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猪肌肉生长抑制素基因表达规律及其调控 与肌肉生长量的关系研究 ( 摘要) 瘦肉含量是猪肉品质的重要因素之一，动物的瘦肉率与其肌纤维细胞的数量和生 长密切相关，大量研究证明肌肉生长抑制素( m s t n ) 基因是影响动物骨骼肌生长发 育的重要候选基因之一。为了考察不同品种猪m s t n 基因的表达规律及其表达量与肉 品质( 尤其是瘦肉率) 的关系，本研究包括以下几个试验： 1 不同品种猪m s t n 基因表达规律的研究：采用荧光定量p c r 方法，以1 3 a c t i n 基因为内标，研究汉普夏猪和长撒猪( 长白撤坝猪) 在不同体重阶段( 2 0 k g 、5 0 k g 和1 0 0 k g ) 时背最长肌的m s t n 基因表达量，同时考察试验猪在1 0 0 k g 时胴体肉质指标。 结果表明：猪背最长肌中m s t n 基因的表达随体重的增加呈上升的趋势( 尸 o 0 5 ) ； 相同体重条件下长撒猪背最长肌中m s t n 基因表达均显著高于汉普夏猪( p 0 0 5 ) ， 其q j 2 0 k g 时达到极显著水平( p o 0 1 ) ；m s t n 基因的表达量与瘦肉率呈极显著负 相关( 尸 0 0 1 ) ，与背膘厚呈极显著正相关( 尸 0 0 5 ) 。本研究结果表明猪背最长肌的m s t n 基因的表达量随体 重增加而提高，品种间差异显著，并且m s t n 基因的表达量与瘦肉率、背膘厚存在显 著的相关性。 2 营养水平对猪肉品质和m s t n 基因表达量影响的研究：选择平均体重为 6 4 2 4 + 2 6 6 蚝杜洛克长白大白三元杂交猪( d l y ) 2 4 头，随机分为2 个处理，每个 处理6 个重复，每个重复2 头猪，两个处理分别饲喂高营养水平( d e = 1 3 8 1 m j 瓜g ， c p = 1 4 1 9 ) 和低营养水平( d e = 1 2 5 5 m j k g ，c p = 1 1 0 8 ) 饲粮。在体重：1 0 0 k g 时， 每个重复选择一头猪屠宰取样。结果表明：与低营养水平处理组相比，高营养水平处 理组日采食量和料肉比分别降低了5 0 7 ( p o 0 5 ) ，肌肉的滴水损失和肌内脂肪分别降低了1 6 8 ( p 0 0 5 ) 和3 7 2 8 ( p 0 0 5 ) 。本研究结果表明猪背最长肌中m s t n 基因 的表达量随体重增加而提高，品种间差异显著，日粮营养水平对m s t n 基因的表达量 没有显著影响，并且品种和营养水平对m s t n 基因的表达量的交互效应不显著。 4 肌肉生长抑制素主动免疫对肌肉生长量的调控：选择平均体重为2 5 池1 埏 健康、阉割的杜洛克长白大白三元杂交猪( d l y ) 2 7 头，随机分为3 个处理，即对 照组( 生理盐水) 、高剂量免疫组( 4 m g 蛋白) 和低剂量免疫组( 1 m g 蛋白) ，每个 处理9 个重复，每个重复1 头猪。在体重达6 0 k g 和1 0 0 k g 时，各处理组分别屠宰3 头和6 头。结果表明：在4 2 d 和8 4 d 时，高剂量和低剂量免疫组的血清肌抑素抗体滴度均极显 著高于对照组0 0 0 1 ) ，而免疫组之间差异不显著。1 0 0 k g 时，主动免疫处理组的胴 体瘦肉率均极显著高于对照组0 o 0 5 ) t h el o n g i s s i m u s m y o s t a t i ng e n ee x p r e s s i o no fc h a n g s ap i gw a sg r e a t l ys i g n i f i c a n t l yo rs i g n i f i c a n t l yh i g h e r t h a nt h a to ft h eh a m p s h i r ea tt h es a n l eb o d yw e i g h t t h ee x p r e s s i o no fm y o s t a t i nh a d g r e a t l ys i g n i f i c a n tp o s i t i v ec o r r e l a t i o nw i t hb a c k f a tt h i c k n e s s ( p 0 01 ) a n dg r e a t l y s i g n i f i c a n tn e g a t i v ec o r r e l a t i o nw i t hl e a np e r c e n t a g e ( 尸 0 0 1 ) t h er e s u l t sd e m o n s t r a t e d t h a tt h e l o n g i s s i m u sm y o s t a t i ng e n ei n c r e a s e de x p r e s s i o nw i t l lt h eg r o w t ha n di t s e x p r e s s i o nw a ss i g n i f i c a n t l ya f f e c t e db yb r e e d so fp i g t h er e s u l t so ft h ec o r r e l a t i v i t y a n a l y s i sa m o n gm y o s t a t i n , c a r c a s sq u a l i t ya n dm e a tq u a l i t y , i n d i c a t e dt h a tt h ee x p r e s s i o n o fm y o s t a t i nh a dd i f f e r e n ts i z ec o r r e l a t i o n sc o e f f i c i e n t sw i t hc a r c a s sq u a l i t ya n dm e a t q u a l i t y 2 e f f e c to fn u t r i t i v el e v e lo nm e a tq u a l i t ya n dm s t n g e n ee x p r e s s i o ni np i g s ：2 4 x i d l y ( d u r o c x l a n d r a n c e x y o r k s h i r e ) 、 ，i mb w6 4 2 4 士2 6 6 k gw e r ea l l o t t e di n t o2g r o u p s o n eg r o u pw a sf e dh i g hn u t r i t i v el e v e l ( d e = 1 3 8 1 m j k g ，c p = 1 4 1 9 ) ，a n dt h eo t h e rw a s f e dl o wn u t r i t i v el e v e l ( d e = 1 2 5 5 m j k g ，c p = i1 0 8 ) s i xp i g sw e r es l a u g h t e r e di ne a c h g r o u pa tb w 10 0 k g t h er e s u l ti n d i c a t e dt h a tt h ea f ia n df gr e s p e c t i v e l yw a sd e c r e a s e d 5 0 7 ( p o 0 5 ) a n d8 7 5 ( p o 0 5 ) f o r p i gf e dh i g hn u t r i e n tl e v e lc o m p a r e d t ol o wn u t r i t i v el e v e l t h ec a r c a s sl e a np e r c e n t a g ea n d l o i nm u s c l ea r e ar e s p e c t i v e l yw e r ei n c r e a s e d4 4 6 a n d4 2 8 ，d r o pl o s sa n d i n t r a m u s c u l a rf a tw e r ei n c r e a s e d16 8 a n d3 7 3 b u tt h ee x p r e s s i o no fm s t ng e n ew a s n o to b v i o u s l yi n f l u e n c e db yn u t r i t i o nl e v e l i ti sc o n c l u d e dt h a tn u t r i t i o nl e v e lc o u l d i n f l u e n c ec a r c a s sq u a l i t y , b u tn o ti n f l u e n c et h ee x p r e s s i o no fm s t ng e n e 3 e f f e c to fb r e e da n dn u t r i t i o nl e v e lo nt h ee x p r e s s i o no fm y o s t a t i ni np i g s ：t h e r e a l - t i m eq u a n t i t a t i v ep c rw i t h1 3 - a c t i nm r n a 觞i n t e r n a ls t a n d a r dw a sa p p l i e dt o d e t e r m i n et h el e v e l so fm y o s t a t i nm r n a t h ee x p e r i m e n t a ld e s i g nw a sa2 x 2f a c t o r i a l a r r a n g e m e n t , i n c l u d i n g2b r e e d ( r o n g c h a n gp i g sa n dc h a n g r o n gp i g s ) a n d2n u t r i t i o n l e v e l s ( f e e d i n gs t a n d a r df o rr o n g c h a n gp i g sa n dc h i n af e e d i n gs t a n d a r df o rl e a n t y p e p i g s ) 12 0p i g s ( 6 0r o n g c h a n gp i g sa n d6 0c h a n g r o n gp i g s ) w e r ea l l o t t e di n t o4g r o u p s ( 6 r e p e a t sp e rg r o u pa n d5p i g sp e rr e p e a t ) s i xp i g sw e r ek i l l e db ye l e c t r i c a ls t u n n i n g f o l l o w e db ye x s a n g u i n a t i o na tb wo f2 0 k g ，3 5 k g ，5 0 k g ，8 0 k ga n dll0 k gr e s p e c t i v e l y t h e r e s u l ti n d i c a t e dt h a tt h ee x p r e s s i o no fm s t nh a da ni n c r e a s i n gt e n d e n c yi nb o t hb r e e d so f p i g sw i t ht h ei n c r e a s i n go fb o d yw e i g h t a n dt h el o n g i s s i m u sm s t ng e n ee x p r e s s i o no f r o n g c h a n gp i g s w a sg r e a t l y s i g n i f i c a n t l yo rs i g n i f i c a n t l yh i g h e rt h a nt h a to ft h e c h a n g r o n gp i g sa tt h es a m eb o d yw e i g h t t h ee x p r e s s i o no fm s t ng e n ew a sn o t o b v i o u s l yi n f l u e n c e db yn u t r i t i o nl e v e l ，n e i t h e rb yt h ei n t e r a c t i o no fb r e e da n dn u t i t i o n l e v e l s t h er e s u l t ss u g g e s t e dt h a tt h el o n g i s s i m u sm s t ng e n ee x p r e s s i o nw a si n c r e a s e d w i t ht h eg r o w t ha n di t se x p r e s s i o nw a ss i g n i f i c a n t l ya f f e c t e db yb r e e d so fp i g ；a n dt h e e x p r e s s i o no fm s t ng e n e w a sn o to b v i o u s l yi n f l u e n c e db yn u t r i t i o nl e v e l 4 e f f e c t so fa c t i v ei m m u n i z a t i o na g a i n s tm y o s t a t i no nm u s c l em a s si np i g s ： t w e n t y - s e v e np i g sw e r ea l l o t t e di n t ot h r e eg r o u p s ( 9p i g sp e rg r o u p ) t h r e ea n ds i xp i g s w e r ek i l l e db ye l e c t r i c a ls t u n n i n gf o l l o w e db ye x s a n g u i n a t i o na tb wo f6 0a n d1 0 0 k g r e s p e c t i v e l y t h et r e a t e dg r o u p sw e r ei m m u n i z e dw i t hl m ga n d4 m gm y o s t a t i na n dt h e x i i c o n t r o lg r o u pw a s 侧e c t e d 、) l ，i 也t h es a n l ev o l u m eo fp h y s i o l o g i c a ls a l i n e t h er e s u l t s i n d i c a t e dt h a tt h et i t e ro fm y o s t a t i na n t i b o d yw a si n c r e a s e di nt r e a t e dg r o u p sc o m p a r e dt o t h ec o n t r o lg r o u pa t d 4 2 ( p 0 01 ) a n dd 8 40 o 01 ) r e s p e c t i v e l y n os i g n i f i c a n t d i f f e r e n c ew a so b s e r v e di nt h et i t e ro fm s t n a n t i b o d yb e t w e e nt w ot r e a t e dg r o u p s t h e c a r c a s sl e a np e r c e n t a g ew a ss i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e di nt r e a t e dg r o u p sc o m p a r e dt ot h e c o n t r o lg r o u pa t10 0k gb w ( p 0 0 1 ) t h ea c t i v i t yo fe r e a t i n ek i n a s ei nm u s c l eo fp i g t r e a t e dw i t hi m ga n d4 m gm y o s t a t i no b v i o u s l yd e c r e a s e dc o m p a r e dt ot h ec o n t r o lg r o u pa t 10 0 k gb w a t6 0k gb wa n d10 0k gb wt h ei m m u n i z a t i o no fm y o s t a t i no b v i o u s l y d e c r e a s e dt h eg e n ee x p r e s s i o nl e v e l so fm y o s t a t i ni nm u s c l ea n dg r e a t l ys i g n i f i c a n t i n c r e a s e dt h ed i a m e t e ra n da r e ao fm u s c l ef i b e r i tw a sc o n c l u d e dt h a to p t i m a la c t i v e i m m u n i z a t i o na g a i n s tm y o s t a t i nc o u l di n c r e a s et h ec o n t e n to fm y o s t a t i na n t i b o d ya n dt h e d i a m e t e ra n da r e ao fm u s c l ef i b e r , s u p p r e s st h ea c t i v i t yo fc r e a t i n ek i n a s ea n dt h e e x p r e s s i o no fm y o s t a t i ng e n e ，a n di nr e s u l ti m p r o v et h ec a r c a s sl e a np e r c e n t a g ef o rp i 擎 5 c o n s t r u c t i o no fr e c o m b i n a n ty e a s tw x p r e s s i o nv e c t o ro fm s t n ：s p e c i f i c p r i m e r so fm s t nw e r ed e v i s e da c c o r d i n gt ot h eg e n o m es e q u e n c eo fm s t n ，a n dt h e e n z y m e c u r i n gs i t e sw e r ee c o ri a n dn o ti r e s p e c t i v e l y t h et a r g e tr t - 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m e a tt y p ew a so b v i o u s l yl o w e r t h a nt h a to fc h i n e s el o c a lb r e e dp i g so rt h a to fc r o s s b r e e dp i g si n c l u d i n gc h i n e s el o c a l x i b r e e dp i g s ；t h em s t ng e n ee x p r e s s i o nf o rc r o s s - b r e e d p i g si n c l u d i n gc h i n e s el o c a l b r e e dp i g sw a so b v i o u s l yl o w e rt h a nt h a to fc h i n e s el o c a lb r e e dp i g s ；a n dt h ee x p r e s s i o n o fm s t n g e n eh a dg r e a t l ys i g n i f i c a n tn e g a t i v ec o r r e l a t i o nw i t hc a r c a s sl e a np e r c e n t a g e ( 2 ) t h ee x p r e s s i o no fm s t ng e n ew a sn o to b v i o u s l yi n f l u e n c e db yn u t r i t i o nl e v e l ( 3 ) a c t i v ei m m u n i z a t i o na g a i n s tm s t nc o u l di n c r e a s et h ec o n t e n to fm y o s t a t i n a n t i b o d y , t h ed i a m e t e ra n da r e ao fm u s c l ef i b e r , s u p p r e s st h ea c t i v i t yo fc ka n dt h e e x p r e s s i o no fm y o s t a t i ng e n e ，a n di nr e s u l ti m p r o v et h ec a r c a s sl e a np e r c e n t a g ef o rp i g s k e yw o r d s ：m y o s t a t i n ；e x p r e s s i o np a t t e r n ；m a n i p u l a t i o n ；c a r c a s sq u a l i t y ；p i g s x m s ，n 叮 g d f 8 t g f - 1 3 f l r g g a s p 1 m y o d m y f - 5 江s m y h c l d h c k m r n a p c r r q p c r r t c t l b a m p x - g a l i p t g d d h 2 0 c d na d n t p p c n a 常用的英文缩写词汇含义说明 肌肉生长抑制素( m y o s t a t i n ) 生长分化因子8 ( g r o w t h d i f f e r e n t i a t i o nf a c t o r8 ) 转化生长因子p ( t r a n s f o r m i n gg r o w t hf a e t o r l 3 ) 卵泡抑素相关基因( f o l l i s t a t i n - r e l a t e dg e n e ) 生长分化因子相关血清蛋白一1 ( g r o w t ha n dd i f f e r e n t i a t i o n f a c t o r - a s s o c i a t e ds e r u mp r o t e i n - 1 ) 过氧化物酶体增殖子活化受体吖( p e r o x i s o m ep r o l i f e r a t o r s a c t i v a t i o nr e c e p t o r 丫 肌分化因子 生肌因子5 ( m y o g e n i cf a c t o r5 ) 生肌调节因子( m y o g e n i cr e g u l a t o r yf a c t o r s ) 肌球蛋白重链( m y o s i nh e a v yc h a i n ) 乳酸脱氢酶( 1 a c t i ca c i dd e h y d r o g e n a s e ) 肌酸激酶( c r e a t i n ek i n a s e ) 信使r n a ( m e s s e n g e ri 蝌a ) 聚合酶链式反应( p o l y m e r a s e c h a i nr e a c t i o n ) r e a l t i m eq u a n t i t a t i v ep c r ( 实时荧光定量p c r ) 逆转录( r e v e r s et r a n s c r i p t ) 阈值循环数( c y c l et h r e s h o l d ) l u r i a b e r t a n i 培养基 氨苄青霉素( a m p i c i l l i n ) 5 溴4 氯3 吲哚p d 半乳糖苷 异丙基一b d 硫代半乳糖苷( i s o p r o p y lt h i o p d - g a l a c t o s i d e ) 双蒸水 互补d n a ( c o m p l e m e n t a r y d n a ) 脱氧三磷酸核苷( d e o x y r i b o n u c l e o s i d et r i p h o s p h a t e ) 增殖细胞核抗原( p r o l i f e r a t i n gc e l ln u c l e a ra n t i g e n ) 论文独创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行研究工作所取得的 成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，学位论文中不包含其他个 人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得i 四) l l 农业大学或其它教育机 构的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已 在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 一徘龙定细 闻年7 月r 口日 关于论文使用授权的声明 本人完全了解四川农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国家有 关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。可以采用影印、缩印或扫描 等复制手段保存、汇编学位论文。同意四川农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学 位论文的全部或部分内容。 研究生签名： 导师签名： 龙应都 j 倦乏妥 i v 加g 年7 月o e l 四川农业大学博士学位论文 上l 刖吾 随着现代养猪业的发展和人们生活水平的提高，人们对猪肉品质的要求越来越 高，如何提猪肉品质是当前养猪业的一个热点问题。肉品质主要包括肌肉质量、背膘 质量和食用质量，其中瘦肉含量是肉品质的重要因素。动物的瘦肉率与其肌纤维细胞 的数量和生长密切相关，大量实验证明肌肉生长抑制素基因是影响动物骨骼肌生长发 育的重要候选基因之一。 1 9 9 7 年m c p h e 盯0 n 等【1 】在研究t g f 1 3 ，通过简并引物p c r 方法，扩增出一个约2 8 0 k b 的新产物，以此为探针筛小鼠骨骼肌e d n a 文库，得到全长e d n a 序列，该e d n a 只有 一个可读框，可编码3 7 5 个氨基酸，其结构具有t g f 1 3 超家族的典型特征。同源性实 验证明此基因属于转化生长因子d 超家族成员。进一步研究发现，肌肉生长抑制素主 要在小鼠的骨骼肌中表达，利用基因敲除技术研究它的功能发现，m y o s t a t i n 基因敲除 鼠的骨骼肌是正常野生型小鼠的3 倍以上，其肩、臀部的肌肉明显肥大，整个身体的 骨骼肌都比野生型的小鼠大得多，单块肌肉的重量约为野生小鼠的2 3 倍，从而导致 了体重的增加。突变型小鼠的骨骼肌纤维数目比野生型小鼠高出8 6 ( p 0 0 1 ) ，表 明突变小鼠骨骼肌肥大的原因既有肌细胞的增生也有肌纤维的肥大，但在其他生长发 育性状上没有发现任何表型的差异。随后，k a m b a d u r 等( 1 9 9 7 ) 【2 】报道了在具有双肌 现象的比利时兰牛和皮埃蒙特牛均与m y o s t a t i n 基因失活密切相关。这些结果均表明 m y o s t a t i n 基因是骨骼肌生长的负面调控因子。鉴于该基因对骨骼肌生长有副调控作 用，并且有肌肉组织特异性表达的特点，因此命名为肌肉生长抑制素( 肌抑素) ，又 称为生长分化因子8 ( g d f 8 ) 。 肌抑素具有共同的功能，且高度保守。就羧基末端成熟区域而言，g d f 8 在不同 物种间十分保守，大鼠、人、猪、鸡、火鸡、小鼠的同源性达1 0 0 ；狒狒、牛、羊 的肌抑素仅与成熟肌抑素蛋白相差3 个氨基酸；斑马鱼的肌抑素变异较大，成熟区域 的同源性仅为8 8 【3 】。目前对于肌抑素对骨骼肌负调控的研究主要集中在鼠和牛上， 其中鼠上的研究大多是通过肌抑素缺失变异或过量表达后对肌肉生长的影响，而牛上 的研究主要是对当前存在的双肌牛品种的研究。关于肌抑素对猪的骨骼肌影响的研究 有待于开展，这对于调控猪肉品质是极具重要的意义。 本研究拟考察不同品种猪的骨骼肌中肌抑素基因在不同屠宰体重时表达的规律， 四川农业大学博士学位论文 并进一步研究营养水平和重组肌抑素主动免疫对生长猪肌肉生长及相应基因的表达 的影响，并构建出肌抑素的真核表达载体，从而了解肌抑素的表达规律，并通过营养 或免疫手段来调控肌抑素基因的表达和肉品质。 2 四川农业大学博士学位论文 1 肌抑素的概述 第一部分文献综述 1 1t g f p 超家族 转化生长因子p ( t g f p ) 超家族是以多肽形式存在的细胞因子，广泛分布于脊 椎动物和无脊椎动物，这些蛋白在胚胎发育和成熟组织内环境稳定方面发挥着不同的 功能。迄今为止，至少已发现了3 0 种结构相关的蛋白，包括t g f d s 、骨形态发生蛋 白( b m p s ) 、活化素( a c t i v i n ) 、抑制素( i n h i b i t ) 、生长分化因子( g d f s ) 、缪 勒氏管抑制物( m i s ) 、果蝇中的d p p 、g b b 6 0 a 、s c r e w 和d a c t i v i n 、尼采蝇中的d a f - 7 、 d b l 1 、l i l a c 12 9 和廿g 2 等组成。 t g f p 超家族的所有成员都具有一些共同的结构特征。在合成初期，t g f p 超家 族都是以一个分子量较大的前体蛋白形式存在。该前体蛋白含有一个氨基末端信号肽 序列、一个前肽区域和一个成熟区域( 羧基末端区域) 。氨基末端信号肽可能指导前 体蛋白的分泌；而可变的前肽区域则可能有助于t g f d 超家族成员的折叠、二聚体的 形成及调控；成熟区域则是具有高度保守序列的羧基末端形成的同型或异型二聚体。 绝大多数t g f p 超家族成员都含有7 个保守的半胱氨酸残基，其中6 个半胱氨酸残基形 成3 个单体内二硫键，将几个p 片层结构连接在一起，形成一个半胱氨酸结的刚性结构， 使t g f 1 3 超家族在各种构想中保持稳定性。第7 个半胱氨酸形成一个单体间二硫键， 将两个单体连接在一起，构成具有生物活性的二聚体。在t g f b 超家族中，只有g d f 3 和g d f 9 缺失链间二硫键，其单体间靠疏水键来维系。 1 2 肌抑素的结构 肌抑素蛋白的预定结构是通过对t g f b 家族成员的基本序列显示的经典结构所 推论出来的。但是肌抑素与t g f p 超家族其他成员在发育期间表达存在差异，肌抑素 的表达被限于正发育的骨骼肌中，而参与负调控肌形成的t g f 1 3 超家族其他成员则表 达于邻近组织【4 】。肌抑素是主要由骨骼肌合成的含3 7 5 个氨基酸的前体蛋白，是以含 有一个n 一末端分泌信号的前体蛋白形式存在。肌抑素具有t g f p 超家族的共同特性： 含有一个信号肽序列，一个n 末端前肽区域和c 末端成熟区域存在一个保守的半胱氨 酸残基结构【5 1 。信号序列是加工和分泌所必需的，而前肽除了在前体蛋白正确折叠方 四川农业大学博士学位论文 面起作用，对蛋白酶水解加工后c 末端二聚体的活性也起调控作用【6 j 。研究报道，由 细菌产生的c 末端片段经纯化后，仅在很高的浓度下才具有生物效应( 1 0 0 5 0 0 # t ) ， 这就说明纯化的样品在没有前肽的情况下仅有一部分是正确折叠的c 末端二聚体【l 引。研究表明肌抑素蛋白在保守r s i m 位点被蛋白水解处理后产生一个4 0 k d a 前肽和 1 2 1 3 k d a 有活性的、被加工的成熟肽。加工后成熟肌抑素分子量的不一致原因可能 是翻译后的糖基化修饰所致。两分子的成熟肽形成二硫化同型二聚体，成熟的肌抑素 二聚体在分裂后仍和两分子前肽以非共价键结合，形成潜在的复合物。当肌抑素与前 肽以复合物存在时，肌抑素配体不能与其受体结合。成熟区域存在一个保守的半胱氨 酸残基结构形成的半胱氨酸结对于肌抑素功能的发挥具有重要作用，皮特兰牛肌抑素 的形成半胱氨酸结的3 1 3 c y s 变异为t y r 后，骨骼肌中的肌抑素m r n a 和肌抑素前体蛋 白提高，但是成熟肌抑素降低，进而不能对成肌细胞的分化起抑制作用【9 】。 血清中大多数循环的天然的肌抑素是同其前肽结合的，形成无活性的潜在复合物 【1 0 川】。l e e 和m c p h e r r o n ( 2 0 0 1 ) 【1 2 】对过表达肌抑素的中国仓鼠卵巢细胞( c h o ) 分 析发现，c h o 分泌的肌抑素蛋白是是前肽和c 末端二聚体以非共价键形式的复合物。 除了肌抑素前肽，卵泡抑素、f l r g ( 卵泡抑素相关基因) 、g a s p 1 ( g d f 8 相关血 清蛋白1 ) 等也能与肌抑素c 一末端二聚体结合，并在体内或体外负调节肌抑素的活性 【l o ，1 3 】 o 1 3 肌抑素蛋白的活化 在机体内发挥信号作用的肌抑素必须是以活化形式存在，而以前体蛋白质存在肌 抑素是没有生物活性的，肌抑素前体蛋白的活化可能是前肽的蛋白酶裂解【61 4 】。首先 是含有2 4 个氨基酸信号肽的分裂，以利于前体蛋白的分泌。第二次分裂位点是2 4 0 - 2 4 3 位氨基酸( 信号肽后的第一个氨基酸开始计数) 之间的r s r r 处( a r g s e r - a r g a r g ) ， 产生n - 末端和c 末端片段。第二次分裂所需要的体内的精确的蛋白酶还不清楚，由分 裂位点前的碱性氨基酸可推测该分裂是碱性氨基酸分裂酶完成的( p a c e ，也叫弗林 蛋白酶，为枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶家族成员) 。体外试验发现，当肌抑素在 中国仓鼠卵巢细胞中表达时，可溶形式的p a c e 能够在r s r r 位点完全分裂肌抑素前体 蛋白【1 2 1 。金属蛋白酶的骨结合蛋白一1 t o l l o i d 家族成员不仅能够分裂纯化的前肽，而且 能够分裂与c 末端二聚体结合的前肽，并且在复合物中前肽的分裂导致c 末端二聚体 的活化【1 4 1 。该蛋白酶裂解前肽的位点是天门冬氨酸7 6 ，这对于肌抑素成熟区域从结合 4 四川农业大学博士学位论文 位点释放是足够的。w o l f m a n 等( 2 0 0 3 ) 1 4 1 的体外研究表明将天门冬氨酸7 6 变异为丙 氨酸，前肽可耐受b m p 1 t o l l o i d 蛋白酶的蛋白质水解作用，并且将变异的前肽注射给 鼠( 共注射4 次) 导致肌肉生长大约提高了2 5 ；而野生型对照肌肉量无变化。h u e t 等( 2 0 0 1 ) 1 5 l 对c 2 c 1 2 细胞研究结果也表明金属蛋白酶在肌抑素的加工过程中可能起 作用，当c 2 c 1 2 细胞用金属蛋白酶的小分子抑制剂处理后，使得未加工的肌抑素比例 提高并导致肌纤维肥大，推测可能是因为这些细胞产生的成熟肌抑素蛋白减少的结 果。然而，迄今为止没有发现到可用于直接分裂肌抑素前体蛋白碱基位点的金属蛋白 酶 6 1 ，但是肌肉中存在的特定的金属蛋白酶执行着这一功能。 1 4 肌抑素的信号转导 被活化后，肌抑素c 末端二聚体能够与受体结合，并在靶细胞中活化信号转导。 肌抑素信号主要是通过t g - f 9 活化素n o 蹦途径【1 6 1 ，即i 型和i i 型丝氨酸苏氨酸激酶 受体转导的。肌抑素在体内的信号转导途径如下：肌抑素首先与i i 型受体( a c t r i i b ) 结合，然后肌抑素a c t ri ib 复合物与i 型受体( a l k 4 或a l k 5 ) 结合【1 6 1 ，i 型受体 通过a c 儇i ib 富含甘氨酸丝氨酸区域磷酸化而被激活，然后磷酸化r - i 受体活化 s m a d s ，s m a d s 与其他的s m a d s 活化后移入细胞核，结合转录因子并调控靶基斟1 7 】。 2 肌抑素的生物学作用 2 1 对肌肉组织生长的影响 众所周知任何特定组织的大小取决于该组织所含的细胞数量和大小以及细胞外 基质和液体。骨骼肌形成起始于肌节处的多功能中胚层细胞，这些用于肌肉生成的细 胞成为生肌细胞，生肌细胞单核细胞融合形成多核细胞( 肌管) ，这些肌管最终发育 成成熟的肌纤维。肌纤维数量很大程度上在出生时前就已固赳1 8 】，因此胚胎和胎儿期 肌肉生长主要是通过肌纤维数量的逐渐增大( 增生) ；而出生后的肌肉生长通过已存 在肌纤维的膨胀( 肥大) 。 大量的证据表明机体内成肌细胞和卫