（农药学专业论文）高效氯氰菊酯对鱼生物化学影响及鲇鱼nrf2基因的克隆.pdf

中国农业大学硕士学位论文 中文摘要 中文摘要 随着农药使用量的逐步增加，导致环境污染也日趋加重，威胁着人类的健康。作者以高效氯 氟菊酯为研究对象，研究其对鱼的生物化学影响，并克隆了由高效氯氟菊酯诱导的调控i i 相解毒 酶基因和抗氧化蛋白基因表达的转录因子s i n r f 2 0 此项研究对于降解环境中的农药以及有毒化合 物，保护人类赖以生存的环境，具有重要的理论意义和实际价值。 高效氯氟菊酯对鱼的生物化学影响研究包括其对鲇鱼、鲤鱼代谢酶、r n a 和蛋白质的影响研 究。通过高效氯氰菊醑对鲇鱼急性毒性研究，确定高效氯氟菊酯对鲇鱼的安全浓度为0 3 5 6 扎。 采用高效氯氰菊酯的安全浓度处理鲇鱼和鲤鱼，鲇鱼和鲤鱼的6 磷酸葡萄糖脱氢酶( g - 6 p d h ) 和乳酸脱氢酶( l d h ) 活性以及r n a 和蛋白质含量逐渐降低。撤离高效氯氰菊酯后，鲇鱼和鲤鱼 的脑、腮、肝、骨骼肌肉中g 6 - p d h 和l d h 酶活性、r n a 和蛋白质含量恢复到对照水平。研究结 果表明高效氯氟菊酯对鱼代谢酶，r n a 和蛋白质的生物化学影响显著，撤离高效氯氰菊酯后能够 逆转其对鱼的生物化学影响，g 6 - p d h 和l d h 活性与蛋白质含量呈正相关关系。高效氯氟菊酯能 破坏鱼的细胞新陈代谢。 分离获得高效氯氰菊酯诱导的鲇鱼幼苗m r n a ，构建c d n a 文库。用小鼠基因作探针，通过 与鲇鱼的c d n a 文库进行原位杂交，克隆了鲇鱼的n r f 2 基因，命名为s i n r f 2 ，其核苷酸长度为 t 7 6 1 b p 编码5 8 7 个氨基酸组成的蛋白质，与斑马鱼、小鼠、猩猩、青蛙n r f 2 基因的氨基酸序列 比较，同源性较高。转录因子s i n r l 2 具有6 个功能n e h 结构域，n c h l 、n e h 2 、n e h 3 、n e h 4 、n e h 5 、 n e h 6 。其中尉n r f 2 基因自l j n e h 2 结构域与c n c 家族成员n r f l 、小鼠n i 乜、c n c c 和s k n 1 的n e h 2 结构 域同源性比较，n e h 2 的n 端是高度保守的。s i n r f 2 基因的n e h 4 t a l n e h s 结构域与小鼠n r f 2 、p 4 5 和 n r f l 韵n e h 4 和n e , h 5 结构域同源性比较，& 獭口与p 4 s 和n f f l 的n e h 5 结构域有高的同源性，与p 4 5 和n r f l 的n e h 4 结构域没有任何同源性。转录因子 j ! 口与削i t e 顺式作用元件特异性结合，诱导i i 相解毒酶和抗氧化胁迫蛋白基因的表达，i i 相解毒酶基因包括苯醌氧化还原酶，谷胱甘肽一s 一转 移酶和u d p 一葡萄糖醛酸基转移酶等，对农药的代谢具有重要的解毒功能。通过r t - p c r 对s i n r f 2 基因的m r n a 累积的研究，结果表明s 椭r f 2 基因在肝、肾中表达量较高，本论文结果对深入研究 环境中异源有毒物质的作用机制具有重要的意义。 关键诃：高效氯氰菊酯鱼，转录因子，n r f 2 a b s t r a c t w i t ht h ep e s t i c i d eu s a g ei n c r e a s i n g ，t h ep o l l u t i o no f e n v i r a n m e t ui si n c r e a s i n g l ya g g r a v a t i n g w c s t u d yt h eb i o c h e m i s t r ye f f e c t so f b e t a - c y p c r m e t h r i no nc a t f i s ha n dc a r p ，a n dt h e 掘g e n ec l o n eo f t h e c a t f i s hw h i c hc r e g u l a t et h ee x p r e s s i o no f p h a s e h d e t o x i f c a t l o ne n z 蛐ea n da n t i o x i d a n tp r o t e i n t h e s t u d yp o s s e s s e si m p o r t a n tt h e o r ys i g n i f i c a n c ea n dp r a c t i c a lr e f e r e n c ev a l u e t h ee f f e c t so f b e t a - c y p e n n c t h r i no nb i o c h e m i s t r yi n c l u d et h es t u d yo f t h ea c u t et o x i c i t yo fc a t f i s h ， a n dt h ee f f e c to fm e t a b o l i ca l z y m 0 8 ，r n aa n dp r o t e i no f t h ec a t f i s ha n dt h ec a r p w ec o n f n mt h es a f e c o n c e n t r a t i o no fc a t f i s hf o rb e t a - c y p e r m e t h i i ni s0 3 5 6 p g l e x p o s u r et ob e t a - c y p e r m e t h r i ng r a d u a l l y d e c r e a s e dt h ea c t i v i t yo fg l u c o s e & p h o s p h a t ed e h y d r o g c o a s e ( g 4 1 - p d h ) a n dl a c t a t ed e h y d r o g e n a s e ( l d h ) a n dt h er n aa n dp r o t e i nc o n t e n t t h ea c t i v i t yo f g l u c o s e6 - p h o s p h a t ed e h y d r o g e n a s e ( g - 6 - p d h ) a n dl a c t a t ed e h y d r o g e n a s e ( l d h ) a n dt h er n aa n dp r o t e i nc o n t e n tr e s u m et ot h ec o n t r o ll e v e la r e r w i t h d r a w lo fb o t a - c y p c r m c t h d n t h ep r e s e n ts t u d ys u g g e s t st h e r ew e r es i g n i f i c a n tf p ( o 0 s ) p o s i t i v e c o r r e l a t i o n sb c t w e e l la c t i v i t i e so fd i f f e r e n te i i z y l n c sa n dt o t a lp r o t e i no ff i s h ，i ts h o w st h a tt h e r ei st h e e x t r a o r d i n a r yi n f l u e n c eo fb e t a - c y p e r m e t h d no bb i o c h e m i s t r yo f t h ef i s h ；i tw i l lr e v e r s et h ei n f l u e n c e a f t e r w i t h & a w lo f b u t a - c y p e r m e t h r i n t h e b c t a - c y p c n n c t h r i nc a n i m p a i r t h e c e l l m e t a b o l i s mo f f i s h a t t a i nm r n ao fc a t f i s hi n d u c e db yb c t a - c y p c r m e t h r i n ，e s t a b l i s he d n al i b r a r y w ec l o n en r f 2o f c a t f i s hn a m e ds i n r j 2t h r o u g ht h es i m - b l o t i n gw i mt h ee d n al i b r a r yb yt h en r po fm o u s ea sp r o b e , s i n r f 2l o n g1 7 6 1 b p ，c o d et h ep e o t c i nm a d eo f 5 8 7a m i n oa c i d ，t h ei d e n t i t yo fc a t f i s ha n dz e b r a f i s ho f n f f 2 h a v e h i g h i d e n t i t y t h r o u g hc o m p a r e t h e a l i g n m e n t b e t w e e n n f f 2o f c a t f i s h , z e b r a f i s h ，h o u s e m o u s e ， o r a n g u t a na n df r o g t h en e h 2d o m a i no f n 也s h a _ r eh i 曲s i m i l a r i t y t r a n s c r i p t i o nf a c t o rs n v r f 2i n c l u d e s i x n e h d o m a i m n e h l 、n e h 2 、n c h 3 、n e h 4 、n e h 5 、n e h 6 7 n 艟n - t ( a m i n a t o f n e h 2 d o m a i n i s h i g h l y c o n s e r v a t i o n i n c n c f a m i l y n f f l 、n r f 2 、c n c c 和s k n 一1 t h e n e h 5d o m a i no f 受m 口，p 4 5a n d n r f l s h a r eh i 曲s i m i l a r i t y , b u tn e h 4d o m a i n so f p 4 5a n dn f f lh a v en os i m i l a r i t y t r a n s c r i p t i o nf a c t o rs i n r f 2 c a n b i n d t o t h e a r e ，i n d u c e t h e e x p r e s s i o n o f p h a s e i i d c t o x i f c a t i o ne f l z y m e a n d a n t i o x i d a n t p r o t e i n ，t h e p h a s e i ! d e t o x i f c a t i o ne n z y l l l e i n c l u d en a d ( p ) h ：q u i n o n eo x i d o r e d u c t a s e ( n q 0 1 ) ，g l u t a t h i o n e s - h a n s f c r a s e s ( g s t s ) ，a n du d p - g h i c u r o n o s y lt r a n s f e r a s e sc o o t s ) a n ds oo n ，w h i c hh a v ei m p o r t a t d e t o x i f i c a f i o nf u n c t i o nf o rp e s t i c i d em e t a b o l i s m t h er c s t d ts h o w s 聊g e n eh a v eh i g he x p r e s s i o ni n l i v e rb ut h er t - p c r , t h ep a p e rr e s u l tp o s s e s si m p o r t a n ts i g n i f i c a n c ef o rs l u d y i n gt h ef u n c t i o n m e c h a n i s mo f p o i s o n o u sm a t t e ro f a n v i r o n m o n t k e yw o r d s ：b e t a 哪锄e t h r i n ，f i s h ，咖m 嘶6 f a c t o r , j 归 珏 独创性声明 y 9 3 8 , 9 6 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位或证书 而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示了谢意。 研究生签名： 时间：年月日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复 制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、 传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 时间：醇帅易年月，o 日 时间： 二一一年月，彳日 中国农业大学碗士学位论文第一章文献综述 i i l l 第一。章文献综述 农药是用于防治病、虫、草、鼠等危害以及调节农作物生长发育的一类重要的化工产品，目 前全世界各国的化学农药品种约有1 4 0 0 多种进入产业化生产和实际应用的约5 0 0 多种，年产量 以原药计已经达到3 0 0 万吨以上。按农药用途分为杀虫剂、杀菌剂、除草剂、植物生长调节剂和 熏蒸剂等按化学组成主要分为有机磷类、氨基甲酸酯类、拟除虫菊酯等。农药广泛应用于农业、 林业、畜牧业等行业，能够快速、离效、经济的防治有害生物，农药的广泛使用为人类带来了巨 大的效益- 同时农药的长期使用对环境和生物的安全也产生了诸多不利影响，农药对环境和人类 的影响已越来越引起人们的关注。国家环保局在1 9 9 8 年统计了1 9 9 7 年我国加工生产了8 亿k g 以上 各种农药制剂，只有1 0 2 0 吸附于植物体，而8 0 舻9 0 散落于土壤、水和大气中，一些农 药被降解，有些农药残留于土壤或水中，给环境带来污染。化学农药多为有毒物质。巨大数量的 有毒物质进入环境中不可避免地会对人体及生态环境造成不利影响“1 。所以，研究环境中农药对 水体中鱼的生物化学影响以及有毒物质在鱼体中的代谢。降解环境中的有毒物质具有理论意义。 1 1 农药在环境中的代谢降解 施入农田的农药，随着大气的扩散与水的流动，从点到面，从一个环境介质到另一环境介质， 不断地扩大其影响范围。农药在环境中的持留性取决于农药的降解性能，农药在环境中的降解分 三种类型：生物降解、化学降解和光降解。 1 1 1 农药在环境中的生物降解 农药的生物降解是通过生物酶的作用，将农药分解成小分子化合物的过程，降鲫农药的生物 包括微生物、高等植物和动物。微生物在农药降解中的作用尤为重要。土壤中的细菌、真菌、放 线菌和藻类中有一些种类具有农药降解功能。细菌由于其生化上的多种适应能力和容易诱发突变 菌株，从而在农药降解中占有主要地位”。在土壤、污水及高温堆肥体系中，细菌类在农药分解 中起主要作用，这与农药类型、微生物降解农药豹能力和环境条件等有关，由于自然界存在着这 些大量可以降解农药的微生物，所以，微生物就成为生物修复技术的主体，通过微生物的作用， 把环境中的有机污染物转化为c 0 2 和h 2 0 等无毒、无害或毒性较小的其它物质。农药的微生物降 解可分为三个阶段：( 1 ) 初级生物降解，是指有机污染物在微生物的作用下，母体化合物的化学 结构发生变化，并改变了原污染物分子的完整性，邵农药本来的结构发生部分变化；( 2 ) 环境容 许的生物降解，是指微生物除去农药的毒性。或人们所不希望的特性：( 3 ) 最终生物降解，是指 农药通过生物降解，从有机结构向无机化合物转化，完全被降解为= 氧化碳、水和其他无机化合 物- 并被同化为微生物的一部分f ”。环境中广泛存在的可降解d d t 的微生物，既可以在好氧条件 下脱氯降解，又可以在厌氧条件下脱氯降解，如气单胞细菌能在厌氧条件下将d d t 降解转化为 d d d n 。 1 1 2 农药在环境中的化学降解 化学降解主要指自然界产生的各种氧化剂和还原剂以及其它一些功能团破坏或取代有机化 合物上的键或基团，决定于可能反应位的数量和类型，取代功能团的存在以及数量、酸碱性和加 入催化剂的条件，以及溶液的离子强度等影响反应活性的因素1 5 。农药的化学降解包括氧化反应、 还原反应、水解反应、结合反应等。杀虫剂、杀菌剂和除草剂大多数是极性较小的化合物，在生 物体内氧化成急性较大的水溶性代谢物。氧化过程是农药在生物体内最重要的代谢途径。一般是 由多功能氧化酶系在辅酶i i ( n a d p h 2 ) 和分子氧存在下进行的；农药分子中舍有的- n o ，及偶氮 基，在生物体内可被还原为相应的氨基化合物反应生成的相应氨基化合物与原硝基化合物比， 一般均失去活性；水解反应是哺乳动物、植物、昆虫以及微生物中最常见的解毒反应，农药中的 磷酸酯、氨基甲酸酯以及含羧酸酯和酰胺的化合物均可在生物体内由各种酯酶催化水解，产物失 去活性；结合反应是进入机体的外来化合物在代谢过程中与某些内源性化合物或基团发生生物合 成反应，一般情况下，通过结合反应，其水溶性增强，加速了由体内消除过程，而毒性多属失去 或有所降低，并排除出体外 6 1 。 1 1 3 农药在环境中的光降解 残留在地表、水体上层、植物表面及分散在大气层中的农药，无不受阳光照射。因此，研 究农药的光解性能是评价农药在环境中持留性的一个重要指标也是新农药登记时必备的资料。 农药在环境中光解与农药本身的性质、光照强度、土壤或水体的物理性质及化学环境等因素有关。 甲基托布津和托布津在水溶液及喷布于植物叶上的情况下，自然光可使它分解，但在固相条件f 不产生变化。二氯苯酸和谷硗磷在湿润土壤表面可受光分解，而于干燥土壤难分解n l 。江希流等 人研究3 种农药在水体中与土壤表面的光解速率为呋喃丹 甲基对硫磷 v - 6 6 6 ，试验表明，同农 药对不同土壤表面的光解速率基本相同，但不同农药在同一种土壤表面的光解速率则相差很大。 岳永德用高效薄层色谱法研究了农药在自然光照条件下的光解动力学。实验证明农药的光解速率 与光照直接相关，在黑暗的条件下，两种农药都是稳定的f 8 】。 1 2 农药对水生态环境的毒理学研究进展 进入环境中的农药有相当数量经生物圈物质循环后汇集到水体中，从而降低了水生态环境的 质景，影响水生系统中水生生物的多样性和水产品的品质。在被农药污染的水生态环境中，水生 生物是最直接的受害者，农药对水生生物的影响可以表现在分予、器官、组织、个体及种群、群 落等不同水平上。大多数情况下，水生生物暴露在亚致死浓度农药下，但不论长期或是短期都会 受到影响凹。农药进入水体对生物产生的影响，既有因农药对水环境引起变化产生的影响，在一 般情况下不会表现的很明显。在水生态环境中，蚤、藻、鱼组成了一条重要的水生食物链，农药 2 中国农业大学硕士学位论文第一章文献综述 对水体的污染势必给蚤、藻、鱼三种水生生物造成毒害。水中食物链是捕食生物与被捕食生物之 间一个错综复杂的关系，农药污染可能以某种方式破坏或消除这一食物链中一个重要组成部分， 而使生态平衡失调。 i 2 i 农药对鱼类的生态毒理学研究 农药对水体中对鱼类的毒害，主要表现还是经食物链积累产生的慢性毒害，通常情况下发生 急性毒害情况比较少，多出现于局部地区。水域中的农药多数是通过地表径流、漂移或地下水渗 漏从农田进入水体，也有一部分来自于工厂捧放的农药污水，或因卫生需要直接喷洒于水域的农 药。鱼类长期生活在水体中，如水体中存在有一些腊溶性强的农药，即使含量很微少，它也会逐 步在鱼体内富集，造成对鱼的污染f l q 。农药不断的在水产动物体内蓄积，引起中毒、畸变、繁殖 衰退及死亡等。农药的分子结构及脂溶性不同，导致不同农药对同一种鱼类的毒性不同，同种 农药对不同鱼类和同一种鱼类的不同发育阶段的毒性也不同，其原因是农药在不同鱼体内的分 布、激活和解毒等过程不同且比较复杂。一般来说，鱼的不同发育阶段对农药的敏感性由强到弱 的顺序为幼鱼 仔鱼 卵。卵对农药的敏感性较差可能是因为其卵壳蛋白具有保护作用【1 “。 阿特拉津由于高亲脂性在水生生物体内富集，对鱼腮上皮产生严重危害，破坏鱼的生理功能包括 渗透调节、组织坏死、增加肾对血清及蛋白质的排泄，5 u 班的阿特拉津能改变斑马鱼的行为【i “。 对硫磷直接毒害作用明显，可引起鱼类骨骼畸形，对硫磷在0 0 9 4 m f l 浓度时，鲤鱼三天后出 现弯体。中毒病症是出现散群、游动缓慢。有机磷农药引起骨骼畸变和死亡的原因是鱼脑中的胆 碱酶的活动被有机磷所抑制【l ”，如胆碱酶的抑制达到7 0 以上时，鱼就难以生存。洪万树等人研 究5 种有机磷农药对黄姑鱼胚胎和仔鱼毒性的影响，结果表明甲胺磷对胚胎的毒性最大，敌百虫 和敌敌畏对仔鱼的毒性大于其他3 种有机磷农药，敌百虫、敌敌畏、甲胺磷和呋哺丹对仔鱼的毒 性大于对胚胎的毒性，乐果对两者的毒性基本相似。 有机氯农药水溶性差，残效期长，主要是通过土壤侵蚀、沉积物转移和大气沉降等途径进 入水体，对水底中的底栖生物影响很大，它可以在体内蓄积，且有致癌作用。鱼通过腮很容易吸 收到水中的d d t ，而在各组织中蓄积，5 m g k g d d 魄留量能使淡水鱼的鱼苗、鱼种不能完全发 育1 1 5 】。 1 2 2 农药对藻类的生态毒理学研究 藻类在水域中是鱼类饵料的重要来源，作为水生态系统的韧级生产者，藻类能通过光合作用， 为无脊椎动物、鱼类、水鸟等生物提供0 2 、食物，其种类的多样性和初级生产量直接影响水生态 系统的结构功能。藻类也成为监测评价水环境质量的重要指标n 日。农药对藻类毒性的研究表明， 藻对农药的毒害作用可能有七种不同反应h - q 。( 1 ) 随着浓度增加藻类对农药的敏感性急剧增加； ( 2 ) 农药低浓度时有抗性，尚浓度时敏感；( 3 ) 在农药存在之初藻较敏瘟，随后产生抗性，藻能继 续生长；( 4 ) 在高浓度时也有抗性；随后则藻细胞受毒害，脱色：( 5 ) 农药在有限的低浓度范围内 促进藻生长；( 6 ) 农药在高浓度时藻的生长明显受捌激；( 7 ) 对农药有完全t 充 p - 。 藻类对农药毒害反应的多样性决定了必须进行大量的实验。测试不同农药对藻的毒性。许多 3 中国农业大学焉学位论文第一章文献综述 实验发现在自然环境中如湖泊、河流、土壤中，许多农药的浓度很低，往往不足以产生急性毒性， 但在低浓度下，农药也会对藻类产生慢性毒性，并对生态系统产生毒性影响【l q 。大部分有机磷农 药高浓度时，通过降低海洋微藻细胞的超氧化歧化酶( p o d ) 和过氧化物酶( s o d ) 活性，因此无法消 除大量的自由基，引起膜脂过氧化及细胞膜的伤害，抑制海洋微藻的生长和繁殖l i 观。低浓度的脂 质过氧化可能具有刺激细胞生长和繁殖的生理功能刚。不同浓度的氯氰菊酯处理斜生栅藻，藻细 胞的生长受到不同程度的抑制，且抑制浓度与氯氰菊酯的浓度呈正相关，而且观察到部分藻细胞 体积增加，子细胞出现畸形分裂，出现人字形和裤形；氯氟菊酯对栅藻光合色素含景亦有影响， 三种色素( 叶绿素a ，叶绿素b 和类胡萝h 素) 的含量均有所下降，表现明显的毒性作用叫】。 1 2 3 农药对蚤类的生态毒理学研究 蚤类是淡水生物的重要类群，亦是经济鱼类的主要饵料来源，是淡水生态系统中物质循环和 能量流动中的重要环节，它们对毒物有很强的敏感性。农药进入水环境后，会影响水蚤的取食率、 繁殖率和性别比例等。枝角类动物网纹蚤属( 1 a c u s r e i s ) 暴露于氟戊菊酯2 4 , b 时，引起滤食率严 重降低t a x i 。d o d s o n e t ，发现狄试剂和阿特拉津影响水蚤的生殖，可以改变其性别比例1 2 3 j 。呋哺丹、 甲基对硫磷、y - 6 6 6 及溴氰菊酯4 种农药对水蚤的实验室毒性均属于高毒等级，这四种农药对隆 线蚤4 8 h 的半致死浓度依大小顺序为溴氰菊醑 甲基对硫磷 y - 6 6 6 呋喃丹，溴氰菊酯对隆线蚤的 毒性比呋喃丹大6 1 7 倍甲基对硫磷对水蚤的毒性比鲤鱼( 9 6 h - l c m 5 6 p p m ) 大4 3 2 倍，比栅列藻毒 性大4 8 9 倍1 2 4 j 。植物生长调节剂类农药多效唑处理大型蚤，试验结果显示，多效唑对大型蚤母蚤 以及f l 、f 2 代幼蚤的存活率、生长发育、繁殖等指标均有较大的影响哪j 。 1 3 拟除虫菊酯对鱼的毒理学研究进展 拟除虫菊醋类杀虫剂是一类含有苯氧烷基的环丙烷酯从7 0 年代中期拟除虫菊酯类杀虫剂 进入农药市场以来，因其高效、低毒、广谱得到了迅速发展。拟除虫菊酯类杀虫剂的毒性作用机 理是通过对钠泵的干扰使神经膜动作电位的去极化期延长，周围神经也出现重复电位而造成肌肉 的持续收缩，增强脊椎中间神经元和周围神经的兴奋性。拟除虫菊醑类杀虫剂虽然对哺乳动物等 非靶标动物低毒，但它对鱼类、水蚤等水生动物的毒性却很高【2 6 l ，因为拟除虫菊酯农药绝大多数 属于高亲脂性杀虫剂，在水中能直接被分配进入鱼腮和血液中，因而对鱼类产生强烈的毒性口 。 龚瑞忠等研究五种常用的拟除虫菊酯类农药对鱼的毒性影响，结果表明，拟除虫菊酯类农药 对鱼类的毒性极大，并且具有十分明显的时闻效应。五种拟除虫菊醋农药对鱼类的毒性依次为： 氟氰菊酯 溴氰菊醣 氟胺氟菊醋 氰戊菊醋 = 氯苯醚菊醢，鱼类在低浓度的澳氰菊醅溶液中长时 期的暴露，对鱼类的生长有一定的影响，但不一定造成致死的危害；鱼类卵膜对受精卵的发育有 极为良好的保护作用，即使在高浓度拟除虫菊醑农药的环境中，卵膜依然能保护胚胎继续发育成 鱼，但是稚鱼一旦破膜而出其中毒规律和成鱼就相差无几了叨。s h i m ( 1 9 8 3 ) 报道由于氯氰菊酯的 使用能导致鱼死亡脚j 。 4 中国农业大学预士掌位论文 第一章文毂综述 拟除虫菊酯类杀虫剂能影响鱼类钠通道和钠离子代谢。带有a 一氨基的拟除虫菊酯能使钠通 道开发。从而使钠离子流动加快，使神经传递和肌肉收缩加快。例如甲氰菊酯对自鲢心脏收缩的 影响是由于其使穿过心肌膜的钠离子流动速度加快而引起，甲氰菊酯对鱼类高毒的原因之一就是 对钠通道的影响干扰了鱼体离子代谢。干扰了离子平衡嘲。 拟除虫菊醑类杀虫剂对鱼类的亚急性效应主要体现在生长及组织毒害的影响上。郑永华等人 报道甲氰菊酯对鲫鱼毒性极大，大于o 0 0 1 4 m g l 就会导致肝脏发生病变，对生长也产生明显影 响 3 0 l ，拟除虫菊酯类杀虫剂对鱼类高毒的原因之一就是对鱼体组织的损伤破坏作用。甲氰菊酯引 起白鲢腮组织病变，如腮小叶增生膨胀，上皮细胞坏死脱落、粘液分泌增多等现象与其它拟除虫 菊酯相似，这种腮小叶上皮细胞的自然增生现象是生物体保护未受损伤的组织对外界刺激的一种 反应，而上皮细胞的加厚不仅减少了氧呼吸的有效面积，也增加了氧从水体到血液之间的扩散距 离，这必然影响了腮的呼吸、分泌、排泄功能，对鱼体的离子代谢、渗透调节也有一定程度的影 响【3 ”。 拟除虫菊酯类杀虫剂通过影响鱼不同组织中酶的活性和代谢水平引起许多生理和生化变化 ”，对鱼类的生化指标产生影响。周志刚等人的研究结果表明溴氟菊醋能抑制鱼脑乙酰胆碱酯酶 ( a c h e ) 的活性p ”。e d w a r d se t a l ( 1 9 8 7 ) 发现氯氰菊酯在鱼中的代谢和排除速度明显的比哺乳动物 或鸟慢这可以解释相对于其它生物体，这些化合物对鱼有高的毒性p ”。u n e r n ( 2 0 0 1 ) 报道氯氰 菊酯的亚致死浓度诱导在鱼肝，肾组织中，s o d 、c a t 等抗氧化酶活性的改变口5 l 。甲氰菊酯也能 明显抑制腮、肾组织中n a + 、k + - a t p a s e 和脑组织中的c a 2 + 、m 9 2 + r p 觞e 的活性，甲氰菊酯对鱼 高毒性且使鱼致死的原因之一就是抑制腮组织中n a + 、k + - a t p a s e 的活性i 冽。 1 4 高效氯氰菊酯简介 高效氯氰菊醑是一种广为推广的高效、低毒、低残留的拟除虫菊酯类杀虫剂。1 9 8 6 年匈牙利 g h i d a s ie t 耐报道高效氯氰菊酯，8 4 异构体中出1 r c i s s ，1 s c i s - r 及1 r t t a n s s 1 s t r a n s r 两对外消 旋体混合物( 简称高效体) ，并报道了它的生物活性。1 9 8 8 年我国南开大学黄润秋教授等，进行 了深入研究，使其实现了工业化生产。高效氯氟菊酯的英文通用名称是b e t a - c y p e r m c t h r i n ，化学名 称是2 ，2 - 二甲基一3 一( 2 ，2 - 二氯乙烯基) 环丙烷羧酸一a 一氯基一( 3 - 苯氧基) 一苄酯，分子式 c 2 2 h 1 9 c 1 2 n 0 3 分子量4 1 6 3 ，是两对外消旋体混合扬，其顺反比约2 ：3 。该品原药含高效顺、反氯 氰菊酯9 0 以上，外观为白色至奶油色结晶体，2 0 时密度1 1 2 ，熔点8 0 5 ，难溶于水，易溶于 芳烃、酮类和醇类。在中性及弱酸性下稳定，遇碱分解，室温存放两年不分解，储存温度不能高 于3 5 。 按我国农药毒性分级标准，高效氯氟菊醑属中毒杀虫荆该品原药大鼠急性经口l ，d 5 06 0 - 8 0 m g k g ，小鼠急性经i u l d ，0 1 2 6 3 8m g k g ，大鼠急性经皮u ，硝0 0m g k g 。对兔有轻微皮肤和眼 刺激，对豚鼠不致敏，人体接触时对有些人有致敏作用。对鱼、蚕高毒，对蜜蜂、蚯蚓有毒。 高效氯氰菊酯的生物活性较高，是氯氟薅酯的高效异构体。对昆虫有很高的触杀和胃毒作用， 具有杀卵活性，杀虫谱广击倒速度快等特点，杀虫活性较氯氰菊酯高，由于高效氯氰菊醣对人、 畜的毒性较氯氰菊酯和其他异构体低，因此除用于农田害虫的防治外广泛用于卫生害虫的防治。 5 1 5 转录因子腑彤研究概述 1 5 1n r f 2 的结构 转录因子是具有真核启动子特定d n a 序列结合活性的蛋白质分子，转录因子的d n a 结构域有 b z i p 结构域、锌指结构域、m a d s 结构域、m y c 结构域、m y b 结构域、h o m e o 结构域以及 a p 2 e r e b p 结构域等。碱性亮氮酸拉链( b a s i cl e u c i n e z i p p e r ，b z i p ) 蛋白是真核生物的转录因子和 阻抑蛋白中最大而且最保守的类型之一，在高等植物和哺乳动物中广泛存在，在基因表达和调控 中起重要作用。b - z i p 转录因子包括c h i c ，j u n 和l o s 家族。b - z i p 转录因子c h i c ( c a p nc o l l a r ) 家 族分为6 类；口4 5 ，n r f l ，n r f 2 、n r f 3 、b a c h l 和b a c h 2 。在这6 个成员中，n r f 2 ( n f - e 2 p 4 5 - r e l a t e d f a c t o r ) 是细胞质蛋白质，是一个有效的转录激活因子。 在n r f 2 中有6 个功能n e h 单位n e h l 、n e h 2 、n e l g 、n e h 4 、n e h 5 、n e h 6 ，如图i 1 所示。在 n r f 2 蛋白的c 端有一个碱性亮氨酸拉链结构与b m a f 蛋白形成二聚体并结合到a r e 顺式作用元件 3 6 , 3 7 , 3 8 1 。：在- n r f 2 的n 端有一个n e h 2 结构域，高度保守。n r f 2 有两个活化结构域n e h 4 和n e h 5 ，在不 同f i 勺1 n r f 2 蛋白中是保守的 3 9 1 , n e h 4 和n e h 5 与c b p 互作 c r e bc a m p 一成答元件结合蛋白( c r e b ) ， 因而n r f 2 有强的转录活性。n e h l 对应于b z i p 基元调控d m 的结合，与d 、m a f 蛋白形成二聚体。 同时c b p 结合到n r h 4 和n d a 5 这两个结构域，从而活化n 啦靶基因的转录。k e a p l 结合n e h 2 ，抑制 n r f 2 转录活化作用，e t g e 是在n e h 2 结构域中一段4 个氨基酸序列，它是n r f 2 - - k e a p l 相互作用中 的关键基元。e t g e 基元的点突变或缺失能消除活体k e a p l 的抑制活性，n r f 2 和k e a p l 不能相互作 用，从而使k e a p l 不能抑制霞调控基因转录活性l 帅4 ”。 腰卜1 n q 2 有6 个高度保守的蛋白质区域n e h l 到n e h 6 f i gi - in r f 2h a ss i xh i g h l yc o n s e r v e dp r o t e i nr e g i o n sc a l l e dn d a lt on e h 6 ( k e ni t o h , k i ti f r e er a d i e , , db i o l o g ya n dm e d i c i n e 2 0 0 4 ，3 6 ( 1 0 ) ：1 2 0 8 1 2 1 3 ) 6 中国农业大学硕士学位论文 第一章文献综述 1 5 2n r f 2 的功能 在缺失n r f 2 的小鼠中，已证明n r f 2 对细胞防御异源物质( 药物、杀虫剂、致癌物等) 胁迫有 重要的作用p ”。n r f 2 能在有代谢作用和解毒功能的器官中表达例如肝和肾，还有不断暴露于 环境的器官如皮肤、肺和消化道。当暴露于亲电子试剂或在氧化胁迫( r o s ) 时，n r f 2 从细胞质转 移到细胞核，作为转录激活剂与小m a f 蛋白形成二聚体并结合到a i 强顺式作用元件，顺式作用元 件舢t e 位于许多i i 相解毒酶基因5 区域口”。a r e 序列类似n f - e 2 结合位点的序列，是调控解 毒酶和抗氧化胁迫蛋白基因的顺式作用元件。n r l 2 通过a r e 诱导多数i i 相解毒酶和抗氧化胁迫 蛋白基因的表达。小鼠n r t 2 基因的种系突变实验证明，n r f 2 是多数i i 相解毒酶和抗氧化酶的关 键调控基因1 3 7 j 。无n r 忽的突变小鼠的广泛分析，还揭示了解毒酶基因和抗氧化应答基因的诱导 表达对预防致癌作用和亲电子试剂、氧化削引起的毒性是重要的。 圈卜2n r f 2 - k e a p l 帮1 控的细胞防御机理 f i g 1 - 2 n t f 2 - k g a p lr e g u l a t i o n o f c e l l u l 口d t 触m e c h a n i s m s ( h o z u m im o t o h a s h ie ta 上t r e n d si nm o l e c u l a rm e d i c i n e 2 0 0 4 。1 0 ( 1 1 ) ：5 4 9 5 5 7 ) 1 5 2 1n r f 2 诱导解毒酶基因的表达 异源物质( 非生物产生的化学物质，如杀虫剂，工业污染物或合成农药等) 生物转化过程分为 i 相和i i 相反应。i 相反应又称官能团反应，包括氧化、还原、水解、水台、脱硫代乙酰作用、异 构化作用。i i 相反应又称结合反应。包括糖苷结合、硫酸化、甲基化、乙酰化、氨基酸结合、谷 胱甘肽结合、脂肪酸结合、缩合反应等。i 相反应能被细胞色素p 4 5 0 加氧酶体系调节。i i 相酶促 进i 相产物与亲水族包括谷胱甘肽、葡糖醛酸的结合。异源物质经常作为i 相酶基因的关键的转录 活化的配合体，然而i i 相解毒酶基因能被i 相解毒酶的代谢物诱导，通常是亲电子试剂的诱导。 细胞的解毒作用对保持健康非常关键，可以防御各种异源有毒物质。有效合理的办法就是阻塞有 毒物质诱导的阱4 a 伤害这可l ；l 通过解毒酶基因的表达减少细胞损伤 3 6 , 3 7 , ”。 n r 2 能够调控i i 相解毒酶基因的表达，例如苯酝氧化还原酶，谷胱甘肽- - s - - 转移酶和u d p 一 葡萄糖醛酸基转移酶1 3 9 , 4 0 , 4 ”。除了这些传统的i i 相酶，在- n r n 调控下。发现了两个运送基因，一 7 中国农业大学硕士学位论文 第一章文献综述 个是编码半胱氨酸一谷氨酸盐一交换运输的基因，它能调节半胱氮酸流入与细胞内的谷氨酸盐流 出，这种运送活性潜在地保持细胞内的半胱氨酸浓度和谷胱甘肽的水平f 4 2 】。另一个是m r p l ，是多 重抗病性相关蛋白0 偶p ， b c c ) 家族的成员。m 啦l 是一个 = r p 结合盒子( d n a 序列组件) 的运输 者，它在排除细胞的共轭的1 1 相代谢物中起着重要的作用h 3 】。因此n r 2 协调地调控异源有毒物 质的结合反应、细胞内谷胱甘肽的的供应和异源物质的排泄，能有效解毒从而解除异源物质的毒 性。n r t 2 缺乏的小鼠易受异源物质胁迫的影响，因为削弱了有细胞保护作用的酶基因表达 1 4 4 , 4 5 , 4 6 , 4 7 , 4 目。 n r 9 2 在癌的化学预防中起着关键的作用。最近证明缺失n r f 2 的小鼠对致癌物质和氧化胁迫高 度敏感，因此n f f 2 能防止异源物质诱导的致癌作用 4 b , 4 9 ) 。 1 - 5 2 2n r f 2 诱导抗氧化胁迫蛋白基因的表达 n r t 2 是诱导抗氧化胁追蛋白基因的重要调控基因，抗氧化胁迫蛋白基因包括亚铁血红素加氧 酶一1 和过氧化氨酶一1 基因等。组织氧过多的感受性与n d 2 的位点有关系。在小鼠的n r f 2 基因的启 动予区发现一个单核甘酸的多态性，对含氧高胁迫敏感，无n 皿的突变小鼠发现含氧高造成肺伤 害。 最近的研究已确定在肝、肺和各种细胞中，n d 2 在抵御r o s 、化学致癌物质或其它的亲电子 试剂所产生的氧化胁迫中起着关键的作用，在无n m 的突变小鼠观测到细胞内活性氧( r o s ) 的积 聚。因而削弱氧化胁迫的防御机制。r o s 是一类性质十分活泼的化学基团，它主要包括超氧自由 基、羟自由基、氢过氧化物自由基、过氧化氢和单线态氧等r o s 能潜在的破坏细胞蛋白、脂质 和d n a ，引发各种疾病，包括动脉硬化症、癌症、肺纤维化等。电子顺磁共振( e p r ) 的结合和旋 转探针动力学分析，证实在无n m 的突变小鼠的肝和肾中不能消除r o s 删。 1 5 3 肿理活化的分子机理 k e a p ( k e l c h o l i k oe c h - a s s o d a f i n gp r o t e i n1 ) 是细胞骨架肌动蛋白的结合蛋白，位于细胞质。 k e a p l 分为4 个结构域：b t b i v r ，d g r 和衄l 。d g r k d c h 结构域对n r f 2 的结合和肌动蛋白 骨架相互作用是重要的。r 对亲电子试剂和氧化激活k e a p l 的反应是重要的，i v r 的两个半胱氨 酸残基对k e a p l 抑制晰2 的活性起着关键的作用。b t b 结构域被认为参与= 聚物的形成。k e a p l 的 n 端和c 端有一个b t b 结构域和双重氨基乙酸重复结构域( d g r ) 。d g r 结构域对与n r t 2 相互作用和 肌动蛋白的结合是重要的。 在没有胁迫的情况下，在细胞质d p k e s p l 结合n f 也，x 捌粤l 限制n r f 2 的范围并抑制n r f 2 的转录 活性，n m 靶基因的转录水平很底。当细胞暴露于异源有毒物质能破坏这种作用，n r t 2 从细胞质 转移到细胞核，n f f 2 的两个活化结构域n “和n e h 5 与c b p 互作( c r e bc 柚仰一应答元件结合蛋白 ( c r e b ) ) ，同时n e h l 与小m a f 蛋白( 包括m a 飓m a 卿m & 但) 形成异二聚体并结合到a r e 顺式作 用元件，从而诱导解毒酶和抗氧化胁迫蛋白基因的表达( 如图l - 2 ) 。在纯合的k e a p l 敲除的动物的 肝和胚胎的纤维原细胞中，i i 相解毒酶基因的表达明显持续的增加。这些结果证明k e a p l 是n r f 2 的负调控基困。在一般情况下k e a p l 抑制n m 的调控作用，在缺乏k 鼬p l 时，n i l 2 在细胞核中不 断积聚，说明k e a p l 负调控n f 。k e a p l 结合n 磁限制其在细胞质中，防i e n 啦活化靶基因。当细 8