（动物营养与饲料科学专业论文）苯甲酸壳聚糖酯的合成及其抑菌性能研究.pdf

摘要 摘要 论文题目：苯甲酸壳聚糖酯的合成及其抑菌性能研究 学科、专业：农学动物营养与饲料科学 硕士研究生姓名t 于沛沛 指导教师：夏文水教授 壳聚糖具有生物可降解性、生物相容性、生物无毒性，对多种微生物都具有抑菌作 用，是开发天然、安全食品防腐剂的良好材料。但壳聚糖的抑菌活性受p h 值的变化和 溶解性等因素的影响较大，这限制了壳聚糖作为防腐剂在食品中的广泛应用。本研究用 苯甲酰氯和壳聚糖进行酯化反应合成苯甲酸壳聚糖酯，以期提高壳聚糖的抑菌性，扩大 抑菌谱及p h 值应用范围。研究对于发展化学保藏技术具有重要的学术意义同时对于促 进壳聚糖的深加工也有重大的现实意义。 以大分子壳聚糖和n 乙酰氨基葡萄糖为原料，选用苯甲酰氯为酯化剂，进行酯化 反应合成苯甲酸壳聚糖酯与苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯，研究了反应条件对产物结构和得 率的影响。结果表明：在反应温度0 、反应时间3 h 时，酯化产物得率最高：当苯甲酰 氯氨基葡萄糖残基摩尔比6 ：1 时，苯甲酸壳聚糖酯的取代度为1 8 ，得率达6 0 7 0 ； 当苯甲酰氯n 乙酰氨基葡萄糖摩尔比4 ：1 时，苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯得率达 8 0 一8 5 。 对合成制备的产物用红外光谱、液质联用进行了结构确证，并测定了其溶解性和热 稳定性。结果表明：酯化反应发生在壳聚糖的羟基上；n 乙酰氨基葡萄糖的酯化产物中 苯甲酸乙酰氨基葡萄糖三酯成分占9 7 ；苯甲酸壳聚糖酯的热分解温度为1 8 7 1 9 6 1 2 ， 热稳定性高于壳聚糖，苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯的热分解温度为1 7 1 1 7 5 ，热稳定性 低于n - 乙酰氨基葡萄糖；两种合成产物在丙酮、乙酸乙酯等多种有机溶剂中都具有良 好的溶解性能。 用滤纸片抑菌圈法和平板菌落计数法对两种合成产物进行抑菌性能研究。探讨了合 成产物抑菌活性的影响因素，测定了合成产物对受试菌种的抑菌作用并与合成原料进行 对照，分析了产物结构与抑菌活性的构效关系。结果表明：两种合成产物的抑菌活性随 浓度升高逐渐增强，p h 值的变化则对其影响不大；两种合成产物在p h 3 5 7 5 范围内均 有较好的抑菌效果，苯甲酸壳聚糖酯对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、啤酒酵母、黑曲霉 的最低抑菌浓度( m i c ) 范围分别为0 0 2 加0 4 、0 2 0 加2 9 、0 0 4 加1 0 、 o 0 5 加0 7 ，苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯对以上菌种的m i c 范围分别为o 2 4 加2 6 、 0 1 4 加1 6 、0 2 0 加2 2 、0 1 8 4 ) 2 0 ；苯甲酸壳聚糖酯对受试菌种的抑菌效果随 取代度的增加逐渐增强，苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯对大肠杆菌的抑菌效果居于取代度 o 5 和0 9 的苯甲酸壳聚糖酯之间，对金黄色葡萄球菌的抑菌效果略优于取代度1 8 的苯 甲酸壳聚糖酯，对黑曲霉和啤酒酵母的抑菌效果与取代度0 9 的苯甲酸壳聚糖酯相当。 摘要 以上研究结果表明，两种合成产物在酸性及中性条件下对受试菌种均有较好的抑制 作用，有望开发成为一种低毒、高效、抑菌谱宽、抑菌范围广的食品防腐剂广泛应用于 食品工业中。 关键词：壳聚糖；苯甲酸壳聚糖酯：n 乙酰氨基葡萄糖；苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯；合 成；酯化；抑菌 a b s t r a c t a b s t r a c t c h i t o s a nw h i c hi sb i o d e g r a d a b l e b i o c o m p a t i b l ea n db i o l o g i c a ln o n t o x i cc a ni n h i b i t m i c r o b e sa n di sa l s oc o n s i d e r e da sak i n do fg o o dm a t e r i a l sf o rd e v e l o p i n gn a t u r a l ，s a f ef o o d p r e s e r v a t i v e s d u et ot h ea n t i m i c r o b i a la c t i v i t yi se a s i l ya f f e c t e db yt h ep ha n ds o l u b i l i t y , c h i t o s a nc a n n o tb ew i d e l yu s e di nf c l o di n d u s t r ya sap r e s e r v a t i v e t oi m p r o v et h e a n t i m i c r o b i a la c t i v i t yo fc h i t o s a na n de n l a r g ec h i t o s a n sp hr a n g eo fa p p l i c a t i o n ，w eh a v e u s e dc h i t o s a na n db e n z o y lc h l o r i d et os y n t h e s i z eb c n z o y lc h i t o s a ne s t e r t h e r ew i l lb eh i 曲 a c a d e m i cv a l u ef o rt h ed e v e l o p m e n ta n da p p l i c a t i o no fc h i t o s a na sap r e s e r v a t i v ea n di t s f u r t h e rp r o c e s s i n g u s i n gm a c r o m o l e c u l e so fc h i t o s a na n dn a c e t y l d - g l u c o s a m i n e ( n a g ) a sr a wm a t e r i a l s a n db e n z o y lc h l o r i d ea sa c y l a t i n ga g e n t , w es y n t h e s i s e db e n z o y lc h i t o s a ne s t e ra n db e n z o y l n a ge s t e r o u rr e s e a r c hs h o w e dt h a tw h e nt h er e a c t i o nt e m p e r a t u r ew a s0 t h et i m ew a s3 h c o c n z o y lc h l o f i d e g l u c o s a m i n er e s i d u e s ) ，t h ey i e l dw o u l db et h eh i g h e s t w 1 l i l ew h e nt h e m o l a rr a t i oo f r e a g e n t sw a s6 ：1 ，t h es u b s t i t u t i o nd e g r e eo f b e n z o y lc h i t o s a ne s t e rw a s1 8 。t h e y e i l dw a s6 0 0 0 , - , 7 0 w 1 l e nt h em o l a rr a t i oo fr e a g e n t sw a s4 ：1 ( b e n z o y lc h l o r i d e n a g ) ，t h e y e i l do fb e n z o y ln a ge s t e rw a s8 0 一8 5 1 1 伦c h e m i c a ls t r u c t u r eo ft h ep r o d u c t sw e r ec h a r a c t e r i z e db yf t - i l 乙l c m s 1 1 1 e s o l u b i l i t ya n dt h e r m a ls t a b i l i t yw e r ea l s os t u d i e d 1 1 豫r e s u l t ss h o w e dt h a ta c y l a t i o no c c u r r e da t t h eh y d r o x y lo fc h i t o s a n b e n z o y ln a gt r i e s t e ra c c o u n t e df o r9 7 硼舱t h e r m a l d e c o m p o s i t i o nt e m p e r a t u r eo fb e n z o y lc h i t o a ne s t e rw a sl8 7 1 9 6 a n di t st h e r m a ls t a b i l i t y w a sb e t t e rt h a nc h i t o s a n t h et h e r m a ld e c o m p o s i t i o nt e m p e r a t u r eo fb e n z o y ln a ge s t e rw a s 1 8 7 1 9 6 a n di t st h e r m a ls t a b i l i t yw a sw o r s et h a nn a q i na c e t o n e e t h y la c e t a t ea n do t h e r o r g a n i cs o l v e n t s 。t h e ya 1 1h a dag o o ds o l u b i l i t y t h ea n t i b a c t e r i a la c t i v i t yw a sc o n d u c t e db yi n h i b i t i o nz o n ea n dp l a t ec o l o n yc o u n t m e t h o d ，n l ei n f l u e n c i n gf a c t o r sw e r es t u d i e d w ec o m p a r e dt h e i ri n h i b i t o r ye f f e c tw i t h b e n z o i ca c i d ，c h i t o s a n , n a ga td i f f e r e n tp hv a l u e s a l s ow ep r e l i m i n a r ya n a l y s i s e dt h e r e l a t i o nb e t w e e nm o l e c u l a rs t r u c t u r ea n da n t i m i c r o b i a le f f e c t t h ea n t i b a c t e r i a l a c t i v i t y i n c r e a s e d 、析t l lt h ec o n c e n t r a t i o na n dc h a n g i n gp hv a l u e sh a dl i t t l ee f f e c to nt h e i ri n h i b i t o r y e f f e c t n l ei n h i b i t o r ye x p e r i m e n t ss h o w e dt h a tt h et w op r o d u c t sh a ds i g n i f i c a n te f f e c ta g a i n s t t h eg r o w t ho fm i c r o o r g a n i s m st e s t e df r o mp h 3 5t op h 7 5 n em i n i m u mi n h i b i t o r y c o n c e n t r a t i o n ( m i c ) o fb c n z o y lc h i t o s a ne s t e ra g a i n s te s c h e r i c h i ac o l i , s t a p h y l o c o c c u s a u r e u s , a s p e r g i l l u sn i g e r , s a c c h a r o m y e e sc e r e v i s i a ew e r e0 0 2 - - 0 0 4 ，0 2 0 d 2 9 ， 0 0 4 , - 0 10 ，0 0 5 旬0 7 t h em i co fb e n z o y ln a ge s t e ra g a i n s tm i c r o o r g a n i s m st e s t e d w e r e0 2 4 o 2 6 ，0 14 - - , 0 16 ，0 2 0 o 2 2 ，o 18 o 2 0 1 1 l ea n t i b a c t e r i a le f f e c ti n c r - e a s e dw i t hi n c r e a s i n gs u b s t i t u t i o nd e g r e eo fb e n z o y lc h i t o s a ne s t e r 1 1 l ei n h i b i t o r ye f f e c to f b e n z o y ln a g e s t e ra g a i n s te s c h e r i c h i ac o l iw a sb e t w e e nb e n z o y lc h i t o s a ne s t e r ( d = 0 5 ) a n d b e n z o y lc h i t o s a ne s t e r ( d = o 9 ) ，a g a i n s ts t a p h y l o c o c c u sa u r e u sw a sal i t t l eh i g h e rt h a nb e n z o y l c h i t o s a ne s t e r ( d = 1 8 ) ，a g a i n s ta s p e r g i l l u sn i g e ra n d s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a ew e r et h es a m e a sb e n z o y lc h i t o s a ne s t e r ( d = 0 9 ) o u rs t u d ys h o w e dt h a ti na c i d i ca n dn e u t r a lc o n d i t i o n s ，t h et w op r o d u c t sb o t hh a dg o o d i n h i b i t i o ne f f e c to nm i c r o o r g a n i s m st e s t e d t h e yw e r ee x p e c t e dt ob ed e v e l o p e di n t oal o w m a b s t r a c t t o x i c ，h i g he f f i c i e n t ，b r o a da n t i b a c t e r i a ls p e c t r u mp r e s e r v a t i v e st h a tc o u l db ew i d e l yu s e di n f o o di n d u s t r y k e y w o r d s ：c h i t o s a n ；b e n z o y lc h i t o s a ne s t e r ；n a g ；b e n z o y ln a ge s t e r ；s y n t h e s i s ；e s t e r i f i c a t i o n ； a n t i b a c t e r i a la c t i v i t y 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地 方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含 本人为获得江南大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示谢意。 签名： 吼习年7 月办日 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规 定：江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和 磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编 入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、 汇编学位论文，并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签名： 导师签名趸竺= 日期：州卞_ 7 月，。日 引言 1 引言 1 1 立题依据及意义 1 1 1 立题依据 壳聚糖( c h i t o s a n ) 是由氨基葡萄糖和少量n 乙酰氨基葡萄糖通过b 1 ，4 糖苷键连接而 成的阳离子生物活性多糖，由于其葡萄糖胺单体上有游离的氨基，故带正电荷，它可以 干扰细胞表面的负电荷，导致细胞物质外泄，使微生物死亡【1 。3 】。已有大量研究证实， 壳聚糖对微生物具有抑制作用，是开发天然、安全食品防腐剂的良好材料【4 8 l 。目前对 壳聚糖抑菌机理的阐述主要有两种：一种是壳聚糖通过渗透作用进入微生物细胞内部， 吸附其中有阴离子的细胞质，产生凝絮作用，从而扰乱细胞的生理活动，改变细胞渗透 性，使细胞组分发生泄漏，导致微生物死亡：另一种是壳聚糖吸附于细胞表面，阻隔了 细胞通过细胞壁的营养供给，从而抑制细菌生长l g - i i 】。 壳聚糖具有生物可降解性、生物相容性、生物无毒性1 1 2 1 。在欧洲和日本，壳聚糖已 获准作为防腐剂用于食品、饲料及化妆品中：在加拿大，壳聚糖已获准作为食品防腐剂 用于鸡蛋和水果的涂层保鲜1 1 3 1 。在我国，壳聚糖已被作为增稠剂应用于蛋黄酱、花生酱、 芝麻酱、玉米糊罐头、含沙司罐装食品、奶油代用品、酸性奶油等食品体系中【1 4 】，但作 为食品防腐剂目前仍在研究开发中。 苯甲酸是我国常用的食品防腐剂之一，在酸性条件下，对细菌和真菌都具有较强的 抑制作用，但因其同时具有一定的毒副作用，对人体健康存在较大的威胁【”17 】，目前在 食品中已经较少应用。对羟基苯甲酸生成尼泊金酯后，毒性大大降低，而且具有更宽的 p h 值应用范围f 1 8 - 19 1 。苯甲酸和对羟基苯甲酸具有相似的结构，酯化反应后理应也可以 达到相似的效果。壳聚糖上有大量的羟基，如果把壳聚糖作为多元醇，让其和具有抑菌 活性的苯甲酸发生酯化反应，理论上既可以提高壳聚糖的抑菌活性又能降低苯甲酸的毒 性。 本课题来源于国家高技术研究发展计划( 8 6 3 ) 重点项目( 项目编号：2 0 0 7 a a l 0 0 4 0 1 ) 和食品科学与技术国家重点实验室目标导向项目( 项目编号：s k l f m b 2 0 0 8 0 5 1 ) ，是其 中研究工作的一部分。 1 1 2 立题意义 ( 1 ) 食品防腐剂由于具有使用方便、抑茵效果好等优势，在各类原料和产品贮藏 中发挥着重要的作用。但目前我国常用的防腐剂如苯甲酸、山梨酸钾等有一定的毒副作 用，因此安全、低毒、高效、性能稳定的食品防腐剂的开发已成为一种趋势。壳聚糖安 全、无毒、易降解，其防腐剂的开发符合食品防腐剂的发展趋势，对于丰富化学保藏方 法具有重要的学术意义。 ( 2 ) 我国甲壳素资源丰富，存在广泛，目前我国对壳聚糖的开发研究不是很深， 对其在食品中的应用也较少，如能将壳聚糖开发成为食品防腐剂，将可以促进壳聚糖的 江南大学硕士学位论文 深加工，增加其附加价值，具有重要的现实意义。 1 2 国内外对壳聚糖及其衍生物抑菌性能的研究与存在的问题 1 2 1 对壳聚糖抑菌性能的研究 a l l a n 首次发现壳聚糖对各种细菌、酵母和真菌具有抑菌活性。此后，许多国内外 学者对壳聚糖的抑菌活性进行了大量的研究，发现壳聚糖的防腐抑菌性与其游离氨基的 存在密切相关，游离氨基含量越高，抑菌活性越强1 2 0 1 。 h o n g 2 1 j 对分子量1 1 1 0k d a 的壳聚糖在抛5 ，1 5 天内对革兰氏阳性菌和阴性菌的 抑菌性进行了研究，研究表明该壳聚糖对革兰氏阳性菌的抑茵作用强于革兰氏阴性菌； 抑菌性随壳聚糖溶液的贮藏而变化，贮藏前期抑菌性强于后期；高温环境下抑菌性低于 低温环境，推测是由于粘度的变化影响了壳聚糖的抑菌活性。 q i n 捌用半纤维素酶水解甲壳素，获得了不同分子量的壳聚糖，通过醋酸酐的乙酰 化作用，得到乙酰度5 0 的水溶性壳聚糖。研究了不同分子量( 1 4 x 1 0 3 - - 4 0 x 1 0 5 d a ) 的 壳聚糖对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白色念球珠菌的抑制作用。结果表明水溶性壳聚 糖对以上菌种无显著抑菌作用，而且能促进白色念珠菌的生长；相反，非水溶性壳聚糖 在酸性介质中对微生物表现出抑制作用，其中分子量为5 x 1 0 4 抑菌能力最强，对非水溶 性壳聚糖的抑菌机理进行了假设：壳聚糖在细胞周围形成了不透水层。 t s a i l 2 3 1 研究了脱乙酰度为9 5 的低分子量壳聚糖对蜡样芽孢杆菌的抑制作用及其在 米饭保藏中的应用。研究发现，低分子量壳聚糖对蜡样芽孢杆菌的抑制作用不易受p h 值变化的影响，蜡样芽孢杆菌对壳聚糖的敏感性随着细胞老化而降低，这一变化与细胞 表面的负电荷数量的变化相一致。 l i u 2 4 】通过乙酸水解获得了脱乙酰度8 0 的不同分子量( 5 5 x 1 0 4 1 5 5 x 1 0 4 d a ) 的壳 聚糖。在该分子量范围内，浓度在0 0 2 以上的壳聚糖都对大肠杆菌有抑制作用；在 0 0 0 2 以下有促进其生长的作用：浓度在0 0 0 5 - 0 0 1 5 的壳聚糖抑菌活性受分子量大 小影响，低大于高，推测是由于壳聚糖引起细胞的絮凝并导致细菌被杀死。 l i u 2 5 】研究了壳聚糖乙酸溶液的抑菌性，在培养的不同时期计数，通过穿透电镜观 察微生物细胞外膜和内膜的完整性及通透性，测定溢出细胞内容物在2 6 0 n m 的吸收， 1 - n 苯基萘胺荧光探针标记细胞的荧光变化和细胞质中半乳糖苷酶的活动，同时采用凝 胶渗透层析、紫外检测、傅立叶红外检测和热力分析研究了壳聚糖与合成磷脂膜的相互 作用。结果表明：壳聚糖增强了细胞外膜和内膜的通透性，最终导致细胞膜破裂，细胞 内容物释放，这种损伤很可能是由n h 3 + 和磷脂磷酰基的相互作用导致。 a l t i e d 2 6 】在意大利奶酪的生产初期添加壳聚糖的乙酸溶液作为防腐剂。观察意大利 奶酪在4 c 冰箱中贮藏1 0 天后微生物的生长和p h 值的变化。发现壳聚糖对大肠杆菌有 抑制作用，对微球均没有抑制作用，对乳酸菌的生长有轻微的促进作用。 r o l l e r l 2 7 l 将壳聚糖溶于经过杀菌的苹果汁中，发现天然壳聚糖在某些食品中具有作 为防腐剂的潜力。测定了壳聚糖谷氨酸盐对引起苹果汁腐败的8 种酵母和7 种真菌的抑 制作用，浓度为l g l 壳聚糖可降低总状毛霉的生长，但是需要5 9 l 壳聚糖来完全抑制 2 引言 丝衣霉属。所有的酵母在含有0 1 5 9 l 壳聚糖的苹果汁中都受到抑制。其中，路氏酵母 对壳聚糖的敏感性最小，壳聚糖对它的最低抑制浓度最大，达到了5 9 l 。对比路氏酵母、 接合菌对壳聚糖的敏感性最大，o 1 9 l 的壳聚糖就足以抑制它的生长。 f a n g t 2 8 】经过试验发现，在橘子罐头中，浓度为6 9 l 的壳聚糖可完全抑制霉菌的生 长。i z l 蛐j m o t o l 2 9 】研究了不同温度下壳聚糖对牛肉的保藏效果，当浓度为1 时，总细菌 数量、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、假单胞菌和微球菌数量均有l 至2 个对数值的下降。 p a p i n e e a u o o 】经过研究发现，在壳聚糖的乳酸溶液里，啤酒酵母比金黄色葡萄球菌 敏感性更强，而在含有壳聚糖的琼脂平板上，金黄色葡萄球菌对壳聚糖的敏感性却要强 于啤酒酵母。他们认为，有很多种因素影响壳聚糖抑菌作用的发挥。 s u 舻1 】测试了不同浓度( 0 0 1 、0 0 2 5 、0 0 5 和0 1 ) 的壳聚糖溶液对大肠 杆菌、李斯特菌和沙门氏菌的抑制效果。经4 8 小时培养，在0 0 l 和0 0 2 5 的壳聚糖 溶液中，大肠杆菌被全部抑制，而0 0 5 和0 1 的壳聚糖溶液抑菌效果反而稍差；对 于李斯特菌而言，0 0 5 的壳聚糖具有最强的抑制效果，0 0 5 和0 0 2 5 的壳聚糖都可 以完全抑制其生长，抑菌效果优于0 1 和o o l 的壳聚糖；对于沙门氏菌，前1 2 小时 内，各浓度壳聚糖对其抑菌效果没有明显差别，经过2 4 小时的培养后，0 o l 的壳聚糖 溶液对其抑制效果最好。这些实验结果说明壳聚糖抑菌活性与其浓度之间的某种非相关 性。 t o k u m t 3 2 】使用荧光素异硫氰酸盐研究壳聚糖对大肠杆菌的抑菌机理，他们认为壳聚 糖阻隔了细菌通过细胞壁的营养供应而产生了抑制细菌生长的活性。y o u n g p 到用壳聚糖 处理某种细胞时发现了细胞有钙释出，他们认为这可能是由于壳聚糖的诱导作用致使细 胞内的电解质泄漏。h e l a n d e r a 4 通过检测脂蛋白，发现壳聚糖对大肠埃希菌的细胞壁造 成破坏。 1 2 2 对壳聚糖合成改性与抑菌性能的研究 壳聚糖上有大量的氨基和羟基，均是化学改性的位点，目前国内外已有大量研究通 过对壳聚糖改性来提高其抑菌性，并取得了一定的进展。 z h o n g 3 5 】合成了不同的壳聚糖酰基硫脲衍生物。研究了其对几种常见细菌、真菌的 抑菌性，结果表明壳聚糖酰基硫脲衍生物，比其母体壳聚糖的抗细菌性要强，抗真菌性 更强，其中壳聚糖氯乙酰硫脲壳聚糖的抗真菌性显著高于乙酰硫脲和苯甲酰硫脲壳聚糖 衍生物，酰基的接枝率与抗真菌性相关，接枝率越高，抑菌活性越强。 s e y f a r t h 【3 6 】制备了水溶性的不同分子量的氯取代壳聚糖、羧甲基壳聚糖、n 乙酰基 d 葡萄糖胺，研究了它们对白色念珠菌、克鲁氏念珠菌、光滑念珠菌的抑菌活性。研 究表明，只有氯化壳聚糖的抗真菌作用与浓度相关，羧甲基壳聚糖、n 乙酰基d - 葡萄 糖胺抗真菌活性都很弱甚至不如壳寡糖的抗真菌活性，三者的抑菌活性都随分子量的减 小而降低。 h o l a p p a l 3 7 1 制备了季铵n 甜菜碱壳聚糖，并以n 甜菜碱葡萄糖胺作为参比物研究了 其对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌性，结果表明，二者在中性条件下抑菌活性都很 弱，在酸性条件下，随取代度的降低，抑菌活性逐渐增强。 3 江南大学硕士学位论文 p e n g 3 8 j 以丙烯环氧化物与壳聚糖为原料，在碱性条件下制备了不同取代度的羟丙基 壳聚糖衍生物，在c 6 o h 、c 3 o h 和c 2 - n h 2 上都发生了烷基化反应。衍生物对大肠杆 菌和金黄色葡萄球菌没有抑菌性，对几种水果致病真菌有抑制作用，并且低取代度的壳 聚糖衍生物抗真菌性更强。 x i e 3 9 】合成了乙羟基壳聚糖衍生物，并发现其在比较宽的分子量范围内都有很好的 水溶性，对大肠杆菌的抑菌活性强弱取决于n h 2 的比例。 j a y a k u m 盯即l 把阴离子可溶性单体乙烯硫酸钠盐接枝到壳聚糖上，制备了具有两性 离子特性的共聚物，研究发现接枝反应增加了壳聚糖的抑菌活性，并且接枝产物对白色 念珠菌、红色毛菌的抑菌活性强弱取决于接枝度和p h 值的变化。 j e l 4 l 】合成了氨乙基甲壳素2 氯乙胺盐酸化合物，接枝到壳聚糖的c 6 。o h 上，测定 细菌和衍生物接触后培养基在2 6 0 r i m 处的吸光值，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌因细胞壁 结构不同，吸光值有较大差异。 v a s n e v 4 2 】合成了系列水溶性的n 烷基二糖壳聚糖衍生物并研究了其对大肠杆菌和 金黄色葡萄球菌的抑菌效果。研究发现壳聚糖衍生物的抑菌活性受取代度和二糖种类的 影响，忽略二糖种类的影响，取代度3 0 0 旷4 0 的壳聚糖衍生物对两种受试菌种的抑菌 性最强。两种受试菌种对取代度3 0 0 0 的纤维二糖和麦芽糖壳聚糖衍生物最敏感。 尽管二糖壳聚糖衍生物在p n 6 0 时的抑菌性不如天然的壳聚糖，但是在p h 7 0 时，比天 然的壳聚糖高。衍生物浓度小于0 0 5 时，抑菌活性随浓度增加逐渐增强，但在 0 0 5 0 o - 0 2 0 浓度范围内，随浓度增加，抑菌活性增强不明显。 q i i l l 4 3 】合成了n 2 羟丙基三甲铵壳聚糖衍生物，该衍生物在p h 3 1 2 范围内有较好 的水溶性，在中性及碱性条件下比酸性条件下抑菌效果更好。 l i u l 4 4 1 合成了n ，o 羧甲基壳聚糖以及o 羧甲基壳聚糖。发现n ，o 羧甲基壳聚糖比 普通的壳聚糖抑菌活性降低。这可能是因为在酸性条件下带正电荷的- n h 2 也被取代，相 当于降低了壳聚糖的正电荷强度，其抑菌活性降低。o 羧甲基壳聚糖的抑菌效果则有所 提高，因为n h 2 基团数量没有变化，而取代后的c h 2 c o o h 会对n h 2 基团起作用，- n h 2 基团更容易形成州3 + ，增强了壳聚糖分子所带正电荷的强度，抑菌活性也随之增强。 v l a d i 血一5 】合成了n 2 ( 十二烷基2 烯) 丁二酸壳聚糖，具有较好的抑菌活性，浓度 为1 时，对大肠杆菌具有9 8 5 的抑菌率，而同浓度的原料壳聚糖仅有3 8 的抑菌率， 这可能是由于疏水性的脂肪链可以与微生物表面的疏水性物质相互作用，有利于壳聚糖 结合到微生物表面，来增强抑菌作用。 本实验室赵希荣 4 6 1 将壳聚糖经氨基保护、与对乙酰氧基苯甲酰氯发生酯化反应、再 水合胼去保护合成得到了对羟基苯甲酸壳聚糖酯。在适宜的反应条件下，取代度可达1 3 ， 得率8 0 以上。该酯溶解性略优于对羟基苯甲酸庚酯，醇溶性显著提高：对大肠杆菌和 金黄色葡萄球菌抗菌试验表明，该酯抗菌活性大于对羟基苯甲酸庚酯，更优于壳聚糖。 1 2 3 存在的问题 壳聚糖的抑菌活性受p h 值的变化和溶解性等因素的影响较大，只在酸性条件下才 有一定的抑菌效果，在中性条件下几乎无抑菌性：壳聚糖的抑菌谱较窄，表现为对细菌 4 引言 的抑制作用较强而对真菌的抑制作用较弱，而且与常用防腐剂相比，其抑菌活性并不强。 改性后的壳聚糖虽然溶解性有所改善，抑菌性能有所提高，但大部分衍生物仍需在 酸性条件下才具有抑菌性，中性条件下具有抑菌作用的壳聚糖衍生物报道较少。 1 3 研究目的、主要研究内容及技术路线 1 3 1 研究目的 本文的研究目的在于通过酯化反应合成具有双抑菌功能团的苯甲酸壳聚糖酯衍生 物，以期增强壳聚糖的抑菌性；扩大壳聚糖的抑菌谱；弥补壳聚糖和苯甲酸只在酸性条 件下才有抑菌性的不足，可以在更宽的p h 值范围内使用。 1 3 2 主要研究内容 ( 1 ) 以大分子壳聚糖和n 乙酰氨基葡萄糖为原料，选用苯甲酰氯为酯化剂，进行 酯化反应合成苯甲酸壳聚糖酯与苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯，研究反应条件对产物结构和 得率的影响。 ( 2 ) 对合成制备的产物用红外光谱、液质联用进行结构确证，并测定其溶解性和 热稳定性。 ( 3 ) 对苯甲酸壳聚糖酯和苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯经滤纸片抑菌圈法和平板菌落 计数法进行抑菌活性测定，探讨抑菌活性的影响因素，并与苯甲酸、壳聚糖、n 乙酰氨 基葡萄糖在不同p h 值条件下进行抑菌效果比较，分析其结构与抑菌作用之间的关系。 1 3 3 主要技术路线 1 3 3 1 苯甲酸壳聚糖酯的合成路线 将壳聚糖与苯甲酰氯进行酯化，需要对氨基进行保护，采用磺酸与氨基成盐是一种 有效的方法【4 引。酰氯是一种强酯化剂m 9 l ，故反应取决于壳聚糖羟基对苯甲酰氯的亲核 进攻。 h m e s 0 3 i b = o r ：增茁6 图1 苯甲酸壳聚糖酯的合成路线 f 嘻1t h es y n t h e t i cr o u t eo fb e n z o y lc h i t o s a ne s t e r 5 n h 3 h 2 0 - 江南大学硕士学位论文 1 3 3 2 苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯的合成路线 将n 乙酰氨基葡萄糖与苯甲酰氯进行酯化，甲磺酸在反应中作催化剂f 5 0 l ，反应取 决于n 乙酰氨基葡萄糖羟基对苯甲酰氯的亲核进攻。 i - 1 m e s 0 3 r c c h 川3 a 圳b k 图2 摹甲酸乙酰氨基葡萄糖酯的合成路线 f i g 2t h es y n t h e t i cr o u t eo fb e n z o y ln a g e s t e r 6 o i c c)cy0 3 6 ， + 叫 材料与方法 2 材料与方法 2 1 原料与试剂 壳聚糖，经电导率仪法( s c r r3 4 0 3 2 0 0 4 ) 澳y 定其脱乙酰度为8 0 ，经还原端基法【5 l 】 测定其平均分子量为1 9 9 2 ，本实验室提供；n 乙酰氨基葡萄糖，纯度为9 8 ，南通双 林生物制品有限公司提供； 大肠杆菌( e s c h e r i c h i ac o i o 、金黄色葡萄球菌( s t a p h y l o c o c c u sa u r e u s ) 、黑曲霉 ( a s p e r g i l l u sn i g e r ) 、啤酒酵母( s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ) ，江南大学食品学院微生物实 验室提供； 丙酮、甲磺酸、苯甲酰氯、无水乙醚，分析纯，中国医药集团上海化学试剂公司。 2 2 方法 2 2 1 苯甲酸壳聚糖酯的合成及纯化 准确称取干燥恒重的壳聚糖1 o g 于装有搅拌器和温度计的三颈烧瓶中，加入4 0 r a l 甲磺酸，0 下以2 0 r s 速度搅拌3 0 r a i n ，至壳聚糖完全溶解。用恒压滴液漏斗加入4 o r a l 经蒸馏提纯后的苯甲酰氯，继续搅拌3 h ，反应结束后，产物于1 8 下静置2 0 h 。将产 物倾倒于5 0 0 m l 冰水中，抽滤，得土黄色颗粒状固体。用去离子水洗涤至上清液无色 透明。抽滤，将滤饼置于5 0 0 m l 去离子水中，磁力搅拌至产物均匀分散于水中，用1 m o l l 的氨水调p h 值至7 0 。抽滤，将滤饼用乙醚洗涤，至乙醚洗液中检测不出苯甲酸为止【5 2 1 。 抽滤，将滤饼用丙酮进行索氏提取，5 0 下旋转蒸发至大量丙酮蒸出，真空干燥得淡黄 色粉末状产物。 2 2 2 合成条件对苯甲酸壳聚糖酯取代度和得率的影响 在合成反应中，将反应液温度分别保持为0 、1 5 、2 5 、3 5 、4 5 ，将反应 时间分别设为1 h 、2 h 、3 h 、4 h 、5 h ，将反应物( 苯甲酰氯氨基葡萄糖残基) 摩尔比分 别设为2 ：1 、4 ：1 、5 ：1 、6 ：1 、7 ：1 、8 ：1 进行试验，研究反应温度、反应时间和反应物摩尔 比对取代度和得率的影响。 2 2 3 不同取代度的苯甲酸壳聚糖酯的制备 在反应液温度为o c ，反应时间3 h ，反应物( 苯甲酰氯氨基葡萄糖残基) 摩尔比 2 ：1 、3 ：l 、4 ：1 、6 ：1 的条件下，按步骤2 2 1 合成不同取代度的苯甲酸壳聚糖酯。 2 2 4 苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯的合成及纯化 准确称取干燥恒重的n 乙酰氨基葡萄糖2 2 1 9 于2 5 0 m l 三颈烧瓶中，加入1 5 m l 甲磺酸，o 下以1 5 r s 速度搅拌3 0 r a i n ，至n 乙酰氨基葡萄糖完全溶解。加入4 8 m i , 苯甲酰氯，继续搅拌3 h ，反应结束后，产物于1 8 c 下静置2 0 h 。将产物倾倒于5 0 0 m l 冰水中，抽滤，得乳白色颗粒状固体。将滤饼置于5 0 0 m l 去离子水中，磁力搅拌至产 7 江南大学硕士学位论文 物均匀分散于水中，用l m o l l 的氨水调p h 值至7 0 。抽滤，将滤饼用乙醚洗涤，至乙 醚洗液中检测不出苯甲酸为止。抽滤，真空干燥得乳白色粉末状产物。 2 2 5 合成条件对苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯取代度和得率的影响 在合成反应中，保持反应液温度0 c ，反应时间3 h ，将反应物( 苯甲酰氯n 乙酰 氨基葡萄糖) 摩尔比分别设为1 ：1 、2 ：1 、3 ：1 、4 ：1 、5 ：1 、1 0 ：1 进行试验，通过高效液相 分析，研究反应物摩尔比对产物取代度和得率的影响。 2 。2 。6 苯甲酸壳聚糖酯取代度的测定 合成产物苯甲酸壳聚糖酯经干燥恒重后，用n a o h 标准溶液进行皂化，再用h c l 标准溶液反滴定过量的n a o h ，苯甲酸壳聚糖酯的取代度按以下公式计算【5 3 】： 取代度= 菇器淼 2 2 7 合成产物得率的测定 合成产物苯甲酸壳聚糖酯和苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯经干燥恒重后准确称重，按以 下公式计算其得率【5 4 】： 得率= 甓恭藩等川。 式中，反应物分别为壳聚糖、n 乙酰氨基葡萄糖：目的产物分别为苯甲酸壳聚糖酯、 苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯。 2 2 8 合成产物的红外光谱分析 取苯甲酸壳聚糖酯样品1 0 0 9 9 ( 反应温度0 c 、时间3 h 、苯甲酰氯氨基葡萄糖残基 6 ：1 ) ，取苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯样品1 0 0 p g ( 反应温度0 c 、时间3 h 、苯甲酰氯n 乙 酰氨基葡萄糖4 ：1 ) ，用5 d d x bf t - i r 红外光谱仪进行红外光谱分析。 2 2 9 苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯的液相图谱分析 取苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯样品1 0 0 嵋( 反应温度0 。c 、时间3 h 、苯甲酰氯n 乙酰 氨基葡萄糖4 ：1 ) ，采用w a t e r sa c q u i t yu p l c 色谱分析仪进行高效液相检测。色谱 柱为b e hc 1 8 柱( 2 1 1 0 0 m m1 7 p r o ) ，用0 2 的甲酸溶液和乙腈进行梯度洗脱，洗脱 条件为：0 m i n 甲酸乙腈( 1 0 0 ：0 ，v v ) ，1 5 m i n 甲酸乙腈( 5 0 ：5 0 ，v v ) ，2 0 m i n 甲酸乙腈 ( 0 ：1 0 0 ，v v ) 。流速0 3 m l m i n ，柱温3 0 ( 2 ，采用w a t e r s a c q u i t y p d a 检测器，在波长 2 8 0 n m 处进行检测，进样量为5 p l 【”】。 2 2 1 0 苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯的质谱分析 取苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯样品1 0 0 1 t g ( 反应温度0 c 、时间3 h 、苯甲酰氯n 乙酰 氨基葡萄糖4 ：1 ) ，采用w a t e r ss y n a p tq t fm s 质谱分析仪进行结构鉴定。质谱条 件：离子方式e s i + e s i ，毛细管电压3 k v ，锥孔电压3 0 v ，离子源温度1 0 0 c ，脱溶剂 气温度2 5 0 ，质量范围1 0 0 3 0 0 0 m z ，光电倍增器电压1 6 0 0 v ，气体流速5 0 l l a t 5 6 1 。 8 材料与方法 2 2 1 l 合成产物热稳定性的测定 取苯甲酸壳聚糖酯( d = 1 8 ) 样品l m g ，用p 蜘s ld s c 分析仪从5 0 c 开始至2 3 0 c ， 以1 0 c m i n 速率上升，记录其d s c 曲线图。 取苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯( - - 酯含量9 7 ) 样品l m g ，用毛细管法测定其熔点【5 7 1 。 2 2 1 2 合成产物溶解性的测定 准确称取经干燥恒重的苯甲酸壳聚糖酯( 1 3 = 1 8 ) 样品及苯甲酸乙酰氨基葡萄糖酯 ( - - 酯含量9 7 ) 样品各1 0 9 于5 0 m l 烧杯中，室温下分别加入不同有机溶剂，搅拌使 其充分溶解，过滤，沉淀经干燥后称重，样品在溶剂中的溶解度可由已溶解样品的百分 量来确定【铽。 2 2 1 3 受试菌种培养基的配制 肉汤培养液( 培养细菌用) ：5 9 牛肉浸膏，5 9 n a c l ，1 0 9 蛋白胨，与1 0 0 0 m l 水混合， 加热使配料溶解，用0 1 m o l l 的n a 0 h 调p h 值至7 2 - 7 4 ，三角瓶分装，1 2 1 灭菌1 5 m i n ， 待用。 营养琼脂培养基( 培养细菌用) ：1 0 0 0 m l 肉汤培养液中加入1 5 9 琼脂，加热煮沸使 琼脂溶化，分装于三角瓶，封口，1 2 1 灭菌1 5 m i n ，待用。 马铃薯培养液( 培养霉菌或酵母用) ：马铃薯去皮，切成约2 c m 3 的小块，取2 0 0 9 放入1 5 0 0 m l 的烧瓶中煮沸约3 0 m i n ，用双层纱布过滤，取其滤液加糖2 0 9 ( 霉菌用蔗糖， 酵母菌用葡萄糖) ，再用水补至1