（动物遗传育种与繁殖专业论文）人igfⅠ基因在猪pk15细胞中的表达.pdf

适 一 - 目录 中文摘要一i 英文摘要i i i 1j ；i 言l 1 1i g fi 基因的研究进展l 1 1 1i g f 家族概述1 1 1 2i g fi 基因的生物学特征l 1 1 3i g fi 基因的研究展望8 1 2 哺乳动物细胞表达系统概述8 1 2 1 表达载体9 1 2 2 表达系统类型9 1 3r e a l t i m eq u a n t i t a t i v ep c r 检测系统概述9 1 4 酶联免疫吸附测定概述1 0 1 5 转基因动物研究进展1 0 1 5 1 转基因动物的研究方法及其特点1 l 1 5 2 转基因动物的应用1 l 1 6 本研究的目的意义1 2 2 材料与方法1 4 2 1 实验材料1 4 2 1 1 实验用细胞和菌株1 4 2 1 2 主要试剂1 4 2 1 3 主要仪器设备1 4 2 1 4 主要药品、试剂及配制1 5 2 1 5 主要分子生物学软件和生物信息学网站1 6 2 2 实验方法1 6 2 2 1h i g fi 基因e d n a 的t a 克隆1 6 2 2 2 真核表达载体p c d n a 3 1 - h l g fi 的构建2 0 2 2 3 转染用质粒的制备2 2 2 2 4p k - 1 5 细胞转染实验2 4 2 2 5h l g fi 基因在p k - 1 5 细胞内表达的检测2 5 2 2 6 实验数据分析2 9 3 结果与分析3 0 3 1h i g fi 基因c e i n a 的t a 克隆3 0 3 1 1 总r n a 质量检测3 0 3 1 2h i g fi 基因的r t - p c r 扩增3 0 3 1 3h i g fi 基因p c r 产物的纯化3 0 3 1 4 重组克隆质粒p m d l 8 - t - h l g fi 的鉴定3 1 东北农业大学农学硕十学位论文 3 1 5h l g fi 基因序列的测定3 l 3 2 表达载体的构建3 1 3 2 1 目的片段的获得3 1 3 2 2p e d n a 3 1 质粒的线性化处理及回收3 2 3 2 3p c d n a 3 1 - h l g fi 重组载体的鉴定3 2 3 2 4 重组质粒的序列测定3 3 3 2 5 转染用高纯度质粒制备3 4 3 3p k - 1 5 细胞培养及p c d n a 3 1 - h l g fi 重组质粒的转染。3 5 3 3 1p k _ 1 5 细胞培养及转染效果3 5 3 3 2g 4 1 8 筛选浓度的确立3 6 3 3 3p k - 1 5 单克隆细胞的筛选。3 6 3 。3 4 单克隆细胞的纯化与富集3 7 3 4 外源基因表达的检测3 7 3 4 1 荧光定量p c r 检测3 7 3 4 2 酶联免疫吸附测定4 0 z i 讨论4 2 4 1 用于克隆目的基因的引物4 2 4 2 载体构建4 2 4 3 用于r t - p c r 反应的引物浓度4 4 4 4e l i s a 检测过程需要注意的问题4 4 4 5 关于外源基因表达检测的几个问题4 4 5 结论4 6 致谢4 7 参考文献4 8 攻读硕士学位期间发表的学术论文。5 2 i i ， 臂r 席 一 c o n t e n t s c o n t e n ts c h i n e s ea b s t r a c t 。i e n g l i s ha b s t r a c t i i i li n t r o d u c t i o n 1 1 1r e s e a r c ho fl g fig e n e l 1 1 1o v e r v i e wo fi n s u l i n - l i k eg r o w t hf a c t o rf a m i l y l 1 1 2t h eb i o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c so fl g fig e n e l 1 1 3p r o s p e c t so fi g fig e n e 8 1 2m a m m a l i a ne e l le x p r e s s i o ns y s t e mo v e r v i e w 8 1 2 1e x p r e s s i o nv e c t o r 9 1 2 2t y p e so fe x p r e s s i o nv e c t o r 9 1 3r e a l t i m eq u a n t i t a t i v ep c rd e t e c t i o ns y s t e mo v e r v i e w 9 1 4e n z y m e - l i n k e di m m u n o s o r b e n ta s s a yo v e r v i e w 1 0 1 5t r a n s g e n i ca n i m a lr e s e a r c h 1 0 1 5 1t r a n s g e n i ca n i m a lr e s e a r c hm e t h o d sa n dt h e i rc h a r a c t e r i s t i c s 1 1 1 5 2t h ea p p l i c a t i o no f t r a n s g e n i ca n i m a l s 。11 1 6o b j e c t i o na n ds i g n i f i c a t i o n 1 2 2m a t e r i a l sa n dm e t h o d s 1 4 2 1m a t e r i a l s 1 4 2 1 1b a c t e r i a l sa n dc e l l ss a m p l e s 1 4 2 1 2v e c t o rf o rc l o n i n ga n de x p r e s s i o n 1 4 2 1 3m a i na p p a r a t u s 1 4 2 1 4m a i nr e a g e n t sa n de n z y m e s 1 5 2 1 5m a i ns 0 1 a r ea n dw e b s i t e 1 6 2 2m e t h o d s 1 6 2 2 1c l o n i n go f h u m a ni g fig e n ee d n a 1 6 2 2 2e u k a r y o t i ce x p r e s s i o nv e c t o rp c d n a 3 1 - m g fic o n s t r u c t i o n 2 0 2 2 3p r e p a r a t i o no f t r a n s f e c t i o nw i t hp l a s m i d 2 2 2 2 4p k - 1 5t r a n s f e c t i o n 2 4 2 2 5d e t e c t i n gf o re x p r e s s i o no f h l g fig e n ei np k - 1 5c e l l s 2 5 2 2 6d a t aa n a l y s i s 2 9 3r e s u l t sa n da n a l y s i s 3 0 3 11 = ac l o n i n go f h l g fig e n ee d n a 3 0 3 1 1d e t e c t i n gt o t a lr n aq u a l i t y 。3 0 3 1 2h l g fig e n ei u - p c ra m p l i f i c a t i o n 3 0 3 1 3h i g fig e n ep c rp u r i f i c a t i o n 3 0 3 1 4i d e n t i f i c a t i o nf o rr e c o m b i n a n tc l o n i n gv e c t o rp m d l8 - t - h l g fi 3l 东北农业大学农学硕上学位论文 3 1 5d e t e r m i n a t i o nh l g fig e n es e q u e n c e 31 3 2e x p r e s s i o nv e c t o r 31 3 2 1g e t i n gt h et a r g e tg e n es q u e n c e s 。31 3 2 2l i n e a r i z a t i o na n dr e c y c l i n go f p c d n a 3 1v e c t o rp l a s m i d 3 2 3 2 3i d e n t i f i c a t i o nf o r p c d n a 3 1 h l g fi 。3 2 3 2 4s e q u e n c i n go f r e c o m b i n a n tp l a s m i d 3 3 3 2 5t r a n s f e c t e dw i t hh i g h p u r i t yp l a s m i dd n a 。3 4 3 3p k - 1 5e e l lc u l t u r ea n dt r a n s f e c t i o no f p c d n a 3 1 - h l g fip l a s m i n d 3 5 3 3 1p k - 1 5c e l l sc u l t u r ea n dr e s u l to f t r a n s f e c t i o n 3 5 3 3 2c o n c e n t r a t i o nf o rs e c t i o no f g 4 18 3 6 3 3 3s e c t i o nf o rp k - 1 5m o n o c l o n a lc e l l s 3 6 3 3 4p u r i f i c a t i o na n de n r i c h m e n to f m o n o c l o n a lc e l l s 3 7 3 4d e t e c t i o no fe x o g e n o u sg e n ee x p r e s s i o n 3 7 3 4 1f l u o r e s c e n c eq u a n t i t a t i v ep e rd e t e c t i o n 3 7 3 4 2e n z y m e l i n k e di m m u n o s o r b e n ta s s a y 4 0 4d i s e u s s i o n 4 2 4 1p r i m e r sb e i n gu s e df o rc l o n i n gt a r g e tg e n e 4 2 4 2c o n s t r u c t i o no f v e c t o r 4 2 4 3c o n c e n t r a t i o nf o rr r - p c r 4 4 4 4e l i s ad e t e c t i o np r o c e s sr e q u i r e sa t t e n t i o n 4 4 4 5s e v e r a lq u e s t i o n sa b o u tt h ee x o g e n o u sg e n ee x p r e s s i o n 4 4 5c o n e l u s i o n s 4 4 a c k n o w l e d g e m e n t 4 7 r e f e r e n e e s 4 8 p u b l i s h e da r t i c l ed u r i n gs p e c i a l i z i n gt h ed e g r e eo fm a s t e r 5 2 i v 研究生学位论文独创声明和使用授权书 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得东北农业大学或其他教育机构 的学位或证书使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已 在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者躲删魄渺多月6 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。 本人授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以 采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在解密 后适用本授权书) 学位论文作者签名螽陋 导师 签 6 7 舭锣 妒 彬 期 期 j j ， 摘要 捅要 胰岛素样生长因子i ( i n s u l i n 1 i k eg r o w t hf a c t o ri ，i o fi ) 是机体生长、发育和代谢的一 个重要调控因子，同时也是生长激素( g r o w t hh o r m o n e ，g h ) 启动生长活性的主要介导者。 它既有类胰岛素样作用又有生长素样作用，能促进肌细胞的分化生长，平衡脂肪的沉积，调 节泌乳量，提高消化吸收能力，在人类和动物的繁育过程中发挥着广泛的功能。有研究表明， 转人i g fi 基因猪与非转基因猪比较，脂肪含量有所下降，瘦肉率增高，其生长速度快且没 有转g h 基冈猪所存在的嗜睡、繁殖能力低等缺点。因此，采用先进的d n a 重组体细胞核 移植技术进行转h i g fi 基因猪研究具有重要意义。 本研究根据g e n b a n k 上公布的h i g fi 基因序列设计引物，采用r t - p c r 技术克隆了 h i g fi 成熟肽基因序列；构建p c d n a 3 1 - h i g fi 真核表达载体，载体上含有p c m v 启动子、 n e o 和a m p 抗性基因，可以在哺乳动物细胞内高水品稳定表达目的基因；通过脂质体法将重 组质粒转染到猪肾上皮( p k 1 5 ) 细胞中，经0 4 1 8 浓度梯度筛选出单克隆转基因细胞株；利 用r e a l t i m e p c r 和e l i s a 两种方法检测和鉴定了转基因细胞系对外源基因的表达情况。 研究结果如下： 1 准确克隆了h i o fi 编码成熟肽的基因序列，大小为3 1 5 b p ，与网上公布的序列一致； 2 成功构建了p c d n a 3 1 - h i g fi 真核表达载体，并转染到p k - 1 5 细胞中； 3 通过g 4 1 8 浓度梯度筛选获得8 个转h i g fi 基因细胞株； 4 已获得的转基因细胞株传代前后在转录和翻译水平上对h i g fi 基因都有较高的表达。 以上结果表明，真核表达载体构建准确，可以正确表达外源基因，所筛选出的单克隆转 基因细胞株不但能持续稳定地表达h i g fi 蛋白，而且可携带外源基因进行传代，具有良好的 遗传稳定性，这为后续转基因实验奠定了理论基础。 关键词猪；i g fi ；p k - 1 5 细胞；真核表达；转基因 广 一j a b s t r a c t e x p r e s s i o no fh u m a n i g fig e n ei np k - 15c e l l s a b s t r a c t i n s u l i n l i k eg r o w t hf a c t o ri ( i g fi ) i sn o to n l yai m p o r t a n tr e g u l a t o r yf a c t o rf o rg r o w t h ， d e v e l o p m e n ta n de m b o l i s mi nb o d y , b u ta l s ot h em a j o rm e d i a t o rf o rg r o w t hh o r m o n e ( g h ) a c t i v a t i n gg r o w t h i th a si n s u l i n - l i k ea n dg r o w t h - l i k ee f f e c t , p r o m o t i n gt h eg r o w t ho fm u s c l ec e l l s d i f f e r e n t i a t i o n ，b a l a n c i n go ff a td e p o s i t i o n r e s e a r c hh a ss h o w nt h a t ，h u m a ni g f ig e n et r a n s f e r p i g sh a v em a n gs t r o n gp o i n t ss u c ha sl o wf a tc o n t e n t ，h i g hl e a nw i t h o u tt h ew e a kp o i n t si ng h g e n e t r a n s f e rp i g s t h e r e f o r e ，u s i n ga d v a n c e dr e c o m b i n a n td n a s o m a t i cc e l ln u c l e a rt r a n s f e r t e c h n o l o g yt r a n s f e rh l g fig e n ei np i g si si m p o r t a n tt os t u d y t h i sr e s e a r c hr e f e r e n c e st h ep u b l i s h e dh l g fig e n es e q u e n c ei ng e n b 心q - k , u s i n gr t - p c r c l o n e dh l g fim a t u r ep e p t i d e g e n es e q u e n c e c o n s t r u c t i n gp c d n a 3 1 h i g fie u k a r y o f i c e x p r e s s i o nv e c t o rw i t h i np c m vp r o m o t e r , t h en e oa n da m pr e s i s t a n c eg e n e ，w h i c hm a ys t a b l y e x p r e s s i n gt h eg e n ep r o d u c t si nm a m m a l i a nc e l l s b yl i p o s o m ep l a s m i dt r a n s f e c t e dt h e mi n t op i g k i d i l e ye p i t h e l i a l ( p k - 15 ) c e l l s ，a n ds u f f e r i n gt h e ( 3 418c o n c e n t r a t i o ng r a d i e n ts e l e c t e dt r a n s g e n i c c l o n e dc e l ll i n e s f i n a l l y , d e t e c ta n di d e n t i f yt h ee x p r e s s i o no ff o r e i g ng e n e si nt r a n s f e c t e dc e l l s l i n e sb yr e a l t i m e - p c ra n de l i s a t h em a i nr e s u l t sa r ea sf o l l o w s ： 1 h a v ee x a c t l yc l o n e dt h eh l g fi g e n es e q u e n c ee n c o d i n gt h em a t u r ep e p t i d e ，t h es i z eo f 3l5 b p c o n s i s t e n tw i t ht h ep u b l i s h e ds e q u e n c e s 2 h a v es u c c e s s f u l l yb u i l tt h ep c d n a 3 1 - m g fie u k a r y o f i ce x p r e s s i o nv e c t o r 3 b yt h ec o n c e n w a t i o ng r a d i e n to f g 4 1 8s c r e e n e d h a v eg o t8t r a n s g e n i cc e l ll i n e s 4 a n dt h et r a n s g e n i cc e l ll i n e se x p r e s s e sh l g fig e n ea tb o t ht r a n s c r i p t i o na n de x p r e s s i o n l e v e l s t h e s er e s u l t ss u g g e s tt h a te x o g e n o u sh l g fig e n ei np k - 15c e l l s 、) l ，i t l ls t a b l ee x p r e s s i o no f t r a n s g e n i ce x p e r i m e n t sf o rt h ef o l l o w - u pp r o v i d e sat h e o r e t i c a lb a s i s k e yw o r d s ：p i g ，i g fi ，p k - 15c e l l s ，e u k a r y o t i ce x p r e s s i o n ，t r a n s g e n o s i s i i i c a n d i d a t e ：x i ey u t o n g s p e c i a l i t y ：a n i m a lg e n e t i c sa n db r e e d i n g s u p e r v i s o r ：p r o f l i ud i ， 引言 1 引言 1 ii g fi 基因的研究进展 1 1 1 胰岛素样生长因子家族概述 i g f 家族成员包括i g f s ( i g fi 和i g f i i ) ；膜表面受体。包括i g fi 型受体( i g ft y p ei r e c e p t o r , i g fir ) 和i g f i i 型受体( i g ft y p ei ir e c e p t o r , i g f i i r ) ：最少六种结合蛋白 ( i g f - b i n d i n gp r o t e i n ，i g f b p s ) 。 i g fi 和i g fi i 在体内各组织间表达差异很大：i g fi 在肝脏中表达最多，子宫其次；而 i g f i i 仅在少数组织中表达，脑内表达最多，心脏居次。i g f s 在体内影响细胞的生长和分化， 是介导g h 促进动物生长的因子，又称生长介素。i g f s 通过循环系统或局部效应的方式来在 行使功能，因此在循环系统中的浓度较高。i g f s 的合成和分泌守血中生长素( g h ) 水平控 制，循环中i g f s 对g h 的分泌又有负反馈调节作用，形成g h i g f 激素调节轴体系，大多数 动物集体的生长发育都受g h i g f 调控。i g f s 通常与结合蛋白组合，以复合物形式存在，通 过与特异性靶细胞表面受体结合实现其生物学功能。 1 1 2i g fi 基因的生物学特征 1 1 2 1 i g fi 基因的结构特征 目前，人和很多高等动物如牛、猪、羊、老鼠、鸡和鹅等的i g fi 基因序列已经被测定， 相似性很高，这说明i g fi 基因相对保守。经测定，人的i g fi 基因位于1 2 号染色体，鼠的 i g fi 基因位于1 0 号染色体上，牛的i g fi 基因位于5 号染色体上，鸡的i g fi 基因位于1 号染色体上。人的i g fi 基因序列全长大约8 0 k b 左右，由6 个外显子和5 个内含子组成，并 被定位于1 2 号染色体上的q 2 3 2 4 上。i g fi 基因是单拷贝基因，有四种不同的剪接体，长 度大至7 5 k b 小至i k b 不等，其中2 号转录本最常见。其上游没有启动子的c t t a a 或t a t a 序列；外显子1 和外显子2 是前导外显子，编码5 非编码区：外显子3 和外显子4 编码成熟 的i g fi 肽链和前提e 肽链的n 端：外显子5 和外显子6 是选择性剪接的外显子，编码e 肽 链的残余部分以及临近的3 端非翻译区。 c l a s s c l a s s2 图i - i 猪i g fi 基因结构示意图 f i g 1 - 1s c h e m a t i cr e p r e s e n t a t i o no f s t r u c t u r eo f p i gi g fig e n e e 0 n1 e x d n2 c l a s s l - e a c l a s s 2 - e b l g f ，l e a 一图匿一e 二 = 立怂：j 。l 二一二- - j ：、，j r 、。，。- ，：二：t ：， 1 30 0 0 r p m ) ，离心3 r a i n 去除残留的洗脱液， 并晾干； 1 5 将吸附柱放入一个新的干净1 5 m l 微离心管中，直接加入8 0 1 0 0 u le n d o t o x i n f r e ee b 到吸附柱上，室温放置2 r a i n 。1 30 0 0 r p m ，离心l m i i l 洗脱d n a 。 2 2 3 2 线性化质粒 选择载体骨架上a m p 抗性基因的保守限制性酶切位点( s e ai ) 3 7 c 单酶切5 h 线性化质 粒。 酶切反应体系如下： 酶( s e ai ) b u f f e r p l a s m i d s 1 0 “l 1 0 止 4 0 此 总体积 1 0 0 i t l 东北农业大学农学硕十学位论文 2 2 3 3 线性质粒的浓缩和纯化 用乙醇沉淀法回收单酶切后线性化的质粒，具体过程为：加入2 倍酶切反应液体积的在 2 0 c 预冷的无水乙醇，轻轻混匀，会立即看到片状聚集的白色d n a 沉淀( d n a 量较多的时 候才能看到) 。2 0 c 放置2 h ，7 0 的酒精洗脱两遍，溶于适量的去内毒素水中。测定浓度， 2 0 保存备用。 2 2 4p k 15 细胞转染实验 2 2 4 1 细胞培养基本操作 ( 1 ) 细胞复苏 从液氮中取出实验室保存的装有p k - 1 5 细胞的冻存管，迅速浸没在4 2 水槽中快速解 冻，轻摇冷冻管使其在l - - 2 m i n 内全部融化后，以7 0 酒精擦拭冷冻管外部，移入无菌操作 台内。将细胞悬液移入加有适量培养液的离心管中，10 0 0 r p m ，离心5 r a i n ，小心倒掉上清液， 加入适量的完全培养基轻轻混合均匀后，将细胞悬液移入培养瓶中并补全培养基，置于 3 7 5 、5 c 0 2 培养箱中培养。以解冻后2 4 h 细胞贴壁率为指标，评价冻存效果。 ( 2 ) 传代培养 待细胞长至8 0 , - - - 9 0 汇合时，倒掉培养基，用无菌p b s 将细胞洗l 3 遍，加人o 2 5 胰蛋白酶却0 4 e d t a ，3 7 消化细胞，显微镜下观察细胞变圆，加含有1 0 的胎牛血清、 2 m m o l l 谷氨酰胺、1 0 0 u m l 青霉素和1 0 0 i t g m l 链霉素( 双抗) 的d m e m 完全培养液终止 消化，轻柔吹散至单个悬浮细胞，按需要分装至2 个过更多培养瓶中，3 7 5 、5 ，c 0 2 培 养箱中进行培养。 ( 3 ) 细胞冻存 取对数生长期，状态良好的细胞，经胰蛋白酶消化后制成单细胞悬液，收集于1 5 毫升 离心管中，1 0 0 0 r p m ，离心5 r a i n ，小心吸除上清夜，加入冻存液( 冻存液主要成分体积比为 d m e m ：f b s ：d m s o = 7 ：2 ：1 ) ，使细胞密度达到3 - - 5 xl06 m l ，用吸管轻轻吹打至单 个悬浮细胞。将冻存液稀释成的细胞悬液分装入无菌塑料冻存管中，每支l m l 细胞悬液。在 冻存小管上做好标记，包括细胞名称、性别、培养代数、冻存管编号、冻存日期等。将冻存 管放入于4 冰箱中保存2 0 3 0 m i n ，然后置于_ 2 0 冰箱中预冻1 2 h ，再放于一8 0 超低温 冰箱过夜。第二天取出冻存管放入液氮中，可长期保存。将冻存的细胞数据存入到电脑保存， 包括细胞名称、性别、年龄、培养代数、培养条件、冻存管数、冻存时间、冻存位置以及冻 存经手人。 2 2 4 2g 4 1 8 筛选浓度确定试验 g 4 1 8 储存液的配s t j ( 1 0 0 p g “l ) ：l gg 4 1 8 溶于1 0m lm i l i q 水，过滤除菌，2 0 贮存。 将对数生长期的p k - 1 5 细胞按l 1 0 4 个m l 接种于2 4 孔板中，培养在含1 0 f b s 、1 双抗( 青霉素1 0 0 u m l ，链霉素1 0 0 肛g m l ) 和1 l 谷氨酰胺的高糖d m e m 培养基中，总体 积为5 0 0 p l 。将培养板置于3 7 ，5 c 0 2 的细胞培养箱中培养，2 4 h 后加入含g 4 1 8 的新鲜 培养基，使其终浓度分别为：0 、9 0 0 ( 1 此) 、1 0 0 0 ( 2 皿) 、1 1 0 0 ( 3 p l ) 、1 2 0 0 ( 4 i - t l ) 、1 3 0 0 ( 5 i _ t l ) 、 1 4 0 0 ( 6 f t l ) 、1 5 0 0 ( 7 i _ t l ) i l g m l ，设立平行对照三组，继续培养。每2 - - 3d 换一次液，维持 以上g 4 1 8 浓度。选择l 周时致死细胞的g 4 1 8 浓度作为转染细胞最适药物筛选浓度；选择2 周时致死细胞的g 4 1 8 浓度作为筛选后的维持浓度。 2 4 材料与方法 2 2 4 3 转染条件的优化 使用带有绿色荧光蛋白p e g f p c 1 质粒转染待测细胞，优化转染条件。分别设立4 个实 验组，选择最适条件进行干涉质粒的转染( p g ：此) ： 在6 孔板中分别转染a b c d 四个实验组的p e g f p c 1 载体质粒，转染后1 2h 就可以检 测，建议在2 4 3 6h 检测，以达到荧光的最好发光效果，最长不超过4 8h 。在荧光显微镜下 观察转染效率，以确定最佳转染浓度。 2 2 4 4 转染细胞及g 4 18 筛选实验 按照i n v i t r o g e n 公司l i p o f e c t a m i n e2 0 0 0 转染试剂说明书操作，转染2 4 孔板细胞。 1 转染前一天，在含0 5 m l 无抗生素培养基的2 4 孔板中接种p k - 1 5 细胞，使每孔达到 0 5 一2 x1 0 5 个细胞。待细胞汇合到9 0 9 5 时，准备转染。 2 转染复合物的制备 ( 1 ) o 8 p , g 线性化质粒d n a 稀释于无血清d m e m 培养基中，至终体积5 0 此： ( 2 ) 2 1 t l l i p o f e c t a m i n e t m2 0 0 0 转染试剂稀释于无血清d m e m 培养基中，至终体积5 0 止， 室温孵育5 r a i n ； ( 3 ) 5 m i n 后把稀释的d n a 和稀释的l i p o f e c t a m i n e2 0 0 0 混合，总体积1 0 0 p l ，轻轻混 匀，室温孵育2 0 r a i n ； 3 吸出培养基，p b s 清洗细胞l 2 次，每孔加1 0 0 m l 无血清d m e m 培养基，将孵育 2 0 m i n 后的转染复合物加入到细胞孔中。将2 4 孔板置于3 7 ，5 c 0 2 的细胞培养箱中培养， 2 4 4 8 h 后荧光显微镜下检测转染效果。 待转染2 4 - 4 8 h 后，小心将细胞消化下来，以l ：5 的比例稀释，接种到6 孔板中过夜培 养，第二天待细胞贴壁表达蛋白后，以确定好的筛选浓度加入g 4 1 8 ，轻柔混匀，每天观察 细胞状态，根据细胞状态更换培养基。 4 转染后g 4 1 8 筛选1 周左右，未转染的细胞大量死亡，维持浓度再培养一段时间，6 孔板中出现单克隆细胞群落，待其长到较大的群落时，弃掉培养基，p b s 清洗细胞，加入胰 蛋白酶浸润细胞，于显微镜下用记号笔标记较大细胞群落的位置，在超净台里用2 0 0 r a l 的微 量移液器小心吸取单克隆细胞，转移到2 4 孔板中继续培养，4 5 d 后传代培养。 2 2 5h i g fi 基因在p k 1 5 细胞内表达的检测 2 2 5 1h i g fi 基因在p k 1 5 细胞内转录水平上的表达 1 细胞总r n a 的提取： 分别将三组实验组细胞和对照组细胞，以6 孔板中单孔汇合度9 0 的细胞量为标准，按 照以下方法提取转染细胞的总r n a 。 ( 1 ) 1 0 0 0r p m