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一种无载体无选择标记基因转化小麦方法的建立 摘要 随着转基因技术的广泛应用，转基因作物的安全性越来越引起入们的重视。其中在 基因转化中普遍使用的选择标记基因和载体骨架序列是影响转基因作物安全性评价的 两个重要因素。露前，基因枪和农杆菌转纯法均较难实现无载体燹标记基因的转化，面 花粉管通道法则有望解决这一问题，虽然该方法也存在着转化效率低、重复性差等缺点。 为了建立一种简便有效地进行无载体无标记基因转化小麦的方法，本文在对小麦花 粉管通道法研究的基础上，提出了小麦的子房滴注转化法，并在转化中使用了不含选择 标记基因和载体骨架序列的最小基因表达框( 只含有u b i q u i t i n 启动子、嘞基因、? l o s 终止子和t - d n a 边界序列) 。 本文首先对影响小麦花粉管通道法转化的几个可能因素的进行了初步研究，包括对 花粉管生长情况的麓察和努源d n a 的f i t c ( f l u o r e s c e i ni s o t h i o c y a n a t e ，异硫氰酸荧光 素) 示踪观察。其中f i t c 示踪又包括观察转化时间和转化溶液对外源d n a 进入小麦胚 囊效率的影响，以及不同转化部位对外源d n a 进入方式的影响等。结果表明，在授粉 2 0 m i n 后，小麦花粉管可以进入子房；推测外源d n a 沿花粉管延伸过程中形成的花粉 管通道进入胚囊；转化部位对外源d n a 进入子房的方式有影响，伤口加深，外源d n a 进入的量相对较多；在授粉4 5 和6 0 r a i n 以后进行转化，外源d n a 进入小麦胚囊的效率 较高；相对于t e 缓冲液，使用0 0 5 s i l w e tl 7 7 + 5 蔗糖作为转化溶液可以缩短外源 d n a 进入胚囊的时闻。 在以上实验结果的基础上，本文提出了小麦的子房滴注转化法。实际转化操作表明， 子房滴注转化法的p c r 阳性率礤。5 ) 要高于花粉管通道法( 2 。o 哟。此后，本文又从转化 时间和转化溶液组成等方面对前者进行了优化。结果表明子房滴注转化法在使用 0 0 5 s i l w e tl 7 7 + 5 蔗糖的水溶液作为转化溶液，转化时间为6 0 - 9 0 m i n 时可以得到较 高的转化率m 3 ) ；s o u t h e r n 杂交检测表明，外源d n a 已经整合n d , 麦基因组上； r t p c r 及n o r t h e r n 杂交检测表明，外源d n a 在转基因植株中可以正常转录；荧光观 察表明，s m g f p 可以在转基因植株中正常表达。 综上所述，本文成功建立了一种有效的将无载体无标记基因导入小麦的转化方法， 即子房滴注转化法。 关键词：小麦转化；花粉管通道法；子房滴注法；s m g f p 基因；最小基因表达框 大连理工大学硕士学位论文 e s t a b l i s h m e n to fav e c t o r a n ds e l e c t a b l em a r k e r - f r e e t r a n s f o r m a t i o nm e t h o df o r 飘飞e a 童 a b s t r a c t a l o n gw i mt h ew i d ea p p l i c a t i o no ft r a n s g e n i ct e c h n o l o g yr e c e n t l y , t h eb i o s a f e t yo f g e n e t i c a l l ym o d i f i e d ( g m ) c r o p sa t t r a c t e dm o r ea t t e n t i o nt h a nb e f o r e t h es e l e c t a b l em a k e r g e n ea n dv e c t o rb a c k b o n es e q u e n c e sa r et w oi m p o r t a n tf a c t o r s ，w h i c ha f f e c te s t i m a t i n gt h e b i o s a f e t yo fg mc r o p s n o w v e c t o ra n ds e l e c t a b l em a r k e r - f r e et r a n s f o r m a n t sc o u l dn o tb e o b t a i nb ya g r o b a c 恕r i u m - m e d i a t e dt r a n s f o r m a t i o na n dp a r t i c l eb o m b a r d m e n te a s i l y h o w e v e r , t h ep o l l e nt u b ep a t h w a ym e t h o dw a sh o p e f u l l yt os o l v e t h ed i f f i c u l t y ，a l t h o u g hi t s t r a n s f o r m a t i o nf r e q u e n c yw a s1 0 wa n dt h et r a n s f o r m a t i o nr e s u l tc o u l dn o tb er e p e a t e dw e l l i nt h i ss t u d y , t oe s t a b l i s har e p e a t a b l ea n de 题c i e n tv e c t o ra n ds e l e c t a b l em a r k e r - f r e e t r a n s f o r m a t i o nm e t h o df o rw h e a t ，t h eo v a r y - d r i pm e t h o dw a sp r e s e n t e db a s e do nt h es t u d yo f p o l l e nm b ep a t h w a ym e t h o d ，a n dt h em i n i m a lg e n ec a s s e t t e ( u b i q u i t i np r o m o t e r , s i n e # o p e n r e a d i n gf r a m e , r l o st e r m i n a t o ra n d d n ab o r d e rs e q u e n c e ) w a su s e df o rt r a n s f o r m a t i o n s i m u l t a n e o u s l y t h ep o s s i b l ef a c t o r s ，w h i c hc o u l da f f e c tp o l l e nt u b ep a t h w a ym e t h o df o rw h e a t t r a n s f o r m a t i o n , w e r es t u d i e df i r s t l y , i n c l u d i n gt h eo b s e r v a t i o no fp o l l e nt u b eg r o w t ha n dt h e t r a c eo fe x o g e n o u sd n aw i t hf i t c ( f l u o r e s c e i ni s o t h i o c y a n a t e ) l a b e l t h ee f f e c to fd i f f e r e n t t r a n s f o r m a t i o nl o c a t i o no nt h er o u t eo fe x o g e n o u sd n ae n t e r i n gi n t ow h e a to v a r y , t h ee f f e c t o ft r a n s f o r m a t i o nt i m ea n ds o l u t i o no nt h ee 筒c i e n c yo fe x o g e n o u sd n a e n t e r i n gi n t ow h e a t e m b r y os a c sw e r eo b s e r v e di nt h ep r o g r e s so ft r a c i n ge x o g e n o u sd n a r e s u l t ss h o w e dt h a t t h ep o l l e nt u b ec o u l dg r o wi n t ot h eo v a r y2 0 r a i na f t e rp o l l i n a t i o n ；i tw a se s t i m a t e dt h a t e x o g e n o u sd n ae n t e r e di n t oe m b r y os a c st h r o u g ht h ep o l l e n - t u b ep a t h w a y ；t r a n s f o r m a t i o n l o c a t i o nc o u l da f f e c tt h er o u t eo fe x o g e n o u sd n ae n t e r i n gi n t ow h e a to v a r y , b e c a u s eo ft h e l a r g ec u t m o r ee x o g e n o u sd n a c o u l de n t e r ；h i g h e rp r o b a b i l i t yo fe x o g e n o u sd n a e n t e r i n g i n t oe m b r y os a c sw a so b t a i n e dw h e nt r a n s f o r m a t i o nw a sc o n d u c t e d4 5a n d6 0m i n u t e sa f t e r p o l l i n a t i o n ；c o m p a r e dt ot es o l u t i o n , u s i n g0 0 5 s i l w e ti _ , - 7 7p l u s5 s u c r o s es o l u t i o n 鑫st h e t r a n s f o r m a t i o ns o l u t i o nc o u l ds h o r t e nt h et i m eo fe x o g e n o u sd n a e n t e r i n gi n t oe m b r y os a c s b a s e do nt h ea b o v er e s u l t s ，am e t h o dn a m e do v a r y - d r i pw a sp r e s e n t e d 。m o r ep c r p o s i t i v ep l a n t sc o u l do b t a i nb yo v a r y - d r i p ( 4 5 ) t h a nt h a tb yp o l l e nt u b ep a t h w a y ( 2 o ) ， w h e nt r a n s f o r m a t i o nw a sc o n d u c t e d t h e nt h et r a n s f o r m a t i o nt i m ea n ds o l u t i o no fo v a r y - d r i p m e t h o dw a so p t i m i z e d 曩l er e s u l tp r o v e dt h a th i g h e rf r e q u e n c yo fp c rp o s i t i v ep l a n t s ( 8 3 呦 c o u l db eo b t a i n e dw h e nd n aw a ss o l v e di n0 0 5 s i l w e tl - 7 7p l u s5 s u c r o s e ，a n d t r a n s f o r m a t i o nw a si m p l e m e n t e d6 0 9 0 r a i na f t e rp o l l i n a t i o n s s o u t h e r nb l o ta n a l y s i s i l 释无载体纛选择标记基辩转纯小麦方法的建立 一一二一 i n d i c a t e dt h a tt h ee x o g e n o u sd n a w a si n t e g r a t e di n t ot h ew h e a t g e n o m e t h er t - p c ra n d n o r t h e r nb l o ta n a l y s i ss h o w e de x o g e n o u sd n ac o u l db et r a n s e r i p t e dn o r m a l l y t h e f l u o r e s c e n c ed e t e c t i o nc o n f i r m e ds m g f pc o u l db ee x p r e s s e di nt h et r a n s f o r m a n t s i nc o n c l u s i o n ，a l le f f i c i e n tv e c t o ra n ds e l e c t a b l em a r k e r - f r e et r a n s f o r m a t i o nm e t h o df o r w h e a tn a m e do v a r y - d r i pw a se s t a b l i s h e d k e yw o r d s ：w h e a tt r a n s f o r m a t i o n ；p o l l e nt u b ep a t h w a ym e t h o d ：o v a r y - d r i pm e t h o d ； s m 翰g e n e ：m i n i m a lg e n ec a s s e t t e 独创性说明 作者郑重声明：本硕士学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工 作及取得研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外， 论文中不包含其他人已经发表或撰写的研究成果，也不包含为获得大连理 工大学或者其他单位的学位或证书所使用过的材料。与我同工作的同志 对本研究所做的贡献均已在论文中做了明确的说明并表示了谢意。 作者签名： 大连理王大学硕士研究生学位论文 大连理工大学学位论文版权使用授权书 本学位论文作者及指导教师完全了解“大连理工大学硕士、博士学位论 文版权使用规定 ，同意大连理工大学保留并向国家有关部门或机构送交学 位论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阕。本人授权大连理工大 学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，也可采 用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编学位论文。 作者签名：竺! 至 导师签名：哆辱1 乞导师签名： 笪：! 竺 2 堕年月日 一种无载体无标记基因转化小麦方法的建立 己i 吉 j -口 随着转基因技术的广泛应用，转基因作物的安全性越来越得到人们的重视。其中在 基因转化中普遍使用的选择标记基因和载体骨架序列都是潜在的安全隐患l l 捌。本文首先 就小麦转基因技术、选择标记基因和载体骨架序列的研究现状进行了综述，之后又对本 文所使用的g f p 报告基因进行了介绍。目前，基因枪和农杆菌转化法均难以实现无载 体无标记基因的转化，而花粉管通道法则有望解决这一问题，虽然该方法也存在着转化 效率低、重复性差等缺点。 为了建立一种简便有效地进行无载体无标记基因转化小麦的方法，本文在对小麦花 粉管通道法研究的基础上，提出了小麦的子房滴注转化法。在转化中本文使用了不含选 择标记基因和载体骨架序列最小基因表达框( 只含有u b i q u i t i n 启动子、s m g f p 基因、n o $ 终止子和t - d n a 边界序列) ，以期得到无载体无标记基因的小麦转基因植株。 本文对影响小麦花粉管通道转化的几种可能因素的研究，包括对花粉管的生长情况 的观察和f i t c 示踪外源d n a 的观察。在此基础上提出了小麦的子房滴注转化法之后， 又通过实际转化操作，来确定子房滴注法是否可以提高转化率。此后，又从转化时间和 转化溶液组成等方面对该方法进行了优化。而为了验证最小基因表达框的转化效果，在 p c r 检测之后，本文又对p c r 阳性材料进行了s o u t h e r n 杂交检测、r t p c r 检测、n o r t h e r n 杂交检测以及荧光检测。 大连理工大学硕士学位论文 1文献综述 1 1 转基因小麦研究进展 小麦转基因技术大体分为两类：一是农杆菌介导的基因转化；二是目标基因直接转 化，包括基因枪法、花粉管通道法、显微注射法、激光微束穿刺法、p e g 介导和电击穿 孔法等，其中应用较为广泛的是基因枪法、农杆菌介导法和花粉管通道法。 1 1 1 基因枪法 ( 1 ) 基因枪转化原理 基因枪转化或称为粒子轰击( p a r t i c l eb o m b a r d m e n t ，m i c r o p r o j e c t i l eb o m b a r d m e n t ， b i o l i s t i c s ) ，是一种基因直接转化技术，其原理是将外源d n a 包被在微小的金粒或钨粒 表面，在高压作用下将微粒高速射入受体细胞或组织。微粒上的外源d n a 进入细胞后， 整合到植物染色体上得到表达，从而实现对受体细胞的转化。根据动力来源不同，基因 枪可大体分为火药式( g u n p o w d e r ) 、放电式( e l e c t r i cd i s c h a r g e ) 和气动式( p n e u m a t i c ) 3 种类 型。 1 9 8 7 年，k l e i n 等【3 】最早以钨粉为子弹，把d n a 导入洋葱表皮细胞，并进行了表 达，从而验证了该方法的可行性。1 9 8 8 年m c c a b e 等【4 j 将目的基因包被于钨粉上，放 电轰击大豆茎尖分生组织，结果约有2 的组织通过器官发生途径获得再生植株，并在 t l 、t 2 代植株中检测到了外源基因。此后，该方法在多种作物中得到广泛应用【5 7 】。 ( 2 ) 基因枪法转化小麦的研究 1 9 9 1 年，v a s i l 等【s j 采用基因枪转化法转化了新霉素磷酸转移酶( n e o m y c i n p h o s p h o r - t r a n s f e r a s e ，n p t i i ) ，p - 葡萄糖苷酸酶( p g l u c u r o n i d a s e ，g u s ) 和5 - 烯醇丙酮酰 莽草酸磷酸合酶( 5 一e n o l p y r u v y l s h i k i m a t ep h o s p h a t es y n t h a s e ，e p s p s ) 等报告基因或选择标 记基因。s o u t h e r n 分析证实g u s ，n p t i i 和e p s p s 基因已经完整整合进转化株系，并且 在转化后愈伤组织中检测到这三种酶的活性。 1 9 9 2 年，v a s i l 等【9 】采用基因枪转化法，首次获得了用b a r 基因转化的抗除草剂b a s t a ( a c t i v ei n g r e d i e n tp h o s p h i n o t h r i c i n ，p p t ) 的小麦可育转基因植株。在4 株转化愈伤组织中 检测到b a r 基因编码的p p t 乙酰转移酶( p h o s p h i n o t h r i c i na c e t ) r l t r a n s f e r a s e ，p a n 活性。 在r 0 植株中同样检测到p a t 活性。s o u t h e m 分析证实所检测的r 0 植株和2 株r 1 植 株中都存在b a r 基因。转化的r o ，r 1 和r 2 植株也都具有b a s t a 抗性，而且b a r 基因 在r 1 和r 2 植株中的分离比符合孟德尔遗传规律。 一种无载体无标记基因转化小麦方法的建立 1 9 9 3 年，v a s i l 等l lo j 再次应用此方法转化小麦幼胚，并对转化和组织培养条件进行 优化，在短期内得到了可育的转基因植株，转化频率为1 0 。同年，w e e k s 等【1 1 】使用 基因枪技术轰击小麦愈伤组织，获得转报告基因的可育小麦植株。1 9 9 4 年b e c k e r 等【1 2 】 报道，通过基因枪技术轰击幼胚盾片组织，成功获得了转报告基因的小麦植株。1 9 9 7 年傅荣昭等【1 3 j 用该技术轰击小麦幼胚，将雄性不育基因导入小麦品种豫麦1 8 号，获得 转基因植株，经s o u t h e r n 杂交得到验证。截止到2 0 0 5 年，基因枪法转化小麦已有1 2 0 余例报道【1 4 】，成为小麦基因转化的主要方法。然而，该方法对设备要求较高，而且对于 小麦而言，再生体系的建立也较为困难。 1 1 。2 农杆菌介导法 ( 1 ) 农杆菌介导法转化原理 农杆菌介导基因转化是一种天然的遗传转化系统。农杆菌是普遍存在于土壤中的一 种革兰氏阴性细菌，它能在自然条件下趋化性地感染植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿 瘤或发状根。根癌农杆菌和发根农杆菌的细胞中分别含有t i 质粒和砒质粒，2 种质粒 上都有一段t - d n a 。由于农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将t d n a 插入到植 物基因组中，因此可以将目的基因插入到经过改造的t d n a 区，借助农杆菌的感染实 现外源基因向植物细胞的转移与整合，然后通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植 株。 ( 2 ) 农杆菌介导法转化小麦的研究 农杆菌介导法具有操作简单、成本低、转化效率高、重复性好、可以导入大片段 d n a 等优点，且整合后外源基因结构变异小，导入基因一般为单拷贝整合，很少有基 因沉默现象发生。因此，该方法自1 9 8 3 年创建以来，在双子叶植物遗传转化中得到广 泛应用。至于单子叶植物，尤其是禾本科粮食作物，被认为不是农杆菌天然寄主【1 5 】。随 着对农杆菌转化植物细胞的原理进行系统研究，发现农杆菌对单子叶植物浸染的不敏感 性，可能是因为单子叶植物创伤后，在伤口附近往往发生木质化或硬化，而且没有明显 的细胞分裂发生，内源信号分子相对不足，不能形成足量的诱导v i r 区基因表达的酚类 化合物所造成的【1 6 1 。 农杆菌介导在单子叶植物中获得成功是在2 0 世纪9 0 年代初，当时农杆菌介导的石 刁柏转基因植株的获得，特别是农杆菌介导的转基因水稻【1 8 1 和转基因玉米【1 9 的获得， 不仅改变了单子叶植物不是农杆菌的天然寄主的看法，而且证明农杆菌介导法完全可以 用于禾谷类作物的遗传转化。 大连理工大学硕士学位论文 9 0 年代初h e s s 等【2 川和m o o n e y 等【2 1 1 曾分别对农杆菌介导转化小麦的可行性进行了 尝试性研究，但未能获得转基因植株。直到1 9 9 7 年，c h e n g 掣2 2 j 才用此方法获得了有 分子生物学证据的小麦转基因植株。 虽然有关农杆菌介导转化小麦的报道不断增多，不过由于小麦对农杆菌的不敏感， 它依然大大少于基因枪法和花粉管通道法1 1 4 。 1 1 3 花粉管通道法 ( 1 ) 花粉管通道法转化原理 花粉管通道法是由我国生物化学家周光宇首先创立的。他于七十年代末结合我国远 缘杂交的成功经验，提出了远缘杂交中存在d n a 片段的假设 2 3 1 。之后，周光宇等渊基 于这种理论假设，设计了白花传粉后外源d n a 导入方法，即在授粉后利用花粉管的通 道使外源d n a 导入植物卵细胞、合子或早期胚细胞的技术，因此称之为花粉管通道法 转基因技术。 花粉管通道法转基因技术最早应用于棉花【2 5 】的转化研究，该方法利用整体植株的卵 细胞、受精卵或早期胚细胞转化外源d n a ，具备以下优点：无需细胞、原生质体等组 织培养和诱导再生植株等一整套人工培养过程，方法简便，对于再生困难的植物的遗传 转化尤为有利；不受受体的限制，单胚珠及多胚珠的单双子叶植物均可采用，只需针对 具体植物的花器构造，开花习性和受精过程，采用合适的导入技术即可；可以缩短育种 时间；不受基因型的限制，可以任意选择生产上的主栽品种进行外源d n a 导入；直接 得到转化种子，成本低。 该技术不足之处在于转化机制尚需进一步阐明，外源基因的整合机理需要进一步验 证，转化技术有待进一步完善，操作程序不规范，转化效率有待进一步提高。 ( 2 ) 花粉管通道转化法转化机理的探讨 目前转化效率不高主要与以下几个方面有关：花粉管的路径长，变化复杂；外源 d n a 导入的时期选择不合适；导入的外源d n a 在渗入的过程中不可避免的被降解；外 源d n a 的片段大小和浓度；不同的导入方法和导入部位；外环境因素中的温度和湿度 对花粉萌发和花粉管的生长速度的影响。为了解决这些问题，人们对花粉管通道法的转 化机理进行了研究。 花粉管通道形成时期的研究 为了确定合适的转化时间，需要了解受体植物的受精过程，并对花粉管通道的形成 时间进行确定。申家恒等1 2 6 】对小麦整个受精过程进行了研究，观察到花粉管进入珠孔大 约需要1 h ，授粉后1 h 花粉管经珠孔及珠心表皮细胞间隙进入1 个助细胞，并释放精子。 一种无载体无标记基因转化小麦方法的建立 授粉后2 - 6 h 精卵融合，授粉后1 6 h 合子第一次分裂。授粉后2 - - - 3 h 精子与极核融合， 授粉后4 h 初生胚乳核第一次分裂，因此他们建议授粉后2 1 6 h ，即精卵融合至合子分 裂前为花粉管通道法转化合适的时间。 外源d n a 进入胚囊的途径 对外源d n a 进入胚囊途径的观察有利于我们了解外源d n a 的进入机制，根据这 种机制可以改进花粉管通道法的转化效率。龚蓁蓁等【2 7 】利用放射自显影技术证明棉花受 精时所形成的自珠孔到胚囊之间的花粉管通道是外源d n a 进入胚囊的唯一途径。邓德 旺等【2 8 】使用t o t 0 3 标记外源d n a ，进一步确定外源d n a 是经过棉花胎座传输组织中 的花粉管外缝隙、胎座表面、珠孔、珠心通道进入胚囊，直接转化处于融合时期的无壁 生殖细胞。 ( 3 ) 花粉管通道法转化小麦 在棉花之后，人们还对水稻【2 9 】、大豆【3 0 1 、小麦【3 1 】和玉米跚等多种作物进行了花粉 管通道法转化的初步研究。随着研究的深入，目前已经通过多种分子生物学方法鉴定外 源d n a 已经整合到受体植物的基因组中，而且培育了一批具有经济价值，遗传稳定的 作物品系1 3 2 - 3 。 1 9 9 1 年刘文轩等【3 8 】首先使用基因组作为外源d n a 转化小麦，得到了性状变异的植 株。1 9 9 3 年曾君祉等p 2 j 利用花粉管通道法将带g u s 标记基因的质粒p b l l 2 1 导入普通 小麦，经点杂交初步筛选，再经s o u t h e r n 分子杂交鉴定，确定获得了转基因植株，同时 用荧光法和x g l u c 染色法检测，证实了这些植株中有g u s 基因的表达产物，证明g u s 基因已整合到小麦植株中，并能在植物体中表达。截止到2 0 0 5 年，已有花粉管通道法 转化小麦的报道5 0 余例【1 4 】，这其中从单基因到基因组转化，从改良生物胁迫和非生物 胁迫的抗逆性到改良品质、高产等生理和农艺性状，应用已经非常广泛。 此前报道的小麦的转化时间，通常为授粉后0 5 3 h ；转化方法，则通常是是剪去 柱头，并在伤口处滴加外源d n a1 3 9 - 4 1 。 1 2 选择标记基因对转基因作物安全性的影响 1 2 1选择标记基因在基因转化中的应用及潜在安全隐患 在进行转基因操作时，为了提高阳性植株的筛选效率，人们通常会将一些抗性基因 与目的基因同时进行转化，例如抗生素抗性基因和抗除草剂基因。然而在筛选过后，这 些抗性基因便失去了用处。这些用于筛选的选择标记基因反而有可能造成转基因作物的 安全性问题。 大连理工大学硕士学位论文 ( 1 ) 抗生素抗性基因 抗生素抗性基因是筛选转基因植物常用而有效的标记基因。转基因植物中所用的抗 生素抗性基因包括n p ti i ( 编码新霉素磷酸转移酶i i 即n p ti i ，提供卡那霉素、新霉素抗 性) 、a p l a ( 4 ) i ( 编码潮霉素磷酸转移酶，提供潮霉素抗性) 、b l a ( 编码p 内酞胺酶，提供 氨苄青霉素抗性) 、a a c ( 提供庆大霉素抗性) 和n p ti i i ( 提供a m i k a c i n 抗性) 等。 编码抗新霉素和卡那霉素的n p ti i 基因是植物基因工程最常用的标记基因，其基因 产物是新霉素磷酸转移酶，对底物有高度特异性，只作用于氨基己糖环3 位羟基上，催 化的磷酸化反应依赖a t p ，而对其他氨基糖苷类抗生素如a m i k a c i n 和n e t i l m y e i n 都无 作用。目前认为植物食品中n p ti i 基因水平转移至肠道微生物中的可能性极小。而且消 化道中a t p 量很低，不足以造成催化活性。若该酶被分泌至消化道中，2 0 3 0 m i n 即 被充分降解而失活。 然而，这些抗性基因能否从转基因作物进入环境微生物而产生对抗生素的抗药性， 则是不容忽视的一个问题。因为细菌很容易交换抗生素抗性基因，若这些基因进入致病 茵体内，就可能产生超级细菌，对人类和其他生物构成威胁。 大量实验对抗生素抗性基因从转基因植物向土壤微生物扩散的可能性进行了分析。 许多研究都表明基因转移是很难发生的。s c h l u t e 等【4 2 j 检测了b a 基因从转基因马铃薯向 其病原菌e r w i n ac h r y s a n t h e m i 转移的情况。他们将马铃薯与病原菌共培养后，重新从马 铃薯组织中分离氨苄青霉素抗性菌，虽然马铃薯与病原菌e r w i n ac h r y s a n t h e m i 关系密 切，但未发现青霉素抗性菌。但也有研究表明抗生素抗性基因可以从转基因作物转移到 微生物中。h o f f m a n n 等m j 在灭菌的土壤中让真菌a s p e r g i l l u sn i g e ，与含潮霉素 ( h y g r o m y c i nb ) 抗性的转基因植物( b r a s s i c an i g r a ，n a p u s ，i n n o x i a ，v i c i an a r b o n e n s i s ) 共 培养几星期，结果分离到2 0 0 个抗性菌株，其中有1 0 个菌株经s o u t h e r n 杂交证实含潮 霉素抗性基因。 ( 2 ) 抗除草剂基因 抗除草剂基因也常用做标记基因。然而，一旦此类基因漂移至杂草中，将会产生超 级杂草。王天宇等m 】研究表明栽培谷子的性状基因可向周围6 0m 范围内的青狗尾草漂 移，其基因流的频率随着距花粉供体中心距离的增加而递减。 除以上风险以外，这些选择标记的表达产物都还有可能是潜在的过敏源。在下列情 况下转基因植物食品可能产生过敏性：所转基因编码已知的过敏蛋白；基因源含过敏蛋 白；在转入蛋白与已知过敏蛋白的氨基酸序列免疫学上有明显同源性，至少有8 个连续 氨基酸相同；转入的蛋白属于家族中有过敏蛋白的家族。 一种无载体无标记基因转化小麦方法的建立 1 2 2 选择标记基因安全隐患的解决方式 由于选择标记基因存在潜在安全隐患，人们尝试用多种方法对其去除。 ( 1 ) 共转化 通过农杆菌介导法能够将多拷贝的t d n a 转移到植物细胞内并整合到植物基因组 中，同样农杆菌也能将2 个不同的t d n a 共同转化到一个植物细胞中。如果将t d n a 上的选择标记基因和目的基因通过共转化导入1 个植物细胞中，而且两个基因整合到染 色体上不同的位点，那么通过杂交能使标记基因与目的基因在子代分离开来。 s t a h l 等【4 5 】为农杆菌同时将2 个不同的t d n a 整合到植物基因组不同的位点上提供 了直接的证据，他们通过将人的抗凝血酶i i i 、b 抗胰蛋白酶、溶菌酶、血清白蛋白、乳 铁蛋白的基因分别与b a r 基因一起共转化大麦，然后通过p c r 获得t d n a 和植物d n a 在t d n a 左侧边界和右侧边界接点处的片段，经测序和g e n e b a n k 比对，证明两个 t - d n a 整合到不连锁的位点上。张新梅等【铂】用该方法获得了无筛选标记的转基因小麦， 沈革志等【4 7 】和z h o u 等【4 8 】也分别对这种方法进行了研究。 ( 2 ) 位点特异性重组体系( s i t e s p e c i f i cr e c o m b i n a t i o ns y s t e m ) 目前，至少有4 种重组酶介导的位点特异的重组系统被证明在植物细胞中起作用： 噬茵体p 1 的c r e l o xp 系统、啤酒酵母的f l p f r t 系统、z y m o s a c c h a r o m y c e s r o u x x i 的 p s r l 系统和m u 噬菌体的g i n 重组酶系鲥倒。 以噬菌体p 1 的c r e l o x p 系统为例，该系统有两个组成成分：重组酶( c r e ) 及其识别 位点( 1 0 xn 。c r e 介导的重组会引起位于两个相邻l o xp 位点之间的d n a 片段的切除。 将一个选择标记基因插入两个相邻l o x p 位点之间，目的基因置于l o x p 位点之外，导人 植物，获得转基因植株，再通过异花授粉或再转化将c r e 基因导人转基因植株，以切除 选择标记基因。最后再通过杂交可将c r e 基因与目的基因分离开。 d a l e 等【5 0 】用含有荧光素酶基因( 助0 及位于概p 位点之间的h p t 基因的双元载体转 化烟草，经二次转化，将连有n p ti i 基因的c r e 基因导人转基因植株。在1 2 株含有c r e 基因的转基因植株中有l l 株消除了幼f 基因。将其中两株进行自交，使n p t i i 基因和c r e 基因与l u c 基因分离。在子代中分别有1 6 3 ( 1 7 1 0 4 ) 和5 4 ( 7 1 3 0 ) 的植株表现了荧光素 酶活性而无卡那霉素抗活性。 ( 3 ) 转座子介导的再定位( t r a n s p o s o n m e d i a t e dr e p o s i t i o n i n g ) 这一方法是借助于转座子系统；如玉米的a c d s 和s p m d s p m 的转座作用，利用转 基因植物与非转基因植物的杂交以及子代的分子分析即可以获得无标记基因的后代植 株。 大连理工大学硕士学位论文 y o d e r 等【5j j 应用a c d s 转化体系在相连的两个基因整合后将目的基因或选择标记基 因转移到新的位点上，如果新位点距离原位点足够远的话，通过杂交能够将目的基因与 选择标记基因分离开。无选择标记的转基因植株在子代水平上分离。g o l d s b r o u g h 等【5 2 】 用含有双元载体的根癌农杆菌转化番茄，该双元载体上带有一个位于瓜反向重复序列 之间的g u s 基因，一个4 c 转座酶基因及一个n p ti i 基因。将其中含有1 2 个t 。d n a 拷 贝的两株转基因植株进行自交，在子代中t d n a 与转移嵌合体d s g u s 元件独立地分 离。在子代中分别有2 3 ( 2 8 7 ) 和6 6 ( 7 1 0 6 ) 含有d s g u s 元件但不含印fi i 基因。这 些结果表明，a c d s 系统能够将目的基因再定位，并能产生无标记基因的转基因植株。 ( 4 ) 同源重组( h o m o l o g o u sr e c o m b i n a t i o n ) 该方法是将标记基因置于重复序列之间，通过重复序列的同源重组作用将标记基因 切除。这些重复序列可以是基因表达框的任何部分，如启动子、终止子等。 噬菌体可以使其附着位点( a t t p ) 整合在大肠杆菌基因组的细菌附着位点( 砌) 上，这 种整合需要噬菌体编码的整合酶( i n t ) 及细菌整合宿主因子( i h f ) 。z u b k o 等【5 3 】报道了在 两个a t t p 位点应用染色体内同源重组消除选择标记基因，且不带有i n t 及i h f 蛋白的 转化体系。他们的究结果表明，通过染色体内重组及两步再生，可获得无选择标记的转 基因植株。 以上介绍的方法所具有的共同特征是将选择标记基因和目的基因整合至不连锁的 位点上，通过杂交筛选，去除筛选标记基因，虽然有效，但方法繁琐。 1 3 载体骨架对基因转化的影响 1 3 1载体骨架对基因转化的作用 质粒载体是基因转化中普遍采用的一种载体。无论是农杆菌转化，基因枪转化，还 是花粉管通道法转化，目前普遍使用完整质粒d n a 作为转化载体。 对于农杆菌转化法来说，使用质粒载体是必须的，这是由其转化原理决定的。t - d n a 的左右边界各有一个2 5 b p 的重复序列，在不同的t - d n a 中，此序列是高度保守的。插 入这两个边界序列之间的外源d n a 序列，就有可能被转移到植物基因组中。t - d n a 转 移主要通过农杆菌v i r 基因的产物介导，其中v i r d 位点的2 个产物，v i r d l 和v i r d 2 蛋 白，可以识别边界重复序列并在每个边界序列末端第3 、4 个碱基之间造成单链缺e l 5 4 1 。 这些缺口分别确定了t 链在左右边界的起始和终止。在造成缺口之后，v i r d 2 蛋白与 t d n a 左右边界5 端共价结合，可能作为引导蛋白引导单链t d n a 进入植物细胞 f 5 5 5 6 1 。 一种无载体无标记基因转化小麦方法的建立 而对于基因枪这种直接转化法，质粒的载体骨架序列对外源d n a 进入植物细胞没 有显著影响，但是这些骨架序列可以提高外源d n a 的稳定性，防止其被细胞内的核酸 酶降解1 5 。 1 3 2 载体骨架对基因转化的不利影响 重组质粒在农杆菌介导法和基因枪法转化过程中，其载体骨架序列也会随目的基因 插入到植物基因组中。 ( 1 ) 农杆菌介导法 多年以来，传统的观点认为只有载体t d n a 边界之间的d n a 可以整合到植物基因 组上，而那些非t d n a 序列，即载体骨架序列不可能转移到植物基因组中。然而，对 d n a 插入植物基因组的研究表明，载体骨架的插入也是非常普遍的。其中，既有t i 质 粒序列，也有双元载体上的非t d n a 序列【5 嘶5 1 。这些载体骨架的转移可以不依赖于 t e f n a ，也可能与t d n a 的左边界或右边界相连畔】。在农杆菌介导的转化中，这些载 体骨架序列与植物基因组之间的整合频率很高，典型的转化频率在2 0 5 0 之间，有 时甚至达到7 5 以上【鲫。 k o n o n o v 等【删构建了带有t - d n a 的双元载体，其中印r 基因在t d n a 内部， g u s 基因在t d n a 边界外。通过对所得到的具有卡那霉素抗性的转基因烟草进行g u s 基因的表达分析来验证骨架序列是否也整合到基因组中。结果约1 5 的植株表现出g u s 活性，p c r 分析表明其中7 5 的植株含有g u s 基因，s o u t h e m 杂交分析表明连接t d n a 边界的载体骨架可以整合到烟草基因组。 非t - d n a 序列插入的一个可能原因是v i r d 蛋白的缺乏，如果缺乏充分地识别 t d n a 左边界序列载体蛋白，那么以t d n a 右边界r b 开始的t 链就可能在载体左边 界l b 通读( 或者在r b 通读，如果t 链从l b 起始) ，从而通过滚环复制( r o l l i n g c i r c l e r e p l i c a t i o n ) 形成长t d n a 转移( l o n gt d n at r a n s f e r ) 的j 。 部分载体骨架的插入会将重组质粒上的抗生素抗性基因转移到转化植株中，不仅可 能影响植物的其他基因的表达和功能，而且也可能会因为基因转移给生物的安全性带来 风险。这同时也是基因枪法和花粉管通道法在使用带有抗生素抗性的质粒时，所面临的 问题。 ( 2 ) 基因枪转化法 对于基因枪等直接转化法，非目的基因的质粒载体主干序列随着目的基因整合到植 物基因组中更为普遍【6 ，所引起的问题也更为复杂。 大连理工大学硕士学位论文 质粒载体骨架上的核酸酶和拓扑异构酶识别位点，例如质粒复制起点，可能引起复 制介导的重纠6 8 1 。质粒载体上的a t 富集序列同样也容易引起重组【6 9 】。载体骨架序列还 含有回文