（动物遗传育种与繁殖专业论文）鹅核型分析和gh、ghr基因多态性与生长性状关联研究.pdf

陈清：鹅核型分析和g h 、g h r 基因多态性分析与生长性状关联分析 8 5 扬州大学学位论文原创性声明和版权使用授权书 学位论文原剖性声骥 本人声明：所里交的学位论文是在导师指导下独立进行研究工作所取得的研 究成果。除文中已经标明弓| 用的内容外，本论文不包含其他个人或集体已经发表 豹研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在文中以臻确方式标明。 本声骥的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名： w 、治 签字日期：p 舯手年f 月fe 日 学位论文版权使用授权书 本人完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向 国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和电子文档，允许论文被查阅和借 阅。本人授权扬州大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同时授权中国 科学技术信息研究所将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库，并通过 网络向社会公众提供信息服务。 学位论文作者躲像淆 导师 签字日期：j 。母年占月，。网 签字日期；、2 嘴年6 月占墨 ( 本页为学位论文末页。如论文为密件可不授权，但论文原创必须声明。) 陈清：鹅核型分析和g h 、g h r 基因多态性分析与生长性状关联分析 鹅核型分析和g h 、g h r 基因多态性与 生长性状关联研究 专业：动物遗传育种与繁殖 研究生：陈清 导师：陈国宏教授 ( 扬州大学动物科学与技术学院，扬州2 2 5 0 0 9 ) 摘要 本研究以四季鹅，浙东白鹅，皖西白鹅为对象，采用外周血淋巴细胞培养法 对这3 个种群进行核型分析，并计算种群间的核型似近系数和核型进化距离；对 g h 基因外显子进行p c r - s s c p 检测和克隆测序，得到鹅g h 基因编码区序列， 同时对g h r 基因3 调控区进行p c r - s s c p 检测，分别计算3 个鹅种群的基因型 频率和基因频率，比较不同种群间的基因型分布，并对g h 基因和g h r 基因多 态性与1 1 0 周龄体重、屠体重、半净膛重、全净膛重等生长性状进行关联分析。 结果如下： 1 浙东白鹅、四季鹅和皖西白鹅3 个种群染色体数目均为2 n - 7 8 ，包含1 0 对大型染色体和2 9 对微小染色体；染色体的形态相似，1 号为亚中央着丝粒染色 体，2 号、4 号、z 和w 染色体为中央着丝粒染色体，3 、5 9 号染色体为端着丝 粒染色体。且种群间的核型似近系数较高，表明3 个种群有着较近的亲缘关系。 2 对鹅g h 基因外显子进行克隆测序，得到鹅g h 基因编码区全序列，长度 为6 5 l b p 。与鸡g h 基因c d s 的同源性为9 1 4 ，与鸭的同源性高达9 8 5 ，演绎 成氨基酸后同源性分别为9 7 6 和9 9 9 ；与人、鼠g h 基因c d s 序列同源性分 别为6 3 8 1 和7 4 3 1 ，演绎成氨基酸后同源性分别为5 2 5 1 和7 2 8 1 。 3 在鹅g h 基因编码区上共检测到4 个s n p 位点，分别为外显子2 的c 3 9 t 、 2 扬州大学硕士学位论文 c 7 4 t 突变和外显子4 的t 2 9 l c 、g 2 9 7 c 突变，仅外显予2 的c 7 4 t 突变编码的氨 基酸由丙氨酸变为缬氨酸，其余位点均为“沉默 突变。外显子2 多态性分析结 果显示，四季鹅具有7 种基因型，浙东白鹅具有8 种基因型，皖西白鹅具有全部 l o 种基因型。在四季鹅中等位基因a 为优势等位基因，频率为0 5 3 5 ，浙东白鹅 中等位基因d 为优势等位基因，频率为o 5 2 4 ，皖西白鹅中等位基因a 、b 、c 和 d 的频率分别为o 3 5 9 、o 0 6 3 、0 3 3 9 和o 2 3 9 。等位基因分布的差异可能与各种 群的生长速度有关。外显子4 多态性分析结果显示，3 个鹅种群均具有全部3 种 基因型，在四季鹅和浙东白鹅中等位基因e 均为优势等位基因，而在皖西白鹅中 等位基因e 和f 的频率接近，约各占5 0 。推测等位基因e 可能是鹅繁殖性状的 优势等位基因，该基因座可能与繁殖性能相关。 4 对鹅g h 基因外显子的多态性与生长性状进行关联分析，结果表明鹅g h 基因外显子2 的多态位点上对早期体重( 1 4 周龄) 和屠宰性状存在显著的基因 型效应，对于早期体重和屠宰性状而言，c c 、c d 和d d 基因型是有利基因型， 可用于鹅早期体重和屠宰性状的标记辅助选择。在浙东白鹅中的优势等位基因d 和频率较高的等位基因c 可能是有利基因。 5 在鹅g h r 基因3 调控区上检测到1 个s n p 位点，测序结果表明发生a g 点突变。四季鹅和皖西白鹅中具有3 种基因型，浙东白鹅中有2 种基因型。3 个种群均以m m 基因型个体占绝大多数，等位基因以m 为优势等位基因，但在 四季鹅中m n 和n n 基因型的个体相对较多。四季鹅的基因型分布与皖西白鹅、 浙东白鹅间存在极显著差异，这可能与各个鹅种的选育历史和程度有关，皖西白 鹅和浙东白鹅表现出一定程度的品种保守性。 6 对鹅g h r 基因3 调控区的多态性与生长性状进行关联分析，结果表明该 多态位点仅对屠宰性状存在显著的基因型效应，m m 基因型为屠宰性状的有利基 因型，优势等位基因m 可能为有利基因。 关健词：鹅；核型；g h 基因：g h r 基因；单核苷酸多态性：体重；屠宰性状 陈清：鹅核型分析和g h 、g h r 基因多态性分析与生长性状关联分析 3 a n a l y s i so nk 哪。咖ea n dp o l y m o 印h i s mo fg h a n d g h rg e n ea n di t sr e l a t i o n s h i pw i t h g r o 、矾h1 1 r a i t si ng o o s e m s c a i l d i d a t e ：c 髓nq i n g a d v i s o r ：p r 0 c h e ng u 0 - h o n g m 旬o r ：a 面m a lg e n 舐c s ，b r e e d i l l g 锄dr e p r o d u c t i o n ( c o l l e g eo f a 血m a ls c i e n c ea n dt c c l u l o l o g y ，玛z h o uu m v e r s i 坝y h g z h o u2 2 5 0 0 9 ) a b 联 t r a c t l r y o t y p ea n a l y s i s 、舱sc a r r i e do u to ns i j ig o o s e ，z h e d o n gw 1 1 i t e9 0 0 s ea n d w r a n x iw h i t eg o o s eu s i r 坞t l l e p e r i p h e r a ll y m p h o c y t ec u l t u r et e c h i l i q u e ，甜l dt h e k a r y o t ) ，p er e s e m b l a n c e - n e a rc o e m c i e n ta l l de v o l u t i o l l a 秽d i s 咖c ea m o n g 也r e e p o p u l a t i o i l so fg o o s ew e r cc a l c u l a t e d t h ee x o n so f 印w mh o m o n e ( g h ) g e n e 、e r e c l o n e da n ds e q u e n c e d ，a n dm ec o d i n gs e q u e n c eo f9 0 0 s ew a so b t a i n e d ，t h es i n g l e n u c l e o t i d ep o l y m o 印h i s m ( s n p ) o f n 硷c o d i n gr e g i o no fg r o w t l lh o 咖o n eg e n ea n dt h e 3 r e g u l a t o r yr e g i o no fg r o w 墩h 0 髓o n er e c e p t o r ( g h r ) g e n ew 笛i n v e s t 主g a t e di ns i j i 9 0 0 s e ，z h c d o n gw b i t eg o o s ea n d iw 眦eg o o s eb yp c r - s s c pa l l ds e q u e n c e m e t h o d t h ef r e ：q u e n c yo fg e n o t y p e sa n dg e n e s 髑c a l c u l a t e da n dm ed i s t r i b u t i o no f g e n o t ) ，p e 丘e q u l m c i e s 锄o n gd i 仔e r e n tp o p u l a t i o n so fg o o s ew 嬲c o m p a 舱d t h e p o l y m o 咄i s m0 fg h a l l dg h rg e n ea n di t sr e l a t i o n 幽pw 胁g r o w t h 仃a i t ss u c h 韬 b o d yw e i g h t a t1 10w e e k ( s ) o fa g e ，c a r c 弱s w e i g b t ，s e m i e v i s c e r a t e dw e i g h t ， e v i s c e r a t e d 、v e i g h ta l l ds oo nw e r ea 1 1 a l y z e d t h er e s u l t sw e r ea sf o l l o w i n g ： 1 t kk a 叮o t y p e so fs i j ig o o s e ，z h c d o n gw h i t eg o o s ea n dw 童n 】( iw h i t e9 0 0 s e w e r es i m i l a rt oe a c ho t l l e r t h et l l r e ep o p u l a t i o i l so fg o o s el l a da d i p l o i dc h m m o s o m e s n u m b e ro f7 8 ，w i t i l1op a i r so fm a c r o c h r o m o s o m e si n c l u d i n gt l l es e xc 啪i n o s 0 m ea i l d 4 扬州大学硕士学位论文 2 9p a i r so fm i c r o c h r o m o s o m e s ；n 0 1c h r o m o s o m ew a ss u b m e t a c e n t r i cc h r o m o s o m e ， n 0 2 ，n o 4 ，za n dw w e r em e t a c e n t 矗cc h r o m o s o m e ，n o 3 锄df 如mn o 5t on o 9 w e r et e l o c e n t r i cc 1 1 1 0 m o s o m e t h ek 乏i 巧o t y p er c s e m b l a r l c e n e a rc o e f f i c i e n t 枷o n g m r e ep o p u i a t i o n so fg o o s ew e r eh i g h ，w t l i c hi n d i c a t e d 纰tt h e s ep o p u l a t i o n sh a v e c l o s eg e n i e t i cr e l a t i o n s l l i p s 2 t h ee x o n so fg r o w 吐lh o m o n eg e n e 、v e r ec l o n e da n ds e q u e n c e d ，a n dt h ec o d i n g s e q u e n c e 、v 硒o b t a i n e dw i t ht l l el e n g t ho f 6 5l b p h o m o l o g o u sc o m p 撕s i o ns h o wt h a t t 1 1 ei d e n t i t ) ro fc d so fg h g e n ew 嬲9 1 4 b e 觚e e ng o o s ea n dc h i c k e n ，强d9 8 5 b e t w e e n9 0 0 s ea n dd u c k ，a n dn l a tw a s9 7 6 锄d9 9 9 i i la m i n 0a c i ds e q u e n c e s ， r e s p e c t i v e l y f 删l e ra n a l y s i ss h o w e dt h a tm e i d e n t i t i e so fc d so fg o o s eg hg e n e 诵m h h n a i la n di n o u s e 、e r e6 3 8 l a n d7 4 3 1 ，a n dt h a tw 弱5 2 5 1 a n d7 2 8 1 i 1 1 锄i n oa c i dl e v e l ，r e s p e c t i v e l y 3 f o u rs n p s 、忱r ed e t e c t e di nt h ec o d i i l gr e g i o no fg h g e n e ，t h e yw e r ec 3 9 t a n d c 7 4 tm u t a t i o n sw i m i ne x o n2 ，a 1 1 dt 2 91ca n dg 2 9 7 cm u t a t i o n sw i t h i ne x o n4 h o w e v e r ，e x c 印tm ec 7 4 tm u t a t i o 玛砌c hc h 觚g e dt h ec o d i n g 跚i n 0a c i d 肋m a l 撕n et ov 赳i n e ，o m e rm u t a t i o n s 、e r cs l i e n t t h er e 跚l to fp o l y m o 印h i s m 锄a l y s i so n e x o n2s h o 、e dn l a tt h e r ew e r et c ng e n o t ) ，p e si nw 撕x iw 1 l i t eg o o s e ，s e v e ng e l l o t y p e s i ns i j i9 0 0 ，a n de i g h tg e n 0 白，p e si i lz h e d o n gw l l i t eg o o s e i ns i j i9 0 0 s e ，u 1 ea l l e l ea w 嬲s u p e r i o ra i l e l e ，t h e 骶q u e n c yo f 、h i c hw 嬲o 5 3 5 i nz h e d o n gw h i t e9 0 0 s e ，t h e a l l e l ed 、) l 船s u p 耐o ra l l e l e ，t t l e 毹q u e n c y 、v 勰0 5 2 4 i i lw a i l x iw h i t eg o o s e ，n l e f b q u e n c yo fa 1 1 e l ea ，b ，c 甜l ddw e r e0 3 5 9 ，0 0 6 3 ，o 3 3 9a n d0 2 3 9 ，r e s p e c t i v e l y t h ed i 妇融r e n c eo f 廿1 ed i s t r i b u t i o no fa l l e l em i g h tr e l a t et 0m eg r o w 吐lr a t eo fe a c h p o p u l a t i o n 1 1 伦r e s u ho fp 0 1 ) 釉o r 】蛳s ma n a ：l y s i so ne x 0 n4s h o w e dm a t m e r ew e r e n 矾eg e n 0 呻e si i lt l l r e ep o p u l a t i o i l s i i ls i j ig o o s em dz h e d o n gw 1 1 i t e9 0 0 s e ，t l l ea l l e l e ew 硒s u p e d o ra l l e l e i nw m x i 删t e9 0 0 s e ，m e 缸q u e n c yo fa l l e l ee 锄dfw 勰c l o i ti m p l i e dt t 僦a l l e l ee 、惴也ef a y 0 劬l eg e n ef o rr c l ) r o d u c t i v e 仃a i t si ng o o s e ，锄dt 1 1 i s g e n el o c im i g m r c l a 伦t 0r e p r o d u c t i v ep e 0 册a l l c e 陈清：鹅核型分析和g h 、g h r 基因多态性分析与生长性状关联分析 5 4 a s s o c i a t e da n a j y s i so np o l y m d r p h i s m so fe x o n so fg hg e n e 戳l d 罂o w c h 仃a i t s s i 矾r e dt 1 1 a tm e p 0 1 ) ，i i l o 叩i l i cl o c io fe x 0 n2o f g h g e n eh a ds i 鲥f i c 觚tg e n o t y p ee 虢c t o ne a r l yb o d yw e i g h t ( m ea g eo f1 4w e e k s ) a n dc a r c 弱s 仃a j t s c c ，c d 锄dd d g e n o t y i 嚣 w e r ef - a v o r a b l eg e n o 呻e sf o re a r l yb o d y 、v e i g h ta i l dc a r c a s st r a i t so fg o o s e ，跚l dc o u l d b e u s e df o rm o l e c u l a rm a r k e 卜a s s i s t e ds e l e c t i o no fe a d yb o d y 、) v e i g l i ta n dc a r c 嬲s 慨t s i nz h e d o n gw h i t e9 0 0 s e ，l es u p 耐o ra 1 1 e l eda i l da l l e l ecc o u l db e l v o r a b l eg e n e s 5 o n es n p ( a g ) w a sd e t e c t e di i lt t 怆3 - r e g u l a t o 巧r e g i o no fg h r g e n e t h e r e w e i l em 飑eg e n o t y p e si ns i j ig o o s ea n d 、7 v a i iw 1 1 i t eg o o s e ，“) l ，og e n o 够p e si nz h e d o n g w h i t eg o o s e i nt l l e s et l l r e ep o p u l a t i o n s ，i n d i v i d u a l sw i t ht 1 1 cm m g e n o t y p ew e r et h e o v e r v 出e l m i n gm 旬o r i t y t l l ea l l e l emw 弱s u p e r i o ra l l e l e h o 、v e v e r t l l en u r n b e ro f i n d i v i d u a l s 谢t l lm na i l dn ng 锄。咖ew 酗l a r g e ri l ls i j ig o o s e 1 1 1 ed i s m u t i o no f g e n o t ) ，p ei i ls i j ig o o s ew 勰s i 嘶f i c 龇l t l yd i 伍：r e n tf i 0 mm a to fz h e d o n gw l l i t eg o o s e 觚dw a l l ) ( iw h i t eg o o s e i tm i g h tb er e l e v 觚tt ot h c 量l i s t o 巧a i l dd e 莎e eo fb r e e d i n gi n g o o s e z h e d o n gw h i t eg o o s ea i l dw 融iw h i t eg o o s eh a dt h e i ro 、) v 1 1c o n s e a t i v e n e s s 6 舢s o c i a t e da n a l y s i so np 0 1 ) ，1 1 1 0 印l l i s mo f3 一r e g l l l a t o r yr e g i o no fg h rg e n e a n dg r 0 、t ht r a i t ss h o w e d 饥缱t h i sp o l y n l 0 啦虹cl o c ih a ds i 嘶孤tg e n 0 咖ee 髓c t o m yo nc a r c a u s s 饥l i t s m mg e n 吵p ew 嬲f a v o r a b l eg e n o t y p ef o rc a r c 嬲s 僦t s ，觚dt h c s u p e r i o ra l l e l em c o u l db ef a l r a b l eg e n e k e yw b r d ：g o o s e ；k a r y o t y p e ；g hg e n e ；g h rg e n e ；s i n g l en u c l e o t i d ep o l y m o r p h i s m ； b o d yw e i g h t ；c a r c 嬲sp e r f o m l a n c e 6 扬州大学硕士学位论文 第一章文献综述 中国是氆界上养鹅最多的国家，鹅晶种资源丰富多样。我国幅员辽阔，各地 自然生态条件复杂多样，不同时期的经济文化背景不同，对鹅的选择和利用不同， 逐步形成了具有不同遗传特性和生产性能的地方品种【。有产蛋量高的豁眼鹅、 太湖鹅、四川白鹅，有产肉、产绒性能较好的皖西白鹅、浙东白鹅，也有产肝性 能较好的溆浦鹅，狮头鹅等优良品种圆。这些品种不仅自然生态适应性广、抗逆 性强、耐粗饲、觅食力强，而且蕴含着较大的遗传变异和选择潜力。因此探求鹅 的品种瓷源，不同品种的生产性能，研究鹅的遗传特性以及如何合理保护利用都 具有十分重要的意义。 l 禽类染色体研究进展 2 0 世纪6 0 年代起，由于人类终周血淋巴细胞培养方法制备染色体获得成功， 大大促进了畜禽染色体研究工作的进展。愈来愈多的研究者认识到：家禽染色体 数朗、微小染色体( 武c r o c h r o m o s o m e ) 和大型染色体( m a c r o c h r o m o s o m e ) 的结 构、性质和遗传行为没有本质的不同；w 染色体很小，基本不携带遗传基因。对 大多数生物来说，染色体形态观察最理想的时期是有丝分裂中期，这时染色体收 缩最短，形态学特点鲜明而稳定，可以根据染色体长度、着丝点位置及次缢痕的 有无和位置来识别其个别性。以往进行核型分析，主要是根据染色体的形态标志， 船；相对长度、臂比指数、饕丝粒指数等，但仅根据这类指标，在许多场合还是 难以做到单个染色体的鉴别，近年来发展起来的染色体分带技术提供了新的识别 标志。染色体分带技术的发展提高了核型分析的质量。 1 1 禽类染色体核型 核型( 吣印y e ) 是指一个个体或一个物种体细胞核中的染色体组成，也称 为染色体组型，它是某一个体或物种的重要遗传标记特征。任何种核型都有一 个产生和发展的过程，实质上也是一种系统发生的过程，在此过程中，每种核型 在其适应范围内产生最适应的核型，而这种适应的核型是通过染色体重排实现的， 这种变化无疑在物种形成中起着重要作用。当然不同的类群在物种形成以及系统 陈清：鹅核型分析和g h 、g h r 基因多态性分析与生长性状关联分析 7 进化方面都具有本身的特点【3 】。一般对核型的研究主要包括两个内容：染色体数 目和染色体形态。它代表着一个个体或物种在染色体水平上的表型，是细胞遗传 学研究的基础。目前禽类染色体核型研究都使用l e v 趴【4 】的核型分析方法。 目前国内外对鹅染色体方面的研究较少，刘友清等【5 】采用外周血淋巴细胞培 养与胚胎组织两种方法对五龙鹅的染色体核型进行了分析，发现五龙鹅的染色体 2 n = 7 8 ，并推测中国鹅种染色体数目不同于欧洲鹅种可能是由于鹅种的起源不同 所致。郭利敏等【6 】采用外周血淋巴细胞培养，并用中等剂量的5 溴脱尿苷( b r d u ) 和微量的胸苷( r l r ) 同一时间处理细胞研究四川白鹅的染色体核型，发现四川 白鹅体细胞染色体数为2 n 一7 8 ，其中双臂染色体2 6 条。王欢莉【7 】对扬州鹅染色体 核型和带型进行分析，结果表明扬州鹅染色体数目2 n = 7 8 ，有2 对长染色体，2 对中长染色体，2 对中短染色体，3 3 对短染色体。h a 瑚m a r 【8 】对灰雁、小白额雁和 鸿雁进行了研究，发现它们染色体数目均为8 0 。而b e c a l 【等【9 】则认为鸿雁的染色 体数目为2 n _ 8 2 ，灰雁2 n - 8 0 ，家鹅的则介于8 0 8 2 之间，没有统一的定论。 1 2 禽类染色体带型 2 0 世纪7 0 年代，随着染色体显带技术的出现，又兴起了染色体带型的研究。 常见的有g 带、r 带、c 带、q 带和银染核仁组织区带等。所谓“带”，是指经 过一系列处理和染色，从而产生具有种属特异性横纹的差示染色带。显带方法一 般以染料为主，也有以功能为基础的。基于染料的染色体显带技术，有的较简单 ( 即不经任何预处理，仅采用一种染料分子) ，有的较复杂，染色前需要对染色 体进行预处理，并需要混合使用染料。 1 2 1 染色体g 带 g 带是指染色体标本片经胰酶或某些盐类处理，姬姆萨( g i e m s a ) 染色后沿 长度上所显示的丰富的带纹。g 带是应用最广泛的显带技术，简单而精细，具有 种特异性，每一条染色体都会显示特定顺序的明暗相间的带纹，且非常容易鉴别， 所以对识别染色体、进行物种间同源性比较具有重要意义。 s t o c k 【l o 】首次报道了家鸡g 带的研究，此后曾养志【l l l 、傅金恋【1 2 1 、黄勇等【1 3 1 、 刘莉等【1 4 】、徐琪【1 5 】、嵇宝华f 1 6 1 、朱云芬【1 7 】以及熊淑慧等【1 8 j 、赵捷【1 9 】等分别对不 8 扬州大学硕士学位论文 同家禽染色体g 带进行了分析，结果证实了g 带能使染色体显示出特异性、稳 定的、明暗相间的条纹。鸡g 带核型的国际标准中，只考虑了前8 对常染色体和 性染色体【2 0 】，这些染色体单倍核型的g 带共有1 5 1 条带，每条染色体除了长短臂 之分，在臂的基础上，又划分了区，每个区内又有若干条明暗相间的带，最大的 区( 1 p 2 ) 有9 条带，最小的区( 5 p 1 ) 仅有一条带。g 带的应用大大提高了家鸡 染色体识别配对的准确性，并且可以用g 带技术有效地识别染色体断裂。该方法 为禽类核型分析和微小染色体形态识别提供了一种有效的技术和途径。 目前主要将g 带与荧光原位杂交( f i s h ) 技术相结合，用于基因定位、同种 不同属物种间同源性的比较( 如家鸡与鹌鹑) 。 1 2 2 染色体r - 带 r 显带技术，或者对g 显带技术来说称为相反显带技术，也是一种常用的染 色体显带方法。最常采用的程序是先将染色体置预热( 8 7 ) 的酸性盐水中部分 热变性处理，再以g i e m s a 染色【2 1 1 。r 带能准确地辨别所有较大的染色体，特别 是能了解染色体的某个部分或片段，从而分析染色体的某些结构异常，如缺失、 易位和倒位等。与g 带相比，r _ 带较粗糙，但由于r - 带f i s h 技术在基因定位中 的应用，国际上鼓励研究者以标准r 带型来描述基因在染色体上的位置。 r 带的获得主要是在细胞培养过程中掺入b r d u ，制片后用g i e m s a 染色或吖 啶橙染色。1 9 9 5 年，l a d j a l i 等【2 2 1 采用胸苷双阻断法及b r d u 掺入，结合荧光素 光分解和g i e m s a 染色得到了高分辨r - 带，前1 0 对常染色体和性染色体的单倍核 型共得到1 8 2 条r 带。但由于r - 带不易重复，且采用g i e m s a 和荧光染色得到的 r - 带核型存在差异，所以禽类核型标准化会议只提供了暂时的r - 带标准化模式 图，包括前8 对常染色体和一对性染色体，其单倍核型r - 带共有1 3 4 条。 1 2 3 染色体c 带 c 显带技术包括对染色体的一系列酸碱处理，热标准枸椽酸盐溶液( s t a n d a r d s a l i n ec i t r a l t e ，s s c ) 温育以及随后的g i e m s a 染色过程。c 带显示的是结构异染色 质，在细胞分裂的间期和前期，由于异固缩( h e t e r o p y c n o s i s ) 作用，结构异染色 质即可识别，但在分裂中期，它通常不表现出来，只有用特殊的方法( 如酸、碱、 陈清：鹅核型分析和g h 、g h r 基因多态性分析与生长性状关联分析 9 高温处理等) ，才能显示c 带，c 带一般在着丝点处出现( 着丝点c 带) 、在次 绕痕处和随体上也发现有c 带( 端带) 。目前，关于c 显带机制虽提出了一些假 说，如认为是结构异染色质高度重复d n a 变性和复性的结果，也很可能是非c 带区d n a 损失及d n a 与非组蛋白相互作用的结果等，但未有肯定的结论。1 9 8 1 年，p o l l o c k 和f e c t l l l e i m e r 对鸡c 带多态性做了详细研究，结果发现不同个体、 不同细胞间，甚至同源染色体间都在数目、着色深浅、斑点形状及大小上存在着 差异，特别是z 染色体的多态性表现得尤为突出【2 3 1 。这一结果与2 0 0 3 年b a i k 等 【2 4 】得到的结论相似。傅金恋【1 2 】和王偕根【2 5 】分别对家鸡染色体c 带进行了分析， 发现c 一带显示规律受碱处理时间的影响很大，在整个c 分带过程中，w 染色体 整条深染，结果稳定，重复性1 0 0 ，所以c 带对辨别w 性染色体具有重要意义。 1 2 4 染色体q 带 1 9 6 8 年，瑞典科学家c 勰p e r s s o n 等【2 6 l 发明了世界上第一种染色体q 带分带 技术，该显带技术于1 9 8 8 年首次报道用于人类和植物染色体常染色质臂的显带。 q 显带技术是通过喹吖因或喹吖因芥子荧光染料与染色体上某些碱基发生特异性 作用，在紫外线下呈现特定带纹。试验证明亮区相当于d n a 分子中a t 含量相对 丰富的区段，暗带g c 含量相对丰富。该技术基于染色体上的碱基组成必须是非 均匀性前提下进行。q 阳性带也是g 阳性带( 某些异染色质区也着染最著名 的是人类y 染色体长臂末端的区域) ，但q 显带技术在个体发育中的应用比g 显带技术更为广泛。h t s c h i 和s n 狮z i n g e r 对鸡染色体进行了q 一带处理，清楚地 识别了前9 对大型染色体，并绘制了q 带模式图【2 7 】。 1 2 5 染色体a g - n o r s 带 核仁组织区( n u c l e o l a ro r g ；痂z e rr c g i o n s ，n o 黜) 是指某些染色体含有核糖 体i 矾a 基因的固定区域，由于这一功能片段与间期核仁形成密切相关而被称为 核仁组织区。它的一些酸性非组蛋白成分可被a g n 0 3 染色，故称为核仁组织区银 染( a g - n o r ) 技术，通过银染法可揭示染色体核仁组织的活性区。b 1 0 0 m 和b o c o n 利用银染方法，观察到鸡的n o r 位于n o 1 5 n o 1 8 之间的一对染色体上【2 引。a u e r 等【2 9 】采用连续荧光复染技术证实了两个核仁组织区分布于n o 1 7 染色体上。刘友 l o 扬州大学硕士学位论文 清等p 钟和付佩胜等【3 1 1 分别对寿光鸡和济南花鸡的a g - n o 黜带进行了研究，发现 n o r 位于n o 1 5 染色体的末端。1 9 9 6 年，f i l l o n 等进一步证实了b 1 0 0 m 等的结 论，即鸡的n o r 位于1 6 号染色体上。目前对作为一种重要的模式动物的鸡的染 色体a g - n o r s 带带型研究最为完善，而对鹅的银染带带型研究鲜见报道。 1 3 细胞遗传学标记研究 自从畜禽细胞遗传学诞生之日起，有不少学者致力于细胞遗传学标记与畜禽 生产性能关系的研究。刘莉等【1 4 1 、陈五湖等【3 2 1 、王偕根【2 5 】分别对泰和乌骨鸡、仙 居鸡和鹿苑鸡的核型参数与体重、体尺、屠宰性能和产蛋性能等生产性状指标作 了相关性研究，结果表明，家鸡前1 0 对染色体的核型参数与部分生产性状指标呈 显著或极显著相关，其中n o 4 染色体参数与部分指标存在较强的相关。徐琪f l 副 研究发现狼山鸡的屠宰性能、产蛋性状的不同经济性状值在不同的n o 1 染色体 相对长度时具有显著差异。王欢莉【7 】研究发现扬州鹅染色体参数与生产性能的相 关性研究表明，n o 3 、n o 6 染色体参数与生产性能存在正相关。染色体核型参 数与生产性能的相关性研究才刚起步，尚无定论，仍需从分子水平作进一步论证。 2 禽类生长激素( g h ) 基因研究进展 2 1 生长激素的结构 生长激素( 鲫、讹h o m o n e ，g h ) 首次于1 9 4 5 年从垂体中得以分离和鉴定， 它是由脑垂体前叶嗜酸性细胞合成和分泌的一种单一肽链的蛋白质激素，由 1 8 6 1 9 1 个氨基酸组成，分子量约为2 l - 2 2k d a 。其与催乳素( p l 也) 同属一个基 因家族，广泛存在于各种脊椎动物中【3 3 1 。不同种属来源的生长激素一级结构之间 高度同源。孙逊等【蚓对哺乳类、鸟类、爬行类、两栖类、鱼类等各种、属多达6 1 种g h 的一级结构序列作了联配分析，发现不同种属来源的g h 一级结构之间具 有不同特点：( 1 ) 近源种属同目、同科之间g h 序列高度同源；( 2 ) 非灵长类哺 乳纲动物之间的序列较为相似( 大于8 1 ) ，但与灵长类的序列差异较大，同源 性在6 4 6 9 之间；( 3 ) 鸟类与非灵长类g h 间的同源性( 7 l 一8 1 ) 较其与灵长 类的同源性( 5 2 5 4 ) 要高得多；( 4 ) 硬骨鱼类不同目之间的同源性较低，只有 陈清；鹅核型分析和g h 、g h r 基因多态性分析与生长性状关联分析 1 l 5 3 5 5 ，硬骨鱼类与其它物种的同源性都较低( 见表1 1 ) 。 裘l 。l 脊椎动物g h 序列嗣源惶 艺较( 单位：) t a b l e1 1t h eh o m o l o g o u ss e q u e n c e sc o m p a r eo fv e m b r a t eg h ( 呦 注l 此表数据摘自孙逊等( 1 9 9 9 ) l 曩表示不阍目之闻；b 表示周耳之间 2 2 生长激素的生物学功能及其作用机制 生长激素的分泌受到丘脑下部生长激素释放激素( 傩砒 ) 和生长抑制素( s s ) 的双重调节，呈脉冲式分泌。它具有广泛的生理功能，影响几乎所有的维织类型， 其作用靶组织包括骨、软骨、脂肪组织【3 5 ，3 矾、免疫系统、神经系统【3 7 】和生殖系统 【3 舯，甚至对脑组织和造血系统也有作用【3 9 4 0 1 。g h 最基本的功能是促进生长。动 物的生长受多种激素的影响，其中g h 是起关键作用的生长调节因子，它能刺激 所有机体组织的发育，增加细胞的体积和数量，还可以促进钙、磷和硫酸根在软 骨中的沉积，加速软骨基质的合成和软骨细胞的分裂，使骨骺部的软骨生长，再 钙化成詈，从藤促进骨的生长转k 镧。 生长激素调节机体生长，主要是逶过影响机体的代谢过程和代谢活动来实现 的：( 1 ) 促进蛋自质合成。研究发现g h 可促进氨基酸和葡蕊糖向细胞内转移以 及蛋白质的合成，并能提高氨基酸合成蛋白质的速率，降低氨基酸的氧化分解； 在g h 作用下，蛋白质周转代谢的总量减少，合成量大于降解量，从而提高蛋白 质的沉积量。( 2 ) 影响脂肪代谢。g h 通过降低机体内葡萄糖转化成脂肪酸的速 度，抑制脂肪酸合成酶m r n a 的转录和乙酰c o a 羧化酶、脂肪合成酶的活性， 降低脂肪酸的合成酯化；同时刺激脂肪的酶解作用，从而减少脂肪的沉积。g h 还可改变脂肪组织对胰岛素的效应，拮抗胰岛素对脂肪合成的刺激作用。( 3 ) 影 响糖的代谢。g h 对糖代谢的影响表现为胰岛素样和抗胰岛素样作用，熊改变组 1 2 扬州大学硕士学位论文 织对糖的敏感性。g h 处理初期，血糖降低，表现为胰岛素样作用，但一段时间 后血糖升高，又表现为抗胰岛素样作用。大量的报道证明，g h 在增加脂肪分解 氧化的同时，也减少了糖的分解氧化，从而为蛋白质合成的增加提供了额外的能 源【4 3 4 4 1 。 另有研究表明，g h 单独对。肾上腺皮质、甲状腺和性腺等靶器官的影响极小， 但同时注射g h 与促激素时，g h 可显著加强促激素对上述靶器官的特异性效应，所 以g h 可以作为一种增效剂，强化其他激素的作用( 4 5 】。此外，生长激素对动物的生 殖功能也具有一定作用，经g h r h 免疫处理的雄性小鼠不但生长受到阻滞，而且垂 体的促卵泡激素( f s h ) 浓度下降，精子形成受阻，睾丸体积变小。对于雌性动物， 提供外源g h 可以使其提前达到性成熟；g h 可以直接作用于卵巢，从而促进配子生 成和甾体激素生成；还可以促进胎儿的生长【4 6 ，轫。 生长激素主要通过三条途径影响生长，即直接途径、胰岛素样生长因子途径 和下丘脑垂体甲状腺轴途径。生长激素能刺激体内多种组织产生i g f i 和i g f i i ， i g f i 能引起脂肪细胞加速葡萄糖氧化并使肌纤维吸收氨基酸，而一般认为i g f i i 对胚胎生长较为重要。现在有学者认为，生长激素与体重增加的关系，主要决定 于g h 受体的数量。禽类有些组织尤其是长骨生长板软骨组织细胞内有g h 受体存 在。一些品系禽的血液中g h 含量多，但其g h 受体不多，生长也缓慢；而有些品系 虽然血液g h 含量不多，但其g h 受体却较多，其生长就较快【4 8 - 5 0 1 。 2 3 禽类g h 基因的结构 由于g h 基因在医学、畜牧业生产和渔业生产中的重要作用，对其基因结构和 基因转录调控的研究开始得很早。与哺乳动物相比，禽类g h 基因的研究起步较晚。 1 9 8 8 年台湾的c h e n 等【5 1 】首先克隆并测定了鸭g h 基因的c d n a 序列，该序列包含 8 2 0 个碱基对，编码2 1 6 个氨基酸，其2 7 个残基的信号肽与大多数哺乳动物的长度 一样。与鸡g h 的周源性极高，只有4 个氨基酸的差异。同年，l 锄b 等【5 2 】完成了鸡 g h 基因的c d n a 测序工作。该片段由编码2 5 个氨基酸的末端前体片段和编码1 9 1 个 氨基酸的成熟脱辅蛋白片段构成。其蛋白编码区序列与其它哺乳动物的同源性为 7 0 7 8 ，与鸭同源性为9 2 ，5 端非翻译区与鸭的同源性为9 0 。 陈清：鹅核型分析和g h 、g h r 基因多态性分析与生长性状关联分析 1 3 1 9 9 0 年，f o s t e r 等【5 3 】又克隆并测定了火鸡g h 基因的c d n a 序列。该序列全长约 8 0 0 个碱基对，包含一个6 4 8 个碱基对的阅读框，编码2 5 个氨基酸的引导多肽和1 9 1 个氨基酸的成熟火鸡g h 蛋白，3 端在多聚a 前有9 2 b p 长的非翻译区。其编码区的 核苷酸序列与鸡的同源性达到了9 6 ，与鸭达到了9 3 ，与人、牛、大鼠和小鼠的 同源性为6 8 7 8 ，但与大马哈鱼的同源性仅有5 8 。 1 9 9 1 年，s i l a w 等【5 4 】将鸡g h 基因定位于l 号染色体的长臂末端，染色体