（动物营养与饲料科学专业论文）猪Ghrelin基因的克隆、表达及组织定位研究.pdf

吉林农业大学硕士学位论文 猪g h r e l i n 基因的克隆、表达及组织定位研究 摘要 g h r e li n 是由2 8 个氨基酸组成的第一个生长激素促分泌素受体的内源性配体， 最早是由k o j i m a 等在小鼠和人的胃内分泌细胞及下丘脑弓状核中发现的。因其具有 促进垂体前叶生长激素的分泌的作用而命名为g h r e l i 1 。g h t e l i n 是目前为止除了生 长激素释放激素和生长抑素外，第二个调节gn 分泌的内源性物质。6 h r e l i n 主要合 成于胃，肠垂体、下丘脑、胎盘、肾脏、胰腺等亦有少量合成。根据现有的资料分析， g h r e l i n 除调节g h 分泌外，还有增加食欲，调节能量平衡，促进胃酸分泌等作用。 目前关于g h r e l i n 在动物方面的研究较少，为了进一步探讨g h r e l i n 在动物中的 作用机制本研究进行了猪g h r e l i n 基因的克隆与表达并结合免疫组化技术对g h r e l i n 在体内各组织中的分布定位进行了初步的研究。 根据g e n b a n k 中检索猪p r e p r o g h r e l i nm r n a 序列，设计了猪g h r e li n 原核表达及 真核表达系统的引物。通过r t - p c r 技术扩增猪的g h r e i i n 基因后，将其目的片段与克 隆载体p m d1 8 - tv e c t o r 连接，转化入e c o l i 经鉴定正确后，回收目的片段分别与原 核表迭载体p e t 2 8 a ( + ) 、真核表达栽体p v a x - i 的载体大片段相连接，分别构建了猪 g h r e li n 的原核和真核表达系统，首次获得了重组菌分泌的猪g h r e li n 原核表达多肽及 真核表达重组质粒p v a x g h r e l i nc d n a 。以纯化的真核重组质粒佐以司班、甘油免疫小 鼠，获取了鼠抗猪g h r e li n 免疫血清，经e l i s a 和w e s t e r n b l o t 方法检测，获得了猪 6 h r e l i n 的多克隆抗体。利用本研究制备的鼠抗猪g h r e l i n 抗体，在国内首次利用免疫 组化技术研究了g h r e l i n 的分布，结果表明：在猪的胃底腺部、小肠各段和胰岛均有 g h r e l i n 的分布，下丘脑中也有少量分布。这些研究将为g h r e l i n 各方面进一步的研究 奠定了基础。 关键词：g h r e i | n原核表达真核表达分布 要堡壅、业查兰堡主兰堡堡皇 登! ! ：! ! ! ! 茎里塑童垦：查垄垦垄堡塞垒堕壅 a b s t r a c t g h r e l i ni sa g r o w t hh o r m o n er e l e a s i n ga c y l a t e dp e p t i d eo f2 8a m i n oa c i d a st h e e n d o g e n o u sl i g a n df o rt h eg h s e c r e t a g a g u er e c e p t o r i tw a sr e p o r t e df i r s tb yk o j i m af r o m t h e s t o m a c he n d o c r i n ec e l la n dl o w e rt h a l a m u so f p e o p l e i tw a sn a m e db y t h ef u n c t i o no fg r o m h s t i m u l a t i o n g h r e l i ni sa t p r e s e n te x c e p t t h a tt h e g r o m h h o r m o n er e l e a s e h o r m o n e ，e n d o g e n o u sm a t e r i a lt h a tt h es e c o n dr e g u l a t i o ng h s e c r e t e d g h r e l i ni sf o r m a t e di n t h es t o m a c h m a i n l y , i n t e s t i n e s ，b y p o p h y s i s ，l o w e rt h a l a m u s ，p l a c e n t a ，k i d n e y ，p a n c r e a s ，e t c a c c o r d i n gt oe x i s t i n ga n a l y s i s ，g h r e l i ni n c r e a s e st h ef o o di n t a k e b e s i d e sr e g u l a t i n gg h r e l e a s i n g ，i ti sb a l a n c e dt or e g u l a t ee n e r g y , f u n c t i o no fp r o m o t i n gt h eh y d r o c h l o r i ca c i di n g a s t r i cj u i c et os e c r e t ee t c ， a t p r e s e n tt h es t u d ya b o u tg h r e l i ni na n i m a l si sl e s s ，t h es t u d yw a sc o n d u c t e dt oe x p l o r t h ef i m c t i o nm e c h a n i s mo fg h r e l i ni na n i m a l s s ow ec l o n e da n d e x p r e s s e dt h eg h r e l i ng e n e c o m b i n gi m m u n e h i s t o r yt e c h n o l o g yt oc a l t yo np r e l i m i n a r yr e s e a r c ho nd i s t r i b u t i o ni nt h e o r g a n i z a t i o n s a c c o r d i n gt o t h e s e q u e n c eo fp r e p r o g h r e l i nm r n a ，w ed e s i g n e dt h ep r i m e ro ft h e e x p r e s s i o ns y s t e mo fp r o k a r y o t i ca n de u k a r y o n g h r e l i ng e n ew a sa m p l i f i e db y r t - p c ra n d t h ep c r f r a g m e n s w e r ec l o n e di n t ot h e p m d 1 8 - tv e c t o r ，a n dt h e n i n d e n t i f i c a t e d ，s u b c l o n e di n t ot h ee x p r e s s i o nv e c t o rp e t 2 8 a ( + ) a n dp v a x - i , c o n s t r c t e dt h e e x p r e s s i o ns y s t e m o f p r o k a r y o t i c a n d e u k a r y o nr e s p e c t i v e l y t h ep o l y p e p t i d e o ft h e p r o k a r y o t i ce x p r e s s i o na n dr e c o m b i n a t i o np l a s m i dp v a x - g h r e l i n c d n aw e r eo b t a i n e d t h e d i s t r i b u t i o no fg h r e l i nw a sd e t e r m i n e db yi m m u n es c r a mf r o mr a t t h er e s u l ts h o w st h a t g h r e l i nl o c a t e di nt h ef u n d i c g l a n d o fs t o m a c h 、s e g m e n t so fs m a l i n t e s t i n ea n d h y p o t h a l a m u s ，f u r t h e rs t u d y a r eb a s e do nt h ep r e s e n t s t u d y k e yw o r d s ：g h r e l i ne u k a r y o ne x p r e s s i o np r o k a r y o t i ce x p r e s s i o n d i s t r i b u t i o n i i 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是个人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得吉林农业大学或其他教育机 构的学位证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均 已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名： 耘弓梅 i f 签字日期：沪一j 簿多月即日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解吉林农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即 吉林农业大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许 论文被查阅和借阅。本人授权吉林农业大学可以将学位论文的全部或部分内容编 入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位 论文。( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 躲扣挣 签字日期：寸卵4 年占月日 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 导师签名： 物勘 签字日期： 枷年石月卯日 一 电话：，毒，予妒? 。p 凶 邮编： 吉林农业大学硕士学位论文 猪g h r e l i n 基因的克隆、表达及组织定位研究 刖舌 g h r e l i n 是一种由2 8 个氨基酸组成的第一个生长激素促分泌素( g r o w t hh o r m o n e s e c r e t a g o g u e s ，g h s s ) 受体的内源性配体u - 3 1 ，最早是由k o j i m a 等【4 1 在小鼠和人的胃内 分泌细胞及下丘脑弓状核中发现的。因其具有促进垂体前叶生长激素( g r o w t hh o r m o n e ， g 甜) 的分泌的作用而命名为g h r e l i n ( g h e 在古印欧语系中的意思为生长，r e l i n 在美国 药典中为表示释放某物质的后缀) 。g h r e l i n 是目前为止除了生长激素释放激素( g r o w t h h o e m o n er e l e a s i n gh o r m o n e ，g h r h ) 和生长抑素( s o m a t o s t a t i n ，s s ) 外，第二个调节 g h 分泌的内源性物质。g h r e l i n 主要合成于引一6 1 ，肠5 1 垂体【1 8 】、下丘脑h i 、胎盘【5 “ 、 肾脏 1 9 】、胰腺 2 0 1 等亦有少量合成。根据现有的资料分析，g h r e l i n 除调节g h 分泌外， 对其他器官系统也有广泛的生物学作用。 1g h r e lj n 的发现 2 0 世纪7 0 年代，b o w e r s 等1 8 】合成了一类促g h 分泌的多肽一生长激素释放肽( g h r e l e a s i n gp e p t i d e s ，g h p s ) ，包括g h p 一6 及随后合成的g h p 1 ，g h p - 2 ，h e x e r a l i n 。1 9 9 3 年s m i t h 等9 1 根据g h p 6 三维结构合成出非肽类的生长激素促分泌素，其中作用最强的 是m k 0 6 7 7 。g h p s 、g h s s 都能通过一种g 蛋白偶连受体( gp r o t e i n - e o u p l e dr e c e p t o r ， g p c r ) j | i i j 激垂体释放g h 。1 9 9 9 年，k o j i m a 等以表达大鼠g h s r 的细胞系c h o g h s r 6 2 作为检测系统，用s a p h a d e x g 5 0 凝胶过滤，离子交换高效液相层析等方法，通过对大 鼠胃、肠、心、肺、脑、肾等的提取物检测，发现大鼠胃组织提取物中的活性最高，经 过系列层析提纯，从中纯化出了2 8 个氨基酸组成的活性肽，命名为g h r e l i n l 4 j 。 2g h r e lin 的结构及生化特征 2 1g h r e i i n 的合成与分布 g h r e l i n 主要在胃中合成，原位杂交表明g h r e l i n m r n a 主要存在于泌酸腺体的颈部 和基部 4 1 ，并证明g h r e l i n 细胞为x a 样内分泌细胞，且为封闭型。电镜观察发现其基 底部与毛细血管紧密相连，表明g h r e l i n 细胞可能以内分泌的方式高效的将g h r e l i n 通过 血液循环运送到表达g h s r 的远端组织。从胃到结肠均有g h r e l i n 存在，而以胃底部浓 度最高。胃体g h r e l i n 细胞的分布密度是下部小肠的十几乃至上百倍，而小肠中的浓度 是肾脏的1 4 0 倍，提示它可能通过自分泌和旁分泌在局部发挥作用”】。中枢神经系 统如下丘脑、垂体、脑干及周围组织如心脏、肾和内分泌器官等也能分泌g h r e l i n l l 3 1 但 吉林农业大学硕士学位论文 猪g h r e l l n 基因的克隆，表达及组织定位研究 量很少。在鱼类等低等脊椎动物中也发现能分泌g h r e l i n 。 2 2 结构与功能 人和大鼠，基因编码的g h r e l i n 前体( p r e g h r e l i n ) 都是由1 1 7 个氨基酸组成的 多肽，它们的同源性高达8 2 9 。g h r e l i n 前体n 端的前2 3 个氨基酸残基具有分泌信号 肽特征，从第2 4 位的甘氨酸( g l y c i n e ，g l y ) 到第5 2 位的2 8 个氨基酸为g h r e l i n 序列 ( 图1 ) ，g h r e l i n 的c 末端的p r 结构( 脯氨酸精氨酸) 为其识别部位f 4 j 。 结构活性关系的研究提示其最小活性中一1 5 , 为n 端的4 5 肽【1 4 。15 】且第三位丝氨酸 残基的辛酰基( 图2 ) 是活性所必需的，对其生物活性具有重要作用。前体还通过选择 性拼接产生第二个g h s r 的内源性配体d e s g l n - g h r e l i n 0 6 j ，它是一个由2 7 个氨基酸组 成的多肽，仅比g h r e l i n 在1 4 位上少一个谷氨酰胺，其他的氨基酸顺序和生物学活性与 g h r e l i n 是致的【4 】。去辛酰基化的形式无生物学活性，可能与辛酰基与其他氨基酸之间 的空间构象有关。 h u m a n ：m p s p g t v c s l l l l g m l w l d l a m a g s s f l s p e h q r v q q r k e s k k p p a k l q p r a l a g w l r p e g g q a e g a e d e l v r f n a p f d v g i k l s g v q y q q h s q a l g k f l q d i l w e e a k e a p a d k r a t ：m v s s a t i c s l l l l s m l w m d m a m a g s s f l s p e h q k a q q r k e s k k p p a k l q p r a l e g w l h p e r g q a e e a e e e l i r f n a p f d v g i k l s g a q y q q h g r a l g k f l q d i l w e e v k e a p a n k 图1人和大鼠的6 h r e i i n 前体氨基酸顺序 f i g la l i g n m e n t o f a r a i n o a c i ds e q u e n c e so f h u m a na n dr a tp r e - - g h r e l i n ( b o l d f a c e i n d i c a t e s g h r e l i ns e q u e n c e ，e m p h a s i s s y m b o l si n d i c a t en - o c t a n o y l m o d i f i c a t i o ns i t e s ) 0 = c 一( c h 2 ) 6 c h 3 nh 2 。gs 、sflspehqkaqqr kesk kppaklqpr - cooh 图2大鼠g h r e i in 的结构 f j 配s t r u c t u r e o f r a tg h r e l i n 3 受体分布 g h r e l i n 受体( g h s r ) 为一种含d 螺旋7 个跨膜区的g 蛋白偶联受体( g p c r ) ， 2 吉林农业大学硕士学位论文 猪g h r e l i n 基因的克隆、表达及组织定位研究 主要g 蛋白是g q 蛋白，主要的信息传递系统是磷脂酶c ( p l c ) ，三磷酸肌醇( i p ，) 和蛋白激酶c ( p k c ) 。广泛分布于中枢神经系统与外周组织。g h s r 可分为i a 和i h 两 型，g h s 的促g h 分泌效应是通过与i 。型g h s r 结合而发挥的【1 7 1 。i a 型g h s r 的m r n a 主要分布于下丘脑弓状核、腹内侧核、漏斗核，海马区及腺垂体【1 7 1 ，而在甲状腺、胰腺、 脾、心肌和肾上腺有低水平表达，其非功能性受体g h s r b n l r n a 在所有组织中都有表 达【2 ”。在弓状核前外侧、背侧及连接第三脑室的漏斗部，腹内侧核的腹侧和背侧的神经 元可同时表达g h s r m r n a 和g h r h m r n a l 2 ”。g h s r m r n a 还在神经肽y ( n e u r o p e p t i d e y ，n p y ) ，生长抑素( s s ) 和前阿黑皮素原( p r o o p i o m e l a n oc o r t i n ，p o m c ) 神经元中表达1 2 ”。研究显示g h s r m r n a 也可在心脏、肺、胰、肠、脂肪组织、肾中 都有分布，分析显示心肌内的表达水平高于在垂体的表达，这些发现表明g h r e l i n 除调 节g h 分泌外，可能有更广泛的生物学作用。 4g h r e l n 的生物学作用 g h r e l i n 的生物学效应目前还不完全清楚，主要有刺激垂体前叶释放生长激素、增 加食欲，调节能量平衡，促进胃酸分泌等作用。 4 1 特异性的刺激垂体前叶生长激素( g h ) 的释放 体内体外的实验均已证实 2 4 5 1 ，g h r e l i n 具有明显的促进g i r l 分泌的作用。静脉、 脑室及腹腔给予大鼠g h r e l i n 均可升高血中g h 水平。从外周静脉给予健康志愿者 g h r e l i n 可促进g h 的释放，明显强于同等剂量g h r h 及非天然g h s 所引起的g h 释放 且具有剂量依赖性【2 “。给健康志愿者静脉注射o h r e l i n 3 3 9 9 k g 、6 6 1 x g k g 后，g h 水 平升高，峰值分别为( 6 9 8 9 2 ) l a g l 和( 9 0 9 1 6 9 ) “g l ，均显著高于安慰剂组及 4 , n 量g h r e l i n ( 1 t g k g ) 组【2 ”。分别给大鼠静脉注射g h r e l i no 2 m g k g 、1 0m 酿唱、5 0 m g k g ，3 0 m i n 后g h 水平分别升高( 4 3 3 6 o ) i x g 几、( 8 1 5 1 2 7 ) g g l 、( 1 0 7 _ + 1 0 7 ) g l f 2 8 】。大鼠脑室内注射g h r e l i n 后，血浆g h 水平呈剂量依赖性上升，但是垂体的 g h m r n a 未变化，提示g h r e l i n 可促进g h 的释放，但不增加g h 的合成。给大鼠静脉 注射g h r e l i n 0 2m g k g 后a c t h 、c o r t i s o l 、p r l 均有升高1 2 4 。 在给予外源性生长抑素后g h r e l i n 诱导的g h 分泌被部分阻断，而同等剂量的生长 抑素则几乎完全阻断o h r h 诱导的g h 分泌【2 引。b o w e r s 等1 8 】也发现o i - r h 拮抗剂能显 著抑制g h r e l i n 诱导的g h 分泌，表明g h r e l i n 促进g h 分泌的作用可能部分有g h r h 介导的参与。在下丘脑弓状核g h r h 神经元亚群中发现有g h s r 的存在，也支持g h r e l i n 可能作用于g h r h 神经元【8 l a 然而，g h r e l i n 在体外试验中也可刺激垂体细胞释放g h 【4 j ， 给g h r h 受体突变的患者注射g h r e l i n 受体激动剂g h r p 2 可刺激g h 释放，表明o h r e l i n 吉林农业大学硕士学位论文 猪g h r o l i n 基因的克隆、表达及组织定位研究 也能通过非g h r h 依赖的方式，即通过g h s r 介导来刺激g h 释放f 2 ”。g h r e l i n 的发现 被看成g h 研究领域中的一个里程碑，它证明了在g h 分泌调控中g h s g h s r 信号系 统的存在，g h r e l i n 与下丘脑分泌的g h r h 、s s 一起参与了对垂体生长激素细胞分泌 g h 的调节。 g h r e l i n 刺激g h 的释放的调节机制完全不同于下丘脑g i - i r h 的调节机制。g h r h 刺激g h 分泌的作用可能是通过c 4 d v i p 信号传递系统实现的 3 0 】。研究表明，生长素促 进g h 分泌的作用并不依赖于g h r h 的存在，而是由垂体g h s r 介导，通过腺苷酸环 化酶( a c ) 或磷脂酶c ( p l c ) 而产生效应可刺激g h 分泌 3 1 1 。g h s s 与g h s r 结合后， 导致k + 通道的去极化和抑制，引起细胞内l ，4 ，5 三磷酸肌醇( i p 3 ) 浓度升高，并由 此引起细胞内c a ”浓度的迅速升高刺激g h 的释放。提示g h r e l i n 在外周和中枢可能有 不同的调节机制。 给志愿者静脉注射g h r e l i n 除明显升高循环中g h 的水平，血中的催乳素( p r o l a c t i n ， p r l ) 、促肾上皮质激素( a d r e n o c o r t i c o t r o p i c h o r m o n e ，a c t h ) 也明显升高，但促甲状 腺激素( t h y r o i d - s t i m u l a t i n gh o r m o n e ，t s h ) 没有明显变化。肾上腺素和环磷酸腺苷 ( c a m p ) 含量增多，去甲肾上腺素和环磷酸鸟苷( c g m p ) 没有明显变化【3 2 j 。可见g h r e l i n 除参与调节g h 分泌外，还与其他激素的分泌有密切关系。f u k u u r a 等【3 3 j 最近报道，脑 室内注射g h r e l i n 可明显抑制卵巢切除大鼠黄体生成素( 1 u t e i n i z i n g h o r m o n e ，l h ) 的分 泌。因此g h r e l i n 可能是体内维持激素平衡的一个重要因子。 研究发现，g h r e l i n 对生长激素细胞的分化和功能可能有一定作用。生长激素细胞 依赖垂体特异性转录因子( p i t u i t a r ys p e c i f i ct r a n s c r i p t i o nf a c t o r ，p i t l ) 特异性表达生长 激素基因。g h r e l i n 与腺垂体g h s r 结合后，诱导p i t 呈时间、剂量依赖性表达，此效 应具有年龄相关性，只对幼鼠有作用，对成年大鼠无作用。 4 2 增加食欲，调节能量代谢 w r e n a m 1 3 4 1 ，n a t a z a t o 3 5 】等给予小鼠脑室内和外周注射g h r e l i n ，均可强烈刺激 小鼠食欲，减少能量消耗，增加体重，甚至增加生长激素( g h ) 缺乏的小鼠的食欲。 脑室内处理后，采食行为迅速加强，并能持续2 4 h ，以采食量变化和持续时间作比较对 象，3 n m o l g h r e l i n 的效力与5 r t m o l 神经肽y ( n p y ) 的效力相当( n p y 是强效的食欲 诱导因子) 。m i t s u y o ( 2 0 0 1 ) 以5 0 0 ( n gr a t ) 的剂量i c v 处理生长激素分泌不足的天生 的矮小鼠，与对照组相比，试验组显著增加了采食量。人在空腹3 6 j 或神经性厌食f 3 7 1 时 血液循环中的g h r e l i n 水平升高，而在急性( 如能量摄入) 1 3 6 】或慢性( 如肥胖) p 8 j 正能 量平衡时降低。在给健康成人静脉注射g h r e l i n 后同样可引起食欲增加、进食量增多例。 f u r u s e 等【4 0 1 研究发现，给雏鸡脑室内注射g h r e l i n 却可以抑制雏鸡食物的摄入，呈 4 吉林农业大学硕士学位论文 猪g h r e i n 基圈酌克隆、表迭及组织定位研究 剂量依赖性，推测g h r e l i n 对鸡的作用机制可能不同于哺乳动物。 下丘脑是控制采食、能量消耗和体重的关键部位之一，许多神经递质、神经肽在下 丘脑中都有表达。原位杂交试验可知g h r e l i n 在下丘脑作用的主要部位是下丘脑食欲中 枢的含n p y 的神经元和含刺鼠基因相关蛋白( a g o u t i r e l a t e dp r o t e i n ，a g r p ) 神经元， 二者均可表达g h s r m r n a 。在弓状核的含a o r p 神经元还可表达n p y m r n a 。已知n p y 和a g r p 均有较强的刺激食欲作用。动物试验中发现，g h r e l i n 或其受体激动剂g h r p 能刺激下丘脑弓状核细胞c f o s 的表达1 4 “，并使下丘脑n p y 和a g r p 表达增加1 3 5 。n p y 与下丘脑中的n p y - y 1 和y 5 受体结合并使其激活，从而促进采食，其中起主要作用的 是y l 受体；且有资料证实g h r e l i n 可能通过该途径拮抗瘦素的抑制食欲作用【4 2 j 。a g r p 是内源的黑皮质素受体的激动剂，a o r p 通过激活黑皮质素- 4 受体，产生抑制厌食作用， 从而增进采食。n p y 或a g r p 拮抗剂能使注射g h r d i n 后产生的增食欲作用减弱p ”。由 此g h r e l i n 的促进采食作用至少包括两方面，一是通过激活n p y 的y 1 受体促进采食， 二是增加a g r p 的释放量，发挥a g r p 的抑制厌食作用。但有报道，在敲除了n p y 基 因的小鼠中，中枢注射仍引起摄食增加，提示a g r p 在介导g h r e l i n 的摄食调控中起关 键的作用剀。 4 3g h r e fj n 对胃肠道功能的影响 g h r e l i n 参与胃肠功能的中枢和外周调节 4 3 ”。给大鼠静脉注射o h r e l i n ，剂量为 0 8 2 o 嵋k g ，能够引起剂量依赖性的胃酸分泌增多，胃运动频率增多、幅度增大，而 这种反应不能被h 2 受体拮抗剂所拮抗，但可被阿托品和迷走神经切断所阻断。静脉注 射g h r e l i n 的促胃酸分泌和胃肠运动作用与刺激迷走神经所产生的作用相似【舭j ，经脑室 给大鼠注射g h r e l i n 也明显刺激胃酸的分泌，这种作用也可被阿托品或切断迷走神经而 阻断1 4 3 1 。g h r e l i n 的脑室内处理可激活延髓中的孤束核( n u c l e u so ds o l i t a r yt r a c t ，n t s ) 和迷走神经背侧核( d o r s o m o t o rn u c l e u so fv a g u s ，d m n v ) ，这两个神经核是大脑调节 胃酸分泌的重要神经核。n t s 接受口腔味觉信息和迷走神经感觉冲动的传入，对d m n v 发出指令；d m n v 整合内脏和中枢神经的感觉输入，从而将整合的信息通过迷走神经 系统传达到胃，促进胃酸分泌。说明g h r e l i n 对胃肠道的作用并不依赖于g h 的释放， 可能通过与周围和或中枢g h s r 结合兴奋迷走神经而发挥作用。 5g h r e l - n 对心脏功能的影响 利用r t - p c r 技术发现在大鼠的主动脉、左心房、左心室均有g h s r 基因的表达。 在心衰及败血症大鼠，g h r e l i n 具有生长激素不能完全解释的心血管保护效应。在离体 心脏l a n g e n d o r f f 2 2 ，大鼠心脏缺血3 0 m i n 黜3 0 m i n 后呈现出严重的心脏 吉林农业大学硕士学位论文猪g h r e l i n 基因的克隆、表达及组织定位研究 功能障碍及代谢紊乱，表现为心率减慢、心室肌收缩力下降及心肌l d h 和m b 漏出增 加，心肌脂质过氧化终产物m d a 生成增加，心肌a t p 含量减少。用g h r e l i n 再灌注明 显减轻了心脏的i r 损伤，表现为心率增加，左室收缩末压增加，+ ，l v d p d t m a x 增加。 g h r e l i n 灌注亦减少了l d h 及肌红蛋白从i 瓜损伤的心肌漏出，且呈浓度依赖性地抑制 了心肌m d a 产生和增加了心肌a t p 含量，这些结果表明g h r e l i n 具有直接心脏保护作 用。n a g a y a 等研究报道，给慢性心衰大鼠皮下注射g h r e l i n 可明显改善左心室功能，表 现为心输出量增加，左心室压力最大变化量增加，增加室壁的厚度，抑制了心室的肌源 性扩张。给健康人静脉注射g h r e l i n 可引起血管扩张和心输出量增加；而给充血性心力 衰竭的患者静脉注射g h r e l i n 后，观察到平均动脉压显著降低雨心率无明显变化，而且 心脏指数和每搏输出量指数增加，而产生有益的血液动力学效应，减轻心脏后负担，对 心脏有保护作用。 6 其他作用 v o l a n t e 等报道，在甲状腺癌细胞系中g h r e l i n 抑制细胞增长，抑制作用呈量效相关； c a s s o n i 等报道，g h r e l i n 在体外可以明显抑制乳腺癌细胞( m c f 7 、1 4 7 d 、m d a m b 2 3 1 细胞株) 的增殖。同时还发现在乳腺癌细胞上并没有g h s r i 。受体表达。i 习此在乳腺癌 细胞应该存在g h s ri 。的亚型，g h r e l i n 及其他g h s 通过这类受体亚型也能发挥生理作 用。g h r e l i n 还可能参与睡眠觉醒模式、睾丸功能等。 实验的目的和意义 由于g h r e l i n 有明显的促生长作用，使得近几年来受到人们的极大关注。但到目前 为止在动物方面研究较少。本研究旨在通过基因的手段来研究g h r e l i n 在猪体内各组织 的分布定位，这一基础研究将为进一步研究g h r e l i n 的分泌规律及其作用方式，弄清 g h r e l i n 调节生长激素释放的作用机制，进而促进动物的生长等奠定了基础。由于g h r e l i n 的纯品蛋白没有商品化，因此本研究在没有抗原的情况下要获得该抗原的抗体采取了基 因免疫的方法来制备p g h r e l i n 抗血清经原核表达产生的多肽鉴定正确后结合免疫组化 技术来进行g h r e l i n 组织定位的研究。 吉林农业大学硕士学位论文 猪g h r e l i n 基因的克隆、表达及组织定位研究 实验一猪g h r e l in 基因的克隆和原核表达 g h r e l i n 是1 9 9 9 年由日本科学家发现的一个由2 8 个氨基酸残基组成的内源性肽类， 存在于下丘脑和胃中，与生长激素促分泌素受体( g r o w t hh o r m o n es e c r e t a g o g u e r e c e p t o r ，g h s r ) 结合发挥促生长激素( g r o w t hh o r m o n e ，o h ) 分泌的作用。有学者 认为，g h r e l i n 可能是生长激素胰岛素样生长因子一l ( g 1 4 i o f 1 ) 轴和调节能量平衡的 神经内分泌之间的一个新的联结纽带。电生理学研究g h r e l i n 的效应显示，对于g h 自 发式脉冲分泌，g h r e l i n 与生长抑素( s s ) 的功能相反，其促进g h 释放活性不依赖于 抑制内源性s s 的释放；在腺垂体水平，s s 拮抗g h r e l i n 的作用；体内g h 对g h r e l i n 的 响应需要一个完整的g h r h 系统。电生理学记录发现，g h r e l i n 刺激下丘脑的室旁核 ( p v h ) n p y 神经元的活动( c o w l e y m a 等，2 0 0 3 ) 。神经肽y ( n e u r o p e p t i d e y ，n p y ) 的受体拮抗剂的研究表明，该物质通过刺激下丘脑弓状核的n p y 刺激摄食，在下丘脑 内部，g h r e l i n 可能控制n p y 神经元的突出前末梢( b a g j a a s c om 等，2 0 0 3 ) 。目前，对 g h r e l i n 在人、鼠、鸡等动物的体内分布及作用机制已有了一些认识，但是对于猪体内 g h r e l i n 的分布等的研究较为罕见。为此，本研究根据g e n b a n k 上检索的猪g h r e l i n ( 口g h r e l i n ) m r n a 序列，利用r t - p c r 技术对g h r e l i n 基因进行克隆，并构建了o h r e l i n 的原核表达载体，获得了其表达的目的蛋白，作为同时进行的d n a 免疫的筛选抗原， 以便于探讨该物质在猪体内的分布以及营养因素等对分泌的影响等方面的研究。 1 材料与方法 1 1 材料 1 1 ，1 实验材料出生仔猪下丘脑及胃底组织。 1 1 2 菌株大肠杆菌菌株b l 2 i ( d e 3 ) 、j m l 0 9 、d h 5q 由本室保存。 1 1 3 克隆载体所用的p m d l 8 - t 载体为t a k a r a 公司产品。 1 1 4 表达载体所用的原核表达载体p e t - 2 8 ( a ) 购自n o v a g e n 公司。 1 1 5 酶与试剂 11 5 1 反应用酶t 4d n a 连接酶、限制性内切酶( n h ei 、x h oi ) 、溶菌酶均为 t a k a r a 公司产品。a m v r e v e r s e 、t a qd n a 聚合酶( 5 u “1 ) 、r n a s i n 为p r o m e g a 公司 产品。 1 1 5 2 试剂焦磷酸二乙酯( d e p c ) 为s i g m a 公司产品；o l i 酣( t ) t f i z o l 为i n v i t r o g e n 公司产品；t r i z o l 试剂，g i b c o 公司产品；琼脂糖、t r i s 、蛋白胨、酵母提取物为t a k a r a 公司产品；氯仿、异丙醇、乙醇、异戊醇、n a c l 、m g c l 2 、磷酸二氢钠、丙烯酰胺、甲 重签壅些查兰堡圭兰垒堡奎 塑! ! ! ! ! ! ! 垂堕堕塞垦：重垫垦望塑塞垒! 窒 叉双丙烯酰胺、甘氨酸等均为国产分析纯试剂：饱和酚、异丙基。0 d 一硫代半乳糖苷 ( i p t g ) 、氨苄青霉素( a m p ) 、卡那霉素( k a n ) 、十二烷基硫酸钠( s d s ) 、乙二胺四 乙酸钠( e d t a ) 等购白长春b i o t e c h 公司。 1 1 5 3 标准参照物 标准分子量核酸d n am a r k e rd l - 20 0 0 ( 分子量为20 0 0 、10 0 0 、7 5 0 、5 0 0 、2 5 0 、 l o o b p ) 、d l 一1 50 0 0 ( 1 50 0 0 、】00 0 0 、75 0 0 、50 0 0 、25 0 0 、l0 0 0 、2 5 0 b p ) 为t a k a r a 公司产品。 1 1 5 4 试剂盒d n a 凝胶回收试剂盒、d n a 质粒提取试剂盒均为杭州v i t a g e n e 公司 产品。 1 1 5 5 质粒提取( 大提) 用溶液等的配制 溶液i ：2 5 ( w v ) 蔗糖，5 0 m m o l l t r i s - e l p h 8 0 ，1 0 m m o l l e d t a p h 8 o ； 溶液i i ：l ( w v ) s d s ，0 2 m o l l n a o h 溶液l l i ：7 5m o l ln h 4 a c t e ( p h 8 0 ) ：1 0 m m o l l t r i s e l p h 8 0 ，l m m o l l e d t a p h 8 o ； 5 0 x t a e ( 5 0 0 m 1 ) ：t r i s1 2 1 0 9 ，冰醋酸2 8 5 5 m l ，0 5 m o l le d t a 5 0 0 m i ( p h 8 o ) 1 1 ，5 6 培养基类 1 ) l b 培养基1 0 0 0 m l p h 7 4 蛋白胨 l o o g 酵母抽提物 5 o g n a c i 1 0 0 9 2 ) l b 固体培养基1 0 0 0 m l p h 7 4 蛋白胨 1 0 0 9 酵母抽提物5 0 9 n a c l 1 0 0 9 琼脂1 5 0 9 1 1 5 7d n a 酶反应终止液 5 0 m m o l l e d t a ；1 5 m o l l n a a e ；l ( w v ) s d s 。在室温s d s 可从溶液中析出， 用时要稍微加热溶解。 1 1 5 8s d s p a g e 用试剂 3 0 母胶：2 9 2 ( w v ) 丙烯酰胺，0 8 ( w v ) 甲叉双丙烯酰胺； 浓缩胶缓冲液：1 0 m o l lt r i s e l ( p h 6 8 ) ； 分离胶缓冲液：1 5 m o l l t r i s e l ( p h 8 8 ) ； 8 吉林农业大学硕士学位论文 猪g h r e l i n 基因的克隆、表达及组织定位研究 5 电泳缓冲液：1 5 t r i s ，7 2 g l y ，0 ，5 s d s ： 5 样品处理液：0 1 2 5 m o l lt r i s e lp h 6 8 ，2 0 丙三醇，4 s d s1 0 1 3 一巯基乙醇， o 0 2 5 考马斯亮蓝r 2 5 0 ； 染色液：甲醇4 5 m l 、水4 5 m l ，两液混匀后再加入1 0 m l 冰乙酸、0 2 5 9 考马斯亮蓝； 脱色液：甲醇4 5 0 0 m l 、冰乙酸1 0 0 m l ，水加至10 0 0 m l 。 1 1 5 9 w e s t e r nb l o t 用试剂 转移缓冲液：4 8 m m o l 几的t r i s 碱，3 9 n m a o l l 的甘氨酸，0 0 3 7 s d s ，2 0 甲醇。 封闭液：1 0 m m o l l t r i s h c l ，p h 7 5 ，1 5 0 m m o i l n a c i ，1 t w e e n 2 0 ，3 b s a 。 洗涤缓冲液：1 0 m m o l l t r i