（动物遗传育种与繁殖专业论文）牛干扰素τ基因的克隆及其在大肠杆菌中的融合表达.pdf

摘要 本研究采用克隆测序技术，首次测定了中国荷斯坦奶牛干扰素一f ( b l f n - t ) 成熟蛋白基因的编码区( c d s ) 全序列( g e n b a n k 登录号：d q 6 8 0 8 4 6 、d q 6 8 0 8 4 7 ) ， 并利用生物信息学方法对b l f n t 的结构和功能进行了预测，结果表明： b l f n - t 成熟蛋白基因的c d s 全序列长度为5 1 9 b p ，编码1 7 2 个氨基酸的 b l f n t 。对b l f n - x 成熟蛋白基因的c d s 全序列和g e n b a n k 上已公布的相关序列 进行聚类分析，可将其聚为4 类，发现了新的一类b l f n - x ( z 4 ) 和六种新亚型( z l e 、 西f 、f 3 9 、x 3 h 、讲a 、订b ) 。d q 6 8 0 8 4 6 属于订类的一种亚型，标记为x 4 a ；d q 6 8 0 8 4 7 属于妇类的种亚型，标记为x 3 l 各b i f n - t 基因核苷酸序列间的同源性在 9 2 7 - - 9 9 8 之间，推导氨基酸序列间的同源性在8 8 5 毋9 4 之间：码a 、x 3 f 与其他b l f n t 基因核苷酸序列间的同源性分别在9 4 0 - 9 7 1 、9 2 9 * , - 9 9 6 之 间，推导氨基酸序列间的同源性分别在9 1 4 - - 9 6 0 、8 8 5 * , - - 9 9 4 之间。不同 物种i f n f 基因可聚为4 类：普通牛与美洲野牛、水牛聚为一类；绵羊、山羊、 麝香牛聚为另一类；大额牛、马鹿、麝香鹿聚为第三类；长颈鹿单独为一类。各 物种i f n t 基因核苷酸序列间的同源性在8 4 6 9 9 2 之间，推导氨基酸序列间 的同源性在6 8 4 曲7 7 之间；中国荷斯坦奶牛b l f n - t 基因x 4 a 和t 3 f 与其他物 种i f n t 基因核苷酸序列间的同源性在8 7 7 0 9 2 之间，推导氨基酸序列间的 同源性在7 4 1 - 9 7 7 之间。对b l f n t 的结构和功能进行生物信息学预测，发 现b i f n ，t 氨基酸序列中有一个潜在的n 一糖基化位点，a s n 7 8 可被耱基化。b l f n - x 中存在5 个主要的疏水区，分别位于氨基酸序列的5 3 - 6 8 位、7 5 8 6 位、9 6 - - 1 0 4 位、“和1 2 1 位和1 3 9 - - - 1 5 6 位。b i f n t 氨基酸序列中有6 个潜在的磷酸化位点： s e r 2 5 、s e r l 3 7 、s e r l 5 3 、s e r l 5 5 、t h r l l 9 和t y r l 3 6 。b i f n - t 的c y s l 和c y s 9 9 、 c y s 2 9 和c y s l 3 9 各自形成两个二硫键，以维持其立体结构。b l f n t 的三维结构 是以5 个a 螺旋为基础构成的，a 螺旋由1 11 个氨基酸残基形成，占6 4 5 3 ； 螺旋之间为无规卷曲，由6 1 个氨基酸残基形成，占3 5 4 7 。b l f n t 氨基酸序列 3 1 5 5 位是包括i f n 吨，b ，( o ，f ，6 等在内的i 型i f n 家族的典型保守结构功能 域。由此可以推测出b l f n t 具有i 型i f n 所共有的抗病毒、抗细胞增生、免疫 调节等生物学功能。 本研究将b l f n f 基因定向克隆到原核表达载体p e t - 2 8 a ( + ) r p ，构建了重组 融合表达质粒p e t - 2 8 a - b l f n 嘞转化大肠杆菌b l 2 1 ( d e 3 ) ，用i p t g 诱导表达， 优化表达条件，并初步纯化重组融合蛋白，结果表明： b l f n t 基因在重组融合表达质粒p e t - 2 8 a - b l f n - x 中的插入方向和读码框均 正确：该基因已在大肠杆菌b l 2 1 ( d e 3 ) 中实现了融合表达，其表达量占菌体总蛋 白的2 0 6 8 。对表达条件进行了优化，其表达量可达2 8 8 4 在3 7 和3 0 时进行诱导，融合蛋白的表达量高于2 5 和2 0 c 时的诱导；在诱导后l h 就有融 合蛋白表达，诱导后3 h 融合蛋白的表达量达到峰值。通过固定相金属离子亲和 色谱( i m a c ) 方法纯化重组融合蛋白。咪唑浓度为3 0 0 5 0 0 m m o f l 的e l u t i o n b u f f e r 的纯化效果较好，纯化后的重组融合蛋白的浓度和纯度都很高。 关键词：中国荷斯坦奶牛；干扰素t 基因；分子克隆；序列分析；生物信息学预 测；融合表达：大肠杆菌；蛋白纯化 a b s t r a c t c o d i n gs e q u e n c e ( c d s ) o fm a t u r ei n t e r f e r o n t ( b i f n dg e n ef r o mc h i n e s e h o s t e i nw a sc l o n e da n ds e q u e n c e df o rt h ef i i 髓t i m e ( o e r l b a n ka c c e s s i o nn u m b e r ： d q 6 8 0 8 4 6 、d q 6 8 0 8 4 7 ) t h es t r u c t u r ea n df u n c t i o no fb l f n tw e r ep r e d i c t e db y b i o i n f o r m a t i e sm e t h o d s t h er e s u l t ss h o w e d ： t h ec d so fm a t u r eb l f n - tg e n ew a s5 1 9 b p e n c o d e db l f n tw h i c hc o m p o s e d o f17 2a m i n oa c i dr e s i d u e s t h ec d so fm a t u r eb i p n - tg e n ea n dc o r r e l a t i v e s e q u e n c e sf r o mg e n e b a n kf e l li n t of o u rg r o u p sb yc l u s t e ra n a l y s i s an o v e lg r o u p ) a n ds i xn o v e lv a r i a n tf o r m s ( t l e ，口f z 3 9 ，t 3 h ，订a x 4 b ) w e r ef o u n d d q 6 8 0 8 4 6w a s av a r i a n tf o r mi n 订，w h i c hw a sd e s i g n a t e dz 4 a ；d q 6 8 0 8 4 7w a sav a r i a n tf o r mi nt 3 ， w h i c hw a sd e s i g n a t e dz 3 f t h ei d e n t i t i e sw e r e9 2 7 * 0 - - 9 9 8 i nn u c l e o t i d es e q u e n c e a m o n ga l lb i f n fg e n e s a n dt h a tw e r e8 8 5 * 0 - - 9 9 4 i na r r l i n oa c i ds e q t l e n c 七t h e i d e n t i t i e sw e r e9 4 0 0 o - 9 7 1 a n d9 2 9 - 9 9 6 r e s p e c t i v e l yi nn u c l e o t i d es e q u e n c e a m o n gt 4 a ，x 3 fa n do t h e rb l f n - zg e n e s ，a n dt h a t w e r e9 1 4 9 6 o a n d 8 8 5 * 0 - - - 9 9 4 r e s p e c t i v e l yi na m i n oa c i ds e q u e n c e t h ei f n fg e n e so fd i f f e r e n t s p e c i e sf e l li n t of o u rg r o u p sb yc l u s t e ra n a l y s i s ：c o w , a m e r i c a nb i s o na n db u f f a l o c o m p r i o n ee l a d e ；s h e e p ，g o a ta n dm u s ko xc o m p r i s ea n o t h e r ；g a y a l ，r e dd e e ra n d m u s kd e e rc o m p r i s eat h i r de l u d e ；g i r a f f ec o m p r i s ea ne n t i r e l yd i f f e r e n te l u d e t h e i d e n t i t i e sw e r e8 4 6 * o - - 9 9 2 i nn u e l c o t i d e s e q u e n c ea m o n gi f n tg e n e so fa l l s p e c i e s a n dt h a tw e r e6 8 4 - - 9 7 7 i na m i n oa c i ds e q u e n c e t h ei d e n t i t i e sw e r e 8 7 7 - - - 9 9 2 i nn u c l e o t i d es e q u e n c ea m o n gb i f n - zg e n e 讲a f 3 f o f c h i n e s eh o s t e i n a n d f n - i ：g e n e so f o t h e rs p e c i e s a n dt h a tw e r e7 4 1 * r 9 7 7 i na m i n oa c i ds e q u e n c e t h es t r u c t u r ea n df u n c t i o no fb i f n - ，cw e r ep r e d i c t e db yb i o i n f o r m a t i c sm e t h o d s o n e p o t e n t i a ln - g l y c o s y l a t i o ns i t e si nb l f n - xa m i n oa c i ds e q u e n c ew a sf o u n d , a s n 7 8 c o u l db eg l y c o s y l a t e d f i v em a i nh y d r o p h o b i c i t yr e g i o no fb l f n tw e r ef o u n d , w h i c h s t a n d5 3 - - 6 8 ，7 5 - 8 6 ，9 6 t 0 4 ，1 1 4 1 2 】a n d1 3 9 1 5 6i n 锄a i n oa c i d s e q u e n c e r e s p e c t i v e l y s i xp o t e n t i a lp h o s p h o r y l a t i o ns i t e si nb l f n ta m i n oa c i ds e q u e n c ew e r e f o u n d ：s e r 2 5 ，s e r l 3 7 ，s e r l 5 3 ，s e t l 5 5 ，t h r l l 9a n dt y r l 3 6 t w od i s u i f i d eb o n do f b l f n tf o r m e db e t w e e nc y s la n dc y s 9 9 ，c y s 2 9a n dc y s l3 9r e s p e c t i v e l y , i no r d e rt o m m a i n t a i ns p a t i a ls 缸 u c t u r eo fb i f n t t h et h r e ed i m e n s i o n a ls t r u c t u r eo fb l f n - 1 ：b a s e d o nf i v ea - h e l i c e s t h e s ea - h e l i c e sf o r m e db y111a m i n oa c i dr e s i d u e sw i t ha m o u n t o f 6 4 5 3 o fb l f n - 1 ：s e q u e n c e ；t h ei n t e r v a la m o n ga - h e l i c e ss t a n d e db yr a n d o mc o i l w h i c hf o r m e db y6 1a l p 血l oa c i dr e s i d u e sw i t ha m o u n to f3 5 4 7 o f b l f n ts e q u e n c e 。 3 1 5 5o fb i f n - 1 ：a m i n oa c i ds e q u e n c ew a st y p i c a lc o n s e r v e dd o m a i no ft y p cii f n ， w h i c hc o n s i s t i n go fi f n - a ，b ，l6 a sar e s u l t , w ec 趾c e n j e c t u r e dt h a tb l f n 。f p o s s e s sm u t u a lb i o l o g i c a lf u n c t i o no ft y p eii f n ，s u c h a sa n f i v i r u s ，a n t i - p r o l i f e r a t i o n a n di m m u n o l o r e g u l a t i o n t h eb l f n ig e n ew a si n s e r t e di n t op r o k a r y o t i ce x p r e s s i o nv e c t o rp e t - 2 8 a ( + ) t h u sw ec o n s l r u c t e dr e c o m b i n a n tf u s i o ne x p r e s s i o np l a s m i dp e t - 2 8 a - b l f n - _ r t h e n p e t - 2 8 a - b i f n - w a s t r a n s f o r m e di n t oe c o l ib l 2 i ( d e 3 ) a n de x p r e s s e d w i t h i n d u c t i o no f 口p t g t h ee x p r e s s e dc o n d i t i o nw a so 叫岫i z e da n dt h er e c o m b i n a n t f u s i o np r o t e i nw a sp u r i f i c a t e d t h er e s u l t ss h o w e d ： b o t ht h ei n s e r td i r e c t i o na n dr e a d i n gf l a m eo fb i f n - fg e n ea tt h ec l o n i n g j u n c t i o nw e r ec o r r e c t ；a n db i f n tg c n eh a da l r e a d ye x p r e s s e di ne c o l ib l 2 1 ( d e 3 ) w i t ha m o u n to f2 0 6 8 o ft h et o t a lb a c t e r i a lp r o t e i n s t h ee x p r e s s i o nc a p a c i t yc o u l d b ei n c r e a s e dt o2 8 8 4 b yo p t i 工l i i z 洫ge x p r e s s e dc o n d i t i o n s 。t h ee x p r e s s i o nc a p a c i t y o f f u s i o n p r o t e i n w h i c h w a s i n d u c e d a t3 7 ca n d3 0 ( 2a r e h i g h e r t h a n 2 5 ca n d 2 0 c t h ef u s i o np r o t e i ne x p r e s s e di nl ha f t e ri n d u c t i o na n dt h ee x p r e s s i o nc a p a c i t yr e a c h e d p e a kv a l u eh a3 ha f t e ri n d u c t i o n t h er e c o m b i n a n tf u s i o np r o t e i nw a sp u r i 五c a t e db y i m m o b i l i z e dm e t a li o na 伍n i t yc h r o m a i o g r a p h y ( i m a c ) m e t h o d s t h ep u r i f i c a t i o n e f f e c to fe l u t i o nb u f f e rw h i c hc o n t a i n e d3 0 0 5 0 0 m m o l li m i d a z o l ea r eb c f f 【e r b o t h c o n c e n t r a t i o na n dp u r i t yo f t h er e c o m b i n a n tf u s i o np r o t e i na r eh i 曲a f t e rp u r i f i c a t i o n k e yw o r d s ：c h i n e s eh o s t e i n ；i n t e r f e r o n - zg e n e ；m o l e c u l a rc l o n i n g ；s e q u e n c ea n a l y s i s ； b i o i n f o r m a t i c sp r e d i c t i o n ；f u s i o ne x p r e s s i o n ；e s c h e r i c h i ac o l i ；p r o t e i n p u r i f i c a t i o n i v 论文独创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行研究工作 所取得的成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，学位论 文中不包含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得 四川农业大学或其它教育机构的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作 的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢 意。 研究生始管涮 ，苫7 年月2 r 日 关于论文使用授权的声明 本人完全了解四川农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向 国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、 缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意四川农业大学可以用不同方式在不同媒体 上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 研究生签名：髻眈文武 导师签名 忱辱喀 如司年只蠲日 训7 年厂月彳日 1 文献综述 哺乳动物的胚胎移植始于1 9 世纪末( 英国，h e a p e1 8 9 1 年) ，历时8 0 年后， 世界上第一家胚胎移植公司成立( 1 9 7 1 年) ，到今天，胚胎移植在畜牧业中的 应用已经相当普及。世界各国的畜牧工作者在胚胎移植的各个环节上，做了大量 的工作，以提高妊娠率，但效果仍不显著。目前鲜胚移植妊娠率在6 0 - 6 5 ，冻 胚移植的妊娠率在5 0 5 5 ，要通过传统的方法提高胚胎移植的效果，已经非常 困难。目前人们采取提高胚胎移植效果的手段主要是从妊娠识别和胚胎植入的生 理基础方面入手。研究发现，干扰素一t ( i n t e f f e r o n - f ，i f n f ) 是反刍动物孕体向 母体发出的最初的胚源性妊娠信号，能够抗黄体溶解进而维持孕酮的分泌来维持 后续的妊娠过程，在妊娠识别和胚胎植入过程中发挥着重要的作用【l 卅，对它的 研究已经成为胚胎生物工程研究中的热点。研究者们希望通过对i f n t 的作用机 理的研究，来提高妊娠率和产仔率，减少流产发生。 1 1 n t 在妊娠识别中的作用机理 妊娠建立是复杂的生理过程，它包括妊娠识别( p r e g n a n c yr e c o g n i t i o n ) 和胚 胎植入( e m b r y oi m p l a n t a t i o n ) 。妊娠建立决定着妊娠的成功与否。在妊娠的早 期，孕体发出信号传递给母体，母体随即产生反应，以维持黄体的存在和促进孕 体的继续发育，由此母体和孕体建立密切信息联系的过程叫妊娠识别。在牛的妊 娠识别过程中，孕体分泌的i f n t 起决定性作用。 1 1 1 溶黄体机制 1 1 1 1 黄体溶解的内分泌机制 牛般是非季节性发情的自发排卵动物。在发情排卵后，母体会产生周期性 黄体( c y c l i cc l ) ，周期性黄体释放的孕酮提供了母体排卵后生殖系统的孕向发 展，为胚胎的发育和着床提供了生理环境。如果没有受孕，由子宫内膜和黄体产 生催产素( o t ) ，o t 进一步诱导溶黄体物前列腺素f 缸( p g f 2 。) 释放，在雌激 素( e 2 ) 的协同作用下，p g f 2 。引起周期性黄体的溶解。导致黄体分泌的孕酮降 低，从而解除对下丘脑和垂体的抑制5 1 。在母体下丘脑一垂体一性腺轴的调节下， 母牛开始进入下一个新的发情周期( 图1 1 ) 。 1 1 1 2 相关基因表达水平的调节 周期性黄体溶解是子宫内膜 和卵巢之间的自动周期性调节。 在子宫内膜腔上皮( e n d o m e t r i a l l u m i n a le p i t h e l i u m ，l e ) 和表层 管状腺上皮细胞( s u p e r f i c i a l d u c t a lg l a n d u l a re p i t h e l i u m ，g e ) 中溶黄体机制的发生过程需要孕 酮、e 2 和o t 的作用，这种作用 通过这些激素各自特异性受体基 因表达的上调或下调来产生。在 发情期，在成熟卵泡分泌的e 2 的 刺激下，子宫内膜雌激素受体q 亚基( e r n ) 、孕酮受体( p r ) 和催产素受体( o t r ) 表达逐渐 增加，而此时黄体尚未形成，使 得由黄体诱导产生的o t 无法生 成，因此没有p g f 2 a 的分泌。在 间情期的早期，由新生黄体产生 图1 - i 下丘脑一垂体一性腺轴调节 的孕酮量较少。孕酮能够引起l e 9 i 8 1 - 1c 。“们io f h y p o m a l ”j 。p i m i t a r y 。g o “a d a l 戤i 5 和g e 中花生四烯酸( 从) 的积累，a a 是p g f 加、前列腺素e 2 ( p g e 2 ) 合成 的原料，由此说明，在间情期的早期，p g f 2 。合成的准备工作已经开始，此时黄 体产生的少量o t 仍然不足以诱导p g f 2 。的产生。在间情期，黄体进一步发育， 孕酮和o t 水平均增加，通过p r 作用阻断了e r a 和o t r 在子宫内膜l e 和g e 中的表达。o t r 、e r a 表达的降低，o t 和e 2 的作用不能充分发挥，使p g f 2 。 溶解黄体的过程不能进行。为什么孕酮能够抑制e r a 基因复制的确切机制人们 尚未知道。孕酮对子宫的作用持续8 1 0 天后，子宫内膜l e 和g e 中p r 的表达 下调，p r 表达的下调可能包含了由孕酮增加引起的p r 基因转录下降。p r 下调 的机制还不清楚，但可能与环氧合酶一2 ( c o x 2 ) 的表达，p g f 2 的合成以及p g f 2 。 合成酶( p g f s ) 、p g f 受体( f p ) 、p g 转运蛋白( p g t ) 的合成有关。由于 2 p r 表达的下降，从而使得e 勋在1 3 天，o t r 在1 4 天时在子宫内膜l e 和g e 中的表达增加，使o t 的生理作用得到发挥。在o t 诱导下p g f 如分泌，发生溶 解黄体的作用陋1 0 1 。p r 的下降作为启动因素，最终导致黄体溶解，孕酮分泌的 停止使得母牛结束发情周期，在垂体促性腺激素的作用下进入到另一个新的发情 周期中( 图1 2 ) 。 ? 治 l - - 一神- r a ，烨1 ：、粤乙 1 jt e r e f m o e 。 一一d i o e ： 、， b 相关基因表达水平的调节 b ：同情期早期；c ：问情期后期 lo f e x p r e s s i o nl e v e lo f r e l a t e dg e n e s e a r l yd i o e s t r u m ；c ：t e r m i n a ld i 0 h 1 i i i l c 在牛的发情后期给以外源性的孕酮处理可以缩短其发情的间隔时间；用 r u 4 8 6 ( 一种p r 颉抗剂) 处理黄体期早期的绵羊，可以延长其发情的间隔时间。 这两个现象说明p r 转录水平决定着发情周期的长短。 在这个调节过程中，孕酮在发情周期中对子宫内膜溶黄体机制发生豹作用包 含相互矛盾的两个方面，即最初的抑制作用和随后的诱导作用，这个矛盾的产生 与p r 的表达降低直接相关。p r 表达下调的发生对溶黄体机制在子宫内膜的发 生起决定作用。什么机制引起p r 下调目前还不清楚。 1 1 2i f n f 与妊娠识别过程 母体妊娠识别的概念最早f l j r o g e r s h o r t 在1 9 6 9 年提出，它被定义为通过孕体 发出的信号使母体系统识别胎儿的存在并维持其黄体功能的生理过程。在妊娠建 立的过程中，大多数哺乳动物，都是由胚胎滋养层产生的激素通过直接或间接的 作用方式，来维持黄体的存在，进而维持孕酮的分泌来维持后续的妊娠过程。 m o o r 在1 9 6 6 年首次发现胚体的抗黄体溶解作用1 1 】。他向处于发情周期的绵羊子 宫内灌注妊娠第1 4 - - 1 6 天的羊滋养层匀浆液，可使黄体持续分泌孕酮达1 个多月， 而灌注第2 1 - 2 3 天的匀浆液则无此效果。早期曾把这种由胚胎滋养层产生的一类 抗黄体溶解的激素叫做滋养层蛋白1 ( t r o p h o b l a s tp r o t e i n 1 ，t p 1 ) 。后来通过对 t p 1 的研究发现，它与干扰素a 是同一类糖蛋白物质，将其命名为干扰素呵 ( i n t e r f e r o n - x ，i f n 吓) 。现在已知这是滋养外胚层分泌的i f n t 的作用。向处于 发情周期的绵羊、牛及山羊子宫内注射i f n - , r ，使其黄体溶解机制不能建立，从而 延长黄体寿命及发情周期间隔。在不同反刍动物中，i f n t 的抗黄体溶解作用可能 稍有差异，但其作用机制非常相似。总结十多年来对i f n 证妊娠建立与维持方面 的研究，可以发现，i f n t 通过直接或间接作用途径，来阻止子宫内膜p g f 2 a i r j 黄 体的溶解作用，是妊娠识别的主要内分泌作用机制。 1 1 3i f n t 基因的结构 反刍动物中，牛、绵羊、山羊的i f n - 1 ：分别被称为b l f n - 1 ：、o i f n - 1 ：和c l f n t 。 编码i f n - t 的基因定位于牛和山羊的染色体8 q 1 5 ，绵羊的2 p 1 5 ，江河型水牛的3 p 1 5 上【1 2 1 3 1 。1 9 8 7 年，有人从绵羊的e d n a 文库中克隆了o i f n t 的e d n a ，并对其序列 进行了鉴定。o l f n t 的m r n a 长度大约为1 k b 有一个5 8 5 b p 的开放阅读框( o r f ) 。 其肽链有1 9 5 个氨基酸并含有2 3 个氨基酸的信号肽【1 4 1 。以后的研究也都表明编码 i f n t 的基因共有9 7 2 b p ，具有5 9 5 b p 的o r f ，编码1 9 5 个氨基酸的蛋白前体，经过 加工切除2 3 个氨基酸的信号肽序列后，得n 1 7 2 个氨基酸的成熟蛋白质。牛具有生 物活性的b l f n - 1 ：是由1 7 2 个氨基酸组成的酸性蛋白质。它的前2 3 个氨基酸组成具 有高度保守性的信号肽序列f 1 5 6 1 ，在不同的反刍动物仅有个别差异，如b i f n 吨 与c l f n t 仅一个氨基酸的差异，与其他i 型干扰素相同。 目前认为b i f n t 基因没有内含子1 7 1 ，属一个多基因家族“8 9 1 。根据b i f n 吓 核苷酸序列差异进行系统发生分类，可将其分成3 类2 0 ，分别标记为t 1 、记、们， 在各类里面还有多种亚型，各型之间有个别碱基的差别。到目前为止，在 g e n e b a n k 中登录的b l f n - 1 ：全部或部分核苷酸序列共有二十多个。 4 1 1 4i f n t 的同源- 陛 哺乳动物干扰素分为i 型和i i 型，i 型干扰素包括q 、p 、t 和6 2 2 u 。i f n l 是在约3 6 0 0 万年前从i f n 进化而来的【1 7 1 8 ，2 2 ，2 3 1 ，并目_ i f n t 只存在于反刍类动物 中。i f n - | c 在进化关系上与i f n 最近，与i f n 吨次之。在氨基酸序列上，i f n 呵与 i f n d 、i f n a 、i f n b 之间的同源性分别为7 5 、5 0 、3 0 1 2 2 】；与i f n 吖( 属 型干扰素) 之间同源性较低。可见i f n - x 在氨基酸序列上与其他i 型干扰素有较 高的同源性，因此也具有抗炎症、抗病毒、抗增生和免疫调节等其他i 型干扰素 共有的特性【堋1 。 不同物种间，经过对西伯利亚山羊i f n 吖( s g i f n - f ) 的核齑酸序列分析， s g i f n t 的o r f 与c l f n - - r 、o l f n t 、b l f n t 的o r f 分别有9 5 、9 6 、9 1 的同源性。 由此可见，在不同反刍动物间干扰素有非常高的保守性【刎。 1 1 5i f n t 的表达及表达调控 i f n t 基因的表达特点与其他i 型干扰素不同。首先，i f n t 基因不能够被病 毒诱导而表达，仅在胚胎滋养层的单核细胞中表达，表达时问限定于囊胚孵化期 至胚胎附植于子宫内膜之前【1 8 】。一旦胚胎滋养层与子宫阜发生组织联系，i f n t 基因的表达就会终止。其次，这些基因的表达时间与母体妊娠识别时间非常吻合， 绵羊胚体滋养层在妊娠第8 - 2 1 天表达i f n 嘞牛在妊娠第1 3 - 2 8 天，即围植入期表 达i f n - x ，尤其是在1 5 1 7 天时达到最高峰。山羊胚体在妊娠第1 4 - - - 2 0 天表达i f n t 。 因此i f n 傲认为是反刍动物胚胎向母体发出的最初的胚源性妊娠信号【2 4 ，2 5 1 。 i f n t 基因的转录被增强子e s t - 2 和a p 1 调控，e s t - 2 、c f o s 、c - j u n 、粒细胞巨 噬细胞集落制激因子( a 出c s f ) 等可增强i f n - f 的表达。作用于e s t - 2 和a p - l 两 个增强子的调控物在很多组织中表达，但并未导致i f n t 的转录，这与i f n - t 基因 上游存在两个抑制控制元件有关( 图1 - 3 ) 。正是因为增强子和抑制元件的存在， 精确的控制着i f n t 的表达时间和表达量 2 6 , 2 7 1 。此外。胚胎性别也会影响i f n t 的 表达量。在牛受精后的第8 5 天到第9 5 天之间回收胚胎，体外培养2 4 h 和4 8 h 后发 现雌性胚胎的i f n - r 分泌量是雄性胚胎的两倍多，但把在第1 4 天后回收到的胚胎 进行体外培养4 5 h 和2 4 h ，i f n t 的分泌量在胚胎性别间没有差异。在体外受精和 体外培养牛的胚胎时，也发现雌性胚胎i f n t 分泌量是雄性胚胎的两倍，但这种 差异在第1 2 天消失。因此体内体外实验都证实胚胎的性别能影响i f n t 的分泌量， 但这种影响在胚胎发育到1 4 天左右时消失。性别影响i f n f 的表达量的可能机制 是，在x 染色体发生失活之前( 在胚胎发育的1 4 天左右，雌性个体中的一条x 染 色体发生失活) ，由于x 染色体的剂量效应，雌性胚胎的戊糖磷酸化途径的氧化 能力比雄性胚胎的强，从而间接地影响i f n t 的合成田2 9 1 。 图1 - 3i f n - , 转录水平的调节 f i g 1 - 3c o n t r o lo f t r a n s c r i p t i o nl e v e lo f i f n - tg e n e 1 1 ，6i f n t 的妊娠识别作用机制 i f n t 是由孕体滋养层在其附植前分泌的一种旁分泌因子。它与子宫内膜上 的受体结合后，抑制雌激素受体( e r ) 和孕酮受体( p r ) 基因的转录，使催产 素( o t ) 不能诱导溶黄体物前列腺素f 2 。( p g f 2 。) 的脉冲释放，从而建立和维 持一个适宜胎儿生长发育的子宫内环境 3 0 , 3 1 】。i f n t 是旁分泌因子，只对子宫起 作用而对黄体无直接作用1 3 2 1 。此外，口刚诱导子宫粘膜细胞分泌一种泛素交叉 反应蛋白( u c r p ) 。【3 3 l ，由于其出现时间与i f n 叫相关，且其特殊的结构和功能 对妊娠识别也有一定的作用。i f n - - * 还有免疫调节的作用，使孕体在附植前不被 免疫系统排斥而引发流产。i f n - - - t 诱导子宫粘膜上皮细胞产生粒细胞巨噬细胞集 落制激因子( g m c s f ) ，这个细胞因子对孕体的存活和生长也有重要作用9 4 1 。 由此可见，i f n 呵在妊娠识别过程中，在多个层次上产生作用。 1 1 6 1 i e n - l ：与p g 的调节关系 前列腺素( p g ) 的合成从花生四烯酸( 从) 开始，要经历p g h 2 、p g l 2 两 个中间产物，其中第一步合成反应由限速酶环氧合酶2 ( c o x 2 ) 调节，第二步 6 合成反应由前列环素合成酶( p g i s ) 调节，p g i s 有p g e 2 合成酶( p g e s ) 和p g f 2 。 合成酶( p g f s ) 两种，分别用于调节p g e 2 和p g f 2 。的合成。p g 要发生生理作 用，与p g e 受体( e p ) 、p g f 受体( f p ) 和p g 转运蛋白( p g t ) 的表达密切 相关。i f n - t 通过直接或间接的方式，下调p g f 2 0 并上调p g e 2 ，实现妊娠识别过 程。 1 1 6 1 1i f n t 对e r 、o t r 和p r 的调节作用 孕酮在黄体期早期到中期阻滞子宫内膜催产素受体( o t r ) 的合成，而雌激 素( e 2 ) 可增加o t r 基因在子宫内膜上皮中的表达。此外，o t 也可以调控其自 身受体的表达，但机制不详。在反刍动物的妊娠早期，胚体分泌的i f n 吨以旁分 泌的方式作用于子宫内膜腔上皮及表面腺上皮，抑制e r 和o t r 的表达。向发 情周期第l l 1 4 天的绵羊子宫内连续注射绵羊i f n - x ，于第1 5 天检测时发现， 实验组子宫内膜的e r m r n a 水平及e r 和o t r 基因转录率均比对照组低两倍。 检测妊娠第1 5 天及发情周期第1 5 天的绵羊子宫内膜e rm r n a 水平及e r 和 o t r 基因转录率，也可发现妊娠组比发情周期组低两倍。这些结果说明，i f n t 能抑制e r 及o t r 的基因转录0 5 - 3 7 。 图1 - 4i f n - t 通过j a k - s t a t 途径诱导i r f 的表达 f i g 1 - 4e x p r e s s i o no f i r fw i t hi f n zi n d u c t i o nb yj a k - s t a tp a t h i f n - t 对e r 的调节主要通过干扰素调控因子2 ( i r f 2 ) 实现。在妊娠羊或 注射i f n - r 的发情周期的羊中。子宫内膜腔上皮及表面腺上皮相继瞬时表达干扰 素调控因子i 及干扰素调控因子2 ( i r f 1 及i r f 2 ) ，而在正常发情周期羊中 无表达。这些结果表明，在妊娠羊中，i f n 呵作用于子宫内膜腔上皮及表面腺上皮 上的i 型干扰素受体，激活j a k s t a t 信号转导途径诱导i r f 一1 及i r f 一2 基因的 相继表达( 图1 - 4 ) 。i r f 1 及i r f 2 基因的表达在时间上与e r 及o t r 的减少 相一致。由此推测绵羊的e r 基因包含i f n t 反应元件，该元件结合i f n - t 诱导的 转录因子( 如i r f 2 ) 。初步研究表明，i f n t 诱导的转录调控因子可以与e r a 启动子的调控元件结合，从而阻止e r a 的表达 3 s 4 0 j ( 图1 5 ) 。 - 稀一昧i o v l r ”脚 p r 锕翥一f f 二 = f o l d i n c r e a s e 粕7 7 - 卜- 卜- 一 2 f f 7 1 - 1 0 4 8 0 f r a - t k - l i j c _ + 一一一一一一一一一匿 西o 1 簟 灞册崽昭由l 硼u l 临_ 一一一一一一一如一一匦【互dt 二兰d j , t 1 皤0 1 9 4 9 瞳嘞f n 障叫卜一_ 一一一6 一嘲一_ 暖】c 曰 j 妻。毒 一洲柏2 嚏r a - t k 4 , u c 卜一一一一一一屯目j d1 4 0 , 8 椰阱9o r = r a t i r , 4 j u c- - - 4 - 一一一- 砸c 正o - 一船 4 鸥 弱。矾洲i 嵋 一一一诬虻蚕d 1 2 妻0 1 汀缸幢o 日b m i i e - 一一砸莨酉d ， 兰o - 1 4 1 7 7 c e p a i r i ； e - t 9 4 u c 侗匾l 面dt 0 i o , 4 tk4uc碰c谣01 o 口1 图1 5 r f 1 、i r f 一2 对e r a 基因表达的抑制机制和抑制能力 i n h l b n o n w i r f - 2 舶主z 4 晤翟 髓毫 住 1 4 - 黼曼 住 留土。 o f i g 1 5i n h i b i t o r ym e c h a n i s ma n di n h i b i t o r yc a p a c i t yo f l r f - i a n di r f 。2t oe r ag e n te x p r e s s i o n 在体外实验中证明，母体妊娠识别过程中阻止e r 基因在内膜上皮中的转录， 会抑制o t r 的表达。证明o t r 数量减少是由于e r 减少所引起的。o t r 的基因 结构复杂，上面存在一个干扰素应答元件( i r e ) 、三个雌激素受体元件( e r e ) 、 一个e r e 类似元件和一个c a m p 连接蛋白应答元件( c r e ) ，同时还有多个s t a t 、 g a s 转录因子的结合位点 4 1 , 4 2 。o t r 表达调节的机制非常复杂，是雌激素受体， 还是雌激素和其受体复合物调