化域和底物结合域。 在木聚糖酶和纤维素酶中富含苏氨酸的连接区域与真核生物中的内含子( 非编 码序列) 区域相似。缺乏富含苏氨酸连接区域或缺乏纤维素结合域的被删短的 木聚糖酶a 与全长木聚糖酶相比，水解含纤维素半纤维素复合物的木聚糖活性 较低( b l a c ke ta 1 ，1 9 9 6 ) 。据报道，生黄瘤胃球菌( r f l a v e f a c i e n s ) ( z h a n g e ta 1 ， 1 9 9 4 ) 木聚糖酶存在一个由3 7 4 个氨基酸组成的连接区域，该区域富含天门冬氨 酸和谷氨酸。此外，粪肥纤维单胞菌( c e l l u l o m o n a s f i m i ) 的木聚糖酶d 含有两 个富含甘氨酸的连接区域，它们使结构域在空阔上分开，赋予蛋自质分子结构 弹。( m i l l w a r d s a d l e re ta 1 ，1 9 9 4 ) 。n e o c a l l i m a s t i x p a t r i c i a r u m 木聚糖酶存在个 非催化连接区域，该区域e 扫4 5 5 个氨基酸残基组成( b a i l e ye ta 1 ，1 9 9 5 ) ，其序列 不寻常之处在于包含了s 7 个八肽重复序列x s k t l p g g ，其中x 可以为s 、k 或 n ；连接区域内存在着大量的羟基氨基酸o 一糖基化，赋予了防止蛋白质分子被 降解的特性。热纤维梭菌( c l o s t r i d i u mt h e r m o c e l l u m ) 木聚糖酶c 在c 末端存在 短的连接区域，该连接区域含有负责纤维素体聚集的船坞区域( h a y a s he t a 1 1 9 9 7 ) 。 木聚糖酶一般由单催化域组成。然而对删短形式的n e o c a l l i m a s t i x f r o n t a l i s 木聚糖酶3 分析发现，全长蛋白质含有两个与底物特异性结合的催化区域 ( d u r r a n d e ta 1 ，19 9 6 ) ；生黄瘤胃球菌( r u m i n o c o c c u s f l a v e f a c i e n s ) 木聚糖酶也 有两个催化区域。对粪肥纤维单胞菌( cf i m i ) 外切葡聚糖酶木聚糖酶c e x 的 3 硕士学位论文第一章前言 催化活性分析和差示扫描热量测定表明，蛋白质的底物结合域和催化域是相互 独立( n i k o l o v ae t a l ，1 9 9 7 ) 。浅白隐球酵母( c r y p t o c o c c u sa l b i d u s ) 内切木聚糖 酶氨基酸序列与溶菌酶的催化区域有一定的同源性( m o r o s o l ie t a l ，1 9 8 6 ) ：根据 序列同源性可以认为木聚糖酶水解底物的糖苷键与溶菌酶水解的底物相似。然 而w e s t 等人( c o u g h l a n ，1 9 9 2 ) 发现该木聚糖酶的催化域与粪肥纤维单胞菌 ( c m i ) 的纤维二糖水解酶、枯草芽孢杆菌c 1 2 5 的木聚糖酶b 等中的催化域 同源。解糖梭菌( c l o s t r i d i u ms a c c h a r o l y t i c u m ) 木聚糖酶与c a l d o c e l l u m 的双功 能纤维素酶即外切纤维素酶内切纤维素酶( e e l b ) 中的纤维二糖水解酶域、粪 肥纤维单胞菌( c f i m i ) 的纤维二糖水解酶的催化域( o n e i l le ta 1 ，1 9 8 8 ) 、枯草 芽孢杆菌c 1 2 5 木聚糖酶、热纤维梭菌( c l o s t r i d i u mt h e r m o c e l l u m ) 木聚糖酶 ( g r a p i n e te t a l ，1 9 8 8 ) 和浅白隐球酵母( c r y p t o c o c c u sa l b i d u s ) 木聚糖酶( b o u c h e r e ta 1 ，1 9 8 8 ) 具有同源性。这些同源性分析表明，酶是通过两个催化域与几个底 物结合域重组进化而来。当此类演化木聚糖酶和纤维素酶在催化域具有广泛同 源性时，可以推测它们的作用机理也密切相关。值得注意的是环状芽孢杆菌两 种木聚糖酶之间缺乏同源。陛( y a n ge t a l ，1 9 8 9 ) ，这暗示可能存在截然不同的进化 途径和或催化机制。据报道在大肠杆菌中表达产琥珀酸拟杆菌( f i b r o b o c r p r s u c c i n o g e n e s ) 全长木聚糖酶c 都比两个删短的木聚糖酶c ( 每个具有完整催化 域) 活性低，这可能由于蛋白质在大肠杆菌中表达后折叠不正确，从而导致酶 三级结构中的催化位点部分被封闭之故。通过h c a l p , 较蛋白质序列发现x y nc 和短小芽孢杆菌( b a c i l l u sp u m i l u s ) 木聚糖酶催化域的二级结构单元之间具有 明显的同源性。由于每一个域中有两个色氨酸完全保守，因此它们可能存在一 个共同的祖先以及相似的三维结构排列方式( z h ue t a l ，1 9 9 4 ) 。 根据序列相似性，酶催化域和纤维素结合域( c e l l u l o s e b i n d i n gd o m a i n s ， c b d s ) 可分为几个不同家族。采用n m r 对酶结构进行研究发现，在c b h i 平 c e x 的c b d 中带电荷氨基酸极少数，而保守性芳香族氨基酸却大量存在。粪肥纤维 单胞菌( c f i m i ) 葡聚糖酶木聚糖酶混合功能酶c e x 中的c b d 具有五个色氨酸， 其中两个位于a 0 桶状结构中，三个暴露在分子表面。n m r 分析和化学修饰 研究确定了暴露的芳香族氨基酸残基直接参与了与纤维素结合，而且它们与纤 维素之间的相互作用似乎是可逆的( b r a y e t a l ，1 9 9 6 ) 。萤光假单胞菌 硕士学位论文 第一章前言 ( p j e “d o m o n a sf l u o r e s c e n s ) 、粪肥纤维单胞菌( c e l l u l o m o n a s f i m i ) 和热纤维梭 菌( c i o s t r i d i u mt h e r m o c e l l u m ) 等酶中也存在纤维素结合域( g i l k e se t a l ，1 9 9 1 ) 。 这些结构域可能起到两方面作用，如打开植物细胞壁结构，有利于酶水解；或 通过具有协同作用的酶聚集在植物细胞壁表面，促使不同酶水解协同进行。粪 肥纤维单胞菌( ef i m i ) 木聚糖酶d 的全长蛋白和删短蛋白水解纸浆木聚糖效 果相同；含有多糖结合域的酶衍生物在降低卡伯值( k a p p an u m b e r ) 方面更为 有效( r i x o ne ta 1 ，1 9 9 6 ) 。粪肥纤维单胞菌( c ，i 晰f ) 木聚糖酶d 具有纤维索和 木聚糖结合域( b l a c k e ta 1 ，1 9 9 5 ) ；删除纤维素结合域导致酶不能与纤维素结合， 但不影响与木聚糖结合；删短的木聚糖酶对不可溶木聚糖的k 。值较高，这意味 着木聚糖酶d 内在的纤维素结合簇包含有不连续的木聚耱结合域，该域影响酶 与不可溶底物的亲和力，但不会直接影响木聚糖酶活性。到目前为止，尚未阐 明粪肥纤维单胞菌( cf i m i ) 酶内在真实功能的c b d 存在情况( t o m m ee t ， 1 9 9 4 ) 。采用大肠杆菌分别表达海栖热袍菌( t h e r m o t o g am a r i t i m a ) 木聚糖酶a 平1 3 c b d 的c 一末端已有报道，用于研究酶的结构域排列和稳定性。c b d 以谷胱甘 肽s 转移酶融合蛋白形式表达，变性和复性研究表明结构域折叠独立进行f d o r i s e ta 1 ，1 9 9 7 ) 。就所有被研究过栖热袍菌属( t h e r m o t o g a ) 蛋白质而言( j a e n i c k ee t 口，1 9 9 6 ) ，木聚糖酶a ( x y n a ) 的c b d 具有极高稳定性，蛋白质的表观t m 值 超过1 0 0 。c ；温度甚至超过t m 时，c b d 还能保持原有二级结构。海洋红嗜热盐 菌( r h o d o t h r m u sm a r i n u s ) 木聚糖酶1 编码的c b d s 在n - 末端出现前后串联重复， 该c b d s 与家族i v 的c b d 相似( e v ae ta 1 ，1 9 9 7 ) ，这是第一个同时编码家族i v c b d 和家族1 0 糖水解酶催化域的木聚糖酶基因。好氧土壤菌萤光假单胞菌纤维 素亚种( 尹f l u o r e s c e n ss u b s p 。c e t l u l o s a ) 和混合纤维弧菌( c e l l v i b r i om b c t “s ) 的四种新木聚糖酶分子结构已有报道( s a d l e re t a l ，1 9 9 5 ) ，每种酶是一种模块， 含有与催化域分开的纤维素新结合域。其中萤光假单胞菌纤维素亚种( 尸 u o r e s c e n ss u b s p c e l l u l o s a ) 的两种木聚糖酶e 和f 含有与固氮菌根瘤菌 ( r h i z o b i a ) 的n o d b 同源的结构域。因此对于腐生土壤细菌可能存在一个很强 的选择压力，促使木聚糖酶保留了c b d s 。对粪肥纤维单胞菌( cf i m i ) 木聚糖 酶d 中的n o d b 结构域功能进行分析表明，它是一个脱乙酰基转移酶，其功能是 从乙酰化木聚糖中除去乙酰基团( s a d l e re ta 1 ，1 9 9 5 ) 。热产硫磺热厌氧杆菌 硕士学位论文 第一章前言 ( t h e r m o a n a e r o b a c t e r i u mt h e r m d s “耽，i g e ”口5 e m l 木聚糖酶a 基因特征为存在 两个c b d s 和c 末端具有一个重复三次的序列，后者被确定为相同微生物支链 淀粉酶( p u l l u l a n a s e ) 中的s 一层样结构域( s - l a y e r l i k ed o m a i n s ) ( m a t u s c h e ke t a l ， 1 9 9 6 ) 。对产木聚糖酶的链霉菌而言，水解去除c b d 的蛋白质水解酶似乎存在 保守性( a r r i b a se ta 1 ，1 9 9 7 ) ，因为它们都存在一个类似水解模式。因此可以认 为蛋白质自动加工和蛋白酶活性是引起c b d 丢失的两个主要原因，从而有助于 酶选择性水解各类木聚糖。 在细菌木聚糖酶和萄聚糖酶中，普遍存在着与催化域无关的重复结构域； 但在大多数情况下，其功能并不清楚。解糖热厌氧杆菌m e r t a o a n a e b a c t e r i u m s a c c h a r o 陟t i c u m ) ( l e ee ta 1 ，1 9 9 3 ) 热稳定性术聚糖酶的耐热性与蛋白质n 末端 的结构域有关；热纤维梭菌( c l o s t r i d i u mt h e r m o c e l l u m ) ( f o n t e se ta 1 ，19 9 5 ) 的 x y l y n 样具有赋予酶热稳定性的同源结构域。热稳定结构域与木聚糖酶催化域 相关联。热纤维梭菌( c l o s t r i d i u mt h e r m o c e l l u m ) 木聚糖酶y 的1 8 0 个氨基酸结 构域中2 8 序列被确认为具有解糖热厌氧杆菌( rs a c c h a r o l y t i c u m ) 木聚糖酶a 热稳定性结构域( 2 0 0 - 3 5 3 氨基酸残基) 特征。热纤维梭菌( c l o s t r i d i u m t h e r m o c e l l u m ) f 1 木聚糖酶c 基因序列中存在一个由1 6 5 个氨基酸组成的区域与 热稳定性有关( h a y a s h ie ta l ，1 9 9 7 ) 。解糖热厌氧杆菌( zs a c c h a r o 酚i c u m ) x y n a 与其它嗜热性微生物木聚糖酶比较发现，嗜热脂肪芽孢杆菌f 占 s t e a r o t h e r m o p h i l u s ) r t 8 b 4 、海栖热袍菌( zm a r i t i m a ) 、a n a e r o c e l i u m t h e r m o p h i l u m 和解糖热解纤维素菌属( c a l d i c e l l u l o s i r u p t o rs a c c h a r o t y t i c u s ) 等 木聚糖酶具有一个与解糖热厌氧杆菌( zs a c c h a r o l y t i c u m ) 的x y na 相似的热稳 定性结构域。这些木聚糖酶与解糖热厌氧杆菌( zs a c c h a r o l y t i c u m ) x y na 多序 列比较结果显示：域内保守的g l y 和t y r 对应于解糖热厌氧杆菌f r s a c c h a r o l y t i c u m ) x y na 的热稳定域。其它嗜热性微生物木聚糖酶与x y n a 热稳 定性结构域相似性为5 - 3 2 ，其中热纤维梭菌( c l o s t r i d i u mt h e r m o c e l l u m ) 木 聚糖酶c 相似性最高( 3 2 ) ，而嗜热脂肪芽孢杆菌( b s t e a r o t h e r m o p h i l u s ) 木聚 糖酶相似性最低。也许这些域赋予了相应木聚糖酶的热稳定性。但是需要更多 的实验数据来证实酶的热稳定源于一个特殊结构域。热稳定结构域中的保守性 氨基酸中并不存在半胱氨酸，其显著的优势是存在大量的脂肪族氨基酸，它们 6 硕士学位论文第一章前言 有可能通过增加折叠的蛋白质分子紧密度提高酶耐热性能( b o w e ne ta 1 ，1 9 8 8 ； m o z h a e ve ta 1 ，1 9 8 4 ) 。大量甘氨酸的出现表明它们有可能位于热稳定蛋白的环 状域中( a h e m e ta 1 ，1 9 8 7 ) ，然而能引起酶失活的天门冬氨酸和谷氨酸相当少， 这是由于在温度上升过程中这两种氨基酸使酶更易变性之故。嗜热性微生物木 聚糖酶在催化域部位具有较高同源性。催化域中保守的氨基酸意味着嗜热微生 物之间具有较近的进化关系，它们之间可能通过单个祖先基因横向迁移而形 成。褐色高温单孢菌( 又称赭色嗜热单孢菌，t h e r m o m o n o s p o r a f u s e a ) 嗜热性 木聚糖酶a 属于家族l l ( i r w i ne t a l ，1 9 9 4 ) 。然而在家族1 1 木聚糖酶中并未发现非 催化域赋予酶热稳定性，其中的个原因是它们天生具有热稳定性，而不象家 族1 0 酶那样能以折叠形式使蛋白质更易进化成为热稳定性酶f f o n t e se ta t ， 1 9 9 5 ) 。所有研究结果揭示嗜热性微生物的家族l o 木聚糖酶具有一个共同现象 即结构域提高了酶热稳定性。到目前为止，发现这些结构域仅存在于木聚糖酶 内，而在许多嗜热性内切葡聚糖酶中并没有这一结构域。 第四节木聚糖酶特性 有关细菌和真菌木聚糖酶生化特性方面研究较多。微生物木聚糖酶是单亚 基蛋白质，分子量为8 1 4 5k d a 的( s u r m ae ta 1 ，1 9 9 7 ) 。细菌和真菌内切木聚糖酶 的最适反应温度为4 0 6 0 ( 刘瑞田等，1 9 9 8 ) 。一般而言，真菌的木聚糖酶热稳 定低于细菌木聚糖酶，但有些嗜温性真菌也能产热稳定较高的木聚糖酶，如奇 异长喙壳( c e r a t o c y s t i s p a r a d o x a ) 的木聚糖酶在8 0 保温1 h 仍十分稳定( d e k k e r e t a l ，1 9 7 5 ) 。各种来源的木聚糖酶通常在p h 3 1 0 范围内稳定，最适p h 为4 7 。曲 霉s p e r g i l l u sk a w a c h i o ( 1 t oe ta 1 ，1 9 9 2 ) 和梅花状青霉( p e n i c i l l i u mh e r q u e i ) ( f u n a g u m ae t a l ，1 9 9 1 ) 等真菌木聚糖酶最适p h 偏酸性( p h 2 6 ) 。不同来源内切 木聚糖酶的等电点为3 - 1 0 。一般细菌产两种木聚糖酶即高分子量的酸性术聚糖 酶和低分子量的碱性术聚糖酶；但在真菌中并末发现这种关系，通常存在的是 低分子量碱性木聚糖酶。据分析各种木聚糖酶氨基酸组成中大量存在天门冬氨 酸、谷氨酸、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸。 4 1 碳水化合物含量 真核微生物的木聚糖酶普遍存在糖基化( f u n a g u m a e la 1 ，1 9 9 1 o 粪堆梭菌 ( c l o s t r i d i u ms t e r c o r a r i u m ) ( b e r e n g e r e t a l ，1 9 8 5 ) 、链霉菌( s t r e p t o m y c e ss p ) 7 硕士学位论文 第一章前言 f m a r u ie ta 1 ，1 9 8 5 ) 和嗜碱嗜温性芽孢菌( d e ye ta 1 ，1 9 9 2 ) 等原核微生物的木聚 糖酶也为糖蛋白。碳水化合物和木聚糖酶蛋白以共价键方式连接，或以可分离 的形式与木聚糖酶蛋白结合。糖基化对于酶蛋白在极端环境中的稳定性极为重 要( m e r i v u o r i e ra i ，i 9 8 5 ) 。嗜碱嗜热芽孢菌的重组木聚糖酶在大肠杆菌表达 ( k u l k a r n ie ta 1 ，1 9 9 5 ) 说明，脱糖基化的重组表达酶与野生型木聚糖酶相比，热 稳定性下降，并且与木聚糖的结合能力也降低。t a t a r o m y c e sb y s s o c h l a m y d o i d e s y h 一5 0 木聚糖酶中的碳水化合物有甘露糖、葡萄糖和果糖( y o s h i o k ae t a 1 ， 1 9 8 1 ) 。 4 2 底物特异性 木聚糖酶作用机理的研究一般涉及酶的底物特异性、底物侧链基团对酶活 的影响、底物特异键的断裂和水解终产物等方面。有关真菌木聚糖酶的研究较 多，除了都能水解木聚糖主链外，它们又可分为非脱支和脱支两种类型，前者 不释放阿拉伯糖，后者从侧链上释放阿拉伯糖( r e i l y , 1 9 8 1 ) 。租糙脉孢菌 ( n e u r o s p o r ac r a s s a ) ( m i s h r ae ta 1 ，1 9 8 4 ) 和黑曲霉( 爿n i g e r ) f t a k e n i s h ie ta 1 1 9 7 3 ) 等许多真菌木聚糖酶能从阿拉伯木聚糖中释放出阿拉伯糖；链霉菌 ( s t r e p t o m y c e sr o s e i s c l e o r t i e u s ) 的内切木聚糖酶为脱支型酶；但木霉 ( t r i c h o d e r m ah a r z i a n u m ) ( w o n ge ta 1 ，1 9 8 6 ) 和另一株黑曲霉( a 盯i g e r ) 木聚 糖酶不能从阿拉伯木聚糖中释放出阿拉伯糖；从康宁木霉( zk o n i n g i i ) 、奇异 长喙壳( c e r a t o c y s t i s p a r a d o x a ) 和其它微生物中发现了脱支和非脱支两种木聚 糖酶；从泡盛蓝霉( 4 a w a m o r i ) 分离到一种新木聚糖酶，该酶能从谷物阿拉 伯木聚糖中释放出阿拉伯糖，特异性地水解与木糖相连的取代基，而不能水解 木聚耱主链( k o r m e l i n k e la 1 ，1 9 9 1 ) 。 一般分支程度高的多糖侧链基团会干扰木聚糖酶活性。黑曲霉( a n i g e r ) 、 绿色木霉( rv i r i d e ) 和其它来源的木聚糖酶对木聚糖分支附近的主链有较高 亲和力( d e k k e re ta 1 ，1 9 7 6 ) 。木聚糖酶对不同纤维素类底物的活性也不同。少 数木聚糖酶只能水解木聚糖，而疣孢漆斑菌( m y r o t h e c i u mv e r r u c a r i a ) 、胶囊 青霉( p e n i c i l l i u mc a p s u l a t u m ) 和绳状青霉( pf u n i c u l o s u m ) 等非特异性的木 聚糖酶能同时水解羧甲基纤维素和木聚糖。特异性较低的木聚糖酶与特异性高 的木聚糖酶的之间差异可能是催化基团不同之故。一般来说，木聚糖酶对糖苷 硕士学位论文第一章前言 键具有特异性( d e k k e re ta 1 ，1 9 7 6 ) 。据报道热纤维梭菌( c t h e r m o c e l l u m ) 内 切葡聚糖酶能水解大麦中的p 一1 ，3 连接键、以及其它底物中的b 一葡聚糖和b 1 ，3 连接键。由于它们在催化位点两侧含有立体结构特异性的结合位点，因此 内切葡聚糖酶的转糖基化作用会产生与底物相同的连接键产物( c o u g h l a n ， 1 9 9 2 ) 。浅白隐球酵母( c r y p t o c o c c u sa l b i d u s ) 的木聚糖酶由于转糖基化作用而 形成1 ，3 b - d 一连接键( b i e l ye ta 1 ，1 9 8 3 ) 。 第五节木聚糖酶的作用机理 亚位点图谱研究和终产物分析对于了解木聚糖酶作用模式具有重要作用。 采用动力学和终产物分析技术，分析了黑曲霉( 4 n i g e r ) 的内切木聚糖酶的亚 位点图谱。该酶不能水解木二糖，但随着木寡糖长度的增加，酶对木寡糖底物 的亲和力逐步提高。由于内切木聚糖酶的底物结合位点是由八个亚位点和居中 间的催化位点组成，因此木二糖不能与酶形成复合物。研究发现，较长的木寡 糖在水解过程中能与木聚耱酶形成复合物。在黑曲霉本聚糖酶中存在有五个亚 位点，而且催化位点位于第三个和第四个亚位点之f 日q ( m e a g h e re ta 1 1 9 8 8 ) 。 s i m o n 等( 1 9 9 7 ) 研究揭示萤光假单胞菌( p s e u d o m o n a s u o r e s c e n s ) 木聚糖酶a 的底物结合位点裂缝中存在有另一个亚位点( 亚位点f ，即第六个木糖结合位 点) 。现已证实木聚糖酶a 中亚位点f 的主要功能是阻止小分子寡糖形成非酶底 物复合物。一株不同黑曲霉菌株的内切木聚糖酶具有七个亚位点( v r s a n s k a 8 f 口， 1 9 8 2 ) ，而浅白隐球酵母( c r y p t o c o c c u sa l b i d u s ) 木聚糖酶有四个亚位点，且中 间带催化基团( b e i l y e ta 1 ，1 9 8 1 ) 。采用核磁共振光谱和甲基化分析技术，d e b e i r e 等( 1 9 9 0 ) 研究了热乳梭菌( c l o s t r i d i u mt h e r m o l a c t i c u m ) 木聚糖酶亚位点，并 分析了水解终产物的结构，结果发现该酶有五个亚位点a e ，分别结合五个木糖 环a e ，催化位点位于木糖环b c 之间，亚位点d 和e 结合木糖残基与亚位点a 、b 和c 不同。木聚糖酶作用模式的不同和底物被分解释放出终产物长度的不同， 可能与木聚糖酶具有不同亚位点数目有关。 一般认为糖水解酶的催化机理与溶菌酶相似。本聚糖酶和纤维素酶的水解 反应是通过两个氨基酸的酸碱机制实现。第一个氨基酸作为催化剂，并使糖 苷键上的氧质子化；第二个氨基酸作为亲核试剂，与带正电荷的氧代有机离子 的中间代谢物相互作用，或促进水分子形成一个o h 离子。维持构象反应存在 9 硕士学位论文 第一章前言 一个两步机制：质子转移到异头中心平伏位的氧原子上；此后再转出( s i n n o t ， 1 9 9 0 ) 。该反应机理与溶菌酶相似( k e l l ye ta l ，1 9 7 9 ) 。淀粉酶是通过单置换 反应使构象倒置( t h o m ae ta 1 ，l9 7 i ) ，因此单个氨基酸残基( 酸碱催化剂) 在 质子转移过程中可能都起作用，而木聚糖酶主要为双置换机理即糖基化酶中间 体的形成和构象转位状态的氧代有机离子的水解。 根据环状芽孢杆菌木聚糖酶与底物结合复合物的晶体学结构，w a k a r c h u k 等( 1 9 9 4 ) 认为g l u 7 8 和g l u l 7 2 分别为亲核和酸碱催化剂。由于羧基侧链缩 短和伸长都会导致恕。，值一定程度的降( 氏( l a w s o n e ta 1 ，1 9 9 7 ) ，因此酸碱催 化残基位置的精确性对反应并非关键。这一点正好与催化亲核残基g l u 7 8 需要 精确位置相反。因此质子转移对位鸯的要求并不严格。当p h 上升时，里氏木霉 木聚糖酶i i 的谷氨酸残基的构象发生变化，该特性对于催化十分重要，由于它 的触发反应，从而有利于水分子进攻底物( t o r r o n e ne ta 1 ，1 9 9 4 ) 。进一步研究表 明，二糖中末端糖的基本功能是改善酸催化和亲核配对，从而提高糖基酶中间 体的形成速率，但不影响其降解速率( c o u g h a n ，1 9 9 2 ) 。根据酶结构和突变研究 结果能确定亲核氨基酸残基。t u l i 等( 1 9 9 1 ) 发现粪肥纤维单胞菌cf i m i 外切葡 聚糖酶木聚糖酶c e x 的g l u 2 7 4 为亲核残基，而g l u l 2 7 为酸碱催化残基 ( m a c l e o de ta 1 ，19 9 4 ) 。 综合各种研究结果表明，家族l l 木聚糖酶的催化反应是通过双置换机制实 现。但是黑曲霉的内切木聚糖酶( c o u g h l a n ，1 9 9 2 ) 的催化反应是一种通过酶倒置 而进行单置换反应机制( 图1 2 ) 。对环状芽孢杆菌术聚糖酶进行n m r 分析表明， 在i l e l l8 的h n 和t r p 7 1 的吲哚环之间，氨基化合物和芳香族化合物之间能形成 氢键，这种反应在已知低分子量木聚糖酶中相当保守，对建立木聚糖酶活性构 象起着重要作用( p l e s n i a ke ta 1 ，1 9 9 6 ) 。根据萤光假单胞菌( 户f l u o r e s c e n s ) ( s p u r w a y e ta 1 ，1 9 9 7 ) 木聚糖酶x 衍射晶体结构和粪肥纤维单胞菌( c f i m i ) 外 切葡聚糖酶木聚糖酶( t u l le ta 1 ，1 9 9 4 ) 动力学特征，发现家族1 0 木聚糖酶水解 底物是通过网状的异头构象进行。 硕士学位论文 第一章前言 釜述羞兰兰篡裂蹴獗麓黼躺蒜兰兰蓑誉 叫呷吣 q 蛐m 曲l o “一- 目4 f q l 图1 - 2 木聚糖酶反应机制：( 1 ) 单置换机制：( 2 ) 双置换机制 第六节影响木聚糖酶产量的因素 一般来说，真菌的木聚糖酶的酶活高于细菌。在真菌中里氏木霉 ( t r i c h o d e r m a r e e s e i ) 酶活最高，达3 3 5 0 1 u m l ( h a a p a l a e ta 1 ，1 9 9 4 ) ：固体发酵 酶活最高为真菌类的裂褶菌( s c h i z o p h y l l u mc o m m u n e ) ，达2 2 7 0 0i u g ( h a l t r i c h 吖 a 1 ，1 9 9 2 ) ；据报道木霉( t r i c h o d e r m ah a m a t u m ) 以小麦秆为底物进行发酵，其 干基木聚糖酶活性为7 0 0 0 i u g ( g r a j e k ，1 9 8 7 ) 。但底物的选择和培养基的优化等 因素也影响木聚糖酶产量。木霉和曲霉常用本聚糖作为碳源生产木聚糖酶，用 纤维素作为碳源会同时产生纤维素酶和木聚糖酶，这可能与纤维素底物中存在 微量的半纤维素有关( b i e l y ，1 9 9 3 ) 。一些真菌生长在无纤维素且氮碳比低的培 养基中，也许是一种生产无纤维素酶的木聚糖