（农药学专业论文）葛根化学成份分离及生物活性研究.pdf

摘要 近年来，具有天然活性成分的中草药在农药和医药上得到广泛应用。中药葛根 是一种重要的传统中药材，来源于豆科植物野葛p h p 珊t 粥却“劬册埘或甘葛藤 p 孵r 口r f 韶腩绷加删髓聍加的干燥根。是中医常用的扶风解表药之一，具有降低血管 阻力，改善脑及冠脉循环，降低心肌耗氧量等作用。其中异黄酮类化合物是其主要 活性成分。 本文以贵州省中草药葛根为研究对象，通过优化分离提取方法，对葛根中化学 成分进行提取、分离、纯化和结构鉴定，并探讨粗提物和活性成分对烟草花叶病毒、 病原菌( 辣椒枯萎病、小麦赤霉病、马铃薯晚疫) 和癌细胞( 前列腺癌细胞p c 3 及 胃癌细胞b g c ) 的抑制活性作用。目前从葛根中分离出十七个化合物，通过l1 h a m l1 3 c l 偶和质谱鉴定了其中十三个化合物，其余化合物的分离、鉴定正在进 行中。生物活性试验研究发现在分离出的化合物中，胡萝h 甙在2 0u m o l l 浓度下对 p c 3 细胞的体外抑制率为4 49 0 ，对b g c 细胞的体外抑制活性为6 0 9 2 ；二t 四酸 一甘油酯在2 0 “m o l 几浓度下对p c 3 细胞的抑制率为4 3 2 8 ，对b g c 细胞的抑制率 为6 0 1 7 ；卢谷甾醇在5 0 0 p p m 浓度下对烟草花叶病的活体抑制率为3 0 8 。化合物 显示出良好的生物活性，为进一步深入研究奠定基础。 本论文内容主要包括三部分：第一部分对天然植物抗病毒、抗肿瘤的研究进展 进行了综述 第二部分为活性成分的提取、分离和生物活性测试；第三部分为化合 物波谱结构鉴定和生物活性测试结果讨论。 关键词葛根；异黄酮：分离提取；结构鉴定；生物活性 贵州大学2 0 0 5 届农药学硕士研究生学位论文 a b s t r a c t r e c e m l y ，t h ec h i n e s eh e r b a lm e d i c i n ew i t ha c t i v ec o n s t i t u e m sa r eb e c o m i n gm o r e 枷m o r ei m p o r t a n ti np e s t i c i d ea n dm e d i c i n ei n d u s t r yp u e r a r i ai sa ni m p o r t a ml 【i n do f t r a d i t i o n a lc h i n e s em e d i c i n a lm a t e r i a l sni so b t a i n e d 宜o mt h ed r yr o o t so f ( 聃m 0o rj w 谚e f 加出砌口，计加舶m 拧删肪o f w i l dp u e r a r i a e ( 诵l d ) p u e r 撕ai sc o m m o n l yu s e da s t h ed i 印h o r e t i cm e d i c i n e ，a n di sa l s ou s e di nr e d u c i n gb l o o dv e s s e lo b s t m c t i o n ， i m p m v i n g t h eb r a i na n dc o m r l a l 叮a r t e r yc i r c u l a t i o nm n c t i o n ，a f l d r e d u c i n g t h e m y o c a r d i u mo x y g e nc o n s u m p t i o n f r e s h p u e r a r i a e v i n ew e r ec o l e c t e d舶mg u 曲o up r o v i n c e t h ea c t i v e c o n s t h e n t sw e r ee 埘r a c t e d ，i s o l a t e d ，a n dp u r i f k d 疗o mt h er o o to f p u e r 耐v i n e t o t a l l y 1 7c o m p o 眦d sw e r ei s o l a t e d ，锄o n gw m c ht h es t n l c t u r e so f1 3c o m p o u n d sw e r e c h 啪c t e r 泣e db y 风1 hn m r ，1 3 c 瑚l 锄dm s t h eb i o a c t i v 哪o ft h e s ec o m p o u i l d s w e r et e s t e da g a i n s tt h e 而配 破坫谢cp ? ，乱已，k 蚴一l 删o 】妒口，删，与pc c i p 鲥c ”聊， d 西施增，口朋卯，用删砒啊咖妣聊括a n dt w o “n d so f c a n c e rc e l l s ( p c 3a n db g c ) f r o mt h er e s u l to f t h eb i o a s s a y h 、a sf o u n dt h a td a u c o s t e r o lp o s s e s sm o d e r a t e 卸t i c a n c e r b i o a c t i 诎y 诵t ht h ei n i i i b i t i v i t yo f4 4 9 0 趾d6 09 2 t op c 3a i l db g cc e l l s a t 2 0 u m o 扎，r e s p e c t i v e l yt h ei n h i b i t i v i t yo ft e t r a c o s a n o i c a c i d - 2 ，3 一d i h y d r o 珂p m p y le s t e r t op c 3a n db g cc e l l sa t2 0 脚o l lw e r e4 3 2 8 a l l d6 0 1 7 ，r e s p e c t i v e l yt h e 叫t o s t e r o lw a sf o u n dt op o s s e s sv i m c i d a la c t i v 咄w h j c ht h ei n h i b i t i o nr a t ew 觞3 0 ，8 7 t o t m va t5 0 0 p p m 加订阳 t h i st h e s i si n c i u d e st h r e ep a r t st h er e s e a r c hp r 0 嘻r e s so nn a t 删p l a n t su s e da s v i m c i d e sa n da n t i t u m o ra g e l l t sa r er e v i e w e di np a n1 p a n2r e p o r t st h ee ) ( t r a c t i o n ， i s o l a t i o n ，p 嘶f i c a t i o na n dt h eb i o a s s a yt e s to ft h ea c t i v e di n g r a d i e m si np u e 砌a e t h e s t r u c t u r ec h a r a c t e f i z i o na n dt h eb i o a s s a va r ed i s c u s s e di np a r t3 k e y w o r d s ：p u e r a a ： i s o f l a v o n e ； i s o l a t i o na n d e ) ( t r a c t i o n ； s t r u c t u r a i i d e m 讯c a t i o n ： b i o a c t i v “y 贵州大学2 0 0 5 届农药学硕士研究生学位论文 前言 植物病毒有植物癌症之称，在农业上具有很大的危害性。长期以来，国内外均 致力于利用各种无机和有机化合物来防治作物病毒病，但真正成功的例子却很少。 近年来，人们逐渐将注意力转向生物农药，特别是从植物发现天然抗病毒活性的化学 物质，是开发抗病毒的天然药物的重要途径。植物源抗病毒物质在自然界中广泛存 在，成为绿色杀菌剂创制的重要先导源。研究源于植物的抗病毒药，不仅具有发现 新药的潜力，更重要的是为了设计理想的新药提供了很好的先导化合物。 恶性肿瘤是目前世界范围内的常见病、多发病，严重影响着人类的生命健康。 中国每年约有1 5 0 万人患癌症，其中约有1 1 0 万人丧生。而且癌症对人类的威协不仅 仅是死亡，它对社会的经济和发展也潜含着一股巨大的冲击力。中国每年约有1 0 0 万人因患癌症失去工作能力，1 5 0 万人因他人患癌症而无法正常工作。虽然手术治疗 是肿瘤的首选方案，但多数恶性肿瘤早期症状不明显，待出现症状、明确诊断时已 属中晚期，失去了最佳的手术时机。 在此背景下，中医药治疗因为优势明显、疗效确切，正日益成为重要的治疗手 段。药学家们越来越重视中草药中所蕴藏的巨大潜力，从天然植物( 或生物) 中寻找 具有抗癌活性的药物成分成为抗癌药研究的一大重要途径。从长春花中提取的去甲 长春花碱、长春花碱酰胺；从植物鬼臼中提取的鬼臼乙叉甙、鬼臼噻吩甙；从中药 莪术、鸦胆子中提取的榄香烯、鸦胆子乳，以及植物中提取的三尖杉酯碱、靛玉红、 秋水仙碱、紫杉醇等均有很高的抗癌活性，大大提高了治疗癌症的效果。中医中药 抗癌虽然起步较晚，但在该领域己取得了相当的发展。随着现代科学技术的高度融 合，多元科学的交叉渗透，生命科学技术和中医药在内的医学的紧密结合，将更能 显示和明确中医药在肿瘤综合治疗中的价值。近年来在抗肿瘤药物的筛选中发现， 从许多植物中提取的粗提物具有良好的抗肿瘤作用，如从中分离出单一活性化合物 作为先导化合物。进行适当的结构修饰和改造，可为开发优良的抗癌药物提供新的 来源。因此，从中草药提取物中筛选具有抗肿瘤作用的活性成分具有十分重要的意 义。 贵州大学2 0 0 5 届农药学硕士研究生学位论文 为了寻找具有较高生物活性的抗癌药物， 分离，并进行抗病毒、抗癌活性的联合筛选， 物，为新医药和农药的联合研发探索新途径。 本课题开展对葛根化学成分的提取、 以期从中寻找到较高活性的先导化合 贵州大学2 0 0 5 届农药学硕士研究生学位论文 第一章文献综述 随着人们对化学合成物毒副作用的日益关注，源自植物中提取的活性物质因其 环境兼容性好、毒副作用小逐渐成为人们研究的热点，出现了大量有关植物提取物 生物活性的相关报道，现对近年来国内外对抗病毒植物、抗肿瘤植物报道及葛根化 学成分、生理活性等研究工作进行概述，分成以下三个部分。 1 1 抗病毒植物研究报道 目前从植物体中发现天然抗病毒活性的化学物质，是开发抗病毒的天然药物的 重要途径。植物源抗病毒物质在自然界中广泛存在，是绿色杀菌剂创制的重要先导 源。植物体内的抗病毒化合物是植物体产生的多种具有抗病毒活性的次生代谢产物， 包含了生物碱类、类黄酮类、蛋白质类、有机酸类和酚类化合物等许多不同的类型。 本部分分科属介绍近年来抗菌植物研究与应用方面的进展。 1 1 1 虎耳草科翰瑚卵c 删 钮锗燕等( 1 9 9 6 ) 用虎耳草科7 种植物3 种溶剂的2 1 种提取物对烟草花叶病毒t m v 室内毒力测定结果表明，茶蔗子( r ，l f 6 p 跏卿拗w f 凹泐配肌) 的石油醚提取物和二氯甲 烷提取物对盆栽防治黄瓜霜霉病的保护效果分别为7 l ，3 6 和5 86 1 ；对盆栽烟草花 叶病毒的效果分别为5 17 4 和6 4 2 3 。小花溲疏的石油醚提取物和二氯甲烷提取 物都对t m v 表现明显的保护作用，特别是二氯甲烷提取物，保护作用离达 6 4 2 3 ，其余样品对孙d v 的保护效果不明显。上述结果说明，茶蔗子中含有高活 性的抗病毒物质。 1 1 2 藜科c 协f 刀印绷g 揪 林存銮等( 1 9 8 7 ) 从9 0 种植物中筛选发现，小黎( 西肼删”m 韶阳咖“胁) 和玉簪 ( 月钿细p 胁l 细加阳) 两种植物的抽提液对番茄花叶病( t o m v ) 毒病有一定的治疗作用， 尤以小藜提取液对n 一t 效果好；油莱中的脂肪酸对n 厦v 和黄瓜花叶病毒c m v 均 有抑制作用。 向木春等r 1 9 9 4 ) 报道以心叶烟为指示植物，测定了菠菜、灰藜、甜菜、甘草、莫 合烟、苦豆子6 种植物的叶片抽提物对烟草花叶病毒的抑制作用，其中菠菜抽提物 对t m v 的抑制效果最明显，喷后3 0 m i n ，对烟草花叶病毒抑制率达9 64 5 ：喷后 贵州大学2 0 0 5 届农药学硕士研究生学位论文 2 4 h 仍达到8 7 4 6 ，甜菜抑制率分别为5 4 0 5 、5 0 4 5 。甘草、苦豆子、莫合烟处 理后，不仅没有抑制作用，反而增加了枯斑数。分别采用以下5 种方法进行了菠菜抽提 物对烟草花叶病毒作用方式研究先喷抽提物后接种n 匿v ；先接种t m v 后喷 抽提物；菠菜抽提液与t m v 等量混合后间隔时间接种；不同间隔时间冲洗抽 提物；菠菜抽提物在心叶烟上的运转测定。试验结果表明抽提物只有在接种前喷 施才有效，同时也只能通过寄主才能起作用，对病毒本身无直接作用，抑制物可被植物 叶片牢固地吸附在叶片表面，从而占据了植物病毒的接受位点，而使病毒侵染受阻，抑 制物只作用于喷施过叶片，而无内吸运转作用。 郭兴启等( 1 9 9 8 ) 发现大黄、连翘、大黄、板蓝根的提取液对t m v 具有稳定的疗 效，研究发现大黄提取物不仅影响番茄植株内t 曲( 番茄花叶病毒) 的含量，还影响 其症状表现。取配制好的大黄提取物原液与5 m l 病汁液混合处理，以5 m l 病汁液与 等量的清水混合作对照，室温下放置2 0 m i n ，然后用截头毛笔分别接种于离体心叶 烟叶片上，在室温下保湿培养7 2 h 后检查枯斑数，计算钝化效果。大黄提取物不仅有 钝化病毒的作用，造成枯斑数目的减少，而且还有抑制删扩展的作用，使枯斑直 径缩短。大黄提取物对番茄花叶病的作用不单纯局限于病毒本身，而且能调节番茄 植株的抗病毒机能、诱导激发植物潜在的抗耐病能力。这在理论上符合现代植物病 理学系统论的观点，在实践上具有重要实际应用价值，值得开发利用。 郭兴启等( 1 9 9 8 ) 研究表明，大黄提取物对t o m v 粒体具有钝化作用，但在电镜 下没有观察到在形态，长度方面与对照的差异，大黄提取物使接种心叶烟叶片上枯 斑直径比对照减小了2 1 9 ，接种前喷施大黄提取物的植株过氧化物酶( po ) 活性 比对照高，接种后处理株的po 活性第12 天达到高峰，而对照的最高峰比处理提 前6d ，接种tom v 处理的番茄与对照相比，新增l 条po 同工酶酶带，接种后， 虽然处理与对照都增加2 条高迁移率( r f = 0 8 2 6 ，08 6 7 ) 同工酶带，但处理株出现的 晚，经大黄提取物处理的番茄植株与清水处理的植株相比，p r 蛋白总带数相同，但 处理的各带强度高于对照。 1 1 3 紫草科& ) 懈f ，抑卯珊 李重九等( 1 9 9 8 ) 从紫草中提取得到几种萘醌类化合物具有抗病毒活性。紫草的 干燥根分别用二氯甲烷、冷热甲醇、热水提取，将有活性的粗提物通过柱层析( t l c ， 6 贵州大学2 0 0 5 届农药学硕士研究生学位论文 印，l c ) 分离，抗病毒活性测试方法为半叶法，结果发现只有二氯甲烷提取物 有活性。对其进一步分离得到9 个化合物：1 ) 脱氧紫草宁，2 ) 异戊酰氧基紫草宁， 3 ) 洳甲基丁酰氧基紫草宁，4 ) p ，p 二甲基丙烯酰氧基紫草宁，5 ) 异丁酰氧基紫草宁， 6 ) 丙酰氧基紫草宁，7 ) 乙酰氧基紫草宁，8 ) 紫草宁，9 ) p 羟基异戊酰氧基紫草宁，分 别为具有萘醌结构的紫草宁及其衍生物。对每一个化合物进行抗病毒抗菌活性测 试，发现6 和7 具有抗t m v 活性，且前者活性更高。在5 m m o l l 的浓度下l 和5 也有抗n f v 活性，化合物2 、9 、4 有微弱的活性( 抑制率为2 6 叫6 ) ，3 和8 无活 性。较高的浓度2 5 m m 下3 有活性，8 和9 则表现出植物毒性，丙酰氧基紫草宁对 t m v 有1 0 0 的活性。 化合物1 丙酰氧基紫草宁 化合物2 3 侯玉霞等( 1 9 9 8 ) 从药剂、病毒、寄主三者的关系着手，试图筛选出一种既抑制 n 增殖又使叶绿素的含量增加，促进植物光合作用的抗植物病毒剂，以防治植物 病毒。实验结果表明：8 种植物抽提物中，紫草、月季抽提物抑制t m v 与叶绿体的结 合活性高。从以下植物源中提取( 自提) ：紫草( 三衲呷p 册。啪阳胁舶h ) ，月季( m 嘲 如妇，拈妇) ，蛇床子( o 硪力”珊埘d m f p 一) ，苦瓜( m 删。砌幽锄册砌) ，海带( 删打枷记 胂f c 叻，连翘r 凡例外砌涮甲8 m 跑j ，牛蒡( 4 r c 打蜊，c 骅回，蹄叶橐吾( 凰卿切忉 黼唧 y 蚴，配制浓度为o 5 供试抗植物病毒剂，测定8 种植物抽提物对感病烟草 叶片叶绿素含量、光合速率、f 6 8 5 f 7 4 0 比值的影响表明：紫草、月季的抽提物使感 病烟叶叶绿素含量、光合速率增加非常显著，感病烟草叶片f 6 8 5 f 7 4 0 比值与健康 叶片f 6 8 5 f 7 4 0 的比值接近。证实了抗病毒剂能够抑制t m v 对烟草叶绿体作用，把 抗病毒剂对t m v 与烟草叶绿体互作的影响可作为筛选抗病毒剂的靶标。其机制可 能是叶绿体中t m v 外壳蛋白的浓度和花叶症状严重程度呈正相关，t m v 外壳蛋白 与叶绿体相结合打断光合作用电子传递链。采用此法筛选出紫草、月季的抽提物具 贵州大学2 0 0 5 届农药学硕士研究生学位论文 有高效选择性的抗病毒作用。它们既抑制1 m v 的增殖，又抑制1 l n ，对叶绿体的破 坏，并促进寄主植物光合作用。 1 1 4 商陆科坳船 刘学端等( 1 9 9 7 ) 利用商陆y 细挑c 口韶、甘草( g 似：妒毋把倒，砒船砷、连 翘( 胁毋砌胁翩习卵删) 等几种中草药植物自制复配为m h l l 2 4 可湿性粉剂，对病毒 和烟草植株的作用两个方面探讨了天然植物性农药m h l l 2 4 对烟草花叶病的防治作 用，结果表明，m h l l 2 4 的防病机理表现在体外钝化病毒、体内抑制病毒增殖和诱导 烟株产生抗病性3 个方面。这说明m h l l 2 4 对烟草花叶病的防治是多方面综合作用 的结果m h l1 2 4 在体外对病毒的强烈钝化作用，可以解释其对烟草花叶病有良好的 预防效果( 8 5 6 ) ，而m h l l 2 4 在烟株体内对病毒增殖的抑制作用则可以解释其对烟 草花叶病具有较好的防治效果( 6 57 ) 。但这种对病毒的抑制作用是表现在阻碍r n a 复制，还是蛋白质合成，或是病毒的脱衣壳和装配过程中，正在进一步研究。此外， 药剂是否有阻止病毒在烟株体内扩展的作用，有待进一步研究。本试验中所证实的 m h l1 2 4 对烟株的诱导抗病性可以看作是种系统诱导作用它在病害形成过程中 表现为延缓和抑制病情的扩展，即是一种抗扩展的作用。这种高效、持久的诱导抗 病作用的产生，可能是由于m h l l 2 4 引起烟株体内一系列的生理变化所致，因此， 除过氧化物酶外，多酚氧化酶、苯丙氨酸转氨酶等其它与抗性相关酶的活性当有所 升高。但尚待进一步测试。 吴云峰等( 1 9 9 9 ) 从美洲商陆( 啪，d c 硎p ， 加) 和紫茉莉脚6 廊扣z 叩口) 块根中提取配制了s d ，肌，e k ，c t 和a z 制剂，用4 0p g ，l 的c t ，e k ，e hp ap 和 m ap 在体外钝化c m vlh 后接种，枯斑数依次降低达1 5 2 ，8 8 5 ，6 瓤，2 81 和6 1 6 在接种c m v 前2 4h 喷施8 0p g ，l 的c t ，e k 和e h 预防效果依次为 9 2 4 ，9 0 和8 2 ，将浓度提高到1 0 0p g l 时3 种药剂能完全抵抗t m v 的摩擦 接种和c m v 的3 头蚜虫接种。接种c m v2 4h 分别喷施8 0 g ，l 的c t ，e k 和e h ， 病情指数依次为o0 9 ，o2 9 和ol l ；若间隔喷旄2 次则能使9 3 2 ，8 96 和7 4 1 的病 株恢复正常。 刘学瑞等( 2 0 0 0 ) 发现由商陆、甘草、连翘等几种植物提取物配制而成的复配剂 m h l l 4 对植物病毒有较好的防治效果。经大量试验筛选，利用商陆、甘草、连翘等 贵卅大学2 0 0 5 届农药学硕士研究生学位论文 几种植物抽提物配制而成的复配剂对由1 m v 和c m v 引起的烟草花叶病进行了室内 和田间小区防治试验。室内盆栽试验结果表明，2 0 0 倍液对t m v 和c m v 的病株抑制 率分别为6 1 。9 和5 6 9 ，体外钝化效果分别为8 5 0 2 和9 8 8 0 ，防治效果分别为 7 4 7 和7 0 3 ；田间小区试验表明2 0 0 ，3 0 0 倍液的平均防效分别为8 8 4 ，8 6 5 。 1 1 5 红豆杉科m 钟韶 秦淑莲等( 1 9 9 7 ) 发现紫衫皮提取液对植物黄瓜花叶病毒具有较明显的抑制作 用。紫杉皮提取液的制备将紫杉皮粉碎成粉，与等体积的9 5 的乙醇混合搅拌后，浸 泡1 0 天，蒸馏去乙醇后制备成2 的水剂用于试验测定。对c m v 的抑制钝化效果分 别为3 8 3 曲8 8 ；在黄瓜和普通烟草上，于接种前后分别喷施药液，对病害侵染的 作用效果分别7 2 1 9 0 5 ，6 1 6 7 0 5 。 辛玉成等( 1 9 9 8 ) 在对红豆杉树皮提取物进行研究试验的基础上，研究探讨其类似 物质三尖杉( & 砸盯，o 船z 舻r 劬评fh o o kf ) 酯碱物质的入工合成及对t m v 的作用 效果测定。试验合成了8 种砚的合成物质，结果发现苯丙氨酸三尖杉酯碱 ( h a 玎i r 蜉o l l i n e ) 合成物，对t m v 粒子的抑制钝化作用最明显，苯丙氨酸三尖杉酯碱对 烟草花叶病毒具有一定的钝化作用，其中1 0 8 0m g 兄，在烟草和蔓陀罗上测定对 n 的抑制钝化效果分别为4 5 1 v 8 5 3 ；在普通烟草上，于接种前后分别喷施4 0 m g ，l ，对病害初侵染的作用效果分别为7 6 ，3 和6 4 9 。试验结果表明苯丙氨酸三尖 杉酯碱是良好的抗植物病毒的物质。初步作用机制研究试验结果看，苯丙氨酸三尖杉 酯碱合成物对t m v 粒子有较好的钝化作用和降低病害初侵染的效果。至于对病毒 粒子的其它方面的作用机制，还有待进一步探讨。 116 木犀科植物凡岬柏穑 吴迎春等( 2 0 0 4 ) 发现连翘的粗提物具有抗病毒活性，金丝桃素( h y p e r i c i n ) ，即4 ， 4 ，5 ，5 ，7 ，7 一六羟基2 ，2 二甲基一中位萘并二醌酮是贯叶连翘中最具生物活性 的物质，具有抗病毒活性。 贵州大学2 0 0 5 届农药学硕士研究生学位论文 4 ，4 。，5 ，5 。，7 ，7 彳澎基_ 2 ，2 - 二甲基一中位礤并二醌酮 化合物3 刘道贵等( 2 0 0 0 ) 进行了紫茉莉、药菊、板蓝根3 种植物丙酮抽提物对不同病毒抑 制作用的比较试验，结果表明：稀释5 0 倍的紫茉莉根组织抽提物对t m v 、c m v 和 t 心的抑制效果最好，抑制率为6 3 6 9 7 9 ，药菊次之，板蓝根最差；这3 种植物抽 提物对不同种病毒的抑制效果也有差异，紫茉莉根组织抽提物对n d v 抑制作用最明 显，对t u m v 次之，对c m v 稍差。另外，紫茉莉根组织的抽提物对病毒系统的抑制作 用也较明显。 田兆丰等( 2 0 0 3 ) 经过筛选从苦丁茶、板兰根、酸膜叶蓼、椿叶、摩萝、香菇菌 丝体和亚麻油渣中获得几种具抗病毒活性的生物材料。将上述材料抽提物经抗病毒 效果及对病毒的作用方式试验，初步明确这些材料具有抗病毒侵染能力。把不同作 用点的抗病毒材料经复配得到复配剂g ，以烟草花叶病毒为舫治对象，田间试验结 果证明，复配制剂g 可以控制病毒的侵染，对柿椒病毒病防治效果达8 1 1 2 ，比单 独使用各抗病毒材料制剂效果增加1 6 5 8 。 李红霞等( 2 0 0 0 ) 用植物源抗病毒制剂v a 与烟草花叶病毒( t m 聊混合，经枯斑 半叶法接种，结果证明，v a 对州有较强的体外钝化作用，体外钝化后的枯斑抑制 率为8 0 0 ；用苯酚氯仿法提取t m v 的核酸后，按一定的比例与v a 混合，经枯斑半 叶法接种测得枯斑抑制率为4 3 8 7 7 9 ：n l v 与v a 混合后用r n a s e 处理测 得侵染率为7 8 6 ，比未用r n a 处理的对照降低了2 1 ，4 ，初步明确了v a 对删 具有显著的体外钝化作用，经钝化后的吓侵染率降低为8 0o 。通过电镜观察发 现v a 可使t m v 粒体发生断裂或粗细不均等畸变现象，使之失去侵染活力，而经 r n a s e 处理的结果证明v 敞寸1 m v 具有体外脱衣壳作用。由此推测、v a 通过对删体 外钝化而降低病毒侵染率，可能是由于：v a 破坏了病毒衣壳蛋白亚基之间的作用 力，使病毒粒体衣壳蛋白结构松散，导致病毒粒体的断裂，而小片段的病毒粒子侵染率 贵州大学2 0 0 5 届农药学硕士研究生学位论文 较低；v a 破坏了衣壳蛋白，使核酸部分暴露于寄主组织后，而受寄主体内对妇s e 的 消化，降低病毒的侵染率。v a 可以抑制n d v 核酸的侵染( 侵染抑制率为4 38 7 7 9 ) ，由此推测，v a 可能会与病毒核酸直接作用，破坏核酸序列的某一功能区，或 者抑制r n a 复制酶( 1 2 6m ，1 8 3k d ) 的合成，或者抑制运动蛋白( 3 0k d ) 的合成，或者 抑制结构蛋白( 1 7 5k d ) 的合成，从而导致复制过程受到干扰：v a 可能会在病毒 粒子的复制过程中使双链r n a 增加并维持时间较长，切断了信息传递，干扰了核酸 信息的翻译和复制，切断或减慢衣壳蛋白的合成，影响病毒的装配，进而抑制病毒的增 殖。结果表明，植物源抗病毒制剂v a 对t m v 的控制机理之一是体外钝化病毒，由此 可以解释v a 对1 剐【v 引起的植物病毒病的保护作用，而v a 对t 核酸的侵染抑制作 用又进一步说明v a r 可以抑制t m v 复制，表现一定的治疗作用。 1 1 7 萝摩科4 卵劬妇矗黜韶 姚宇澄等( 2 0 0 1 ) 报道萝摩科鹅绒藤属多年生直立半直立丛生草本植物牛心朴子 草地上部分醇浸粗提物( h ) 对烟草花叶病毒口m v ) 有高抑制活性，牛心朴子草抗植 物病毒有效组分是菲并吲哚里西定生物总碱( g ) 半叶枯斑法测定( g ) 制剂对t m v 、 马铃薯y 病毒口v 、和芜菁花叶病毒( t i i m v ) 呈现高活性；用酶联免疫法( e l i s a ) 测定( g ) 制剂对t l ，m v 的最佳浓度防效，与枯斑法测定结果基本相符，( g ) 中含量最丰 的( 1 ) 7 脱甲氧基娃儿藤碱( 8 m o f i n e ) 是该草活性最高的主组分，它在1 0 “m 1 浓度的 r i m v 抑制率达6 0 。酶联免疫法但l i s a ) 测定( g ) 制剂对h ，m v 的防治效果为，当( g ) 制剂浓度为15 lo _ 暂m l ，对t m v 有明显防效( 6 6 7 ) ；当浓度在3 o 1 0 “m l 时， 对t u m v 有极显著防效( 9 1 2 ) 。 化合物4 ( 血t 0 丘n e ) 1 18 菊科c o m p f 招e 陈志敏等( 2 0 0 3 ) 利用丙酮浸渍法提取了艾蒿、银杏、大黄、紫草、青蒿以及独 活等1 1 种中草药中的抗病毒活性物质，并以西瓜花叶病毒2 号为供试毒源，在西葫 贵州大学2 0 0 5 届农药学硕士研究生学位论文 芦上对提取物进行了室内生物防效测定和叶绿素含量测定。结果表明，青蒿和独活 的丙酮提取物对西瓜花叶病的相对防效达4 7 6 8 和4 90 7 ，显著高于对照，具有 较好的预防效果。且经提取物处理的西葫芦的叶绿素的含量显著高于发病对照丽低 于空白对照和病毒a 治疗对照，其对西瓜花叶病毒2 号具有一定的抗性作用，其活 性成分可能具有体外钝化病毒或诱导系统获得抗性的作用。 陈启建等( 2 0 0 3 ) 测试了从三叶鬼针草中提取的黄酮甙对烟草花叶病毒的抑制作 用。结果表明：黄酮甙对t m v 具有明显的体外钝化作用，其质量浓度为1 0 0 鸣m l 时，对n n ，的抑制率为9 1 3 ，但对烟草体内病毒复制无显著的抑制效果：聚丙 烯酰放凝胶电泳显示黄酎甙与病毒外壳蛋白混合的泳带比对照明显滞后，表明黄酮 甙可与t m v 外壳蛋白结合，透析或萃取可使这种结合解离，使病毒恢复侵染力， 说明黄酮甙对病毒无直接杀灭作用；用黄酮甙处理过的普通烟叶片，1 2 h 后接种病 毒，可阻抑病毒初侵染，延迟病害症状的出现 陈启建等( 2 0 0 4 ) 对福建省常见的蟛蜞菊( f 沱出f f 口拍加e ，删等2 6 种植物的乙醇提 取物体外抑制烟草花叶病毒( 勋6 卯聊蝴捃协伽，t m v ) 的活性进行测定，发现抑 制率达5 0 以上的有1 7 种植物依次用氯仿、正丁醇对这1 7 种植物的乙醇提取物 进行萃取，并分别测定各萃取物的抗病毒活性，结果表明，正丁醇萃取物的抗病毒 活性最高，但去除其中鞣质后，其抗病毒活性明显降低蟛蜞菊( 耽毖妇如f n 哪捃) 、 大蒜似胁甜珊硼打m ) 和决明( c c l 咖 d 加) 3 种植物的乙醇提取物对烟草叶片中的n 增殖有明显的抑制作用。 1 1 9 蓼科而6 伊嘲赠 刘国坤等( 2 0 0 3 ) 测定了”种植物的乙醇粗提物对1 m v 的体外抑制作用，其中 1 1 种具有明显效果，这1 1 种植物粗提物经水氯仿萃取，水萃取物具有明显抑制 t m v 效果；而氯仿萃取物抑制效果差。水萃取物用明胶去除单宁后，基本失去抑制 t m v 的能力，表明单宁在其中起着重要作用。从杠板归与假槟榔种子中提取的总单 宁对t m v 具有明显的抑制作用：病毒粒体样品在分别加入这2 种植物总单宁后， 电镜下表现为聚集结合：t m v 分别与这2 种植物的单宁混合后，通过透析，可恢复 大部分侵染力，表明单宁对病毒并无直接毒害作用；1 m v 外壳蛋白( c p ) 与单宁混合 后，在蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳中表现为结合现象；单宁对删体内抑制复 贵州大学2 0 0 5 届农药学硕士研究生学位论文 制效果不明显；单宁在接种t m v 前后旖用并没有降低t m v 侵染力；这些结果表明 这2 种植物单宁对t m v 抑制作用可能是与t m v _ c p 结合而引起病毒侵染力下降或 影响病毒c p 对侵染位点的识别。 1 2 植物抗肿瘤报道 从天然植物中寻找具有抗癌活性的药物成分是抗癌药研究的一大重要途径。据 国外资料介绍，到1 9 9 4 年末，美国开发的8 7 种抗癌新药中有5 4 种为天然植物提取 物或其半合成衍生物。各种抗癌药物的总销售额呈快速上升之势。1 9 9 9 年全美1 0 个主要抗肿瘤药物【紫杉醇、对铂、喜树碱、泰索帝( 半合成紫杉醇) 、6 啪z a r 、i f e x 、 h y c a m t i n 、p l a t i n o l 、n a v e h i n e ( 长春花碱衍生物) 、c a e l y l l ) ( 】中，来自天然植物的抗 癌药已占一半以上，如紫杉醇、喜树碱、长春花碱衍生物等。近年来美国在天然植 物提取物的抗肿瘤新药研究开发上取得多项突破性进展，奠定了天然抗癌药的大规 模开发基础。本部分分科介绍近年来植物抗肿瘤的研究进展。 1 2 1 姜科劢硒k 愀 卢榄香烯( 肛e l e m e n e ) 是莪术油中所含抗癌活性成分之一，能够减少药物使用剂 量及其它成分所引起的毒副反应，也有助于就人工合成及作用机理等问题进行深入 研究。旌广霞等( 1 9 9 4 ) 以从莪术油( c u r c u 腿a r o r n 砒i c a ) 中分离出的一种倍半萜类衍生 物肛榄香烯为研究对象，观察其在体外对l 6 1 5 白血病细胞的直接作用。实验结果 显示伊榄香烯u k 为2 5 7 峙，m 1 ，并可致肿瘤细胞变性坏死。虽然助溶剂对照组 t w e e n 8 0 组中也有一部分肿瘤细胞变性坏死，但细胞死亡率明显低于伊榄香烯组， 说明其对白血病细胞有一定治疗作用。 施广霞等( 1 9 9 4 ) 同时以小鼠乳腺癌c a 7 6 1 8 6 细胞为模型研究肛榄香烯在体外抗 肿瘤作用，采用瘤内多点注射的方法对c a 7 6 1 8 6 细胞进行治疗，在第7 天或第1 4 天开始治疗时，肿瘤已长到一定大小，虽然药物未能使肿瘤完全消退，但表现出一 定抑制生长的作用。 吴万垠等( 1 9 9 9 ) 以莪术油进行2 次抑制小鼠肝癌h 印a 细胞增殖的抑制机理研 究，用病理细胞图像分析仪分析莪术油对小鼠肝癌细胞核d n a 含量的影响。发现 莪术油对小鼠肝癌h e p a 的抑瘤率分别为5 1 8 5 和5 1 1 6 ，与对照组比较有显著 性差异。莪术油能降低小鼠h e p a 肝癌细胞核的d n a 光密度值及d n a 指数，同时 贵州大学2 0 0 5 届农药学硕士研究生学位论文 能提高肝疮细胞中二倍体细胞的比例及降低超五倍体细胞比例，说明莪术油具抗肝 癌作用，且其机理可能与其抑制肿痛细胞d n a 合成有及增殖活性有关。 1 2 2 十字花科c 加咖，獬 梁永红等( 2 0 0 3 ) 采用m t t 法测定板蓝根二酮b 对肝癌b e l 7 4 0 2 细胞和卵巢癌 a 2 7 8 0 细胞的体外活性研究；集落形成实验观察药物的诱导分化作用：p c r e li s a 试剂盒测定细胞的端粒酶活性。实验结果显示板蓝根二酮b 具有抑制肝癌b e l 7 4 0 2 细胞、卵巢癌a 2 7 8 0 细胞增殖的能力，其i c 5 0 分别为8 2 雌加l l 和7 8 8 2 嵋m l 。 从板蓝根二酮b 抗肝癌b e l 7 4 0 2 细胞、卵巢癌a 2 7 8 0 细胞活性表明，板蓝根二酮 b 具有体外抑制肝癌b e l 7 4 0 2 细胞和卵巢癌a 2 7 8 0 细胞的能力，抑制作用均与浓 度呈正相关，且抑制卵巢癌a 2 7 8 0 细胞的能力比肝癌b e l 7 4 0 2 细胞强。 侯华新等( 2 0 0 2 ) 采用类似实验方法研究板蓝根高级不饱和脂肪组酸体外抗人肝 癌b e l7 4 0 2 细胞的活性，结果发现经板蓝根高级不饱和脂肪组酸处理后的b e l 7 4 0 2 细胞生长速度明显减慢且软琼脂内集落形成率大大降低，能抑制b e l7 4 0 2 细 胞的增殖，有促使肿瘤细胞向正常细胞逆转的趋势，降低端粒酶活性的表达，说明 板蓝根高级不饱和脂肪组酸具有体外抗肿瘤活性。使人肝癌b e l7 4 0 2 细胞恶性特 征消失。缺点是其i c 5 0 为o 6m m l ，较一般典型的抗癌药物为大。 侯华新等( 2 0 0 2 ) 采用s 1 8 0 肉瘤、h 2 2 肝癌作为实验瘤株，测试板蓝根高级不饱和 脂肪组酸抗癌活性。结果显示板蓝根高级不饱和脂肪组酸能延长荷瘤小鼠的生存期， 在实验剂量范围内，各组动物用药前后体重均有明显增加，其增长幅度与模型组相 似，无明显差异。实验观察各组小鼠的一般状态良好，活动正常，且它们的平均体 重均有不同程度的增加，未见毒副反应。板蓝根高级不饱和脂肪组酸对小鼠s 1 8 0 肉 瘤的生长具有一定的抑制作用，其抗肿瘤效应呈剂量依赖性。板蓝根高级不饱和脂 肪组酸高、中剂量组对小鼠h 2 2 腹水型肝癌的生命延长率有较明显的影响，进一步 说明板蓝根高级不饱和脂肪组酸具有较好的抑制肿瘤生长的作用。 单风平等( 1 9 9 4 ) 以5 0 板蓝根注射液对小鼠3 c l 8 细胞( 小鼠受f r i e n d 病毒感染 后诱导机体产生的一种永久性红细胞分化反应细胞，致病性极强) 进行体内外杀伤。 结果表明：在体外细胞培养时，5 0 板蓝根注射液对3 c l 8 细胞有强大的直接杀伤作 用，最低杀伤浓度可达1 ：8 0 。皮下局部注射5 0 的板兰根注射液时有一定的杀伤作 贵州大学2 0 0 5 届农药学硕士研究生学位论文 用，3 c l 8 实体瘤有减少趋势。腹腔注射5 0 板兰根时未见对3 c l _ 8 细胞有明显的 杀伤作用。通过对小鼠f r i e n d 红白血病3 c l 广8 细陀株的体内外杀伤作用研究，为用 中药治疗红自血病提供了一条新途径。 12 3 五加科4 m 阮c 8 船 刺五加多糖( a c a f 曲o p 锄a xs a n t i c o s u s p o l y s a c c h a r i d e s ，a s p s ) 系从五加科植物刺 五加( 爿喇的p 瓣簖暨h 统。硪，田鹌秽“嬲矗祀l 目| 口瑚，) 根中提取的有效成分，具有 增强机体适应能力提高免疫力和抗瘤作用。冯雪梅等( 1 9 9 9 ) 以刺五加叶皂甙 口彻2 珈华锄蕊胁f f c o 矾盯a s s ) 为研究对象测试其诱导肝癌细胞凋亡和抑制宿主肝癌 生长和转移的作用。采用给b a b l ，c 小鼠腹腔内注射h e p g z 肝癌细胞，a s s 腹腔注 射，处死实验动物，取瘤称重的方法，测试a s s 对小鼠移植癌的抑制作用，以流式 细胞仪检测移植肝癌组织凋亡小体百分率。结果显示当a s s 剂量为o 2 5i r 蚍g 和1 m g ，l ( g 时，抑瘤率分别为4 54 3 和7 2 0 6 ，凋亡小体百分率为2 0 6 士3 9 和3 1 1 士7 8 。a s s 组腹膜、肝、肠系膜和脾的癌转移率显著低于对照组。说明a s s 有 抑制人肝癌在小鼠体内生长和转移的作用，且其作用随剂量增加而递增，此作用可 能与a s s 促进肝癌细胞凋亡有关。 张文智等( 1 9 9 7 ) 以1 2 0 只大鼠进行了化学致癌物( ( 3 一m e _ d a b ) 诱发肝癌的试验， 通过对肝脏病理形态、t - 谷氨酰转肽酶0 g t ) 阳性细胞和肝组织内t g t 含量的检测， 观察刺五加多糖和谷胱甘肽硫转移酶( g s t ) 对肝细胞增生癌变过程的影响。结果表 明：刺五加组肝脏形态学与3 l - m e d a b 组无明显差异但肝脏发生病交的时间向后推 迟了一周；肝细胞7 - g t 阳性强度明显低于3 一m e - d a b 组；肝组织t g t 含量动态分 析发现低于3 i m e _ d a b 组且缓慢增加，实验第9 天才有升高趋势( ( 3 i m e - d a b 组第4 天就迅速升高) ，提示刺五加多糖对肿瘤性增殖有明显延缓作用。实验后9 天v g t 含量开始缓慢上升，升高水平都低于3 一m e d a b 组。说明刺五加多糖对肝癌的形成 和发展有抑制作用 佟丽等( 1 9 9 4 ) 研究了刺五加多糖( a s p s ) 对小鼠肉瘤s 1 8 0 细胞、人白血病k 5 6 2 细胞体外增殖的影响，并从膜唾液酸、磷脂、胆固醇含量，膜肌醇磷脂代谢和膜脂 肪酸组成变化几方面对其作用机理进行深入研究。发现a s p s 对两种细胞的增殖均 有强烈抑制作用，半数有效抑制浓度分别为o3 8g 几和o 2 8g 几。通过对s l 蜘细胞膜 贵州大学2 0 0 5 届农药学硕士研究生学位论文 成分进行了分析，结果显示a s p s 与细胞接触2 4h ，引起细胞膜唾液酸含量升高， 膜磷脂含量降低，膜磷脂脂肪酸组成发生明显改变，与对照组相比，这些变化均有 显著差异；但膜胆固醇含量、膜流动性及膜中性脂脂肪酸组成不受影响。将a s p s 与s 1 8 0 细胞膜在适当条件下一同温育，发现a s p s 干扰膜的肌醇磷脂代谢，明显抑 制磷脂酰肌醇转换。上述结果提示a s p s 的抗瘤机理与膜生化特性改变有关，其中 对膜磷脂含量、脂肪酸组成_ 和作为膜磷脂组分之一的肌醇磷脂代谢的影响是重要环 节。 1 2 4 豆科三曙姗打脚p 葛淑芬等( 1 9 9 8 ) 以小鼠领下腺纤维肉瘤细胞株为研究对象，通过细胞生长状态 检测、光电镜水平的形态学观察、细胞周期分析等方法，观察甘草甜素憎y c y r r h i z i n ， g l ) 对纤维肉瘤细胞的增殖抑制作用。实验组与阳性对照组细胞生长曲线证明：g l 浓度在6 0 0m l 以上、放线菌素浓度在1 2 5u g 几以上时，随浓度的增加、时间的 延长、对纤维肉瘤细胞的增殖抑制越显著，与空白对照组相比差异显著。实验证实 甘草甜素可引起纤维肉瘤细胞形态学改变，可使纤维肉瘤细胞g 期向s 期移行受阻。 g l 的浓度为6 0 0m 班时是其抑制瘩细胞生长的最低有效浓度。 聂小华等( 2 0 0 3 ) 采用m t t 法研究比较甘草有效成分对胃腺癌细胞s g c 7 9 0 1 的 抑制作用和对小鼠脾脏淋巴细胞的增殖作用。从实验结果来看，甘草有效成分中甘 草黄酮对s g c 7 9 0 1 具有显著的抑制作用，抑制率可达8 3 4 1 ；甘草酸在l o o o l m l 的高浓度下，才显示出较强的抑制作用，抑制率为4 4 5 5 。甘草黄酮能明显抑制 s g c 7 9 0 l 的生长，甘草黄酮浓度与抑制作用之间存在着量效关系；甘草有效成分