（作物遗传育种专业论文）水稻白叶枯病抗性相关基因及抗病基因类似序列的克隆.pdf

中文摘要 水稻抗病相关基因的克降有助于阐明水稻抗病的分子机制。x a 2 3 是章琦等人从我国普通野生稻 o r y z ar u f i p o g o n ) r f _ l 鉴定出来的1 个新的白叶枯病抗性基因，并己育成以感病籼稻晶种j 0 3 0 为遗传 背景的近等基因系c b b 2 3 。本研究以j g 3 0 和c b b 2 3 为材料，通过m r n a 差异显示技术和基于同 源序列的候选基因法，对抗、感近等基冈系材料接种痫原【笥后1 、3 、5 、7 、1 0 天得到的e d n a 进 行r t - - p c r 分析，分离前：抗、感近等基冈系问差异表达的e d n a 片段，期望找到与抗病基因连锁 或相关的基因片段，为克降x a 2 3 基提供条件。 通过m r n a 差异显示技术获得5 个在抗、感近等基因系间著异表达的e d n a 片段。其中片段 c u l 0 在感痛材料j g 3 0 接种病菌后1 1 0 天期间的表达量基奉不变，而在抗病近等基田系c b b 2 3 接种病菌厉的同一时段内所发达量普遍大丁感病材料，i l l h 其表达量随着接种病菌后时间的延k 增 强。序列同源件比对结果袭明：c u l 0 与水稻接种稻瘟病菌6 、2 4 小时后获得的4 个e s t 序列 ( c b 6 6 3 8 0 1 、c b 6 5 8 0 7 9 、c b 6 5 1 0 7 5 、c b 6 4 8 3 3 8 ) 有9 9 ( 3 6 8 3 6 9 ) 的同源性。据此推测，c u l 0 序列来源于水稻基因组，其发达受到病原菌的诱导，其产物可能延水稻抗病信号传导途径中某种共 同冈子。将其电子定位到水稻第2 号染色体。其它4 个e d n a 差异片段，在g e n e b a n k 中未搜索到 具有明显同源性的序列，推测可能是新的e d n a 片段。 根据s t k 类抗病基冈保守区没计引物，从抗、感近等基冈系中均扩增出条4 7 2 b p 大小的条带， 序列分析表明：该片段与通过差异显示方法所获得的c u l 0 是同一序列，根据与其高度同源的e s t 序列，将其延长为1 0 3 0 b p ，记为r t k ；多序列比对显示，r t k 上游序列与水稻接种稻瘟病菌6 、2 4 小时后获得的e s t 完全相同，而与未接种对照莘别较人；r 游亍, y l j 在对照与接种病原菌斤得到的 e s t 之问没有差别。通过设计引物，在抗病的c b b 2 3 中扩增r t k 全长序列，而在感痫亲奉j g 3 0 中没有扩增出条带；证实了电r - 延长的正确性，同时也说明r t k 基闪与抗病性存在着某种联系。 r t k 育一个完整的开放阅读框，其编码的蛋白质具有信号肽和跨膜结构域，可能是一个具有磷酸化 功能的跨膜蛋白。 根据n b s l r r 类抗病基闪保守区设计引物，从抗、感近等基因系中扩增出一条5 0 0 b p 人小的 条带，测序后获得r2 类不同的n b s l r r 类抗性基因同源序列，其中n b l 欧5 1 4 b p ，电子定位于 第1 1 号染色体6 9 7 8 5 k 6 9 7 9 1 k 处；n b 2 长5 0 5 b p ，电r 定位丁第1 1 号染色体2 9 7 0 7 9 k 2 9 7 0 8 5 k 处。二者的d n a 序列同源性只有3 0 ，但编码的氨基酸序列均具有n b s - l r r 类抗性基因的典型 保守结构，同源性搜索显示与已克隆的n b s l r r 类抗性基闪同源序列有较高的同源性说明n r l 和n b 2 是n b s - - l r r 类抗性基因同源片段。它们与抗病性的关系有待获得全长e d n a 序列卮再进 行分析鉴定。 根据胞外l r r 类抗病基因保守医设计引物，从抗、感近等基因系中获得了2 个r g a 序列：l r l 和l r 2 。序列分析发现，l r l 和l r 2 不具有l r r 类抗病基因的典型保守结构域。推测两片段与目 的抗性基刚无关。 对图位克隆法获得的4 个抗病候选基阑进行r t - p c r 分析，表明4 个候选基因在转景水平上均 有表达。 关键词：水稻，白叶枯病，m r n a 著异显示，抗病基因同源序列 a b s t r a c t b a c i c r i a lb l i g h t ( 船) c a u s e db yx a n t h o m o n a so r y z a ep v o r y z a e ( x o o ) i so n eo ft h e “”8 。o ” d i s e a s e s o fr i c e x a 2 3 , a n e w b br e s i s t a n c e g e n e w a s i d e n t i f i e d f r o m o r u f i p o g o n 。ap a i ro fr i c e n e a t i s o - g e n l cl i n e ，c b b 2 3 ( c a r r y i n gx a 2 3 ) a n dj g 3 0 ( w i t h o u tb b r e s i s t a n c eg e n e ) w a su s e di nt h i ss t u d y i no r d e rt os t u d yt h em 0 1 e c u l a rm e c h a n i s mo fb br e s i s t a n c ea n dc l o n en e wg e n e sr e l a t e dt ob b ，m r n a d i 丘b r c n b a id i s p l a y ( d d a n dr e s i s t a n c eg e n ea n a l o g ( r g a ) d o n i n gm e t h o d sw a su s e dt oa n a l y z e t h ed i f f e r e n c eo fg e n ee x p r e s s i o nb e t w e e naj g 3 0a n dc b b 2 3 f i v ed i f f e r e n t i a l l ye x p r e s s e de d n af r a g m e n t sw e r eo b t a i n e db yd d r e v e r s en o h e mb l o t t i i 培 a n a l y s i si n d i c a t e dt h a tt h ee x p r e s s i o no fc u l 0 i sh i g h e ri nc b b 2 3t h a ni nj g 3 0 i tw a sa l s on o t i c e d t h a tt h ee x p r e s s i o no f c u l 0b e c o m es t r o n g e ri nc b b 2 3f o l l o w i n g1 dt o1 0 da f t e ri n o c u l a t i o nw i t h x o o w h i l ew a sn oc h a n g ei nj g 3 0 s e q u e n c i n ga n db l a s ts e a r c h i n gi n d i c a t e dt h a tc l o n ec u i oh a s9 9 h o m o l o g yw i t h4f a s t sf r o mr i c el e a v e s6 ，2 4ha f t e ri n o c u l a t i o nw i t hp y r i c u l a r i ag r l s e a t h er e s u l t s s u g g e s t e dt h a tc u l 0i saf r a g m e n to fr i c eg e n o m e t h ee x p r e s s i o no fc u i ow a ss t r o n g l yi n c r e a s e db y b a c t e r i u mi n o c u l a t i o ni nc b b 2 3 i ti sp r e d i c t e dt h a tt h ep r o d u c to fc u l 0m a yb eo n eo ft h ec o n l l l o n s i g n a lt r a n s d u c t i o nc o m p o n e n t si nr i c ed i s e a s er e s i s t a n c e ，c u i ow a sl o c a l i z e do l lc h r o m o s o m e2 t h e o t h e r4e d n af r a g m e n t sh a dn os i g n i f i c a n ts i m i l a r i t yi nt h eg e n e b a n k ，s ot h e ym a yb en e wg e n e f r a g m e n t s a 4 7 2 b pf r a g m e n tw a sa m p l i f i e db ys t kc o n s e r v e dp r i m e r sb a s e do nr g ac l o n i n gm e t h o d s s e q u e n c ea n a l y s i si n d i c a t e dt h a ti t s h a r e s1 0 0 h o m o l o g yw i t hc u i o i tw a se x t e n d e dt o1 0 3 0 b p b a s e do i lt w o1 0 0 h o m o l o g u ee s t sa n dd e s i g n a t e da sr t i cm u n i p l es e q u e n c ea l i g n m e n ts h o w e dt h a t t h eu ps t r e a ms e q u e n c e so fr t ka r et h e8 a l n ea st h et w oe s t so b t a i n e df r o mt h e6 h ，2 4 ha f t e r i n o c u l a t i o nw i t hj ，c u l a r i ag r i s e a ，b u tq u i t ed i f f e r e n tf r o mt h eu n a f f e c t e dc o n t r 0 1 t h e r ea t en o d i f f e r e n c e sb e t w e e nt h ed o w ns t r e a ms e q s u e n c e so ft h ef a s t so b t a i n e d6 h ，2 4 ha f t e ri n o c u l a t i o nw i t h p y r 缸u l a r i ag r i s e aa n dt h eu n a f f e c t e dc o n t r 0 1 f u l ll e n g t ho fr t kc a nb ea m p l i f i e df r o mt h er e s i s t a n c e l i n ec b b 2 3b yp r i m e md e s i g n e db a s eo hl l ! n 0b u tc o u l dn o ta m p l i f i e df r o mt h es u s c e p t i b l el i n ej g 3 0 b yt h es a m ep r i m e r s t h i sr e s u l t ss u g g e s t e dt h a tt h ee x t e n s i o no fr t ki sr i g h ta n dr t kh a ss o m e r e l a t i o n s h i pw i t hd i s e a s er e s i s t a n c e r t kh a sat x ：r f e c to r ft h a tc o d ep r o t e i n sw i t hs i g n a l - p e p t i d ea n d t r a n s m e m b r a n er e g i o n i ti sp r e d i c t e dt h a tt h ep r o d u c to fr t km a yb eat r a n s m e m b r a n ep r o t e i nw i t h p h o s p h o r y l a t i o ns i t e t w os o r t so fr g a sw e r eo b t a i n e db a s e do nn b sc o n s e r v e dd o m a i n s n b la n dn b 2s h a r e d3 0 h o m o l o g yi nd n as e q u e n c ea n dw e r ea l ll o c a l i z e do nc h r o m o s o m e1 1 。i ti sk n o w nt h a ts e v e r a lo t h e r d i s e a s er e s i s t a n c eg e n e sa r el o c a l i z e do nc h r o m o s o m e1 1t o o d e d u c e da m i n oa c i ds e q u e n c e so fn b l a n dn b 2h a v et h et y p i c a lc o n s e r v e dd o m a i n so f n b s b l a s ts e a r c hs h o w e dt h a tn b l a n dn b 2 h a dh i g h h o m o l o g yw i t hc l o n e dn b s - l r rr e s i s t a n c eg e n ea n a l o g s ( r g a s ) ，i ti sv i d e n tt h a tn b la n dn b 2 b e l o n gt ot h ec l a s so fn b s - l r rr e s i s t a n c eg e n ca n a l o g s t h er e l a t i o n s h i pb e t w e e nn b l ，n b 2a n d d i s e a s er e s i s t a n c er e m a i nu n k n o w nu n t i lt h ef u l ls e q u e n c eo f n b la n dn b 2w i l lb en n d e r s t o o d l r la n dl r 2 ，t w ok i n d so fr g a s ，w e r eo b t a i n e db a s e do nl r rc o n s e r v e dd o m a i n s s e q u e n c e a n a l y s i ss h o w e dt h a tl r la n dl r 2h a dn os i g n i f i c a n tl r r c o n s e r v e dd o m a i n t h e ym a yh a v en om o r e e f f e c t sf o rr e s i s t a n c et od i s e a s e r t - p c ra n a l y s i sw a sc a r d e do u tt oi d e n t i f yt h ee x p r e s s i o n sm a n n e r so f4c a n d i d a t e 胁2 3g e n e s t h a tw e r eo b t a i n e df r o mm a p b a s e dc l o n i n g r e s u l t ss h o wt h a ta l l4c a n d i d a t eg e n e sw r ee x p r e s s e di n m r n a1 e v e l k e yw o r d s ：r i c e ；b a c t e r i ab l i g h t ；m r n a d i f f e r e n t i a l l yd i s p l a y ；r g a 缩略词表 a f l p b a is t b p d d h 2 0 d d r t e b e d l l a e s t s h r l r r l z n b s n i l o r f p c d p c r r a p d i a r f r g a r g p s a s a r s n p s s h s s r s t k s t s n n _ p c r t e 忸d n r t m 缩略词表 a m p l i f i e df r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m b a s i cl o c a la l i g n m e n ts e a r c ht o o l b a s ep a i r d o u b l ed i s t i l l e x iw a t e r d i f f e r e n t i a ld i s p l a yr c v e r s et r a n s c r i p t i o n e t h i d i u mb r o m i d e e t h y l e n e d i a m i n e t e t r a a c e t a t e e x p r e s s e ds e q u e n c et a g s h y p e r s e n s i t i v er e a c t i o n l e u c i n e r i c hr e p e a t l e u e i n ez i p p e r , n u d e o f i d eb i n d i n gs i t e n e a r - i s o g e n i cl i n e o p e nr e a d i n gf r a m e p r o g r a m m e dc e l ld e a t h p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n r a n d o m l ya m p l i f i e dp o l y n l o 啦i cd n a r e p r e s e n t a t i o n a ld i f f e r e n c ea n a l y s i s r e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i ：s m r e s i s t a n c eg e n ea n a l o g y r i c eg e n o m or e s e a r c hp r o g r a m s a l i c y l i ca c i d s y s l e ma c q u i r e dr e s i s t a n c e s i n g l en u d e o t i d ep o l y m o r p h i s m s u p p r e s s i o n s u b t r a e t i v eh y b r i d i z a t i o n s i m p l es e q u e n c er e p e a t s e r i n e - t h r e o r i nk i n a s e s e q u e n c et a g g e ds i t e t h e r m a la s y m m e t r i ci n t e d a e e dp c r t e t r a m e t h y l e t h y l e n e d i a m i n e t o l la n di n t e r l e u k i n - r e c e p t o r t r a n s m e m b r a n e 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。 尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰 写过的研究成果，也不包含为获得巾国农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过 的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的蜕明并 表示了谢意。 研究生签名：专 时削：年6 月，争伺 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送 交论文的复印件和磁赫，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手 段保存、汇编学位论文。同意中国农业大学町以用不同方式在4 i 同媒体上发表、传播学 位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名 导师签名 j 、一t ：纱 敬掺夺 时间：瑚年b 月) 9 日 时可：矽吁年1 f 月，乎日 中国农业大学博士学位论义 第一章文献综述 第一章文献综述 1 1 植物抗病基因的研究进展 1 1 ，1 植物的抗病性及抗病机制 自然界存在着上千种植物病害，据不完全统计，能够侵害植物的病毒有4 0 0 多种，细菌有 3 0 0 余种，它们给全世界农业生产造成严重减产，产生严重经济损失。另外在危害农作物的 自然病害中真菌病害也是十分严重的一类，如稻瘟病等，它们直接影响到一些重要的农作物， 造成严重的农业减产和经济损失。植物病害不仅会造成农作物的减产或经济上的损失，也可能 带来重大的社会影响，如1 9 世纪( 1 8 4 5 - 1 8 6 0 ) 在爱尔兰发生的马铃薯晚疫病大流行，这次人流 行导致1 0 0 万人饥饿，升迫使另外1 0 0 万人移民北美；上世纪7 0 年代初美国爆发的玉米h 斑病 大流行使美国玉米当年减产1 5 ，曾再次引发全球恐慌。 通常情况r 植物具有抵抗病原菌侵染的能力，能够避免灾害的发生。植物对外界病原菌的 防御体系包括其自身固有的和痛原菌诱导的两种。前者主要包括细胞壁的角质、蜡质、术质素、 特殊的气孔结构、小分子抗病物质( 如毒性脂肪酸、酚类化合物、类砧与类黄酮类植保素以及 有关的过氧化物酶、多酚氧化酶与苯丙氨酸解氨酶等1 、种子固有的抗真菌蛋白和能与真菌儿r 质结合的凝集素、破坏真菌细胞透性的蛋白质和核糖体失活蛋白等( 王钧，1 9 9 s ) 。而后一类属 于植物第二层防御体系，只有当病原菌突破植物固有的第一道防线时才起作用。病原菌诱导的 防卫系统义可分为局部和系统的抗病反应两种。前者主要是指过敏反应( h y p e r s e n s i t i v er e a c t i o n ， h 鼬，即当植物受1 r 亲和性病原菌感染后，侵染部何细胞迅速死亡，使病原菌不易获取养分， 同时又诱导周围细胞合成抑制病原菌生长的物质，从而限制了病原菌的增殖( 1 - i a m m o n d - k o s a c k a n dj o n e s ，1 9 9 6 ) 。在h r 过程中的细胞死亡，过去称为坏，e f e c m s i s ) ，现在被认为是编程性细 胞死亡“p m g n l e dc e l ld e a t h ，p c d 或a p o p t o s i s ) ( d a n # e ta 1 ，a 9 9 0 。而后者是建立在前者基 础之一 的，又称系统获得抗一陛( ( s y s t e ma c q u i r e dr e s i s t a n c e s a r ) 。它是指植物受病原菌侵染后局 部的h r 会产生一类信号分子，这种信号分子能诱发整个植株防卫基因的表达，从而使植物对 更多的病原菌产生抵抗作用。其特点是不出现局部抗性那样的枯斑，却能抗多种病原物引起的 病害( r y a l se ta 1 ，1 9 9 6 ) 。 多年研究结果表明，诱导防卫反应是由植物特异抗病基因介导完成的( n a n g la n d j o n e s , 2 0 0 1 ) 。从目前来看，至少有4 类不同的作用机制。1 ) 、抗病基因编码产物能钝化病原菌 侵染时产生的毒素，进而抑制病原菌的繁殖。往往会出现植物局部坏死的症状。这种机制典型 的例子就是j o h a l 和b d g g s ( 1 9 9 2 ) 克隆的世界上第一个植物抗病基因h m l 。该基因能编码依赖 于n a d p h 的h c 毒索还原酶，该酶能使玉米圃斑病菌生理小种1 所产生的毒素失活，从而使 玉米获得抗性。2 ) 、显性基因能编码病原菌致病性的靶标物。若植物缺乏该靶标物就会产生抗 性。这方面的例子是玉米线粒体基冈t - u r f l 3 ，浚基冈不仅能编码与雄性不育有关的蛋白，也能 编码与病原菌b i p o l a r i sm a y d i s 生理小种t 分泌毒素亲和的产物，导致玉米与病原龄发生亲和性 中冈农业大学博十学位论文 第一章史献综述 且作，即植株感病。而缺乏该基因的玉米晶种则抗该种病原物( b r a u neta 1 ，1 9 8 9 ) 。最近，v o g e l 等但0 0 2 ) 在拟南芥抗白粉病研究中也发现类似的机制。3 ) 、抗病基冈表达产物直接引发抗病反应。 到目前为止。只在大麦中发现这种作用机制。研究发现大麦显性基阂m l o 编码由5 3 4 个氨基 酸残基组成的分f 量为6 0 k d a ，含7 个跨膜域的膜锚定蛋白它可能是植物细胞死亡和其他防 卫系统的负调控因子，i i 了含隐性基因r n l o 的植株则能抵抗病原菌e r y s i p h eg r a m i n i sfs ph o r d e i 的侵染( b t t c h g e se t a t ，1 9 9 7 ) 。4 、植物抗性基因表达产物能特异性识别病原菌中相戍无毒基因 编码的产物，并产生信号分子，这些信号分子经信号传递因子传递后，开启植物防p 基闪的表 达最终对病原菌产生抗性。这就是著名的基因对基网假说( f l o g1 9 7 1 1 。这种防作用机制在 植物中普遍存在，也是目前研究最深入的一种作用机制。抗病基因编码的产物与病原菌无毒基 冈表达产物直接或间接结合后会引发一系列反应，如蛋白磷酸化、c a ”浓度变化、活性氧变化、 水杨酸变化和离子流等( y a n g ela 1 1 9 9 7 ) 。植物防卫基因的表达主要包括谷胱苷肽s 转移酶、 过氧化物酶、细胞壁蛋白、蚩自酶抑制荆、水解酶( 如几j _ 质酶和1 ，3 一b 葡聚糖等) 及涉及 次级代谢的；嗣鼙相关o a n l o g 日l s r e l a t e d p r ) 蛋向和酶等( z 1 1 ue ta 1 ，1 9 9 6 ) 。 目前所克隆的抗病基因大部分都编码l r r - - n b s ( 表1 ) ，而且序列同源性很高( g e y e r se t a l ，2 0 0 2 ) ，而病原菌的种类千变万化，植物在诱导防卫反应中如何战胜病原菌侵袭的问题己引 起世界各国科学家的酱遍芙注。近十年来，人们对植物抗病基因表达产物与病原菌中相应的无 毒基因编码产物是否直接反应以及植物从病原菌的起始识别到诱发防卫基因表达过程中信号如 何传导等问题进行了广泛地研究，并取得了明显进展。据d e w i t ( 2 0 0 2 ) 和b o g d a n o v e ( 2 0 0 2 ) 报道，目前除番茄抗细菌叶斑病基因p t o 和水稻抗稻瘟病基因p i t a 编码的产物能与病原菌中 相应的无毒基因表达产物直接作用外，大部分抗病基因表达产物并不能直接与病原物中相应的 无毒基因编码产物作用。最近，m a c k e y 等( 2 0 0 2 ) 在拟南芥抗丁香假单胞的基因r p m l 抗性机制 研究中发现，j 香假单胞中无毒基因a v r b 和a v r r p m l 编码产物并不直接与抗病蛋白r p m l 结合， 而是首先与蛋白质r i n 4 结合形成复合体才能识划抗病基因所编码的蛋白。 人们研究发现，植物抗病基因引发防卫基因表达的信号传导途径是多种多样的，如水杨酸 途径( g a f f n e ye ta 1 ，1 9 9 3 ：d e l a n e ye ta 1 ，1 9 9 4 ) ，茉莉酸途径( v i j a y a ne ta 1 ，1 9 9 8 ) 和 乙烯途径( p e n n i n c k xe ta l ，1 9 9 6 ) 等，涉及许多信号传导相关因子( d o d d sa n ds c h w e c h h e i r r e r ， 2 0 0 2 ；n i s h i m i r aa n ds o m e r v i l l e ，2 0 0 2 ) 。虽近，英国和荚国等发达国家的几个世界著名实验 室在植物抗病机制研究中发现两个抗病信号传导的f 游调控因子r a r l 和s g t i 在防口反应中发 挥重要作用( a u s t i ne ta l ，2 0 0 2 ；a z e v e d oe ta l ，2 0 0 2 ) 。 随着功麓基因组和比较基因组学的不断发展，人们将会对植物细胞与病原菌之间的相互 识别机理、各种信号分子信号传导机制以及多种信号传导途径的相互关系有更深入的了解，从 而揭示植物抗病分子机制的奥秘，为植物抗病基闶丁程研究与应用打下坚实的基础，同时也将 极大地丰富现代分子生物学的内涵。 表卜1已克隆的植物抗病基因及其结构特征 t a b i e lc l o n e dp l a n td i s e a s er e s i s l a n c eg e n e s 垡缝 奠丛生垦疸厦堕缝塑堑堑 o r y z a s a t i v a x a - 2 1 x a l 讲l a m o n a s o r y z a e p v o r y z a e l r k p k x a - 2 6 x a n t h a m o n a so r y z a ep v o r y z a el r rp k x a - 1x a n t h a m o n a so r y z a ep v o r y z a el z - n 强- l r r 2 中困农q k 大学博士学位论文 第一章立献综述 p i - b m a g n a p o r t h eg r i s e a i c b s - l r r ! ：塑 m ! 艘p ! 些! 匹些! 一堡曼：生坠一一 s o l a n u i r l lt u b o t o s u m r x - 1 r x - 2 g p a 一2 p o t a t ov i r u s x 舶缸t ov i r u s x g l o b o d e r a p a l l i d 口 l 不n b s l r r 必n b s l r r 1 2 ，n b s l b r 曼! 必生塑! b 墼堕塑望：塑! ：燮一 h o r d e u ms a t i v u m m l a m l a l e r y s i p h eg r a m i n i s b l u m e r i ag r a m i n i s f s ph o r d e i z n b s - l r r n b s l r r r p g lp u c c l n i a g r a m i n i s f s p t r i a d r k hml c o c h l i o b o l u sc a r b o n u m t r 。 r p l d p u c c i n i as o r g h i l z - n b s - l r r 墅堑鲤塑婴! 照堡塑! 垫塑篓堂丝堡里堕丝 型望蔓：垡堡 r p s 2p s e u d a m o a ss y r i n g a ep vt a r a t o l z - n b s l r r r p m l r p p 5 r p p l ，1 0 ，1 4 r p p 8 r p s 5 r p s 4 r p p l 3 臁t r p w 8 r r s l 一r s s l 4 r c y l p s e u d a m o n a ss y r i n g a e p vm a c u l i c o l a p e r o n o s p o r a p a r a s i o t i c a p e r o n o s p o r a p a r a s i o t i c a p e r o n o s p o r a p a r a s i o t i c a 飓a 幽m m m 5s y r i n g a e ，缸m l d p s e u d a m o n a ss y r i n g a ep v t a r a t o p e r o n o s p o r a p a r a s l o t i c a t u r n i pc r i n k l ev i r u s e r y s i p h ec r u c i f e r a r u m r a l s t o n 妇s o l a n a c e a m m p s e u d o m o n a s5 y r i n g a ep v m a c u t i c o l a c u c u m b e r m 0 3 a i cv i r u s l 玉n b s l r r t 珉- n b s l r r r - n b s - i 腿 l 玉n b s - l 职 l z 邶s - l r r m n b s i 腿 l 己n b s - i 腿 l z n b g - 器r n b s 一腿r t i r - n b s - l r r 1 t n b s i 腿 n b s i 且r 壁壁堡翌蝤2 旦塑趔塑也堕塑里垦塑璺：垡堡 p r o p a e u d o m o n a s , s y r i n g a e p v w “l l 口p k l y c o p e r s i c u t l e s c u l 6 1 1 t i i m c f - 9 c 2 c f - 4 ( 善5 m j 皿 h c r 9 4 e s w 5 v e h e r o c l a d o s p o r i l u n f u l v u m c l a d o s p o r i u mj i t v u m f u s a r i u mo x y s p o m m c l a d o s p o r i u m f u h u m c l a d o s p o r i u m 血l v u m m e l o i d o g y n ei n c o g n i t a f u s a r i u mo x y s p o n “m c l a d o s p o r i u m 如i v u m t o s p o v i r u s v e r t i c i u i u m a l b o - o a t r u t l g l o b o d e r ar o s t o c h i e n s i s i 且r 1 m l r r t m n b s ，i 。r r u 腿j i m u 阻- 1 m l 玉n b s i r r n b s l r r u u r 1 m l z - n b s u t r c s l r n b s i 。r r i l u m u s i t a t i s s i m u n l 6 m m e l a m p s o r al i n i m e l a m p s o r al i n i t i r _ n b s l r r t 瑾0 n b s i 且r 婴! 丛丝监塑型塑!堡：女! 变：坚墨 婪i 鲤堕垫! 尘! 塑婴堡堕地型箜! 堑咝塑堕卫堂丛哩 堡塑! 尘g ! 查璺! 竺些! 堡睦丝逊! 盟型堡型 功啦c a s a t i v a d m 3 b r e n 抽如c t u c an b s - l r r 独! i 塑些业! 粤里蟹墨堑丝鲤鲤墅塑型燮煎塑璺：丛堡 l r r 富含亮氨酸重复单位；p k 蛋白激酶；n b s 核昔陂结台位点；l z 亮氨酸拉链；r i 口l p 类似受体激酶虽臼：t r 毒 索土原酶；t i p 白细胞介素l 一受体；t m 跨膜域；c s l r 类似细胞表面受体 ， 中周农业大学博十学位论文 第一审文献综述 ! ! ! ! e ! ! ! ! ! 鼍曼! 寰! 曼! 鼍! ! 曼! 曼! 皇皇曼皇_ _ 量曼曼曼曼曼曼! 曼曼量詈皇i pi,i墨 1 1 2 已克隆的植物抗病基因 抗病基凼是植物病原菌相互关系中的一个关键冈子，是抗病机制研究的基础。抗病基冈 的克隆将有幼于更快地揭示寄丰与病原茵相互作州的分子机理，推动植物分子病理学与分子生 物学的发展。因此，对抗病基因的分离与分析成为当今科技界的热门课题，并己取得显著进展。 据不完全统计，人们己利用不同的方法从各种粮食、经济作物利其他植物中克隆山4 8 个抗病基 因( 表1 ) 。其中大部分基因从双子叶模式植物番茄( l y e o p e r s i e i n ne s e u l e n o 和拟南芥 ( 4 r 日b i d o p s i st h a l i a n a ) 中获得。在粮食作物中，人们己克隆到1 5 个抗病基因，其中水稻( ( ) r y z a s a t i m ) 5 个，马铃薯( s o l a n u mt u b e r o s e s ) 4 个，大麦( h o r d e u nv u l g a r e ) 3 个，玉米( z e a m a y 砷2 个和小麦( t r i t i c t m la e s t i 订1 个。从表1 可以看到，不同的植物克隆到的r 基因的数量 是不一样的，这是由丁各种植物基因组研究的基础不同如遗传图谱、物理图谱的紧密度、转 座子研究的情况以及转化方法的难易，使从不同植物中克隆r 基因的难度不同。基因组小的分 子生物学研究基础较好的模式植物如拟南芥、番茄、水稻比较容易克隆到r 基因，而基因组人 的，分子生物学研究还不够深入的植物如小麦，则克隆r 基因相对困难。从表中可以看出，植 物r 基因结构与抗何种病原物并无直接联系。虽然这些r 基因抗不同的病原物，但它们的产物 在氨基酸水平上却有共同的特征保守结构域，这些保守区很可能是r 基因的功能医，它们决定 rr 基因抗哪种病的哪个生理小种。 1 13 抗病基因的保守区 1 亮氨酸拉链( 1 e u e i n ez i p p e r ，l z ) l z 存在于一些寡聚蛋白中，其结构为x x x a x x l ( i 。代表亮氨酸，a 代表疏水氨基酸，x 为任 意氢基酸) 。即每7 个氨基酸残基构成一个重复，第4 位置上为一个疏水氨基酸，而第7 位置上 为( 异) 亮氨酸。这些( 异) 亮氨酸在蛋白质二级结构中形成a - 螺旋的疏水脊，在疏水作用下，两 个l z 中的异( 亮) 氨酸残基形似拉链，将其所在的亚基聚合成同二聚体或异二聚体( k o b ee t a l 1 9 9 4 ) 。与1 z 相似的卷曲螺旋( c o l l e d c o l l ) 结构区能促进不同功能的蛋白之间相互作用， 如d n a 结合蛋白、肌球蛋白以及g 蛋白的1 3 和y 亚基均具有l z 结构【b e n t ，1 9 9 6 ) 。r 基因产 物是否通过l z 与其他信号分子相互作用还有待进一步研究。 2 与果蝇t o l l 蛋白及哺乳动物白细胞介素一1 受体相似的区域( t o l la n di n t e r l e u k i n 一1 r e c e p t o r ，t i r ) 果蝇t e l l 蛋白及哺乳动物的白细胞介素一1 受体，在各自的免疫系统信号传导过程中起 重要作用。它们通过对病原物的某些分子的结合，将信号传导给传导因子，如果蝇的d i f 因子 和哺乳动物的n f kb 网子。这些传导因子获得从细胞质向细胞核内运输的能力，并与各免疫 反应基因的启动子相结合，引起免疫反应基因的表达，从而对病原物产生抗性( d i n e s he ta l ， 1 9 9 5 ) 。r 基因的t i r 结构不但在序列上与果蝇t e l l 蛋向或哺乳动物的向细胞介素( i l 一1 b ) 有 相似性，它们在抗病中的反应也是相似的。如与i l 一1b 结合的n f kb 可以刺激活性氧的产生， 而n f kb 的活性还受水杨酸类物质的调节，在r 基因抗病反应中也观察到有活性氧的迸发 4 中国农业人学博士学位论文第一章史献综述 ( o x i d a t