（劳动卫生与环境卫生学专业论文）化妆品中亚硝胺的lcmsms检测方法研究.pdf

摘要 本文根槲化妆品中可能含有的亚硝胺种类，选取了n 亚硝基二甲胺、n 亚硝基二 乙胺、n 哑硝基二丙胺、n 亚硝基二丁胺、n 亚硝基二乙醇胺和n - 亚硝基吗啉作为代 表，探讨了使用l c m s m s 对它们进行测定的实验条件，包括质谱条件和色谱条件以 及村 矗的i 拇处理方法，并且针对化妆品中最常被检出的n 亚硝基二乙醇胺进行了方法 评价和方法应用。实验过程中发现，6 种亚硝胺化合物在所选择的质谱和色谱条件下 出峥很好，但是它们的回收率未能同时满足实验要求。所以随后主要针对n 亚硝基二 乙酚胺进行了方法研究。 将样品溶解后，加载到e x t r c l u t 圆l n t 液相萃取柱，用乙酸乙脂洗脱，浓缩后在 l c m s m s 进样分析。实验结果表明，本方法灵敏度高、选择性好，n 亚硝基二乙醇 胺舀：o - , 1 0 0 0 n g m l 范围内线性相关系数达到了0 9 9 9 6 ，最低检出限为0 4 槲低于 口z 弘i f 缛 当前文献巾报道的最低检出限( 5 酬) 。同h e 该方法的加标回收率在8 l 毛形3 弗之间， p 鲁 讲 相列标准偏差在2 4 7 8 3 3 之间a 在抽检的1 2 个样品中，检出含有n 亚硝基二乙醇 胺的样品5 个，检出率为4 1 7 ，含量最低0 6 5 2i tg k g ，最高2 4 2i ig a g 。 关键词：化妆品亚硝胺n 亚硝基二乙醇胺l c m s m s 测定 a b s t r a c t b a s e do i lt h ep o s s i b l en - n i t r o s a m i n e ss p e c i e sc o n t a i n e di nc o s m e t i c s ，s i xk i n d so f n n i t r o s a m i n e s 、v e r es e l e c t e d 硒r e p r e s e n t a t i v e sf o rr e s e a r c h e x p e r i m e n t a lc o n d i t i o n s ， i n c l u d i n gm a s s - s p e c t r u mc o n d i t i o n s ，c h r o m a t o g r a p h i cc o n d i t i o n sa n ds a m p l ep r e p a r a t i o n m e t h o d sf o rd e l e c t i n gt h e s en - n i t r o s a m i n e s b yl i q u i dc h r o m a t o g r a p h y - t a n d e m m a s s s p e c t r o m e t r y ( l c m s m s ) w e r ei n v e s t i g a t e d i tw a sf o u n di nt h ee x p e r i m e n t st h a t ，u n d e r t h ec h o s e nm a s ss p e c t r u mc o n d i t i o n sa n dc h r o m a t o g r a p h i cc o n d i t i o n s ，s i xk i n d so f n - n i t r o s a m i n e sa llh a v eg o o dp e a k s ，b u tt h er e c o v e r yc o u l dn o tm e e te x p e f i m e n t f l r e q u i r e m e n t s t h e nd e t e r m i n a t i o nm e t h o d so fn n i t r o s o d i e t h a n o l a m i n e ( r , a g e l q ，t h em o s t f r e q u e n t l yd e t e c t e dk i n do f n - n i t r o s a m i n e si nc o s m e t i c s ，w e r es t u d i e d a p o f l i o no fc o s m e t i cp r o d u c tw a sd i s s o l v e da n da p p l i e dt oa ne x t r e l u t c n tc o l u m n t h e nt h en e d l af r a c t i o nw a s e l u t e db y e t h y la c e t a t ea n da n a l y z e d b yl c m s m sa f t e r b e i n gc o n c e n t r a t e d t h i sm e l h o dp o s s e s s e sf a i r l yh i g hs e n s i t i v i t ya n dg o o ds p e c i f i c i t y u s i n g t h i sm e t h o d ，t h el c m s m sr e s p o n s et on d e l aw a sl i n e a ri nt h er a n g eo l0 0 0 n g m la n d t h el i n e a rc o r r e l a t i o nc o o f f i c i e n tr e a c h e d0 9 9 9 6 ；t h em i n i m u md e t e c t i l o w e rt h a nt h em i n i m u md e t e c t i o nl i m i t ( 5 r e c o v e r yw a sf r o m8 1 t o1 0 3 ，a n dt h r t e di nc u r r e n t b e t w e e n2 4 7 8 3 3 12c o s m e t i c s w e r es a m p l e da n da n a l y z e da n dn d e l aw a sm e a s u r e di nf i v eo u to ft h e m t h er a t i ow a g 41 7 a n dt h em i n i m u mc o n c e n t r a t i o nw a s0 6 5 2pg & ga n dt h em a x i m u mw a s2 4 2l a g k g k e y w o r d s ：c o s m e t i c sn n i t r o s a m i n e sn d e l al c m s m sd e t e r m i n a t i o n 2 鹰 硕士学位论文 m a s t e r st h e si s 第一部分绪论 1 化妆品中亚硝胺的研究现状及意义 1 i 化妆品中有害物质分析的必要性 化妆品是以涂抹、喷洒或其它类似方法，施于人体表面任何部位( 皮肤、毛发、 指甲、口臂、口腔粘膜等) ，以达到清洁、消除不良气味、护肤、美容和修饰目的的产 口【lj 口i l o 随着人民生活水平的提高，化妆、美容已成为同常生活的重要内容，因此对化妆 品的需求也i l 益增大，成千上万种成分、功能、牌号各异的化妆品如潮水般涌入人们 的生活中。在化妆m t - 1 u 1 二- 产中，一方面由于未严格操作规程或原材料检测，造成了化妆 品的生物或化学污染；另一方面，由于缺乏知识，或惟利是图不顾消费者的安全，在 化妆一 f l 配疗巾包含了禁川物质或超量使用了限用物质。因此化妆品在美化人们生活的 同时，也滑? | 乏了一系列不安全因素。西方的古代妇女因为频繁使用铅白粉导致慢性中 毒而发生贫j | l 、胃疼、神经麻痹，甚至引起肾脏萎缩等疾病。英国女王伊丽沙白一世 经常使用白他铅粉搽丽，使面孔白晰细腻，当时的英国妇女纷纷效仿。但是这一流行 的美容方法佗许多1 61 | ：l = 纪的女性中毒而亡。在人类的历史上，水银曾一度作为妇女的 化妆品原料，与铅一起使用。迷恋于淡妆浓抹的古代中国妇女，到了唐朝以后，就广 泛将锇与水 r 混合起来使用，因而中毒的事件屡有发生。第二次世界大战以后，石油合 成化学突乜j i 最进，鉴于铅及水银对人体的显著伤害，有人致力于研究利用石油来制成 化妆品。厂家将由石油精制而成的石腊均匀地调和于水中，为了进一步促进油脂对皮 肤的渗透性，又加入大量的表面活性剂以及以焦油为原料的各种色素和香料。因此， 化妆品的t 要成分，大部分都是石油化学制品。最令人不可想象的是，这些成分和市 场上出售的鞋油成分几乎完全一样。表面活性剂加入化妆品中后，由于其浸透性过 强，往往会过度吸收不必要的物质。这样渗入皮肤深处的各种物质，会结成橡胶纸般 难以熔化的有害物质而严重的伤害了皮肽的自然调理机能。据统计，女性脸上的斑点 般比男陛多，这和长期使用含有矿物油的化妆品有关。 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 国i 勺夕f 何不少有害物质超标的事例报道例如：育发剂中加入了有强致癌性和刺 激性的禁用 勿质氮芥；染发剂中检出可致癌的禁用物质2 ，4 一二氮基苯甲醚和邻一苯二 胺：健美、炎乳产品q , j j h 入可引起代诩 紊乱的性激素：祛斑产品中含有强刺激性的禁 用物质苯酚、氢醌、维甲酸和大量汞，有些产品中汞的含量高达4 ；一些护肤化妆 i ! i 及洗涤产 | 1 中检f n 达p p m 级的强致癌物质一亚硝胺化合物。由于化妆品含有这些不 应有的化学成分，近年来已引起多起消费者受损害的事故。因此，加强对化妆品中禁 用、限川物质的榆测，对保证消费者使用安全的化妆品具有十分重要的作用。 针对戗妆晶i - j 能潜在的危害，各围根据本闻的实际情况，制定了相应的法规，采 取了不刚的 施和手段。工业发达国家大多着重于原材料质量的控制，配合以配方的 t 耵查。我国也颁和了化妆品卫生规范，对化妆品成品、原料、包装都做了具体要求， 列 l j 了儿百绅禁月j 物质和限用物质，并给 l j 了毒理学、卫生化学、微生物及人体安全 性评价n ，j 实验方法。歹r 展化妆品中有争 物质的检测，有助于找出污染根源，便于采取 治理措施，保障人们的身体健康。对化妆t 镇中有害物质的检测分析已越来越为人们所 踅视。 1 2n 皿硝胺检测的必要性 亚硝基化合物是一类很强烈的化学致癌物质，它们能诱发许多动物的恶性肿瘤。 在已知的一河多种亚硝胺中经动物实验证明具有致癌作用的约占7 5 8 0 n 1 。自从1 9 5 6 年英国科学家j o h nb a r n e 和p e t e rm a g e e 发现二甲基亚硝胺在老鼠上产生肝癌，人们 才开始对亚硝胺和亚硝基化合物的致癌性进行关注。在被测试的3 0 0 多种n 一亚硝胺 化合物【f l 有近9 0 具有致癌性。它几乎能引起动物所有的重要脏器和组织的各种肿瘤， 是引起人类恶性肿瘤的一类重要的致癌物质。亚硝胺很容易由前身物仲胺和亚硝酸盐 反应合成，无论在实验室和自然条件下还是在人体和动物体内，合成反应均能顺利进 行。因此，哑硝胺在自然界中分布广泛，在土壤、工业废水、空气以及烟草、熏肉、 腌菜、啤酒等食品饮料中都发现了这类物质。1 9 7 7 年，f a ne ta 1 报道在化妆品中发 现了亚研j 胺，亚硝胺可经皮肤吸收进入人体，有研究发现，皮肤接触化妆品后，在尿 中能检f l ln 亚硝基二乙醇胺n 。亚硝腋及其前身物在人们生活和工作中的广泛分布， 驱硝胺体内外合成的可能性，以及最j ：要的亚硝胺的广谱而强烈的致癌活性，使亚硝 2 回 、饥二一， 硕士学位论文 m a s t e r st i l e s i s 胺在恶性肘瘤的病因研究中占有极为重要的地位。检测环境中的亚硝胺及其前身物的 种类和数量，是恶性肿瘤流行病学和病因学的重要研究内容之一。化妆品中亚硝胺的 j l f i 测也成为化妆品工业中一个令人关注的主要问题。 1 3n 亚硝胺的种类及理化性质 亚硝胺是指含有 n n 铷功能基i 羽的一大类化学物质，根折；其化学结构 可分为哑硝基胺和哑硝壁酰胺两类。亚硝胺的化学性质和物理性质是, - 1 1 1 1 i l 。j 胺的分析测 定疗法赖以建立的主要依据。 1 3 1 化妆品中亚硝胺的种类 山于化妆品原料中的含氮物质种类繁多，加上近年来分析方法的改进，在化妆品 中捡测到的偃i i f | i 胺化合物越来越多，表l 列 乜了化妆品中已检测到的亚硝胺种类及相 应的结构式1 1 i 。 丧l in ：化妆晶中已经枪测到的亚硝胺种类及相应的结构式 中文钇称缩写结构式 n 幔硝基二乙醇胺 n 幔硝基二甲胺 n 姬硝基乙胺 n 哑硝基二丙胺 n 幔硝基二】胺 n 眶硝基吗啉 n d e l a ( h o c h 2 c h 2 ) 2 - 删o n d m a n d e a n d p i a n d b a n m p l e n 眶硝基二异丙醇胺 n d p l a n 哑硝基甲基十八烷基胺n m o d a ( c h 3 ) r 小酣o ( c h 3 c h 2 ) r 小i n o ( c h 3 c h 2 c h 2 ) r 小n o ( c h 3 c h 2 c h 2 c h 2 ) r 小腻。 厂、 0 n n o 彳h 3 ( h o c h c h 3 ) 2 - n n o 彳h 3 c1 8 h 3 7 n n o 。 t ! 匿衫 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s n 眶硝般甲勰+ 卜- 烷桀胺 n m d d a n 弧硝 ：甲赫十i ，q 烷基胺 n m t d a 2 异牛筇- 4 一( n - 孵硝基一n 一甲氮基) 苯i p 酸 n m p a b a o h o o c c | 。 c1 2 h 2 5 n n o c1 4 h 2 9 一n n o c i h 3 e h 2 c h 2 c h 2 c h 2 c h 2 c h c h 3 ，n o n 7 n h c h 3 砼：这些种类中尤以n d e l a 的检出率最高，在多种防晒、护肤、清洁用品中都有 捡 的 艮道，而且含量很高。从美国f d a 官方报道的数据来看，n d e l a 的含量范围 从l 到4 8 0 0 0ug l ( g 不等【4 l ，大部分都超过允许的含量范围，虽然随着一些强制措施的 实旌n d e l a 的含量有所降低，但是仍然较高。 1 , 3 2n 一亚硝胺的物理性质心1 分子量较低的二烷基n 一亚硝胺化合物是黄色或黄绿色不吸湿液体，部分溶于水和 很好的溶予有机溶剂。沸点随烷基链的增长而升高，在1 5 0 2 2 0 。c 范围内。有取代基 的亚硝! ! 友一般为带黄绿色的结晶化合物。 距硝胺的红外光谱有三个相对强的带，分别在7 1 7 4 、7 6 8 6 和9 1 5 ，9 5 5 微 米之间前三个吸收带为n = o 键的i 皮动，后者为n 一_ n 键的波动，其紫外光谱有二个吸 收带，嘏道过的资料有2 3 5 和3 6 5 n m 、2 3 0 和3 7 4 n m 、2 3 0 和3 6 5 n m 、2 2 8 和3 3 2 n m ( 在 水中) 尊。其中第一个吸收带表现明显，在2 3 0 。2 3 5 n m 的吸收带表征为n n 键，在更 长波长内的吸收带表征为n = o 键。 1 3 3n 一亚硝胺的化学性质 亚硝胺能在中性或碱性环境中，在甲醛催化下由亚硝化剂与胺类物质反应生成。 目前化：恢品原料大约有8 0 0 0 多种，其中很多原料含有可亚硝化的胺类物质，而且在一 些辅料1 1 1 也含有潜在的可被驱硝化的胺。化妆品的制作和放置过程由于亚硝化反应生 成的亚+ i i - j 胺是化妆t 铬中贬硝胺的主要来源。 4 业硝胺迓能与其它一些物质发生去硝化、氧化还原、重氮化、光解等化学反应。 这j 蟹化学i 应对亚硝胺的检测具有指导意义。 去硝化： 还原： 氧化： r1r j ! n n o ! 些! 汐r i r 2 n h * i k l + h n o r 1 r 2 n n o + l i a i h4 + h2 0 + r 1 r 2 n n h2 + l i a i o2 + h2 2 ( c 2 11 5 ) 2 n n o + n2 0 5 c 2 11 5 n 0 2 + h n o2 重氮化： 光解： 2 c 2 h 5 n 0 2 + 2 c h3 c o o h + h n o2 + t - n o3 c | - 3 c ( n o h ) n o2 + h2 0 ll d n o e 1 0 2 c c h 2 n h 2_e t 0 2 c c h 2 n 2 t i 2 0 早：h i 1 1 r 厂1 c h r 2 一r 1 一节一c r 2 上， 1 k n o h + n o h 硕士学位论文 m a s t e r st i l e s i s 1 4 兰j 前亚硝胺的主要检测方法 fj ：妆品中里f 硝肱的种类繁多，含量低， 有1 叮能生成新的, - l e v i j 胺，出现假阳性干扰， 亚 i i | j 鼽的测定是比轫网难的。 化学结构和性质多样，而且在分析过程中 影响测定结果的可靠性，因此，化妆品中 f t 巫硝胺分析过程中经常会出现人为因素的影响硒1 ，主要有两种：假阳性和假阴 性二二扰。 假阳性二f 扰通常是山于在样品处理和分析过程中形成了新的亚硝胺化合物所致。 假阳f e 一般在刖g c 榆测时出现较多，在用i i p l c 检测时出现较少。避免分析过程中可 能j l j 玑的似阳性1 二执一般有以下几种措施： 1 ) 尽量减少分析步骤； 2 ) 在分析前加入抑制剂( 必须加入过量) ； 3 ) 通过实验测定人为形成亚硝胺的量来扣除假阳性所产生的干扰。 假阴性干扰通常是由于在样品处理和分析过程中亚硝胺的遗失所致。主要有以下 几个方面：1 ) 光、热的影响和过高的p i l 条件导致假阴性；2 ) c - c 中的高温、h p l c 中柱二j 1 ：的吸附导致伊 阴性；3 ) 检测器导致假阴性。避免分析过程中可能出现的假阴 性f 扰一般有以f ) i 种措施： 1 ) 使用月j 黄光或舀：暗中操作； 2 ) 不同的l l p i ，c 柱和不同的溶剂条件进行必要的回收性实验； j i e l 硝胺的分析方法主要包括提取、分离、纯化和检测、确证等步骤。提取、分离 和纯化统称为样品的制备或分离方法，大都采用以下基本技术1 ： 1 ) 萃取和分配 2 ) 蒸馏方法 3 ) 消煮法 1 ) 纯化技术，如柱层色谱法、薄层色谱法和离子交换法 亚硝胺的检测与确证方法，随着现代分析化学的发展和仪器选择性和灵敏度的 提高，亦同趋完善，根据分析方法的原理可以分为： 1 ) 紫# f - 可见分光光度法 2 ) 薄层色谱汰 6 荸、i适。k l 1-、 硕士学位论文 m a s t e r st il e s i s 3 ) 气液色谱洗 4 ) 气：夜色谱一质谱联川法 5 ) 极i 普法 6 ) 热能分析法 f = l 前对化妆品t i ，弧硝胺的检测，气液色谱法足比较准确快速的方法，其中又以填 充托7 t 泓色i 普法的f 、v 用最为。泛。国外近年来测定亚硝胺总量多采用n o 化学发光法， 根抛e i s t ，n l 1 r a n d 和p r e u s s n l a n n 报道的去硝基反应，用h b r c h 。c o o l 溶液将亚硝胺n n 0 官能 1 1 【1 的n - nm 雕化断裂，分解产生的n 0 经过载气吹脱及净化后用热能分析仪或“n 0 化学发光检测器”测定。在弧硝胺的测定中经常提到的热能分析法( t e a ) 是一种发生 在产棚劳固一气界面巾的实质为化学反应的气相技术。溶解在适宜溶剂( 如c h ：c l 。等) 中的亚 i i i 胺经裂解使n - n o 键断裂，释放n o ，再通过o 。氧化成激发态的n o ：木，n o ：木衰变 发射 j ：特征屠射，发射强度与亚硝胺的浓度成j f 比心1 。采用g c - t e a 、h p l c - t e a 来检测 亚硝胺； j 有很高的选择t e 和灵敏性，是种比较可靠的分析方法。先把样品用水稀释， 吸附到k i e ：e l g u r 杜上，用f 丁醇沈脱，提取液通过用丙酮洗脱的硅胶杠，把洗出液 烘二l 二再耍新溶解在【：1 1 ：c 1 ：溶液中，然后用g c - t e a 进行分析。但是，由于t e a 检测器价 格昂贵，一收的实验室都无法负担，因而应用并不普遍。此外，还可用分光光度法或 毛细管电泳法等来检测亚硝胺。一般来说，测定挥发性的亚硝胺可用g c 法，而测定非 挥发性的距硝胺则月jh p l c 法。 袭l - - 2 几种检测方法比铰l 化妆品前处理榆测限 化合物榆测方法州收率优缺点参考文献 种类方法ug l ( g 凝胶 9 9 n d e l a柱层灵敏度商但需衍 膏霜 c , c t e a5 38 6 一1 1 2 n m p a b a o 析法生化。步骤繁琐 乳液 ( n = 4 ) 嗣液 n i ) e l a 浴液h p l c u v 5 蓼取 简便。适于日常检 9 0 验，但结果可靠性 不高 浴液 o t c e c 液液 5 0 9 4 ( 洗液)适用范围广，但灵 7 一每 硕士学位论丈 m a s t e r st h e s l s 孵秆萃取 离了交 n d e l a l i p ! 。c - l e a 换法 青曩； n d e l 人 浴液 5 5 ( 聃膏) l o8 0 一1 0 0 敏度不高 选择性好结果可 靠，但t e a 价格昂 贵应用不普遍 液液苯 8 0 取一柱简睁迅速，但灵敏 d p i )1 0 07 3 9 l 层色谱度不商 ( n = 3 ) 法 6 8 ( n = 9 青霜适用范用广，可测 n d e l a液液n d e l a ) 香波n o 化学荧光5 0 定皿硝胺的总量， n m l d 萃取 6 3 ( n = 6 浴液需要事先进行屏蔽 n m t d ) 由于亚硝胺的强致癌性，化妆品中的亚硝胺污染已逐渐成为大家关注的热点。我 国在化妆船卫生规范中已明确将亚硝胺列为化妆品组分中的禁用物质，但由于没 有有效的检：则方法，我刚市售化妆品中亚硝胺的污染状况缺少相关资料。因此，目前 急需建立灵敏、7 f 仨确、快速的分析方法，监测化妆品中亚硝胺的污染状况，为卫生监 督和修汀标准提供科学依据。从表中可以看出，目前化妆品中亚硝胺的检测方法还不 够完善，这就要求我们 i 生检验工作者进一步努力，提出更好的检测方法。 2 l c m s m s 技术及其应用 色谱一，贡谱联机技术结合了色谱对复杂基体化合物的高分离能力与质谱独特的选 择性、灵敏度、分子量及结构信息于一体，具有广泛的应用领域。目前色谱一质谱主要 有气相色谱一质谱和液相色谱一质谱，气相色谱一质谱的联用技术已趋于成熟，它适于 易挥发、半挥发性的有机小分子化合物的分析。然而据估计已知化合物中约7 0 的化 合物均为亲水性强、挥发性强的有机物，热不稳定化合物及生物大分子，这些化合物 广泛存在于刍前应用和发展最广泛、最有潜力的领域，包括生物、医药、环境等方面， 因而液相色潜一质谱的联机显得更为迫切2 1 。l c m s 比传统的紫外和荧光睑测器具有 8 一每一 。硕士学位论文 m a s t e r ，s t t l e s i s ， 更高的选择性、灵敏度和准确度，它既有定性的功能，也有定量的能力，尤其是分析 药物和垡：物样n h t l 的理想： 具。自1 9 8 3 年m c l a f f e r t y 等开发串联质谱技术( m s m s ) 以来， 经过短氰i 十，f l 年的发展，串联质谱已成为一种成熟的技术，在许多领域发挥了巨大作 用。串联质谱法是指质屠分离的质谱检测技术，有分离、结构解析同步完成的特点， 能直接分析混合物纰分，有高度的选择t e 和可靠性，因此用串联质谱可解决分析领域 中的许多问题，国外已有不少文献报道。 2 1m s m s 基本原理 s lm s 2 选择一定质孱的离予通过一级质谱( m s l ) ，使其进入碰撞室，与室内充有的碰撞 气体( 常川气体为h e ，a r ，x e ，c h 4 等) 进行碰撞诱导裂解( c o l l i s i o n i n d u c e dd i s s o c i a t i o n ， c i d ) ，发生离子分于碰撞反应，产生予离予，樗经第二级质谱( m s 2 ) 进行分析。 m s m s 仪主要有3 种数据采集方式：子离子扫描：选择一定的母离子经c i d 活化，m s 2 记录产，j 三的予离子。该方式特别适合于软电离( 如e s i ，c i ，f d ，f a b ) 得 到的分予离子进一步裂解以获得分子的结构信息。母离子扫描：选择m s 2 中的某一 子离予测定m s ii f l 的所有母离子。该方式能帮助追溯碎片离子的来源，能对产生某 种特征硝片离子的一类化合物进行快速筛选。中性丢失扫描：m s l 和m s 2 同时扫描， 但m s 2 孑m s i 始终保持质量差a m ，最终的谱图将显示那些来自一级谱图中通过裂解 丢失q f t ! 碎t - ( a m ) ( 1 ：j 离子。中性丢失游最能反映化合物的特定官能团。 2 2 色谱与串联质谱联用技术 f 1n ，与质谱i f 关刚的色谱技术主要有气相色谱( g c ) 、液相色谱( l c ) 、毛细管电泳 ( c e ) 等。气质联用是种比较成熟的技术，在我国已有2 0 年的应用历史。l c 可以直 接分析刁：挥：甓性化彳 物、极性化合物、热不稳定化合物和大分子化合物( 包括蛋白、多 肽、多柳f 、多聚物等) ，分析范围广，而且不需衍生化步骤。因此液质联用长期为人们 所关注。随管各种离子化技术的不断出现，液质联用已成为可能。当前人们广泛采用 的接口批术阿：热喷雾( t s p ) 、等离子体喷雾( p s p ) 、粒子束( l r n c ) 、大气压电离( a p i ) 9 l t s )、。 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 和动态快原予轰击( f a b ) 。其中，a p i 包括电喷雾电离( e s i ) 和大气压化学电离( a p c i ) 。 e s i 和a p c i 均属予最“软”的电离方式，都能分析许多样品，目前还没有一个明确 的规定判断何时使用某一种电离方式更好，但是通常认为e s i 有利于分析生物大分子 及其他极性大的化合物。另外由于e s i 可以产生大量的多电荷离子，因此特别适合分 f 蛋白质、多肽类的生物分子，而a p c i 更适合于分析极性较小的化合物。 l c m s ，m s 技术具有比m s m s 和l c m s 更优越的性能。首先通过l c 的分离， 佗m s m s 可以分析具有大量杂质的混合物中的待测物，并提高分析的专一性和灵敏 度，i 面且i ，ci l 丁以分离同分异构体，弥补了m s m s 的不足。另外，l c m s m s 相对于 ic m s 可以提供待测物更多的结构信息。 2 3l c - m s m s 的主要应用领域 1 ) 蛋白质与肽类的鉴定 2 ) 天然药物( 中草药等) _ 开发研究 3 ) 临床药理学研究 4 ) 药物的动力学研究 5 ) ( 环境、食品、农产品中) 毒物榆定分析 2 4a p l 4 0 0 0 l c m s m s 的仪器特点 新型a p l 4 0 0 0l c m s m s 系统采用最新科技发展的成果，进行革新性的设计，具 订无可比拟的灵敏度、选择性、重现性，提供更稳定、更可靠的结果。 1 ) 无与伦比的高灵敏度一一最新设计的高效率“v 型t u r b o 电离源和新型接口 提供的离：f 进样使灵敏度提高十倍。 2 ) 无可比拟的耐用性与可靠性一一享有盛誉的“专利气帘技术”和创新的气体 动力学设计，大大降低了维护需要，提高了仪器的利用率。 3 ) 更高通：避性能一优异的高流量性能、降低的离子抑制效应、自清洁离子源 探针设计和可靠的接口设计，加速了分析速度。 4 ) 使用更简便一一新型“v 型t u r b o 电离源”使得“电喷雾电离源 和“a p c i r 乜离源”即捅即用( p l u g a n d - p l a y ) 。 l o 硕士学位论文 m a s t e r st i l e s i s 5 ) 采用由2 新的双加热器技术和优化的7 飞体动力学设计，最大地提高样品的电离 设率。 6 ) 电喷雾r 乜离源允许f l 常使用l 毫升分钟的流量，而无需分流，且保持同样水 i 严的灵套j 【度，j i f 实现了和常规液相色谱的联用。 7 ) a p c i 电离源的快速加热技术和新型惰性材料的采用，最大地降低了目前常规 l c m s m s 仪较易产生的高浓度样品的“拖尾现象 和“交叉污染”。 8 ) 自清沽离子源探针设计，使离子源无需维护 9 ) 创新巾e 专利线性加速l i n a c 技术保证m s m s 超强性能 1 i n a c 高压碰撞室技术一一提高了所有m s m s 方式的灵敏度，使离子到达检 测器的f 名输效牢最大，大大提高了串联质谱的性能。 增加结果的可靠性一一l l n a c 技术可有效防止m r m 实验中产生记忆效应。 。次分忻可定最更多的化合物一- - l i n a c 技术允许在m r m 实验中减少测睦驻 留时问州不降低灵敏度。 巨适合m s 和m s m s 自动切换扫描技术( i d a ) 一一l i n a c 技术提高了母离 严手1 描祁巾性丢失扫描的速度、灵敏度和分辨率。 3 前处理技术 3 1 固相萃取技术及其应用 固悃萃取( s p e ) 是一种用途广泛而且越来越受欢迎的样品前处理技术，它建立 在传统f | 0 液液萃取( l l e ) 基础之上，结合物质相互作用的相似相溶机理和目前广泛 应用的li p l c 、g c 中的固定相基本知识逐渐发展起来的。s p e 具有有机溶剂用量少、 便捷、多：全、高效等特点。s p e 根据其相似相溶机理可分为四种：反相s p e 、正相s p e 、 离子交换s p e 、吸附s p e 。 3 1 1 基本原理 固旧萃取是一个包括液桕和固相的物理萃取过程。在固相萃取过程中，固相对分 忻物的q 乏附力大于样品摹液。当样品通过固相柱时，分析物被吸附在固体填料表面， 硕i 学位论文 m a s t e r st h e s i s 其它样品组分则通过f t 子。分析物可用适当的溶荆沈脱下来。 s i e 的甚本j 嗄理与h p l c 相同，但目的则完全不同。h p l c 是要在短时间内将各 化合物分离并保持好的峰形。而s p e 是要从复杂的基液中分离人们感兴趣的化合物并 将其浓缩，以便进行进一步的分析。 s p e 装霞l | s p e 小柱和辅件构成。s p e 小柱由三部分组成，柱管、烧结垫和填料。 s p e 辅件一冉i 有，e 空系统、真空泵、吹干装置、惰性气源、大容量采样器和缓冲瓶。 3 1 2 基本程序 陋i 相萃j 双的坫本程序可分为以下h 个步骤。但在实际应用时可根据最后分析手段 对柑品的要求对远血个步骤进行增加或减少。 1 ) 固4 1 i 柱的预处理 确：萃取样品，乙前为了湿润固相萃取柱填料，用一满管溶剂冲洗管子。为保证良好 的i l 现性，f i i i l 棚托必须用适：与的溶液进行预处理。 2 ) 加入样品 将样品， j 玎于响卡| 柱中，用正压或负压使样品通过柱子。样品的流速必须控制，一 般舀：1 5 m v m i n 。对于以离子交换为作用机理的萃取，样品通过s p e 柱的速度应该适当 降低，以保证分析物汀足够的时间与s p e 柱填料的离子交换功能团发生作用。 3 ) 固棚柱的洗涤 刚适当的洗涤剂选择性的将吸附力弱的杂质洗脱，而把分析物保留在固相柱上。 4 ) 固年l i 柱的干燥 如最后的洗脱剂为缓冲溶液或水溶性有机溶剂，而分析手段为反相h p l c ，固相 柱j ：的残留水对分析影响不大。但是，当非水溶性有机溶剂为洗脱剂或分析手段又为 g c 时，固棚柱的干燥就特别重要。 5 ) 分析物的洗脱 在选择洗脱溶剂时必须考虑以下几个因素： 洗脱剂必须有足够的强度，以最小用量将分析物洗脱下来； 沈脱剂必须宙足够的选择性，只将分析物洗脱，而将吸附力强的杂质保留在柱子 匕。 1 2 硕士学位论文 m a s t e r st i l e s i s 拒选择洗脱溶剂时可以通j 立改变溶剂的极性指数、溶剂强度、溶剂选择性来达 到最；c f 的分离效果。 3 1 3 应用 s p e 大多数用柬处理液体样品，萃取、浓缩和净化其中的半挥发性和不挥发性化 合物，也可刖于固体样品，但必须先处理成液体。目前图内主要应用在水中多环芳烃 ( p a l i s ) 和多氯联苯( p c b s ) 等有机物质分析，水果、蔬菜及食品中农药和除草剂 残留分析，扰生素分析，临床药物分析等方面。 3 2 新型的液液萃取方法一e x t r e l u t 萃取小柱 在分析复杂基质的样品如蛋白质、化妆晶时，在j 下式分析前进行净化步骤是必要 的萃取技术足样品f j 处理的主要手段包括溶剂萃取、微波协助萃取( m a e ) 、固相萃 取( s p e ) 、超临界流体萃取( s f e ) 、膜萃取、固相微萃取( s p m e ) ，微滴溶剂萃取( ( s d e ) 等， 这些方法都有各自的应用范围。溶剂萃取是常用的萃取技术之一，色谱分析样品制备 中使i 】的溶剂萃取方法主要有液液萃取、液固萃取和液气萃取等，它们都属于两相间 的传质过程，即物质从一相转入另一相的过程。液液萃取( l l e ) 是一种传统的样品预处 理技术，f l 前报道仍有7 0 的有关文献采用液液萃取作为样品预处理方式，它是利用 待测幺 1 分与样f | 】l 中的杂质在互不相溶的两种溶剂中的分配系数不同而实现样品的纯 化，提高分析方法的选择性。这种经典的萃取方法虽然设备简单，但是经常会有一些 不利之处。主要的问题如下：第一，液液萃取操作烦琐、费事、萃取时间长，且因多次 萃取易造成重现性差，又会产生乳化作用而使分析结果偏低或导致净化作用达不到预 期要求：第二，萃取剂消耗量大，长时间萃取需消耗大量溶剂、能源和人力；第三，l l e 需要大量有毒有害有机溶剂作为萃取剂，特别是含有卤素的有机溶剂，不利于分析人 员的身体健康，在萃取过程中以及之后的溶剂回收过程中会伴有严重的污染问题；第 四，后处理分析复杂经萃取后的样品 芒往不能用于直接进样，还需要进行样品的净 化和浓缩等复杂过程。 嘎 、 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 3 2 1 特点 e x t r e l u t 鸯n t 是一种新型的样品制备装胃，可以取代分液漏斗，只要少量的有机 溶剂就可以非常安全地完成样品的萃取j j 二作。它足由经特殊处理的带有大孔容的大孔 硅藻k i l l 成。其硅藻上基质为化学惰性，可承受1 1 3 的p h 范围。e x t r e l u t 萃取小柱 主要戍j f j 于水溶液巾脂溶性化合物的提取，具有以下特点： 1 ) 防j l ：乳化现象形成： 2 ) 节钳溶剂、材料和时i n j ； 3 ) 在蒸发疗订无需二r 燥洗提液； 4 ) 具有较高的网收牢，尤其适用于水溶液巾有机物的提取。 3 2 2 工作原理 水溶液样册，波导入e x t r e l u t 国吸附剂上二，在化学惰性的基质颗粒表面，样品分散形 成覆盖f 其上的薄层，从表面上类似固定桐。接着，用与水不混溶的有机溶剂进行洗 脱，如1 二乙綦醚、乙酸乙酯或卤代烷烃等溶剂。所有的亲脂性物质从水溶液中被萃取 到有机溶剂相中。在这一过程中，水溶液相保留l 笙固定相上，因此沈提液不会出现乳 化现象，能直接蒸发浓缩用于下一步分析。 3 3 3 应用 e x t r e l u t 圆萃取小柱常用于临床医学和毒理学，用于尿、全血、血浆、血清、胃液、 羊膜水、粪便、动植物组织的样品预处理。也应用在环境和残留分析领域中，如对工 业用水、饮用水和废水的分析。对于酸性或碱性物质如体液中药物和药物代谢物的分 级提取也是i i h ? 的。 岖j 硕士学位论丈 m a s t e r st h e si s 1 目标分析物的选择 第二部分实验 通过查阅相关文献考虑到标准物质的获取情况，选取n 亚硝基二丁胺( n d b a ) 、 n 亚硝基二己醇胺( n d e l a ) 、n 亚硝基二乙胺( n d e a ) 、n ，亚硝基二甲胺( n d m a ) 、 n 亚硝基二i 碍胺( n d p a ) 和n 亚硝基吗啉( n m p l e ) 6 种n 亚硝基化合物作为目标 分析物。 2 仪器及试剂 2 1 仪器 阎卡萃暇装置( a l l t e c h 公司) ； 固棚萃取柱( a l l t e c hc 1 8 、f l o r i s i l 、o r o c h e mc 1 8 、w a t e r s 回h l b 、m a x 、m c x ) ： e x t r e l w n t 2 0 液液萃取柱( 德国m e r c k 公司) ； 振荡均匀器； g i l s o n 隋密移液器( 2 0 0 p l ，1 0 0 0 p l ，5 0 0 0 “1 ) ： 电予分忻天平： k d 浓缩器； l c m s m sa p i4 0 0 0 ( 美国a b 公司) ： 质谱部分 苠宇度：3 3 e 5 t o r t 离予源：e s i 离子源 扫描极性：p o s i t i v e 离予源温度：2 0 0 质谱参数：c a d5 0 0c u r17 0 0g sl2 0 0 0g s 23 0 0 0 i s5 5 0 0 0 0 f e m2 0 0 0 0 i h e1 0 0d p3 2 0 0e pl0 0 0c x p6 0 0 5 员士聿傍论炙 m a s t e r st h e s i s 色谱部分 7 色潜柱：a g i l e n tz o r b a xe c l i p s ex d b c 8 ( 4 6 15 0 m m ，5 9 m ) 柱温：室温 进样量：1 0 9 l 流动相：1 0 0 甲醇 流速：3 0 0 9 l m i n 总时间：7 m i n 2 2 试剂 n 亚硝基二丁胺( n d b a ) 、n 亚硝耩二乙醇胺( n d e l a ) 、n 亚硝基二乙胺 ( n i ) e a ) 、n 亚硝基二甲胺( n d m a ) 、n 哑硝基二丙胺( n d p 八) 和n 亚硝基吗啉 ( n m p l e ) 标准品( s i g m a 公司) ；甲醇( 色谱级，f i s h e r 公司) ；二氯甲烷( 色谱级， f i s h e r 公司) ；环己烷( 分析纯，北京化学试剂公司) ；乙酸乙脂( 色谱级，f i s h e r 公司) 3 分析步骤 3 1 标准曲线的绘制 3 1 1 单个标准溶液的配制和标准曲线绘制 分别称取一定量的亚硝胺标准物质，加入少量甲醇溶解，转移至1 0 m l 容量瓶中， 用甲醇定容至刻度，配制单标储备液，将储备液于4 保存。储备液用甲醇稀释至 2 0 0i tg m l 作为中问使用液，一并于0 - - , 4 ( 2 下密闭保存，使用时根据实际需要稀释。中 自j 液用l f l 醇稀释至lug m l 左右用于选择质潜和色谱条件时使用。 把中间使用液用甲醇准确稀释成0 、l n g m l 、1 0n g r n l 、1 0 0n g r a l 、1 0 0 0n g m l 、 浓度系列，分别测定各标准溶液的色谱峰，以峰面积对相应的浓度作图，得到标准曲 线，诈求出回归方程。 1 6 硕士学位论文 m a s t e r st i l e s i s 3 1 2 混合标准溶液的配制和标准曲线绘制 根据单个标准溶液的线性回归方程，以箨剩率的反比作为混合标准溶液中单个化 合物的浓度比。按照比例分别取6 种距硝胺t i 间使用液加入到1 0 m l 容量瓶中，用甲醇 稀释到刻度，摇匀，将混标溶液于0 4 c 保彳f 。 把混标溶液用fr i 醇准确稀释成0 、1 1 0 0 0 、1 5 0 0 、1 1 0 0 、1 5 0 、1 1 0 、1 浓度系列， 分别测定各标准溶液的色谱峰，以峰面积对相应的浓度作图，得到标准曲线，并求出 回归方程。 3 2 实际样品的选择 并f i 是所有的化妆品中都会含有亚硝胺，这就要求我们对所要检测的样品进行初 步的筛选。化妆品在制作和放置过程中由于一些可能形成亚硝胺的前体物质被亚硝化 而形成弧硝