（动物营养与饲料科学专业论文）设计抗菌肽在大肠杆菌中的表达及其活性研究.pdf

摘要 摘要 抗菌肽是对多种微生物、病毒、原虫甚至癌细胞都有明显抑杀作用的小分子多 肽，广泛存在于生物体内。抗菌肽的抗菌机理与通过阻断细菌生物大分子合成的抗生 素抑菌机理完全不同，细菌不易产生耐药性，因此抗菌肽非常有望成为替代抗生素的 新型抗菌药物。天蚕素是现有昆虫抗菌肽中最大的一族，具有抗菌谱广、毒副作用小、 结构简单等优点，但是目前天蚕素的抑菌机理、结构与功能关系还不十分明确，这使 的通过分子改造或全新设计生产，表达高活性抗菌肽的研究受到限制。本课题在前期 研究天蚕索保守序列的基础上设计了四条抗菌肽a m p a 倡c d 。本论文将通过基因 工程技术在大肠杆菌中表达四种抗菌肽，研究各抗菌肽的抑菌活性，并且利用生物信 息学方法初步分析抗菌肽的结构与抑菌活性关系，为今后设计、表达活性更高的抗菌 肽提供技术资料。 、 脚，a b c d 全基因的合成及其克隆。根据大肠杆菌表达偏好密码子，将a m p a ，b c d 多肽序列反翻译为核酸序列；采用分段化学合成的方法合成全基因序列的5 个d n a 片段；利用p c r 反应将短的d n a 片段连接起来，并引入限制性内切酶位点 砌月门铂卸n 以玑四条全基因和载体p u c l 9 分别经双酶切及连接反应，得到重组质 粒p u c l 9 a m p 刖b ，c 仍。重组质粒转化“感受态”大肠杆菌j m l 0 9 中，构建基i 园工 程菌j m l 0 9 刖b ，c d 。测序分析表明四条抗菌肽全基因已经按照正确的阅读框插入 到载体中。 抗菌肽的诱导表达及溴化氰切割多肽。i p t g 诱导工程菌并利用s d s p a g e 凝胶 电泳鉴定表达产物，结果表明表达产物以包涵体的形成存在。正交实验优化发酵条件 后，大量培养工程菌。收集并破碎菌体，待菌体破碎完全后离心法分离得到包涵体。 洗涤包涵体，除去附着的细菌膜蛋白等杂质。用6 m 盐酸胍，2 m 盐酸溶解包涵体，并 加入溴化氰裂解表达产物，除去其n 端的融合蛋白及部分信号肽。透析除去小分子 。后，冷冻干燥。 利用稀释药敏实验和抑菌圈法测定设计抗菌肽抑菌活性。实验结果发现a m p a 没有抑菌活性：a m 口b 厂c 巾均表现出广谱的抗菌活性，它们的最小抑菌浓度( m t c ) 约为9 hm ，其中a m p c 对革兰氏阴性菌的抑菌效果最强，a m p d 抗菌广谱性较 a d 口b c 差。 利用生物信息学对设计抗菌肽二级结构、两亲性、电场分布、跨膜区域进行预测。 对四种抗菌肽的预测和抑菌活性的关系初步分析表明：a m p 山7 b c 仍二级结构都以 n 。螺旋结构为主，a m p c 正离子性和两亲性较强，因此表现较高抑菌活性。 关键词：抗菌肽基因工程抗菌活性结构预测 江南大学硕士学位论文 a b s t r a c t m m m i c r o b i a lp e p t i d e sa r em i c r o m o l e c u l a rp 0 1 y p e p t i d e s 砌c hh a v eb r o a d s p e c 衄皿 枷b i o s i sa i l dg e n e r a l l yr e s i d ei n b i o s y s t e m 1 1 1 em e c h a l l i s i l l so fa n 硒a c t e 工i a ip e p t i d e sa r e t o “l yd i f r e r e mf 硒ma n t i b i o t i c sw h j c hi i l l l i b i ts y n t h e s i so f m i c r o b e sb i o m a c r 0 l o l e c u l e ，s o a n t i m i c r o b i a lp 印t i d em a y b ean e w 卸俩c r o b i a la g e n t c e c r o p i n si st h eb i g g e s t 胁i l yo f a i l t i b a c t e r i a lp e p t i d e s i th 硒m a l l y9 0 0 dq u a i i 斑ss u c ha sw i d e 锄t i i l l i c r o b i 甜s p e c 仃u m ，n o s i d ee 腑c t so n 舡l i m a l so rp i a n t s ，a n ds i m p i es 仉l c t u i h lp r e s c n tc e c r o p i n s a n t i b i o s i s m e c h a 血s ma n ds t m c t u r e f h n c d o nr e i a 廿o n s h j 口k n o wl e s s 也a tr e s t f i c tt l er e s e a f c ho f 撕g h a c t i v 酊a n t i i l l i c 南b i a lp e p t i d eb yr e f b n l l i n gs 缸1 l c t u r ea 1 1 dr e n e wd e s i g n p r o p h a s eo ft l l i s w o r kh a dd c s i g t lf o u ra n t i b a c 矧a lp e p t i d e sa m p 一纠b c dl h a t b a s e do nt h ec e c r o p i n s c o n s e r v e ds e q u e n c e i nt t l i st h e s i s ，a m p a 倡c 仍a r ec x p r e s s e di n 脚厅e r 耙矗缸c d 疗b y g e n ee n g i n e 翻n gt e c h n i q u e ，锄t i i n i c r o b i a la c d 、，i 够o fe x p r e s s i o np r o d u c t i o na r ea s s a y e d ， 6 1 1 a l l ym es 仃u c t l 聃- 缸1 c t i o nr e l a t i o n s h i po fa m p 一_ b ，c da r ei 1 1 i d a 【l y s 恤d i e db y b i o i l l f o n n a t i c s t h e 、v o r k 嘶l lp r o v i d et e c h l l i c a ld a 芏af o rd e s i g n8 n de x p r e s sh i g l l e ra 曲v i t y a t l t i b a c 锄a 1p e p d d ei i lf h t u r c e n g i n e e n g b a c t e r i aw a sc o l l s 眦t e d f o u r p o l y p e p t i d e s o fi n t e r e s tw e r e r e v e r s e t r 姐s l a t e d 蛔t od n as e a u e n c eb a s e do n 上强c 向盯耙矗妇z fb i a sc o d o n s a ta i mo f g e t t i n gt 1 1 ea 一a 倡c ，d 觚lg e l l e ，s e v e n5 0 7 0 b pd n a m o d e l b a s e dp r i m e r 舳g m e l l t s 肺r es y n 1 e s i z e db yc h e 面c a lm e 吐1 0 d p c ra n l p l m c a t i o nr c s p e c t i v e l yi i g a t e 矗鹋m 朋t s a n ds 谢t c hi nr e s 订i c t i o ne n z y m es i t e 幻r ，肺阿d z 矽b yd e s i 印p 血1 e la f t e rr e a c t i o no f d i g e s t i o n 姐dl i g a t i o n ，m ei 1 1 t e r e s tg e n e 、v a sc l o n c di n t o v e c t o rp u c l 9 r e c o m b i n a n t p l a s m i dp u c a m p - a b c dw a s 廿a n s f b m e di m oc o m p e t e n tc e l lu s i n gc a l c i 啪c h l o r i d e i tw a sc o 划j 彻e da tl a s tt h a tg e n eo fi n t e r e 5 th a db e e ns u c c e s s f h i l yd o n e dj n t op u c l 9 t 1 1 r o 睁d n a s e q u e n c i n g w js u c c e s s 铷l y g e t e n g i n e e r i n g b a 曲面aj 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e t e c t e d t h er e s u l ts h o w e d 也a ta m p ai s i n a c t i v i t y ，a 啤- b c ，da r ea g a i n s te ，c p ，把 如c d ，fa r c c 2 5 9 2 2 ，s 甜加。门e 妇卸矗f ， b 口f 棚淞s “6 r 玎西，母掣吻拈c d c c 螂鲫阳材s m i j l i m 啪i n l l i b i t o r yc o n c e n 廿a d o n ( m i c ) i s i i 摘要 a b o u t9 p m a m p cs d n g l yr e s i s t a mg m m n e g a t i v eb a c t e r i u m ，a m p d sa 1 1 t i b a c t e r i a l s p e c 觚1 i i li sl e s st h a na m p b c u t i l i z i n gb i o i i l f o n a t i c sw ep r e d i c t e ds e c o l l d a r ys t m c t i l r e ，a m p h i p a t h i cp r o p e n y ，e l e c t r i c f i e l da i l dt r 撇e m b r a n ed o m a i no fm ed e s i g np e p t i d e s t m c t u r e f u l l c t i o nr e l a t i o n s h i pw a s a i l a l y z e dw i mr e s u l to fa c t i v i t ye x p 舐m e n ta n dp r e d i c t i o n w ef o 吼dt | l a t 血es e c o n d a r y s t n 】c t u r eo fa m p - 气屉c dm i i l i yi s 小h e l i x ；c a t i o np m p e 啊a n da i i l p l 卸a _ l i cp r o p e 啊o f a m p ca r eb e n e r 也a i lo 幽e r s ，s oi t sa n t i b a c t e f i a la c t i v i t yi ss 昀n g e r k e y w o r d s ：、a m i r n i c r o b i a lp c p t i d e ，g e n ee n g i n e e r i n g ，a n t i b a c t c r i a la c t i v i t y ，s t 工1 i c t u r e p r e d i c t i o n i i i 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地 方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含 本人为获得江南大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示谢意。 签名：塾置璺日期“年多月，日 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规 定：江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和 磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编 入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、 汇编学位论文，并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签名：j 龇导师签名： 日期：a 矿 第一章绪论 第一章绪论 自1 9 2 9 年f l e m i n g 发现青霉素之后，各种天然、合成、半合成的抗生素被广泛 应用于抵抗各种微生物的感染。随着这些抗生素的广泛使用，人们发现了多种产生耐 药性的菌株，并且其数量还在逐年增加。耐药性菌株的出现使的抗感染治疗再度陷入 危机。 细菌对抗菌药物的耐受性机制主要有四种：一、细菌产生一种或多种水解酶或钝 化酶来水解或修饰进入细菌胞内的抗生素，使之失去生物活性；二、抗生素作用的靶 位( 如核糖体和核蛋白) 由于发生突变或被细菌产生的某种酶修饰而使抗菌药物无法 发挥作用，以及抗生素作用的靶酶( 如青霉素结合蛋白和d n a 促旋酶) 的结构发生 改变使之与抗生素的亲和力下降；三、由于细菌细胞膜渗透性的改变或其他有关特性 的改变，如细菌菌膜的形成而使抗菌药物无法进入胞内。四、细菌具有一种依赖于能 量的主动转运机制，即它能将已经进入细胞内的药物泵至胞外i l 】。 细菌耐药性的问题推动了人们寻求新型抗茵药物的决心。抗菌肽由于具有如下一 些特性，非常有望成为替代抗生素的药物：一、多数抗菌肽具有广谱抗菌作用，它 们不仅能对原核微生物、低等真核生物有抗性而且还能作用于少数原核动物及病毒； 二、对人体及其它动物、植物无( 或很小) 生理损害作用：三、大多数抗菌肽的抑菌 机制不同于抗生素，不是通过作用于细菌某些特定位点来阻断其生物大分子的合成， 因此细菌不易产生耐药性和生理抵制作用【2 j 。 1 1 抗菌肽研究进展 抗菌肽( a m i b a c t e r i a lp e p t i d e ) 是一种广泛存在于生物体内的免疫多肽。最早由 瑞典科学家b o m a n 在惜古比天蚕( h y a t o p h o r ac e c r o p i a ) 蛹中发现。由于其具有抗菌活性 高、种类多、抗菌谱广、不易引起耐药性等特点，近年来在各个研究领域都受到广泛 关注。 早期的研究表明抗菌肽主要对细菌有高效广谱抗性，因此将其命名为抗细菌肽 ( a n t i b a c t e r i a lp e p t i d e ) ，随着抗菌肽在各个领域的广泛研究，人们在植物、动物、甚 至人体内都发现了抗菌肽，这些抗菌肽有的还兼有抗真菌、抑病毒、抑原虫和癌细胞 的活性，据此学术界更倾向于称其为抗微生物肽( a n t i m i c r o b i a lp e p t i d e ，a m p ) 3 】。抗菌 肽在自然界如此广泛的存在并非偶然，在漫长的进化过程中生物体将其保留下来，与 它自身特性密切相关。抗菌肽分子相对较小，当病原菌入侵时，它可以快速合成且易 于大量储存，与特异性的免疫反应相比可以更加快速的对病原菌作出反应，正是这种 特性使它成为生物机体内不可或缺的重要成分【4 】。到目前为止被鉴定出的抗菌肽大约 有8 0 0 多种，并且每年都以很高的速度增长。最新的信息可以在抗菌肽数据库 ( h t t p ：w n m b b c m u n i t s i t 卜t o s s i ) 中查询【卦。 江南大学硕士学位论文 1 1 1 抗菌肽的分类 。 目前发现的抗菌肽根据分子结构和功能特征主要分为4 大类，分别是： ( 1 ) 天蚕素族( c e c m p i n s ) ：不含半胱氨酸，不形成分子内二硫键，n 末端区域富 含亲水性碱性氨基酸残基，如赖氨酸和精氨酸；c 末端含较多的疏水性氨基酸残基。 分子的两端各形成一个两亲性螺旋，两个a 螺旋之间有甘氨酸和脯氨酸形成的铰链 区。此类抗菌肽广泛存在于昆虫体内，如家蚕、柞蚕、果蝇、麻蝇、伊蚊等。天蚕素 类抗菌肽对革兰阴性菌、革兰阳性茵、真菌均具有杀伤力。爪蟾抗菌肽( m a g a i n i n s ) 也 是一类具有两亲性n 一螺旋的抗菌肽，存在于蛀的皮肤和胃中1 6 j 。 ( 2 ) 环状抗菌肽族：该类抗菌肽的所有种类在c 末端均含有分子内二硫键，在c 末端形成一个环链结构，而n 末端为线状结构。这类抗菌肽有较强抗菌活性，其中研 究最多的是防卫素( d e f e n s i l l s ) 。 ( 3 ) 富含p r o 或a r g 的抗菌肽( p r o l i n e r i c h o r a r g i i l i l l e r i c h p e p t i d e s ) ：这类抗菌 肽一般含有1 5 3 4 氨基酸残基，可分为两类：一类为不含取代基结构，例如蜜蜂肽 ( a p i d a e c i n ) 、碧蝽金属肽( m e “i n k o w i l l ) 等；另一类为含o 一糖基化位点结构，这些 位点对它们的生物学活性是必须，而且都有一个与t h r 残基相连的n 一乙酰半乳胺一 半乳糖，例如果蝇肽 7 o 富含a r g 的抗菌肽分子中的p r p 及p r p p 结构对抗菌活性有 重要意义嘲。 ( 4 ) 富含g l y 抗菌肽( g l y c i n e r i c hp e p t i d e s ) ：这类抗菌肽首先由b o m a n 等1 9 8 1 年从惜古比天蚕蛾中发现的，命名为天蚕蛾抗菌肽( a t t a t i n ) 。近几年从天蝇、麻蝇中 也发现一些分子量为8 3 0 k d 的阳离子肽，其级结构中富含g l y ，不形成分子内二 硫键，氨基酸残基上也不具有修饰基团。推测此类抗菌肽中含量很高的g l y 对提高肽 链的弹性及广谱抗菌等可能起重要作用( 9 】。此类抗菌肽多数抑制革兰氏阴性细菌。 1 1 2 抗菌肽抑菌机制研究进展 抗菌肽抑菌机制的研究一直是抗菌肽研究的热点。由于抗菌肽种类较多，几乎每 种抗菌肽都有其独特的抗菌机制，所以目前尚没有一个涵盖所有抗菌肽作用机理的理 论。近2 0 年来的研究主要着眼于抗菌肽对细菌细胞膜的作用，但是随着研究的深入， 科学家发现并不是所有抗菌肽都是通过作用于细胞膜来发挥其抑菌作用的。下面根据 近期国内外对抗菌肽作用机制的研究，将抑菌机制归纳为以下几种类型： ( 1 ) 膜结合型抗菌肽抗菌机制【1 0 - 1 2 】：细菌细胞壁表面含有镁离子，抗菌肽取代 这些镁离子后与负电性的脂多糖紧紧结合，或者中和细胞壁上某一区域的电荷，导致 细胞壁结构变形，抗菌肽就可以穿过细胞壁；下一步，抗菌肽通过静电作用结合到细 胞膜表面。抗菌肽作用于细胞膜的机制主要有以下几种假说：a 孔洞学说( t h e b a r r e l s t a v em o d e l ) ； b 地毯模式( 山ec a r p e tm o d e l ) ；c 离子通道学说( t 1 1 ea g 掣e g a t e c h a n n e lm o d e l v l3 1 。 第_ 章绪论 图卜1 抗菌肽穿孔模型和地毯模型示意图 f i g l lb a r r e i s t a v em o d e la n dc a r p e tm o d e io fa n t i m i c r o b i a ip e p t i d ep i o t “穿孔模型”是c r u c i a j l i 等( 1 9 9 2 1 根据对天蚕素和蟾素抗菌机理的研究提出的， 具体内容是：抗菌肽作用于负电性的细菌膜磷脂头部，然后疏水性的c 末端插入膜 中，两亲性的a 螺旋置留于膜界面的位置。由于大量抗菌肽分子与细胞膜结合，使 得膜外正电荷增多，膜两侧电位升高，超过闽值时导致膜去极化，进而两亲性的。 螺旋也插入到膜中，在质膜上形成孔洞，改变细胞内外渗透压及抑制细胞呼吸，最后 导致细胞死亡。“地毯方式”是b r e y & h u l t f l l a 噍等( 1 9 9 8 ) 采用分光荧光分析、固相 核磁共振波谱学和衰减反射傅立叶变换红外光谱等手段，对抗菌肽渗透进入质膜的方 式和抗菌肽单体在质膜表面排列方式进行深入研究后提出的作用机理，其内容是：抗 菌肽利用静电力聚集覆盖在膜表面，然后抗菌肽分子发生旋转，引起疏水性残基改变 方向而趋于质膜疏水性核心，最后破坏质膜双磷脂层中脂质层，导致内容物外泄，细菌 死亡”】。晟近的研究发现，有些膜结合抗菌肽并不是通过在膜上形成i l 洞而导致细 胞死亡，这些抗菌肽是直接进入到细胞内部，然后通过抑制靶细胞d n a 、r n a 、 蛋白质的合成而致细胞死亡。 ( 2 ) 非膜结合型抗菌肽抗菌机制陋1 7 】。这类抗菌肽有些是通过复杂的机制抑制靶细 胞壁组分的合成，导致细菌不能维持正常形态，生长受阻，如：s a r c o t o x i n si i 。有一 些是通过抑制细胞呼吸，达到杀菌目的，如：n l a j l a t i n 。还有一些是通过抑制细胞外 膜蛋白的合成，导致细胞死亡，如：a t t a c i n 。 ( 3 ) 作用于宿主细胞，激活机体免疫功能 1 8 】。这些抗菌肽往往具有抗菌和促进免疫 的双重功能，其代谢产物为内啡肽和强啡肽等脑啡肽类似物，通过血液循环进入大脑 起镇痛作用。 1 2 天蚕素类抗茵肽 天蚕素( c e c m p i n ) 是最早发现的抗菌肽，它是由瑞典科学家b o m a n 等从惜古比天 蚕( h y a t o p h o r ac e c r 叩i a ) 蛹中诱导分离出来的。随着研究的深入，人们又陆续发现 江南大学硕士学位论文 c e c r o 口血a 、b 、c 、d 等亚型，并相继在其他昆虫、哺乳动物、两栖动物以及植物中 分离到了c e c m p i n 类似物。目前从蛋白数据库s w i s s p r o t 可以搜索到的天蚕素类 抗菌肽为5 8 种。 天蚕素又叫杀菌肽，是目前研究较多的一类抗菌肽，它由3 1 3 9 个氨基酸残基 组成，分子量约4 k d 左右，线性多肽，p i8 2 9 6 ，对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性 菌均有较强的抗菌活性，且对革兰氏阴性菌活性更强 1 9 】。在抗菌浓度下对真核细胞 无溶胞作用。天蚕素具有明显的结构特征：( 1 ) 结构较为简单，不存在分子内二硫键， 侧链不被糖基化。( 2 ) 肽链n 端区域富含亲水碱性氨基酸残基，如赖氨酸和精氨酸。 ( 3 ) 肽链的c 末端含较多疏水性氨基酸残基。( 4 ) 分子的两端各形成一个两亲性a 螺旋结构，两端螺旋结构间存在一段由脯氨酸( p m ) 和甘氨酸( g i y ) 组成的铰链区 【2 0 1 1 2 1 天蚕素抗菌肽结构与功能关系 天蚕素抗菌肽是目前发现的最大的抗菌肽家族之一。对于来自不同物种的天蚕 素，其结构存在很多相似之处。m e r r i f i e l d 通过化学方法合成许多c e c r o p i n s 的类似物， 然后用不同g + 和g 一菌测定活性，结果表明c e c r o p i n s 活性很大程度上依赖其特异性 的结构，如：( 1 ) n 端富含亲水性的氨基酸残基，特别是碱性氨基酸如a r g ( 精氨酸) 和 l y s ( 赖氨酸) 。由于抗菌肽中几乎含有等量的极性和非极性的氨基酸残基以及足够的 碱性氨基酸残基，使的多肽在中性时具有净正电荷，这将有利于天蚕素吸附到带负电 的细菌膜上【2 “。( 2 ) c 末端含有较多的疏水性氨基酸残基，并且都被酰胺化。疏水性 的尾部有利于天蚕素插入到细菌膜的双层脂质膜中，而c 端的酰胺化则对抗菌肽保 持广谱抗性有重要作用i 。( 3 ) 分子两端各形成一个两亲性。一螺旋，两个螺旋之间 由g l y 和p r o 形成铰链区。两亲的n 螺旋是破坏、裂解细菌的主要结构，中间铰链区 可以增加肽链的弹性。 1 2 2 夭蚕素抗菌肽分子设计 抗菌肽分子设计( p e p t i d em o l e c l l l a rd e s i 趴) 是基于抗菌肽结构与功能关系，通过 一系列生物信息学方法对天然抗菌肽的定向改造或全新设计，并希望以此来提高抗菌 肽的活性并最大程度降低其毒性。天蚕素类抗菌肽由于种类最多、结构简单、抗菌 谱广等特性，成为当前抗菌肽分子设计研究热点。 c e c r o p i n s 结构功能关系的研究表明，影响其抗菌活性和特异性的物理化学因素 至少有7 个，即：大小、序列、电荷、螺旋程度、疏水性、两亲性、亲疏水面的夹角 “。c e c r o p i n s 分子设计策略可归纳为以下几类：( 1 ) 用天然模板进行序列修饰合成 类似物。主要包括以下内容：增加，删除，或替代1 个或多个肽链上残基；截取肽 链n 端或c 端部分序列，连接不同来源的抗菌肽片断组成杂合肽等。如：s h 洫等【“1 将c e c r o p i n a 的n 端8 个残基作头，m a g a n2 的n 端1 2 个残基作尾，合成得到 4 第一章绪论 了杂合链c e m a ，发现其表现出很强的抗细菌活性，且没有溶血性。 ( 2 ) 以抗菌肽结构功能关系为依据，应用组合化学库的方法，有选择性的模拟合成 一系列类似物，这些类似物主要包括：一个或多个序列位置上的氨基酸残基突变，肽 链缩短，c 末端酰胺化，或由两种天然抗菌肽形成的杂合肽等【2 5 j 。如：b l o n d e f l e 等 。州通过统计分析，采用在c e c r o p i l l s 结构中出现频率较大，对结构贡献重要的7 种氨 基酸( l v s 、l e u 、v a l 、p h e 、s e r 、g h 和p m ) 作为原料，化学合成了各种组合 的类似物，从中筛选出k l s 2 ，活性实验表明k l s 2 对细菌具有广谱抗性，且没有溶 血性。 ( 3 ) 通过比较己知结构的抗菌肽序列，提出序列模型，使之具有合适的肽链长度、 正电荷及两亲性的螺旋，则可能获得活性更高，抗菌谱更广的抗菌肽口“。如：t o s s i 等 “”收集了1 5 0 多条不同的生物来源的两亲a 一螺旋抗菌肽，将其n 端2 0 个氨基酸残 基根据不同类型( 电性、极性、螺旋稳定性等) 进行统计，得出了序列模板：9 1 1 1 1 p + h x p x h + p l l l l + x b h x h ，t i o z z o 等1 2 9 】以该序列模板为基础，设计出新型肽p g y a ，同时 参考昆虫和两栖动物中抗菌肽的特征，设计出类似物p g a a 。通过抑菌实验发现p g y a 对g 一和g + 细菌均有抗性，而p g a a 则表现对真菌假丝酵母有抗性。 随着生物信息学的发展，互联网和计算机软件的应用大大加快了抗菌肽设计速 度，提高了设计的科学性和有效性。目前，抗菌肽分子设计已经成为抗菌肽研究的主 要方法之【3 0 】。 1 2 3 天蚕素基因工程研究 天然抗菌肽提取由于受到来源和分离技术的限制很难满足科研和生产的需要。基 因工程方法生产抗菌肽不受来源限制，成本低，表达产物易于分离纯化，是抗菌肽大 量生产的理想途径。但是利用基因工程生产抗菌肽还必须解决以下问题：( 1 ) 由于抗 菌肽本身对微生物有较强的损伤作用，因此利用基因工程直接表达时可能会对宿主菌 产生较大损伤。( 2 ) 抗菌肽分子一般都很小，分离纯化较为困难。当前利用基因工程 生产抗菌肽时，大多采用融合表达的方式，即在其n 端或c 端添加一段融合肽或蛋白。 这段融合蛋白不但可以减小抗菌肽对宿主菌的损伤，而且如果融合端含有h i s t a g 或 g s t t a o 等标记，通过亲和层析方法便可较为容易的分离到表达产物。目前，基因工 程生产抗菌肽在真核和原核生物都有成功的报道，如：a 且d e r s o l l s 等( 1 9 9 1 ) 将c e c r o p i n a 与葡萄球菌蛋白融合在一起，插入到a c n p v 多角体启动子下游的t p v 信号肽后，在重 组感染的细胞中成功表达川。叶玉坤等( 1 9 9 1 ) 将c e c r o d i n d 基因转化于啤酒酵母 ( s a c c h ar o my c e sc e r e v i s i a e ) 中表达【3 2 】。j a y n e s ( 1 9 8 9 ) 将修饰的c e c r o p i l l b 基因以融合 表达的方式在大肠杆菌中表达l j “。 1 3 课题背景及研究内容 江南大学硕士学位论文 1 3 1 课题背景： 二 2 0 0 3 年教研室李启辉硕士等利用序列检索系统( s r s ) 在蛋白数据库 s s s p r o t 检索到6 2 种天蚕素抗菌肽。按照来源不同，将检索到的6 2 种天蚕素抗 菌肽分为1 1 组。应用i b m 生物信息学服务器上的模式发现( p a 钍e md i s c o v e r y ) 工具 将抗菌肽序列进行比对，找出其中保守序列。见图1 1 表1 1 序列比对后的保守序列 t h b 1 1c o n c e n s u ss e q u e c e sv i am u l t i p l es e q u n c e sa l i g n m e n t 将保守序列进行组合，构建组合肽库。肽链组合的原则是：按照保守序列在原序 列中的位置进行拼接，比如某段保守序列在原抗菌肽中的位置为a a 2 1 一a a 2 4 ，那么 在利用该片段组合多肽时也将其放在a a 2 l a a 2 4 附近。根据保守序列组合一共得到 5 7 条不同的多肽序列。利用生物信息学对组合肽库中的5 7 条组合肽进行物化特性、 静电场分布、二级结构等分析，筛选出满足以下条件的抗菌肽：1 具有良好的结构稳 定性，在大肠杆菌中半衰期大于1 0 小时；2a 一嫘旋含量大于5 0 i3 具备一定的正电 场分布；4 至少具有两段跨膜序列；5 对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌致死浓度低于2 5 “m 。 筛选条件的依据为：1 多肽稳定性越高其构像就越不易被破坏，活性也就越稳定；2 通过对天蚕素二级结构含量的统计分析结果及文献【3 4 3 5 1 表明：叶螺旋含量大于5 0 是很多抗菌肽的一个重要特征；3 正电场的存在是抗菌肽穿膜的动力，大多抗菌肽都 是阳离子肽；4 选择两段跨膜序列可以在一个较大范围内分析发现的保守序列，利于 以后进步的药物筛选；5 一般情况下，天蚕素对g + 和g 一菌都有抑制( 杀死) 作用， 大肠杆菌和枯草芽孢杆菌分别是g 一和g + 菌的代表菌，因此本实验选择这两种菌作为 设计肽的活性检测的一个重要参考标准，并且依据抗菌肽数据库搜索发现 ( h 如；丛垦p s ：幽堕：d 型卫堑旦：n h e ) ，大多天蚕素对两种菌的致死浓度为2 5 “m 左右， 因此这个值是一个较理想的参考指标。 第一章绪论 通过以上分析筛选得到了四条性质较优的组合多肽，分别命名为a m p - a ，、 a m p b l 、a m p c l 和a m p d i 。 设计肽 组合肽氨基酸序列 m v n f s r i l f m k y f v v u w l a l i l a i g i k l ( i g k k l e g v g k r 、，a v i s a a b v a a m p a 1 【g q a a a l a m v n f s r i l f m k y f v v u n ，a g l ( i a a i g i k l ( i g k k l e g v g k r 、佳v i s d s h a k a m p b r l v g q a a a l a m v n f s r i l f m k y f v v i ：v v g a a i g l k g k k l e g v g k r v a v i s a a n n ，a a m p c t 【g q a 从l a m v n f s r i l f m k y v u n ，l a l i l a i g i k i ( i g k k l e g v g k r 、，a v i s d s h a k a m p d - r l v g o a a a l a 1 3 2 课题研究内容： 本课题对以天蚕素为基础的设计抗菌肽进行了以下几方面的研究： 一、将设计抗菌肽根据大肠杆菌表达偏好密码子反翻译为核酸序列。对核酸序列进行 片段化设计，将设计抗菌肽全基因分别分成5 条5 0 7 0 b p 两两互补的d n a 片段， 化学合成。 二、利用多步p c r 合成基因全长，并为其接入限制性内切酶位点。 三、构建四种重组质粒p u c l 9 a m p a b c d ，测序后分别转化到“感受态”大肠杆 菌j m l 0 9 中。 四、i p t g 诱导工程菌j m l 0 9 a b c d 表达，表达产物形成包涵体。洗涤纯化包涵体 后，用溴化氰除去表达产物n 端融合多肽。 五、采用抑菌圈法和最小抑菌浓度研究表达肽抗菌活性。通过对天蚕素抗菌肽序列与 结构分析，研究天蚕素结构特征对其抑茵活性的影响。 江南大学硕士学位论文 2 1 前言： 第二章设计抗菌肽的结构及活性预测 早在1 9 6 1 年a 血n s e n 等人就提出蛋白质的一级结构决定其高级结构的理论。这 个理论后来成为蛋白质结构预测的理论基础。目前结构预测还是基于对已知蛋白质结 构规律的总结、吸收、利用，即“基于结构知识的蛋白质结构预测”口“。近年来随 着i t 技术的飞速发展及其与生物科学的结合，产生了一门新的学科生物信息学 ( b i o i n f o n l l a t i c s ) 。生物信息学加快了蛋白质结构预测的进程，为蛋白质研究提供了 一个崭新的平台。 利用生物信息学研究抗菌肽主要经过以下一些途径f 3 7 】：( 1 ) 比较抗菌肽分子的 一级和二级结构保守氨基酸；( 2 ) 利用蛋白质分析软件预测肽段的二级结构。用h e l i x w h e e l 获得三维螺旋结构，并分析螺旋两侧和整体的亲水和疏水状态；( 3 ) 使用软件， 结合互联网的数据库进行空间结构的预测和静电势的计算等；( 4 ) 根据一级保守结构 确定抗菌肽的基本框架，在保守氨基酸位置逐个填入替代氨基酸，使新设计的抗菌肽 达到抗菌肽分子应有的基本抗菌性质；( 5 ) 考虑增强分子的抗菌活性和分子的稳定性， 如n 末端能形成更强的两亲a 一螺旋的趋势，带电荷的氨基酸与不带电荷的氨基酸螺 旋两侧分布更为合理，c 端a 一螺旋的疏水性( 酰胺化) 更强等( 蔡青松等，2 0 0 2 ) 。 本课题前期设计的抗菌肽全长为6 0 个氨基酸残基，其n 端包含部分信号肽保守 序列，这些氨基酸残基可能会影响抑菌活性。本实验计划除去n 端前1 0 个a a ，截 短后的设计肽命名为址佃a 、a m p b 、a m p c 和a m p d 。本章将通过生物信息学 对截短的设计抗菌肽( 序列见表2 1 ) 进行物化特性分析和二级结构预测，希望以此 得到部分结构信息，为后期研究抗菌肽构效关系奠定基础。 表2 1 截短后设计抗菌肽序列 t h b l e2 - 1s e q u e c e so f t n i n c a t e da n t i m i c r o b i a lp e p t i d e s a m 呼一ak y f v v i r l a i g i k g k k l e g v g k r w i s p 、硝i g q a a a l a n a m 咿- bk y f 、，v i v d g 嗣队a i g i k g k k l e g v g k r w i s d s 日a 最r l 、，g q a a a l a n a m p l ck y f 、n ，i 厂、，4 6 置i d a i g i k k i g k k l e g v g k r 、，a v i s a a p a v a l 、，g q a a a l a n a m p dk y f w i i a l 。a i g i k g k k l e g v g k r 、，a v l s d 5 ：h a 丑r l v g q a a a l a n 2 2 材料与工具 2 2 1 材料 设计抗菌肽：a m p a 、a m p b 、a m p c 、a m p d 第二章设计抗菌肽的结构及活性预测 2 2 2 分析工具 蛋白数据库：s w i s s p r o th ! 垃；丛坚：丛q 箜y ：q 踞 序列搜索：s r s ( s e q u e n c er e t r i e v a is y s t e m ) v5 1 o b ! 姬；也s ：x e a y ：q ! 型! 序列比对： 1 i b mp a t t e md i s c o v e r y1 、o o l s ：m u l t i p l es e q u e n c ea l i g m e n t h 丛p ；地坠型：型丛q 旦：i b 坠：q 型! 盟4 ：h ! 趔 2 盟墨 ( n e t w o r kp r o t e j ns e q u e n c e n a j y s j s j nh j e r a r c h j c a 】n e l l r a l n e t w o r k ) h ! ! p ；n 卫a ：乜b i ! ：i b p ：型g i ：b i 型n p 堡一4 ! q 堡丛：趔! 乜a g 三n 2 生堕旦二鱼! 吐 蛋白物理化学特性分析：! q ! 旦丛b 里：h 鲤；丛坚：x e 箜里q ! 丝q q ! p q ! p 垦1 4 婴：b 塑! 跨膜预钡4 分析： p r e d i c t p r o t e i n ：h 丛p ；丛女b i ：b i q ：q ! l ! 坠b i 4 ：d 型p ! g i ! e e q ! i 型 蛋白结构、物化特性分析软件：结构及电场模拟软件a r g u s l a b 4 o 1 ，蛋白分析软件 a n t h e w i n 4 3 ，p e p t o o l2 0 ( d e m ov e r s i o n ) 。 2 3 结果与讨论 2 3 1 组合多肽的物理化学特性分析 p r o t p a r a m ( h t t e ：u s e x e a s y o