（动物营养与饲料科学专业论文）猪苓液体发酵及其多糖活性的研究.pdf

c l a s s i f i e dc o d e ：$ 8 5 3 7 + r 2 8 2 7 1 c o n f i d e n t i a ld e g r e e ： u n i v e r s i t yc o d e ：1 0 3 8 9 ， g r a d u a t en u m b e r ：1 0 7 5 7 1 2 d i s s e r t a t i o nf o rm a s t e r sd e g r e eo ff a f u s t u d y o np o l y p o r u su m b e l l a t u sl i q u i df e r m e n t a t i o na n d t h ea c t i v i t yo fi t sp o l y s a c c h a r i d e s c a t a g o r y ：a g r o n o m y f i r s t - l e v e ld i s c i p l i n e ：a n i m a ls c i e n c eh u s b a n d r y s e c o n d - l e v e ld i s c i p l i n e ：a n i m a ln u t r i t i o na n df e e ds c i e n c e r e s e a r c hf i e l d ：f e e da d d i t i v e s p o s t g r a d u a t e ： s u p e r i o r ： x i n l i a n gz h a n g a s s o c i a t ep r o f c h e nq i a n g p r o f z h i ji a nh u a n g s u b m i t t e dd a t e ： a p r i l ，2 0 10 独创性声明 本人声明，所呈交的学位( 毕业) 论文，是本人在指导教师的指导下独立完成的研 究成果，并且是自己撰写的。尽我所知，除了文中作了标注和致谢中已作了答谢的地方 外，论文中不包含其他人发表或撰写过的研究成果。与我一同对本研究做出贡献的同志， 都在论文中作了明确的说明并表示了谢意，如被查有侵犯他人知识产权的行为，e h 本人 承担应有的责任。 学位c 毕业，论文作者亲笔签名：玩勤彩日期：h 7 。石沙 1 论文使用授权的说明 本人完全了解福建农林大学有关保留、使用学位( 毕业) 论文的规定，即学校有权 送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或部分内容，可 以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。 保密，在年后解密可适用本授权书。 口 不保密，本论文属于不保密。 口 学位( 毕业) 论文作者亲笔签名：专象 指导教师亲笔签名： 黟已 b 细6 。沙 沙co 6 t ， 期 期 日 日 衫 幼 1 6 发展前景2 2 液体发酵在药用真菌中的运用2 2 1 真菌液体发酵概述：2 2 2 液体发酵的工艺和特点。3 2 3 液体发酵的优点3 2 4 真菌液体发酵的应用举例4 3 多糖研究进展4 3 1 多糖的提取、纯化和结构分析5 3 2 多糖的生物活性9 4 本论文的研究意义和内容1 3 第一章猪苓菌株的筛选1 5 l 材料1 5 1 1 试验材料15 1 2 试验试剂15 1 3 试验仪器15 ：! ：方法11 ； 2 1 无菌操作室的消毒15 2 2 马铃薯葡萄糖琼脂( p d a ) 培养基的制备1 6 2 3 猪苓菌株的复壮1 6 2 4 猪芩菌种的筛选1 7 3 结果。l7 3 1 猪苓菌株的复壮结果1 7 3 2 菌株筛选观察记录1 7 z i 讨论18 4 1 菌种衰退的概念1 8 4 2 菌种衰退的原因1 8 4 3 防止菌种衰退的措施。1 9 4 4 菌种的复壮1 9 5 本章小结。l9 第二章猪苓的液体发酵代谢特性的研究2 0 l 材料2 0 l 。1 供试菌种2 0 1 2 试验试剂2 0 j u l l l 1 1 2 2 引 福建农林大学硕士学位论文 1 3 试验仪器2 0 2 方法2 0 2 1 液体发酵培养基配制2 0 2 2 不同日龄猪苓菌株对茵丝体液体发酵的影响2 l 2 3 猪苓菌丝体液体发酵生长曲线试验2l 3 结果与分析2 3 3 1 不同日龄猪苓菌株对茵丝体液体发酵的影响结果2 3 3 2 猪苓菌丝体液体发酵生长曲线试验结果2 4 z l 讨论2 4 5 本章小结2 5 第三章猪苓液体发酵条件的优化2 6 l 材料：1 6 1 1 发酵基本培养基2 6 1 2 试验试剂2 6 1 3 试验仪器2 6 2 方法2 7 2 1 液体发酵种子的培养2 7 2 2 猪苓菌丝体含量的测定2 7 2 3 猪苓液体发酵单因素分析2 7 2 4 猪苓液体发酵正交试验分析2 9 3 结果与分析3 0 3 1 猪苓液体发酵单因素分析3 0 3 2 猪苓液体发酵正交试验分析3 5 z i 讨论3 7 5 本章小结。3 8 第四章猪苓多糖的提取及其条件优化3 9 l 材料3 9 1 1 试验材料3 9 1 2 试验试剂3 9 1 3 试验仪器3 9 ：! ：；法3 9 2 1 猪苓提取单因素分析3 9 2 2 猪苓菌丝体多糖和子实体多糖得率比较4 0 2 3 猪苓发酵液中各种多糖得率的比较4 0 3 结果与分析4 l 3 1 猪苓提取单因素分析4 l 3 2 猪苓菌丝体多糖与猪苓子实体多糖得率比较4 3 3 3 猪苓发酵液中各种多糖得率的比较4 4 4 讨论一4 4 5 本章小结一4 5 第五章猪苓多糖基本理化性质和体外抗氧化活性的研究4 6 1 试验材料4 6 1 1 试验动物4 6 u 5 本章小结5 3 本研究的创新点5 3 有待进一步研究的问题5 3 参考文献5 5 缩略词表6 1 致谢6 2 i i i 6 6 6 6 7 9 9 9 2 4 4 4 4 4 4 4 4 5 ( 2 ) 观察记录不同试管斜面培养基菌龄对发酵适应期和对数生长期的影响； 测定发酵液的p h 值、还原糖含量和菌丝体量，并绘制猪苓液体发酵生长 曲线； ( 3 ) 对温度、转速、接种量、装液量、碳源种类、氮源种类、碳源浓度、 氮源浓度分别进行单因素分析，对常量元素和微量元素分别进行l 4 2 3 和 l 9 3 4 正交试验分析，优化猪苓液体发酵培养基和培养条件； ( 4 ) 对猪苓菌丝体超声提取条件进行优化；采用水提醇沉方法分别对猪苓 菌丝体多糖和子实体多糖提取率进行比较；采用水提醇沉方法分别提取胞 外水溶性多糖、胞内水溶性多糖和胞内碱溶性多糖：并用苯酚一硫酸法测 定多糖含量； ( 5 ) 进行多糖基本理化性质的检验，并通过芬顿( f e m o n ) 反应、邻苯三 酚自氧化法、抑制h 2 0 2 诱导红细胞氧化溶血、抑制肝组织脂质过氧化等方 法，测定猪苓多糖体外抗氧化活性。 结果：( 1 ) 7 株猪苓菌种都活化、复壮良好；其中1 0 号菌株成活率高、生长迅 速，确定为下阶段试验菌株。 ( 2 ) 确定了2 5 日龄为最适固体斜面培养基菌龄，并绘制出了猪苓液体发酵 生长曲线。 ( 3 ) 单因素试验结果表明，猪苓发酵的最适培养条件为：温度2 6 、转速 1 3 0 r m i n 、接种量1 0 、装液量1 0 0 m l 2 5 0 m l ：碳源为马铃薯淀粉，浓度 4 o ，氮源酵母浸出汁，浓度2 ；正交试验结果表明，常量元素 m g s 0 4 7 h 2 01 0 9 、 k h 2 p 0 42 0 9 、c a c l 20 1g ；微量元素z n s 0 41 5 m g 、 m n s 0 41 5 m g 、f e s 0 40 5 m g 、v b l2 0 m g 。 ( 4 ) 猪苓菌丝体最佳超声提取条件为超声频率1 6 k h z 、液固比为2 0 、破碎 福建农林大学硕士学位论文 时问为3 0 m i n ；猪苓菌丝体多糖和予实体多糖提取率分别为3 9 、1 7 ： 猪苓胞外水溶性多糖、胞内水溶性多糖、胞内碱溶性多糖提取率分别为 6 3 m g m l 、0 8 m g m l 、1 7 m g m l 。 ( 5 ) 基本理化性质鉴定表明，所提猪苓多糖具有糖的基本性质。体外抗氧 化试验表明，猪苓胞外多糖具有较好的抗氧化作用。在多糖浓度为 8 0 m g m l 时，其对羟自由基清除率达6 0 3 ；在多糖浓度为6 0 m g m l 时， 其超氧阴离子自由基清除率为4 9 8 ；当多糖浓度为3 0 m g m l 时，对h 2 0 2 诱导的小鼠红细胞氧化溶血的抑制率可达3 5 5 ；当浓度为4 0 m g m l 时， 对脂质过氧化抑制率达到5 6 8 。 结论：优化了猪苓液体发酵的最适发酵培养基和最适培养条件；提取出猪苓胞外 多糖，并具有一定的体外抗氧化功能。 关键词：猪苓；液体发酵；猪苓多糖；生物活性；提取 h 福建农林大学硕十学位论文 a b s t r a c t o b j e c t i v e ：t h eo p t i m u ml i q u i ds u b m e r g e df e r m e n t a t i o nc u l t u r em e d i u ma n dt h e o p t i m a lc u l t u r ec o n d i t i o n sw e r ed e t e r m i n e db yt h el i q u i df e r m e n t a t i o n t e s t ；e x t r a c ta n di s o l a t ep o l y p o r u su m b e l l a t u sp o l y s a c c h a r i d e ( p u p s ) f r o m f e r m e n t a t i o n l i q u i do fp o l y p o r u su m b e ll a t u s s t u d yo nt h ep u r i f i c a t i o no f e x o c e l l u l a rp o l y s a c c h a r i d e ，a n di t sb i o l o g i c a la c t i v i t yi nv i t r o m e t h o d s ：( 1 ) t h es e v e np o l y p o r u su m b e l l a t u s s t r a i n sf r o md i f f e r e n ts o u r c e sw e r e r e ju v e n a t i v e di nt e s tt u b e se q u i p p e dw i t hp d a c u l t u r em e d i u m ( 2 ) o b s e r v ea n dr e c o r dt h ei n f l u e n c e so fd i f f e r e n tm i c r o b i a ls t r a i na g eo f s o l i dm e d i u ms l o p eo nt h ee f f e c t so fl i q u i df e r m e n t a t i o n ；a c c o r d i n gt ot h e f e r m e n t a t i o nb r o t hp h ，r e d u c i n gs u g a rc o n t e n ta n db i o m a s s ，t h eg r o w t hl i n e o fp o l y p o r u su m b e l l a t u sm y c e l i u mw a sd r e w ； ( 3 ) s i n g l ef a c t o rt e s t sw e r ed o n et oa n a l y z et h ei n f l u e n c eo nb i o m a s s ， i n c l u d i n gt e m p e r a t u r e 、r o t a t i o ns p e e d ，n o c u l u ms i z e 、m e d i u mv o l u m e 、c a r b o n s o u r c e 、n i t r o g e ns o u r c e 、c a r b o nc o n s i s t e n c y 、n i t r o g e nc o n s i s t e n c y t h e nt h e o p t i m u mm a c r o e l e m e n ta n dm i c r o e l e m e n tf o rt h ef e r m e n t a t i o nw e r eo b t a i n e d b yu s i n gl 4 2 3a n dl 9 3 4o r t h o g o n a ld e s i g n ( 4 ) o p t i m i z et h eu l t r a s o n i ce x t r a c t i o nc o n d i t i o no fp o l y p o r u su m b e l l a t u s m y c e l i u m h o t w a t e re x t r a c t i n ga n de t h a n o lp r e c i p i t a t i n gm e t h o dw a s e m p l o y e d t oi s o l a t ep o l y p o r u su m b e l l a t u se n d o c e l l u a rp o l y d a c c h a r i d eo f c o e n o c y t i cm y c e l i u m a n ds u b - e n t i t i e sb e t w e e nw h i c hp o l y d a c c h a r i d e e x t r a c t i o nr a t i oi sc o m p a r e d h o tw a t e re x t r a c t i n ga n de t h a n o lp r e c i p i t a t i n g m e t h o dw a se m p l o y e dt oi s o l a t ee x o c e l l u l a rw a t e r b a s ep o l y s a c c h a r i d e 、 e n d o c e l l u a rw a t e rb a s e p o l y d a c c h a r i d e a n de n d o c e l l u a ra l k a l is o l u b l e p o l y d a c c h a r i d ef r o mt h ef e r m e n t a t i o nb r o t h t h ec o n t e n to ft o t a ls u g a rw a s d e t e r m i n e db yp h e n o l - s u l f u r i ca c i dm e t h o d ( 5 ) t h eb a s i cp h y s i c a la n dc h e m i c a lp r o p e r t yw o u l db et e s t e d a n t i o x i d a n t a c t i v i t yo fe x o c e l l u l a rp o l y s a c c h a r i d ei nv i t r ow e r ed e t e r m i n e db yc l e a n i n g h y d r o x y lf r e er a d i c a l 、c l e a n i n gs u p e r o x i d ea n i o n 、r e s t r a i n i n go x i d i d a t i o no f i i i 福建农林大学硕七学位论文 e r y t h r o c y t e s 、r e s t r a i n i n gl i v e rc e ll sl i p i d p e r o x i d a t i o n r e s u l t s ：( 1 ) s e v e ns t r a i n sw e r er e j u v e n a t i v e ds u c c e s s f u l l y ；n u m b e r 10s t r a i n sw h o s e s u r v i v a lr a t ea n dg r o w t hr a t ew e r eh i g hw e r es e l e c t e df o rt h ee x p e r i m e n t a l s t r a i n s ( 2 ) d e t e r m i n et h eo p t i m u mm i c r o b i a ls t r a i na g eo fs o l i dm e d i u ms l o p ew a s 2 5 d ；f e r m e n t a t i o ng r o w t hl i n eo fp o l y p o r u su m b e l l a t u sm y c e l i u mw a sd r e w ( 3 ) t h es i n g l e f a c t o rt e s t sd e m o n s t r a t e dt h a tt h eo p t i m u mf e r m e n t a t i o n c o n d i t i o n sa r ea sf o l l o w s ：t e m p e r a t u r ei s2 6 ( 2 ，r o t a t i o ns p e e di s1 3 0 r m i n ， i n o c u l u ms i z ei s10 ，m e d i u mv o l u m ei s10 0 m l 2 5 0 m l ；4 o p o t a t os t a r c h ， 2 0 y e a s te x t r a c t ；o r t h o g o n a le x p e r i m e n t ss h o w e dt h a tt h eo p t i m u mm a c r o - e l e m e n tf o rt h ef e r m e n t a t i o na r em g s 0 4 7 h 2 01 0 9 、k h 2 p 0 42 0 9 、c a c l 2o 1 9 ， a n dt h eo p t i m u mm i c r o e l e m e n tf o rt h ef e r m e n t a t i o na lez n s 0 41 5 m g 、m n s 0 4 1 5 m g 、f e s 0 4o 5 m ga n dv b l2 0 m g 。 ( 4 ) t h eo p t i m u me x t r a c t i o nc o n d i t i o ni sa sf o l l o w ：u l t r a s o n i cf r e q u e n c y 16 k h z ，l i q u i d - t o s o l i dr a t i o2 0 ，b r e a k i n gt i m e3 0 m i n ；p o l y p o r u su m b e l l a t u s e n d o c e l l u a r p o l y d a c c h a r i d e e x t r a c t i o nr a t i oo fc o e n o c y t i cm y c e l i u ma n d s u b - e n t i t i e si s3 9 a n d1 7 ；e x o c e l l u l a rw a t e r b a s e p o l y s a c c h a r i d e 、 e n d o c e l l u a rw a t e rb a s e p o l y d a c c h a r i d e a n de n d o c e l l u a ra l k a l is o l u b l e p o l y d a c c h a r i d ef r o mt h e f e r m e n t a t i o nb r o t ha r e6 3 m g m l 、0 8 m g m l 、 1 7 m g m l ( 5 ) t h eb a s i cp h y s i c a la n dc h e m i c a lp r o p e r t ye x p e r i m e n ts h o w st h a tp o l y p o r u s u m b e l l a t u sp o l y s a c c h a r i d ea r ep o s s e s s e do fb a s i cp o l y s a c c h a r i d ep r o p e r t y t h e r e s u l t so ft h ev i t r o a n t i o x i d a t i o ns u g g e s t e dt h a te x o c e l l u l a rp o l y s a c c h a r i d eh a s g o o da n t i - o x i d a t i o na c t i o n ，w i t ht h ed o s a g eo f8 o m g m lt h ec l e a r a n c er a t eo n h y d r o x y lf r e er a d i c a lw a s6 0 3 ：、析t ht h ed o s a g eo f6 0 m g m lt h ec l e a r a n c e r a t eo n s u p e r o x i d e a n i o nw a s4 9 8 ：埘t ht h ed o s a g eo f3 o m g m lt h e i n h i b i t i o nr a t eo na u t o - o x i d i d a t i o no fe r y t h r o c y t e sw a s3 5 5 ；w i t ht h ed o s a g e o f4 0m g m lt h ei n h i b i t i o nr a t eo nl i v e rc e l l sl i p i d p e r o x i d a t i o nw a s5 6 8 c o n c l u s i o n ：t h eo p t i m u ml i q u i df e r m e n t a t i o nm e d i u ma n dt h eo p t i m a lc u l t u r e c o n d i t i o n sw e r e o p t i m i z e d ；p o l y p o r u s u m b e l l a t u s p o l y d a c c h a r i d e w e r e e x t r a c t e d ，a n dt h ee x o c e l l u l a rp o l y d a c c h a r i d ea r ed e m o n s t r a t e dh a v eg o o d i v v 猪苓为我国常用的菌类药材，已有2 0 0 0 多年的药用历史，在国内外享有盛名。 猪苓在我国应用历史悠久。早在庄子一书中名为“豕零”；神农本草经 列为中品。本草经集注记有：“枫树苓，其皮去黑作块似猪屎，故以名之。肉 白而实者佳，用之削去黑皮。”本草衍义载：“猪苓，行水之功灵，久服必损 肾气，昏入目”。本草求真载：“猪苓，凡四苓、五苓等方，并皆用此，性虽 有类泽泻，同入膀胱肾经，解热除湿，行窍利水，然水消则脾必燥，水尽则气必 走。” 1 2 猪苓的形态特征 菌核体呈块状或不规则形状，表面为棕黑色或黑褐色，有许多凸凹不平的 瘤状突起及皱纹。内面近白色或淡黄色，干燥后变硬，整个菌核体由多数白色菌 丝交织而成；菌丝中空，直径约3 毫米，极细而短。子实体生于菌核上，伞形或 伞状半圆形，常多数合生，半木质化，直径5 1 5 c m 或更大，表面深褐色，有细 小鳞片，中部凹陷，有细纹，呈放射状，孔口微细，近圆形；担孢子广卵圆形至 卵圆形。 1 3 猪苓的生长习性 喜肥沃湿润、富含腐殖质、排水良好的萌坡熟地。猪苓在地面下5 c m 温度8 9 时开始生长，1 5 , - - , 2 0 。c 时生长最适，2 5 - - - 3 0 菌丝停止生长，进入短期休眠， 或者长出子实体，度过不良环境，以孢子繁衍生息。秋末冬初，地面下5 c m ，温 度低于8 。c 又进入冬季休眠期。一年中4 - - - - 6 月和9 l o 月为猪苓菌丝的活跃生长期 福建农林人学硕十学位论文 。 1 4 猪苓的生物学特性与培养 猪苓具喜冷凉、阴郁、湿润，怕干旱的特性。在地温5 2 5 条件下均生长。 西北产区地温在1 7 1 9 时生长良好，l o 时萌发，2 2 时子实体开放；华北产 区平均地温达9 5 。c 时萌发，1 2 左右时新苓生长膨大，1 4 左右时新苓萌发多， 个体增长快。土壤含水量在3 0 - 5 0 ，p h 值5 - - 7 腐殖质土、砂壤土为宜。 猪苓的生产分固体栽培和液体发酵培养两种。传统的猪苓栽培方法属于固体 栽培。固体栽培先要进行培养菌材，然后培植种苓，到春秋两季时都可进行培植 【2 】 o 1 5 猪苓的药材性状、主要成分、性味功效 猪苓呈条形、类圆形或扁块状，有的有分枝，长5 - 2 5 c m ，直径2 6 c m 。体 轻，质硬，略呈颗粒状。表面黑色、灰黑色或棕黑色，皱缩或有瘤状突起，断面 类白色或黄白色。气微、味淡。猪苓主要成分为聚糖、麦角甾醇、0 【一羟基廿四 碳酸、糖类、粗蛋白等。猪苓味甘、淡、平，归肾、膀胱经。利水渗湿。治小便 不利、水肿、泄泻、淋浊、带下【3 1 。 1 6 发展前景 猪苓有很好的发展前景。不仅具有利尿和抗菌作用，经研究发现有抗癌作用， 需要量将会逐年增加。同时人工栽培猪苓技术也很成熟。我国森林资源丰富，适 宜栽培的土地较多，发展生产潜力很大。 猪苓生产存在的主要问题是：野生资源保护工作没有跟上，群众连年采挖， 资源越来越少；栽培面积小，单产低，收益少，生长周期长。因此，应切实加强 资源保护工作，指导群众合理采挖。要进一步加强科研工作，研究推广优质高产 栽培技术，积极扩大种植面积，逐步形成生产基地。另外，积极研究猪苓的液体 发酵技术，完善猪苓的液体发酵技术在实际生产应用方面的难题。以缩短生产周 期、提高产量，同时减少木材的使用，确保医药卫生事业日益发展的需要。 2 液体发酵在药用真菌中的运用 2 1 真菌液体发酵概述 食药用菌的液体发酵始于美国。早在1 9 4 8 年，美国的hh u m f e l d 等首先提 出用深层发酵法来培养真菌菌丝体。1 9 5 3 年美国的ssb l o c k 博士用废柑汁深层 2 福建农林大学硕士学位论文 培养了野生蘑菇。1 9 5 8 年js z u e c s 第1 次用发酵罐培养羊肚菌并获得成功。m a r t i n 等( 1 9 5 8 ) 用泥炭水解物深层培养了双孢蘑菇( a g a r i c u sb i s p o r u s ) 和羊肚菌 ( m o r c h e l l ae s c u l e n t a ) 。从此，大规模采用液态发酵生产食用菌逐渐展开。当时 主要研究灵芝、密环菌、银耳等液体发酵。7 0 年代开始研究香菇、冬虫夏草、 黑木耳、金针菇、猴头菇、草菇等。现已被研究适于深层发酵培养的大型真菌有 5 0 多种【4 5 1 。 2 2 液体发酵的工艺和特点 真菌液体发酵是在抗生素发酵技术基础上发展起来的，故沿用了传统的发酵 生产工艺，即菌种分离纯化_ 母种_ 摇瓶种子_ 种子罐发酵_ 发酵罐深层发酵。 有关培养基配方的研究包括碳源、氮源、碳氮比、无机盐、微量元素、维生素、 生长因子、增粘剂等。有关发酵过程中参数控制的研究包括接种量、温度、搅拌 速度、通气量、p h 值、菌丝形状、发酵液中菌丝体个数和重量等。利用废弃物 作培养液可节省粮食，降低成本，使废弃物再生，还可消除污染，改善环境，己 成为发酵工业发展的方向【6 】。 2 3 液体发酵的优点 原料来源广泛、价格低廉真菌的液体发酵碳源可用工业葡萄糖、工业淀 粉、山芋粉等；氮源可用豆粕粉、麸皮粉、蚕蛹粉等；还可用大豆深加工废水、 玉米深加工废水及淀粉废水等作为原料7 】。 生产周期短由于液体发酵能对温度、p h 值、转速、装液量、接种量、碳 氮源种类和浓度、常量元素、微量元素及其各营养素配比进行优化筛选，能控制 最佳培养条件。因此，液体发酵培养条件能很好的满足菌丝体快速生长的需要， 真菌液体发酵一般仅需要3 1 0 d 就可积累大量菌丝体和具有生理活性次生代谢 产物，而固体培养基则需3 0 - - 一6 0 d 。 易于工业化大量生产在液体发酵罐内通过控制最佳培养条件来培养菌丝 体，不受季节限制，生产工艺规范。但是固体人工栽培，则需要有利的地位位置、 较大的空间，受季节影响极大，条件难以控制，且容易受到病虫害的侵袭。 产生的活性物质多真菌在液体发酵过程中除产生菌丝体外，还会在发酵 液中产生多糖、多肽、生物碱、萜类化合物、甾醇、酶、核酸、氨基酸、维生素、 植物激素等多种具有生理活性的物质l8 1 。有很多真菌液体发酵的菌丝体多糖含量 福建农林大学硕士学位论文 远高于子实体。液体培养灵芝菌丝体中的粗多糖及水溶性多糖含量均高于子实体 部分，分别为子实体的2 3 和3 5 倍。 2 4 真菌液体发酵的应用举例 茯苓李羿等【9 】初步探讨了茯苓液体发酵的最适发酵条件，刘忠义等【1 0 】用 麦芽汁液体为培养基，碳源为蔗糖，最佳p h 值为5 5 ，2 8 c 的条件进行培养，培 养周期9 6 h 。研究过程发现茯苓菌人工培养极易污染，采用了严格无菌操作、培 养基中添加亚硫酸钠抑制根霉生长、p h 值小于6 等项避免杂菌污染的措施。王谦 掣】对茯苓菌株进行发酵培养，1 2 0 h 后可达蛰 3 0 9 l o o m l ( 鲜重) ，发酵液中含有 多种对身体有益的有机酸，发酵浓缩液多糖含量大于5 m g m l ，氨基酸含量大于 4 8 0 m g 10 0 m l 。 灵芝 张玉珠等1 2 1 对灵芝液体发酵技术进行了研究，确定了灵芝菌的常规 发酵配方、最佳碳源、氮源组合及最佳发酵工艺参数。梁光剑等 1 3 1 认为在培养 基中加入一定量的f e 2 + 有利于胞外多糖的积累。 密环菌谭周进等1 1 4 1 认为红薯粉含有丰富的营养物质，作为碳源，蜜环菌液 体发酵的菌丝产量和多糖产量都高于小麦粉和蔗糖作碳源；消泡剂有利于菌丝的 生长，过量则不利于多糖生产。 蛹虫草温鲁等【1 5 】对液体培养蛹虫草氮源种类、氮源水平、碳源水平、动 态变化、虫草素及腺苷含量进行研究，蚕蛹粉、豆粕和豆粉都是很好的氮源：碳 源水平为3 4 ；振荡培养8 d ，培养液中虫草素总量是菌丝体中虫草素总量的6 倍多；振荡培养7 , - 一9 d ，每瓶培养物的虫草素和腺苷总量达到1 0 m g 以上。 冬虫夏草余晓斌等【1 6 】研究发现在p h 5 5 的时候能够增加液体深层发酵的菌 丝体和胞外多糖的产量。 子机构复杂且庞大的糖 福建农林大学硕士学位论文 分子牛物学的发展和对多糖研究的深入，发现多糖具有很多生物学功能，如抗肿 瘤、抗病毒、免疫调节、抗凝血等功能，并且具有无毒、无副作用的特点，使多 糖成为当今药物研究的一个热点。 3 1 多糖的提取、纯化和结构分析 3 1 。l 多糖的提取 水提醇沉法该方法是多糖提取的传统方法，是用水作为溶剂煎煮提取多 糖。般要在7 0 - 9 0 c 热水中回流提取2 - 3 h ，将提取液真空浓缩后加入乙醇( 甲 醇或丙酮) 将多糖沉淀出来，达到初步纯化的目的。如盛家荣等【1 7 1 采用此法从 板蓝根中提取多糖；李志洲等【1 8 】采用该法提取大枣多糖。水提醇沉法方法简单、 方便、应用广，是现在提取多糖应用最多的一种方法【1 9 】。 碱提取法含有糖醛酸的多糖可用弱碱提取。孟岳成等【2 0 1 研究了在碱条件下 提取大豆多糖的方法和工艺，提高了多糖的得率。该提取方法优点是提取率高、 时间短；缺点是杂质多、纯度低、提取时间稍长、多糖键易断裂。 酸提取法多糖可用一定浓度的酸液浸泡，使细胞、细胞壁吸水膨胀破裂， 然后用乙醇、丙酮等沉淀多糖，同时除去脂肪和蛋白质，提取多糖。周裔彬等【2 1 l 用酸提取海带中的多糖，多糖得率为3 5 1 。酸提取方法对设备腐蚀大，且多糖 键易断裂。 微波提取法微波提取方法是指使用适合的溶剂在微波反应器中提取各种 物质多糖的方法。它是通过微波加热作用，同时借助于微波的电磁场，加速被萃 取的多糖成分向萃取溶剂界面扩散。近年用微波提取多糖的研究很多，刘依等【2 2 1 使用微波技术提取板蓝根多糖，表明该法可提高多糖得率且缩短反应时间。范会 平等【2 3 1 研究表明，微波法提取多糖随着萃取时间延长，多糖分子量逐渐下降。 该提取方法提取效率高，但可能降解多糖，影响多糖活性。 超声法超声提法是今年多糖提取研究的热点。该方法的原理是利用超声波 破坏细胞和细胞膜结构，从而增加细胞内容物通过细胞膜的穿透能力，有助于多 糖的释放与溶出；超声波使提取液不断震荡，有助于溶质扩散，缩短了提取时间， 提高了有效成分的提出率。该提取方法操作简便快捷、提出率高、提取物的结构 未被破坏等优点。李凤林等【2 4 】用超声波法提取白灵菇多糖，发现该方法提高了 白灵菇多糖的得率。 福建农林大学硕士学位论文 酶法酶提取多糖方法是今年发展起来的新方法。由于酶法提取具有快速、 高效、反应时间温和、反应过程明确、易于控制等诸多优点，收到广泛关注。孙 显等【2 5 1 对纤维素酶法提取川芎多糖进行了研究，并得出了酶法提取多糖的工艺 条件。但酶法提多糖受p h 、温度的影响较大。 c 0 2 超临界萃取超临界c 0 2 流体萃取是一种以超临界c 0 2 流体作为萃取剂 对混合物中某种有效成分进行提取和分离的新型技术，它的最大的优点是可以在 近常温的条件下提取分离，几乎保留产品中全部有效成分，无毒无残留，产品纯 度高，操作简单，安全性高，选择性好。赵子剑等【2 6 1 研究了二氧化碳超临界流 体萃取茯苓多糖，并优化了工艺参数，发现该方法提取多糖有很大优势，但该方 法成本太高，不易于大量推广。 超滤法超滤是一种膜分离技术，其作用原理主要是筛分作用。超滤法分离 多糖得率高、能耗低、不易破坏多糖的生物活性，在多糖分离方面具有很大潜力。 王子尧等【2 刀用超滤法分离丹皮多糖，表明该方法分离多糖截留率高、纯度高