（农药学专业论文）普鲁兰产生菌aureobasidium+pullulans+hp2001发酵条件的优化研究.pdf

华中农业大学2 0 0 8 届硕士学位论文 普鲁兰产生菌a u r e o b a s i d i u mp u l l u l a n sh p 一2 0 0 1 发酵条 件的优化研究 摘要 出芽短梗霉菌( a u r e o b a s i d i u mp u l l u l a n s ) 是一种多形态的真菌，在适当条件下 可生产一种胞外多糖普鲁兰多糖。普鲁兰多糖是一种是很有发展前途的工业用多 糖。通过对普鲁兰多糖发酵菌株的筛选，发酵条件的优化，以及产普鲁兰多糖发酵 过程的优化研究。结果如下： 1 普鲁兰多糖发酵菌株的筛选 通过摇瓶实验测定了6 株出芽短梗霉菌菌株普鲁兰产量，采用不同浓度的稻壳 和米糠为碳源测定了6 株出芽短梗霉菌菌株分解纤维素的能力，同时测定了以葡萄 糖为碳源时普鲁兰生产能力。结果表明，与葡萄糖为碳源时相比，这6 株菌株不能 利用稻壳为碳源生长和生产普鲁兰多糖；6 株出芽短梗霉菌菌株能够利用米糠产生 少量的普鲁兰多糖，但远远不能够足工业生产的需要；出芽短梗霉k c c m 6 0 1 2 2 和 h p 2 0 0 1 具有较强的普鲁兰生产能力和细胞生长能力；葡萄糖浓度为5 0 o o g l 时表 现最为显著，二者的普鲁兰产量分别为1 4 3 5 e d l 和1 5 4 8 9 l ，出芽短梗霉菌菌株 h p 2 0 0 1 普鲁兰产量最高，而其他4 株菌株在同样条件下的普鲁兰产量均小于 5 o o e l 。 2 出芽短梗霉菌a u r e o b a s i d i u mp u l l u l a n sh p 2 0 0 1 菌株发酵条件的优化 通过一系列的单因素实验和正交试验，研究芽短梗霉菌生产普鲁兰多糖的最佳 发酵条件。结果表明，出芽短梗霉发酵过程中细胞生长的最佳培养基配方为：葡萄 糖1 0 0 o o g l ，酵母浸提物2 5 0g l ，k 2 h p 0 47 5 0 9 l 、n a c l1 o o g r t 一，m g s 0 4 。7 h 2 0 o 10 9 l ，( n h 4 h s 0 42 4 9 e ，最适初始p h 为6 0 ，最适温度为3 0 c ；摇瓶发酵优化 条件为：葡萄糖1 0 0 o o g , l ，酵母浸提物2 5 0 9 l ，k 2 h p 0 42 5 0 9 l 、n a c l0 2 5 9 l ， m g s 0 4 7 h 2 0o 0 5 9 l ，( n h 4 ) 2 s 0 40 3 9 l ，最适初始p h 为6 0 ，最适温度为2 5 c 。 3 出芽短梗霉菌a u r e o b a s i d i u mp u l l u l a n sh p 2 0 0 1 产普鲁兰多糖发酵过程的优化 考察通气量、搅拌转速和罐内压力对出芽短梗霉a u r e o b a s i d i u mp u l l u l a n s 普鲁兰产生菌a u r e o b a s i d i u m p u l l u l a n sh p 2 0 0 1 发酵条件的优化研究 h p 2 0 0 1 产普鲁兰能力的影响，分别在7 l 发酵罐内进行通气量和搅拌转速的优化， 在1 0 0 l 发酵罐内进行罐内压力的优化研究。结果表明，出芽短梗霉菌h p 2 0 0 1 发 酵生产普鲁兰的最佳通气量为1 o o w m ，最佳搅拌转速为4 0 0 r m i n ，最佳罐内压力 为0 4 0 k g f c m 2 。 关键词：出芽短梗霉；菌株筛选；普鲁兰多糖；发酵条件 u 华中农业大学2 0 0 8 届硕士学位论文 s t u d yo no p t i m i z a t i o no f f e r m e n t a t i o nc o n d i t i o nu s i n g a u r e o b a s i d i u mp u l l u l a n sh p - - 2 0 01 a b s t r a c t a u r e o b a s i d i u mp u l l u l a n si sak i n do fm u l t i m o r p h o l o g yf u n g i p u l l u l a ni sam a j o r p o l y s a c c h a r i d ep r o d u c e db y s t r a i n so fau r e o b a s i d i u mp u l l u l a n s i th a st h ep o t e n t i a l m u l t i u t i l i z a t i o n i nt h ee x p e r i m e n t ，p u l l u l a nf e r m e n t a t i o ns t r a i nw a ss e l e c t e d ，b o t ht h e m e d i aa n df e r m e n t a t i o np r o c e s sw a so p t i m i z e d 1 s t a i ns e l e c t i o n b a s eo nr o t a r ys h a k e r , t h ep u l l u l a np r o d u c t i v i t yb yt h e6s t r a i n sw e r ei n s p e c t e d d i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o no fr i c eh u l la n dr i c eb r a nw a su s e da sc a r b o ns o u r c et od e t e c tt h e6 s t r a i n s c e l l u l o s ed e c o m p o s ea c t i v i t yp r i m a r y g l u c o s ew a sa l s ou s e da sc a r b o ns o u r c et o c o m p a r ew i t hr i c eh u l la n d r i c eb r a n t h ec e l lg r o w t ha n dp u l l u l a np r o d u c t i o nc o u l d n tb ed e t e c t e dw h e nr i c eh u l lw a s c a r b o ns o u r c e t h es t r a i n ss e c r e t e dal i t t l ep u u u l a ni nr i c eb r a nm e d i u m , a l t h o u g hc a nn o t s a t i s f i e dt h e r e q u i r e m e n t i n i n d u s t r y a u r e o b a s i d i u mp u l l u l a n sk c c m 6 012 2a n d h p - 2 0 01s e c r e t e dm o r ep u l l u l a nt h a no t h e r4s t r a i n s ，e s p e c i a l l yi n5 0 0 0 9 i ng l u c o s e m e d i u m , t 1 1 ep u l l u l a np r o d u c t i o nw e r e1 4 3 5 和1 5 4 8 9 ls e p e r a t e l y ，a n dt h ep u l l u l a n p r o d u c t i o no fo t h e r4s t r a i n sw a s l e s st h a n5 9 l 2 o p t i m i z a t i o no ff e r m e n t a t i o nc o n d i t i o nu s i n ga u r e o b a s i d i u mp u l l u l a n sh p 一2 0 01 t h es i n g l ef a c t o ra n do r t h o g o n a le x p e r i m e n tw a sc a r r i e do u tt oo p t i m i z et h e f e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n t h e o p t i m a l c u l t u r em e d i u mf o rc e l lg r o w t hw a sa l s o o b t a i n e d ( g l ) ：g l u c o s e1 0 0 0 0 9 l ，y e a s te x t r a c t2 5 0g l ，k 2 h p 0 4 2 5 0 9 l ，n a c l1 0 0 9 l ， m g s 0 4 7 h 2 00 10 9 l ，( n h 4 ) 2 s 0 42 4 0 9 l ，i n i t i a lp h 6 0 ，a n dt h eo p t i m a lt e m p e r a t u r e w a s3 0 。c t h eo p t i m a lc u l t u r em e d i u mf o rp u l l u l a np r o d u c t i o nw a so b t a i n e d ( g l ) ： g l u c o s e1 0 0 0 0 9 l ，y e a s te x t r a c t2 5 0g m ，k 2 h p 0 42 5 0 9 l ，n a c lo 2 5 9 l ，m g s 0 4 7 h 2 0 0 0 5 9 l ，( n h 4 ) 2 s 0 4o 3 0 9 t ，i n i t i a lp h 6 0 ，a n dt h eo p t i m a lt e m p e r a t u r ew a s2 5 c 。 3 o p t i m i z a t i o no ff e r m e n t a t i o np r o c e s su s i n ga u r e o b a s i d i u mp u l l u l a n sh p 2 0 01 t i t 普鲁兰产生菌a u r e o b a s i d i u m p u l l u l a n sh p - 2 0 0 1 发酵条件的优化研究 t h eo p t i m i z a t i o no fa e r a t i o n , a g i t a t i o nw a sc a r r i e do u ti n7 lf e r m e n t o ra n di n n e r p r e s s u r ew a sc a r r i e do u ti n1o o lf e r m e n t o r t h er e s u l t ss h o w e dt h eb e s ta e r a t i o na n d a g i t a t i o nw a s1 0 0 v v ma n d4 0 0 r m i n ，t h eb e s ti n n e rp r e s s u r ew a s0 4 0 k g f c m 2 k e yw o r d s ：au r e o b a s i d i u mp u l l u l a n s ，s t r a i ns e l e c t i o n ，p u l l u l a n ，f e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n i v 华中农业大学2 0 0 8 届硕士学位论文 v 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文 否如需保密，解密时间年月日 是否保密 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已 经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位 或证书而使用过的材料，指导教师对此进行了审定。与我一同x - 作的同志对本研究 所做的任何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意。 研究生签名：岛拢 时间：年石月陟日 学位论文使用授权书 本人完全了解“华中农业大学关于保存、使用学位论文的规定”，即学生必须 按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印刷版 和电子版，并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保 存、汇编学位论文。本人同意华中农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传 播学位论文的全部或部分内容。 注：保密学位论文在解密后适用于本授权书。 鲐砌 孙张专莎f 签名日期：加8 年6 月f 钐日签名日期：1 萨牌月f0 日 注：请将本表直接装订在学位论文的扉页和目录之间 华中农业大学2 0 0 8 届硕士学位论文 第一章文献综述帚一早义l 歌练尬 微生物胞外多糖是近2 0 几年来陆续开发的发酵新产品，因其具有独特的物化性 质，已作为乳化剂、增稠剂、稳定剂、胶凝剂、成膜剂、悬浮剂和润滑剂等应用于 石油、化工、食品和制药等多个领域( i a n ，1 9 9 8 ) 。微生物发酵生产的多糖能克服传 统多糖的缺点，具有生产周期短，原料来源广泛，且多为可再生资源，产品质量和 价格受季节和气候的影响d , ( g i a v a s i s ie ta 1 ，2 0 0 0 ) 。而且微生物多糖可以安全的运用 于食品、医药、化妆品等行业，可以被生物降解，不会污染环境( l ie ta 1 ，2 0 0 0 ) 。 普鲁兰多糖来自于淀粉水解物、蔗糖、葡萄糖等糖类直接发酵生产，易溶于水，不 凝胶化，不老化，可以任意加工成型，无任何毒性，是很有发展前途的工业用多糖( 孟 少魁，2 0 0 6 ) 。 1 普鲁兰多糖研究概况 1 1 普鲁兰多糖研究进展 普鲁兰多糖( p u l l u l a n ) 中文亦译为茁霉多糖、出芽短梗孢糖、普聚多糖或普鲁兰 糖。它是出芽孢梗霉产生的胞外多糖，以伐1 ，6 糖苷键结合麦芽糖构成同型多糖为主， 即葡萄糖以0 【1 ，4 糖苷键结合成麦芽三糖，两端再以0 【1 ，6 。糖苷键同另外的麦芽三糖 结合，如此反复连接而成高分子多糖。0 【1 ，4 一糖苷键同c 【1 ，6 糖苷键的比例为2 ：1 ( 许勤 虎等，2 0 0 3 ) ，分子量为1 5 x 1 0 4 - 1 o 1 0 7 ( k 油等，2 0 0 0 ) 。b a u e r 在1 9 3 8 年对真菌出芽 短梗霉产生的胞外聚合物进行了报道( b a u e r ，1 9 3 8 ) ，b e m i e r 在1 9 5 8 年分离并开始表 征这种多糖( b e m i e r ，1 9 5 8 ) ，b e n d e r 等人在1 9 5 9 年将这种多糖命名为“普鲁兰” ( b e n d e r ，1 9 5 9 ) 。自此，这种多糖的诸多问题引起了研究者们的广泛兴趣。w a l l e n f e l s 在1 9 6 1 年基本上确定了普鲁兰的结构( w a l l e n f e l sa n db e n d e r ，1 9 6 1 ) 。1 9 6 1 年b e n d e r 和w a l l e 止1 s 发现了产生普鲁兰的酶，这种酶能专一性的把普鲁兰中的c 【1 ，6 一糖苷键 水解，并几乎把多糖都转化为麦芽三糖。因此普鲁兰普遍被认为是亚单位麦芽三糖 由0 【1 ，6 糖苷键连接起来的聚合物。然而普鲁兰也可以看成是由潘糖或异潘糖亚单位 组成的聚合物。这样能更准确的反映普鲁兰分子这种生物合成的来源。c a t l e y 及其合 作者随后研究发现麦芽四糖亚单位在普鲁兰分子中出现的百分率较，j x ( c a t l e ya n d w h e l a n ，1 9 7 1 ) 。1 9 8 3 年英国c a r o l a n 等报导，普鲁兰的重复单位通常是麦芽三糖，这 普鲁兰产生菌a u r e o b a s i d i u m p u l l u l a n sh p 2 0 0 1 发酵条件的优化研究 种三糖通过a 1 ，6 葡萄糖苷键连接在还原性或非还原性的末端糖基上( 吴东儒，1 9 8 7 ) 。 依据菌株和培养条件的不同，普鲁兰分子中的麦芽三糖残基可以有5 7 被麦芽四糖 代替( 王雪松，2 0 0 5 ) 。 目前对普鲁兰生物合成普的机理了解较少，不同于细菌产生的右旋糖苷，它是 由分泌的葡萄糖蔗糖酶胞外合成。普鲁兰是胞内合成的并且是由真菌茁芽短梗霉 ( a u r e o b a s i d i u mp “_ u _ f 硼岛菌株分泌的。研究表明普鲁兰的合成涉及至u u p d 一葡萄 糖，需要a t p ，通过脂质中间体进行( o n o ，1 9 7 7 ) 。 7 0 年代初研究主要包括普鲁兰的分子结构与性质及其潜在的应用范围，产生菌 出芽短梗霉的分类命名及培养条件等。7 0 年代中后期，日本进行规模化发酵，进入 8 0 年代后，由于应用研究未能突破，生产成本与工艺未能完全解决，生产规模始终 未能突破。我国普鲁兰研究起步于7 0 年代中期，目前尚处于实验室研究阶段。 1 2 普鲁兰多糖的物理、化学性质 1 2 。1 安全性 普鲁兰多糖的急性、亚急性和慢性毒性试验和致畸实验表明，此种多糖不会引 起任何生物学毒性，所以用于食品和医药领域的。普鲁兰多糖在动物体内消化缓慢， 利用此种特性可制造低热量食品和饮料。微生物的酶能够或快或慢的分解普鲁兰， 使之在自然界消失而不造成环境污染。因此，普鲁兰还可以作为生物降解膜的材料。 此外普鲁兰也容易被活性污泥处理净化。微生物产生的普鲁兰酶可将其水解，产物 为麦芽三糖。此外，g 淀粉酶也可将其缓慢水解成寡糖。自然界的普鲁兰多糖可被 微生物降解，使之自然消失，不会污染环境，普鲁兰还可以作为生物降解膜的材料。 此外普鲁兰也容易被活性污泥处理净化。 1 2 2 稳定性 粉末状的普鲁兰对热的反应与淀粉相同，加热后不融化，1 0 0 c 失去平衡水分， 2 5 0 。c 以上会迅速分解炭化，但不会产生有毒气体。普鲁兰多糖粘度在常温下受p h 影响较小，只有p h 3 以下和p h ll 以上才会慢慢水解。一般天然或合成的高分子物质 在金属离子存在时，粘度下降，并引起凝胶现象，而普鲁兰在金属离子溶液中却相 2 华中农业大学2 0 0 8 届硕士学位论文 当稳定，某些金属离子甚至可使其粘度增大。 1 2 3 溶解性 普鲁兰可以在水中自由膨胀、溶解，溶解速度比羧甲基纤维素、藻酸钠、丙稀 醇、聚乙烯醇快两倍以上。溶液呈中性，不离子化、不凝胶化、不结晶。普鲁兰在 相对湿度7 0 以下的空气中含平衡水分1 0 。1 5 ，不吸潮、不胶粘。普鲁兰在高温高 压条件下，经酯化、醚化或同其他高分子材料交联聚合，可改变其溶解性，普鲁兰 的这种性质使其能在很多特殊的工业生产中应用。 1 2 4 粘度 普鲁兰分子呈线状结构，这种结构特性使普鲁兰溶液的粘度远低于其他多糖。 普鲁兰的这种性质对喷雾涂层或制薄膜等制造工艺十分有利。普鲁兰溶液的粘度随 平均分子量和浓度的增加而增大，但比其他高分子物质粘度要小，浓度的增加能使 普鲁兰多糖水溶液从牛顿流体变为假粘流体，利用这一特点能有效的改进食品的咀 嚼性。同其他多糖一样，普鲁兰多糖溶液的粘度随温度的升高而降低。与其他高分 子材料，如羧甲基纤维素、海藻酸钠、聚乙烯醇等有很好的共溶性，与淀粉和动物 胶也有很好的共溶性。因此，可与其它的聚合物添加剂混合应用于食品行业。普鲁 兰多糖水溶液有滑润清爽的感觉，具有改善口感的作用。 1 2 5 可塑性 普鲁兰可塑性强，可以制膜、纺丝、任意造型。将5 2 0 的普鲁兰溶液浇注在 玻璃板、金属板或滚筒上，干燥，卷收，容易制成不同厚度的薄膜，膜的厚度随普 鲁兰的平均分子量和水溶液的浓度的不同而有所不同，但普鲁兰膜的伸展率低，卷 收时应注意。普鲁兰膜对温度不敏感，在o 。c 以下仍具有耐油性、热封性和可食性。 普鲁兰成型物与其他高分子材料不同，成型时不需添加增塑剂和稳定剂，也不含未 聚合的单体。此外，如果普鲁兰同其他高分子材料混合成型，可改进成型物质的性 质。 1 2 6 普鲁兰薄膜的性质 普鲁兰可直接制成薄膜，或在物体表面涂抹或喷雾涂层，成为紧贴物体的薄膜。 普鲁兰产生菌a u r e o b a s i d i u m p u l l u l a n sh p 2 0 0 1 发酵条件的优化研究 普鲁兰粉末加水1 0 2 0 ，在1 5 0 c 加压成型，得聚苯乙烯状的成型物，无色透明、 光亮、弹性较强、可任意染色而强度不发生变化。普鲁兰薄膜表面硬度高，表面摩 擦系数小，弹性强，但伸展率在平衡水分位3 一1 5 时较低。普鲁兰薄膜与其他高分 子薄膜相比透气性能低，氧气、氮气、二氧化碳等气体几乎完全不能透过，仅聚乙 烯醇可与之相比，但普鲁兰薄膜的隔气性能随含水量( 平衡水分) 的增加而降低。 质量浓度为5 的普鲁兰多糖和质量浓度为5 的甘油形成的膜具有较高的阻气性和 拉伸强度。为增加普鲁兰薄膜的柔软性，可在制膜时添加糖醇，但加入糖醇量不能 超过2 0 ，以免在膜上结块。 2 出芽短梗霉研究概况 2 1 出芽短梗霉的特性 出芽短梗霉菌在自然环境中主要分布在植物的茎、叶、果实表面及花粉、树皮 中。由于遗传上的不稳定性，形成许多变种，菌落最初粘稠，白色，很快转变为淡 绿色，最终为黑色。菌落质地由粘稠状到坚硬的革状，菌落边缘呈明显的根状，在 味精、酒糟及母板上形成黑斑。实验室条件下在含糖培养基中生长良好，并产生粘 性多糖。出芽短梗霉呈典型的真菌生长，形成疏松边缘不整齐的真菌性菌落( 崔堂兵， 2 0 0 2 ) 。 出芽短梗霉是一种具有复杂生活史的多形态真菌，其拉丁名曾为p u l l u l a r i a 、 p u l l u l a n 和d e r m a t i u mp u l l u l a n ，现称为a u r e o b i a s i d i u mp u t l u l a n s 。其中文名为“芽生 侧茁霉 、“出芽茁霉”、“出芽短梗霉”、“黑酵母 及“短梗霉 等。出芽短 梗霉具有复杂的生活周期，在其生长过程中细胞形态有如下五种变化：酵母状、肿 胀孢子、芽孢子、菌丝状及厚垣孢子，这几种形态的演化取决于生长条件。无性繁 殖方式多样，主要类似于酵母菌的多边芽殖形式到形成明显的菌丝。常具有节孢子、 厚垣孢子、芽分生孢子。幼龄营养细胞椭圆形至柠檬形，代谢为氧化型。经研究发 现，多糖产量随着酵母状细胞比例的增加而增i j l z l ( b a u e r ，1 9 3 8 ) 。 2 2 出芽短梗霉的菌种选育 目前出芽短梗霉育种的研究主要集中在高产短梗霉多糖菌种的选育，主要希望 解决短梗霉多糖发酵中的两个问题：一是培养物在发酵4 8 h 后开始分泌大量的黑色素 4 华中农业大学2 0 0 8 届硕士学位论文 使产品在下游加工中必须多次脱色；二是出芽短梗霉在发酵过程中只有形态呈酵母 状时，才能分泌出大量的短梗霉多糖。出芽短梗霉的一个野生菌株在试验条件下产 生3 9 l 胞外多聚糖，经过紫外诱变后得到一个高产短梗霉多糖( 在试验条件下产量 为1 0 9 l ，优化条件下为7 0 9 l ) 的新无性系( t a r a b a s z e ta 1 ，1 9 9 3 ) 。方宣钧、张英应用 紫外随机诱变获得了两株多糖产量高、色素低的出芽短梗霉突变株z y 0 4 7 和z y 0 7 3 ， 其产量分别为1 5 1 5 m g m l 和1 4 2 2 m g m l ，而且发酵状况得到很大的改善，产生了 大量的膨大细胞和厚垣孢子。通过对出芽短梗霉培养基的碳氮比和其它发酵条件进 行优化，z y 0 4 7 突变株获得短梗霉多糖的产量为2 1 1l m g m l ，转化率达5 4 1 。与原 发酵条件相比，多糖产量和转化率分别提高5 1 和3 2 。 浓度0 2 m o g l 至1 0 m o l l 的亚硝基胍f n u m ) 对出芽短梗霉菌株具有诱变作用， 影响多糖的产量。当诱变剂剂量为0 0 2 到8 9 时，细胞能够存活，微生物的形态 变异率较高，且有利于多聚糖的生产。o 5 的n u m 照射3 h ，细胞存活率约1 0 时， 对诱导高产量的多糖的变异最佳( p r o n i n ae ta 1 ，1 9 8 0 ) 。在基础培养基中添加适宜浓 度的秋水仙素也可提高出芽短梗霉的变异频率。将3 的秋水仙素溶液作用时间从5 天延长到9 天时，所产生的活性变异株数目相对减少。某些变异株合成普鲁兰的能力 较高，但与出芽短梗霉染色体倍数提高无关( 郭慧云和刘兰英，1 9 8 8 ) 。 采用出芽短梗霉为出发菌株，通过原生质体再生育种方法获得了6 个遗传性状稳 定的菌株。研究了细胞和菌落的形态学变异、色素和多聚糖产量。在相同条件下， 测定了1 0 3 个再生菌株的多聚糖产量，总变异率为6 9 ，在这些再生变异株中，r 4 5 在发酵5 天内不产色素，它的多聚糖产量比原菌株高5 0 ( 丁骅孙和张汉波，1 9 9 7 ) 。 2 3 出芽短梗霉的发酵产物 出芽短梗霉发酵产生的胞外多聚糖多种多样。其中最重要的是短梗霉多糖。 n a v a r i n il 等从一个出芽短梗霉菌株中分离出一种酸性胞外多聚糖。这种多聚糖不 同于短梗霉多糖，分光光度法和色谱法分析证明这种多聚物是p d 葡聚糖，该糖含 有一个( 1 ，3 键) 连接的p d 吡喃葡萄糖苷单位的主链，在氧，6 、4 f f _ 被单一的d 吡喃葡 萄糖苷侧链所取代。主链单位与侧链单位的比值是1 4 ：1 。这种胞外多聚糖的离子性 质是由于通过酯键连接在多聚物上的苹果酸残基而造成的。苹果酸残基取代的程度 很低( o 0 5 ) ，在水溶液中核磁共振谱的信号不强，表明这种多聚物具有刚性有序构 普鲁兰产生菌a u r e o b a s i d i u m p u l l u l a n sh p 2 0 0 1 发酵条件的优化研究 象，这一点被其流变学数据进一步证实。d m s o 可诱导其构象转变，在d m s o 中得 到较好信噪比的核磁共振谱。虽然分支程度和苹果酸基团的取代程度不同，但这种 多聚物的溶液性质仍类似于其它分支( 1 ，3 键) p d 葡聚糖( n a v a r i n ie ta 1 ，1 9 9 6 ) 。 以葡萄糖、甘露糖和葡萄糖类似物作为能源，通气培养出芽短梗霉a t c c4 2 0 2 3 ， 在这种情形下产生的胞外提取物由葡萄糖和甘露糖组成，多聚物提取物中葡萄糖与 甘露糖的摩尔比和多聚物的分子量因所用能源和培养时间不同而改变。当用葡萄糖 和甘露糖作碳源时，多聚物中葡萄糖的含量在8 7 9 1 之间。随培养时间分子量从 3 5 1 0 6 2 1 2 x 1 0 6 下降n o 8 5 x 1 0 6 - 0 7 7 x 1 0 6 ；随着培养时间增加，以葡萄糖胺为碳源， 多聚物中葡萄糖的含量从5 5 士3 到2 9 士2 ，分子量从2 7 3 x 1 0 6 增加到4 8 6 x 1 0 6 。没有 证据表明葡萄糖胺直接掺入到多聚物中。多聚物提取物中葡萄糖与甘露糖的摩尔比 变化范围在2 8 士2 ：7 2 - - b 2 9 l j 8 7 ：1 3 + 3 ，且受所添加能源的影响。在多聚物的酶水解结果 和观察到的组成变化的基础上，甘露糖( 一个重复单位) 被葡萄糖取代，产生一类新 的多聚物类似物( l e ee ta 1 ，1 9 9 9 ) 。 出芽短梗霉的一个菌株在液体培养基( 合成培养基) 和固体培养基( 小麦麸培养基) 中能生产淀粉酶。葡萄糖对淀粉酶的生产或分泌有抑制作用。天冬酰氨是淀粉酶生 产( 4 - 6 9 l ) 最好的氮源。用硫酸铵作氮源时只产生厚垣孢子和黑色素，没有淀粉酶产 生。固体培养基中淀粉酶的产量高于液体培养基。固体培养基中最适宜的含水量在 5 7 7 4 之间。用液体培养基还是固体培养基中培养的细胞接种到固体培养基上， 淀粉酶产量没有显著差异( l o d a t oe ta t ，19 9 7 ) 。 出芽短梗霉以d 木糖为碳源时，可被诱导合成一种木糖醇脱氢酶，这种酶在有 n a d 时能将木糖氧化成d 木酮糖，然而生长在d 葡萄糖上的细胞没有显示出木糖醇 脱氢酶活性。但是，当将生长在d 葡萄糖上的细胞转移到含有d 木糖的液体培养基 中时，这种酶开始合成，这表明木糖醇脱氢酶是一种诱导酶。纯化的出芽短梗霉木 糖醇脱氢酶对木糖醇的催化相当专一，这与其它来源的类似脱氢酶不一样，它们能 水解各种不同长度链的多羟基化合物。这种性质使这种酶在即使有其它多羟基化合 物存在时仍可用于测定木糖醇含量( s u g a ia n dv e i g a ，1 9 8 1 ) 。 出芽短梗霉的一个有色突变株( n 褂t l y 12 9 7 4 ) 在斯佩尔特燕麦木聚糖液体培养 基中培养时产生c 【l 邛可拉伯呋哺糖苷酶( c 【l a f a s e ) 。经硫酸铵沉淀，d e a e b i o g e l a 6 华中农业大学2 0 0 8 届硕士学位论文 柱层析，o 5 m b i o g e l a 柱过滤，阿聚糖琼脂糖凝胶6 b 亲和层析，s p 葡聚糖凝胶c 5 0 柱层析，一种胞外a l a f a s e 被提纯2 1 5 倍。纯化酶的分子量为2 1 0 0 0 0 d a ，由两个相 等的亚基组成。该酶的半衰期在7 5 。c 时为8 h ，在7 5 c 和p h 4 0 4 5 时有最大酶活力， 浓度为2 1 4 8 1 a m o l ( l m i n m g ) 对硝基苯0 【d 呋哺阿拉伯糖苷具有专一的催化活性。纯 化的a l a f a s e 容易水解阿聚糖，去分支阿聚糖及从阿拉伯木聚糖中释放树胶醛糖， 但对阿拉伯半乳聚糖无活性。该酶在7 5 和p h4 5 时水解对硝基苯甜d 呋喃阿拉 伯糖苷，阿聚糖和去分支阿聚糖的米氏常数值分别为0 2 6m m o l l 、2 1 4 m g m l 和 3 2 5 m g m l 。a l a f a s e 活性完全不受l 树胶醛糖( 1 2 m o l l ) 的抑制。酶的活性不需要 金属离子，不受对氯汞苯甲酸( o 2m m o l l ) 、e d t a ( 1 0 m m o l l ) 或二硫苏糖醇的影响 ( s a h aa n db o t h a s t ，19 9 8 ) 。 从培养在含木糖培养基的出芽短梗霉细胞中分离提纯了p 木聚糖酶和p 一木糖苷 酶。酶活性的细胞分布研究表明在对数生长期和稳定期p 木聚糖酶是一个胞外酶， 而p 木糖苷酶大部分是外胞周质酶。p 木聚糖酶对从桉树溶解纸浆中提取的p 木聚糖 表现出很高的专一性，而b 一木糖苷酶仅对对硝基苯木糖苷和木二糖有活性。比较 k c a t k m 的比值显示b 一木聚糖酶水解溶解纸浆中木聚糖的效率比桉树半纤维素b 、桉 树半纤维素a 和落叶松木聚糖高1 3 、2 1 、2 3 倍。当用于亚硫酸纸浆，两种酶都释放 出木糖和不同程度地水解木聚糖。尽管d 木糖苷酶( o 4 u g 纸浆) 从纸浆中释放的木糖 多于p - 木聚糖酶( 4 7 u g 纸浆) ，但有3 的木聚糖溶解。用p 一木聚糖酶处理纸浆释放 出木糖5 1 7 1 - t g g ，并水解1 0 的木聚糖。将两种酶加入纸浆中可1 2 的纸浆木聚糖。 当在两种酶的混合物中补加p 甘露聚糖酶时，从纸浆中释放木糖表现出协同作用。 但是这并不能导致纸浆木聚糖的进一步酶解。p 木聚糖酶和p 木糖苷酶通过增加纸 浆中纤维素的相对含量和减少半纤维素的含量而改变亚硫酸纸浆的糖类组( c h r i s t o v e ta l ，1 9 9 9 ) 。 3 普鲁兰多糖生产工艺的研究 优良的菌株以及优化的培养条件是高产的基础。培养基的碳源、氮源、p h 、无 机盐种类和浓度、培养温度以及溶解氧都是影响普鲁兰发酵产量的重要因素。目前， 可以用来发酵短梗霉的碳源种类非常丰富，多数菌株能利用葡萄糖、蔗糖、麦芽糖 和可溶性淀粉等小分子糖类做碳源来合成大分子的普鲁兰多糖( l e a t h e r se ta 1 ， 7 普鲁兰产生菌a u r e o b a s i d i u m p u l l u l a n sh i - 2 0 0 1 发酵条件的优化研究 1 9 8 8 ) 。c a t l e y 等人利用单糖、蔗糖、麦芽糖、甘油为碳源进行发酵产生普鲁兰的比 较，发现5 的蔗糖的发酵效果最好，普鲁兰产量可达6 0 。使用淀粉作为碳源的报 道最早见于日本林原公司加滕的专利，用1 0 部分的水解淀粉做碳源，多糖转化率 可达7 0 。美国人l e a t h e r 等人用2 的淀粉直接发酵，转化率最高为5 1 。l a z a r i d o u 等人利用甜菜为碳源，糖转化率为5 0 ( l a z a r i d o ue ta l ，2 0 0 2 ) 。 氮源同样影响普鲁兰的发酵产量，一般认为低浓度的氮源有利于多糖的合成。 茁芽短梗霉的不同菌株对氮源的利用有显著差异( b a d r ，1 9 9 4 ) 。硫酸铵、谷氨酸、硝 酸钠、硫酸亚铁铵、乙酸铵、尿素、蛋白胨等无机及有机含氮物，均可作为其生长 菌体和产生普鲁兰的氮源。硫酸铵几乎可被所有菌株利用。c a t l e y 认为只有n h 4 + 消 耗殆尽时，普鲁兰才开始合成( c a t l e ya n dw h e l a n ，1 9 7 1 ) 。以n h 4 + 作氮源时，菌体的 积累与普鲁兰产率属于氮源限制性过程，即增j 3 e i n h 4 + 的浓度可强化碳源更多地形成 菌体，增加菌体总重量，但同时降低了普鲁兰的产率。因此，培养基中保持较高的 c n e t 有利于限制菌体积累而提高普鲁兰产率( s i m o ne ta 1 ，1 9 9 3 ) 。a u e r 和s e v i o u r 通 过实验确认其他氮源如谷氨酸在同样浓度范围和培养的p h 条件下，并不抑制多糖的 合成( a u e ra n ds e v i o u r ，19 9 0 ) 。 培养基p h 值的变化也会影响普鲁兰的产量，同时对菌株的形态和普鲁兰的分子 大小都有作用( l e ea n dy o o ，1 9 9 3 ) 。茁芽短梗霉在液体培养条件下可向环境分泌酸 性物，使p h 下降。但培养液初始p h 原很低时，产酸能力似乎受到抑制，培养终点p h 变化不明显；反之，若初始p h 较高，则培养终点时p h 下降明显。c a t l e y 首先提出在 高p i - i 时，培养基中的葡萄糖用来合成菌体，在合成晚期，p h 较低的情况下才开始多 糖的合成。p h 的变化主要制约培养基中酵母型细胞与菌丝的比例，当初始p h 低于 2 2 5 时，菌体几乎完全呈菌丝状，酵母型细胞极少，培养液中很难检测到普鲁兰的 存在( 即不合成) ；在初始p h3 5 5 的范围内，菌体总重量达到最大值，即为菌体形 成的最佳范围；在初耍f l p h 6 7 的范围内，培养液中菌体形态以酵母型细胞为主，约占 细胞总量的8 0 9 0 ，普鲁兰产率最高，可达5 0 6 0 ( o n oe ta 1 ，1 9 7 7 ) ，是普鲁兰合 成最理想的范围。提高或降低初始p h ，均使酵母型细胞的比例下降，普鲁兰的产率 显然也随之降低。在培养基 p h i l 普鲁兰合成的影响与氮源物质的种类有关。以谷 氨酸代替硫酸铵作氮源时普鲁兰产率不受p h 影响；以酵母提取物为氮源时，普鲁兰 生成的最适p h 要提高1 2 个单位。 华中农业大学2 0 0 8 届硕士学位论文 培养温度也是影响普鲁兰合成的重要因素。m c n e i 坪口时i s t 池e n 利用分批培养和 连续培养发现菌体合成普鲁兰的最适温度为2 4 ，并且温度的变化可能会引起菌体 形态的变化( m c n e i la n dk r i s t i a n s e n ，19 9 0 ) 。t h o m a s 利用蔗糖或玉米糖浆做碳源在不 同温度下发酵，发现2 6 为合成普鲁兰的最适温度，且在此温度下菌体干重最少， 而在普鲁兰产量较低的温度条件下菌体的干重通常较高。 培养基的溶氧水平也会影响普鲁兰的合成( g i b b sa n ds e v i o u r ，1 9 9 6 ) 。普鲁兰的 合成必须在好氧条件下完成，供氧不足除导致产生黑色素外，更重要的是产率下降。 高氧摄入率会提高普鲁兰的产量，利用发酵罐，在无p h 控制条件下，溶氧1 0 即可 达到普鲁兰的最高产率。 除了上述几个影响因素外，培养基中的维生素、无机盐和微量元素对普鲁兰的 合成也会有影响。发酵培养基中磷酸盐浓度偏低不利于菌体生长，偏高则抑制普鲁 兰合成( b a d r e l d i ne ta 1 ，1 9 9 4 ) 。因浓度偏高增加了培养基缓冲容量而i nt l - t p h i 句有利 于合成的最佳范围转变。生物素、铁盐、锰盐的存在有利于提高普鲁兰的产率，而 据r e e s l e v 等人的研究表明，2 当z n 2 + 的浓度大于o 4 5 9 m 0 1 l 时，则菌体由酵母型不断 向菌丝转变，从而使普鲁兰的产率下降( r e e s l e v ，1 9 9 3 ) 。 4 普鲁兰多糖的应用研究 普鲁兰多糖是无色、无味、无臭的高分子物质，具有无毒、安全、耐热、耐盐、 耐酸碱、黏度低、可塑性强、成膜性好等特点。国外已进行多年的研究，日本已工 业化生产，年销售量超过万吨。我国从2 0 世纪8 0 年代开始，许多科研院所和大专院 校进行了研究，分别在菌种诱变、选育、发酵培养基的优化、发酵动力学、发酵过 程中黑色素的抑制及普鲁兰多糖的应用上作了大量的工作，多糖的原料转化率已超 过3 0 。普鲁兰多糖优良的理化性质决定了其在食品、医药、化工、环境方面的特 殊用途。 4 1 普鲁兰多糖在食品方面的应用 普鲁兰多糖具有易溶于水、易降解、无毒性和无污染等优点。浸泡或喷涂食品 表面具有无色、无味、透明、抗菌及抗氧保鲜的作用。作为食品添加剂可赋予其特 殊的品质，如降低热量、改善口感、及防止干化氧化等( 淡家林，1 9 8 5 ) 。 9 普鲁兰产生菌a u r e o b a s i d i u m p u l l u l a n sh p 一2 0 0 1 发酵条件的优化研究 普鲁兰多糖对人体消化器官分泌的消化酶不敏感，在数小时内只有3 0 的a 1 ，6 键被分解。因此，可用它作为一种无害的低热量营养食品配料( 梁金虎，1 9 8 5 ) 。用 适当比例的面粉、直链淀粉和普鲁兰多糖混合制成风味不同的人造米和鸡蛋面，通 心面或烘馅饼等食品，热量比一般食品低一半。添加有普鲁兰多糖的食品外观与一 般食品相似，并能充分满足限制热量摄入的要求。低热量食品食后有饱食感，但吸 收热量少，对于需要低热量吸收的入，如肥胖和糖尿病人是一种减低热量吸收的办 法。 值得注意的是，高分子量的普鲁兰多糖似乎对食品中的高分子蛋白质有特殊的 作用。例如，往豆浆和氧化镁的混合物中加入0 o l 0 3 0 的普鲁兰多糖，可很容 易的制成豆腐，效果与用石膏或6 葡萄糖酸内酯凝固剂一样。用此种方法制成的豆 腐色泽好，而其固有的风味保持不变( 王长海等，1 9 9 9 ) 。 将肉类碎块与普鲁兰多糖混凝成一定形状，干燥至含水量1 0 1 5 ，可制成快 餐用的松脆或半干肉制品。在加工中，普鲁兰多糖显示出良好的凝固性、粘着性和 抗氧化性，并且不带异味。近年，人们已经注意到食品风味和口味的改变，可能是 与食品中的油脂氧化酸败造成的毒素有很大的关系。由于0 2 、n 2 极难透过普鲁兰多 糖膜，故用它制成的薄膜和涂层是防止高脂肪食品氧化酸败和酸价升高的一种极有 效的隔膜。因此，它适合于包装食品级油脂制品如花生糕点等，同样也适用于包装 维生素强化食品，酶制剂，药物等易氧化变质物质。 普鲁兰具有良好的水溶性和较低的粘度，可以用作乳化分散剂，乳化稳定性高， 并赋予食品粘性。在冰淇淋中加入普鲁兰酯，可使其口感滑润，风味良好；在巧克 力加工中使用普鲁兰多糖，成型性好、表面光泽、平滑，口味和风味优良；在果汁 饮料中使用，可适度增加浓郁感，滑润，分散性好，稳定性增强；在高盐食品中添 加，可起到增稠效果，使酱油、调味品、熬煮食品、腌菜等增稠、增光泽，防止离 浆。 4 。2 普鲁兰多糖在化工方面的应用 普鲁兰多糖水溶液有粘稠感，粘度随分子量的增加而提高，热稳定性好，9 0 加热1 小时其粘度仅降低1 0 ，t i 4 + 和s a 2 + 能增加其粘度而n a + 、f e 2 + 、c u 2 + 、c a 2 + 、 m n 2 + 等不影响其粘度。普鲁兰多糖对肉食品、金属、玻璃、混凝土、纸、木制品等 1 0 华中农业大学2 0 0 8 届硕士学位论文 有较强的粘着性，故可做这些物质的粘合剂。以普鲁兰多糖制成的乳化被膜剂，涂 布在水果蔬菜上，能防止鲜度下降，减少干耗，涂在鸡蛋上还能提高鸡蛋壳强度， 阻止局部受压引起的破裂，防止细菌侵入，防止蛋白和蛋黄变坏，在室温下可延长 保存期四、五个月，除此以外普鲁兰多糖还能增加表面光洁度等( 马海容等，2 0 0 0 ) 。 另外，普鲁兰多糖溶液作膜剂处理，能有效防止海产品水分的蒸发