（动物遗传育种与繁殖专业论文）鸡FATP1基因cDNA的克隆、组织表达及其生物信息学分析.pdf

中文摘要 本论文以四川山地乌骨鸡、藏鸡和大恒优质肉鸡为研究对象，采用r t - p c r 的方 法扩增f a t p l 基因并对其c d n a 序列和蛋白质结构进行了生物信息学的分析；运用 实时荧光定量r t p c r 技术，以1 3 a c t i n 为内参基因，研究了四川山地乌骨鸡尉即j 基因的发育性表达规律及其与肌内脂肪含量和皮脂厚的相关分析，比较了三个不同品 种f a t p t 基因组织的表达差异。结果表明： 四川山地乌骨鸡和藏鸡刚即基因c d s 区长1 9 4 1 b p 。对c d s 区序列分析表明：四 川山地乌骨鸡和藏鸡f a t p l 基因c d s 区一致性为1 0 0 ，两者与g e n b a n k 中提交的红色 原鸡f a t p l 基因m r n a 序列( 删4 2 3 6 8 7 ) 同源性均为9 9 9 。其中，第8 7 8 位碱基的 g _ a 突变造成了第2 9 3 位氨基酸的a r g - - - - h i s 突变，第1 6 1 4 位点的a _ g 碱基突变没有 造成氨基酸的突变。 经生物信息学分析，鸡f a t p l 是一个具有单个跨膜螺旋和六个疏水区的质膜蛋 白，相对分子量为7 2 5 8k d a ，等电点p i 为9 0 8 。其氨基酸序列具有2 3 个磷酸化位点， 极可能具有信号肽结构，该蛋白质的二级结构含有a l p h a 螺旋、延伸片断和随机螺旋 三种结构，并与酯酰辅酶a 合成酶具有结构和功能上的高度相似性。 对四川山地乌骨鸡f a t p lm r n a 组织表达差异的研究显示：在胚胎期骨骼肌中的 表达显著高于脑、心脏、肝脏和脂肪组织。随着鸡的生长，在大脑和脂肪组织的表达 持续上升。在发育后期，脑和骨骼肌中的表达显著高于心脏、肝脏和脂肪组织。f a t p l m r _ n a 在整个发育阶段的脂肪组织、心脏和肝脏中表达量较低；腿肌的表达量高于胸 肌的表达量。 对四川山地乌骨鸡f a t p lm r n a 组织表达发育性的研究显示：四川山地乌骨鸡各 组织中f a t p lm r _ n a 表达水平存在明显的发育性交化。1 2 w 脑、脂肪组织f a t p lm r n a 表达显著高于其它周龄；1 2 w 和2 w 心脏、肝脏f a t p lm r _ n a 表达显著高于其它周龄； 2 w 骨骼肌f a t p lm r n a 表达显著高于其它周龄。初生山地乌骨鸡胸肌和肝脏f a t p l 的表达显著高于初生藏鸡；1 0 w 大恒优质肉鸡胸肌f a t p l 的表达显著高于1 0 w 四川山 地乌骨鸡。 相关分析表明：骨骼肌和肝脏f a t p lm r _ n a 表达与肌内脂肪含量呈显著的正相 关，与皮脂厚的相关不显著。因此，我们推测f a t p l 基因的表达能在不显著影响皮下 脂肪沉积量的前提下，显著影响肌内脂肪含量。 关键词：鸡，f a t p l ，表达，肌内脂肪含量，生物信息学 c d n a c l o n i n g ，t i s s u ee x p r e s s i o na n d b i o i n f o r m a t i ca n a l y s i so ff a t t ya c i dt r a n s p o r t p r o t e i n1i nc h i c k e n l u oy i ( a n i m a lg e n e t i c sa n db r e e d i n g ) d i r e c t e db yp r o z h uq i n g ( c o l l e g eo f a n i m a ls c i e n c ea n dt e c h n o l o g y , s i c h u a na g r i c u l t u r a lu n i v e r s i t y , y a a n ，s i c h u a n ，c h i n a , 6 2 5 014 ) a bs t r a c t i nt h i s s t u d y , t o t a lr n aw a si s o l a t e d f r o mt i s s u e so ft i b e t a na n ds i c h u a n m o u n t a i n o u sb l a c k b o n ec h i c k e n s ( s m b c ) ，f a t t ya c i dt r a n s p o r tp r o t e i ni ( f a t p1 ) g e n e w a sp r o l i f e r a t e du s e dr t - p c ra n dt h ep r o d u c t ss e q u e n c e sa n da m i n os t r u c t u r ew e r e p r i m a r ya n a l y z e db y b i o i n f o r m a t i c s t h ed e v e l o p m e n t a lc h a n g e so ff a l l p 1 g e n e e x p r e s s i o ni ns m b c u s e d1 3 - a c t i na si n t e r n a ls t a n d a r dc o n t r o lb yt h er e a l - t i m eq u a n t i t a t i v e r t - p c rm e t h o da n dt h ec o r r e l a t i o na n a l y s i sb e t w e e ni n t r a m u s c u l a rf a t ( i m f ) ， s u b c u t a n e o u sa d i p o s et h i c k n e s s ( s a t ) a n df a t p1m r n ae x p r e s s i o n w ec o m p a r e dt h e f a t p1g e n ee x p r e s s i o nd i f f e r e n c ei nt i b e t a n ，s m b ca n dd ah e n gc h i c k e n ( d h ) t h e r e s u l t sa r e 孙f o l l o w s ： t h ec o d i n gs e q u e n c e ( c d s ) o ft i b e t a na n ds m d cc h i c k e nf a t p1g e n ew a s19 41b p b ya n a l y s i so fc d s ：b e t w e e nt i b e t a na n ds m d cc h i c k e n ，t h eh o m o l o g y r a t e so f n u c l e o t i d es e q u e n c e so fc o d i n gr e g i o no ff a t p1g e n ew a r e10 0 r e s p e c t i v e l y b e t w e e n p r o d u c t ss e q u e n c e sa n dg a l l u s ( x m 4 2 3 6 8 7 ) ，也eh o m o l o g y r a t e so fn u c l e o t i d es e q u e n c e s o fc o d i n gr e g i o no ff a t p1g e n ew e r e9 9 9 r e s p e c t i v e l y t h e r ew a sab a s e st r a n s i t i o na s g _ ao ns i t eo f8 7 8c a u s e da na m i n ot r a n s i t i o na sa 喀叶h i so ns i t eo f2 9 3 t h e r ew a sa b a s e st r a n s i t i o na sa _ go ns i t eo f1 6 1 4 b i o i n f o r m a t i cp r i m a r ya n a l y s i ss u g g e s t e dt h a tc h i c k e nf a t p 1i sap l a s m am e m b r a n e p r o t e i nw h i c hh a so n et r a n s m e m b r a n eh e l i e e a n ds e v e r a lh y d r o p h o b i c i t yd o m a i n s t h e r e l a t i v em o l e c u l a rw e i 出to fc h i c k e nf a t p li s7 2 5 8k d a , a n di s o e l e c t r i cp o i n ti s9 0 8 t h ea m i n os e q u e n c em a yh a v es i g n a lp e p t i d ea n dp h o s p h o r y l a t i o ns i t e s i th a sa l p h ah e l i x ， r a n d o mh e l i xa n dt h es i m i l a rc r y s t a ls t r u c t u r eo ft h ea c y l c o as y n t h e t a s e f a t p1m r n at i s s u e se x p r e s s i o nd i f f e r e n c ei ns m b cs u g g e s t e dt h a tf a t p1m r n a e x p r e s s i o ni nm u s c l ew e f es i g n i f i c a n t l yh i g h e rt h a nt h a ti nb r a i n ，a d i p o s et i s s u e s ，l i v e ra n d h e a r t ( p o 0 5 ) i ne m b r y o n i cp h a s e t h e n ，t h ef a t p lm r n ae x p r e s s i o ni nb r a i na n d a d i p o s et i s s u e sg r o wf a s t f a t p1m r n ae x p r e s s i o ni nm u s c l ea n db r a i nw e r es i g n i f i c a n t l y h i g h e rt h a nt h a ti na d i p o s et i s s u e s ，l i v e ra n dh e a r t ( p o 0 5 ) i nl a t e rg r o w t hp h a s e s f a t p l m r n a e x p r e s s i o ni nl i v e ra n dh e a r tw e r el i t t l el o w ，a n dt h ee x p r e s s i o ni nl e gm u s c l ew a s h i g h e rt h a nt h a ti np e c t o r a lm u s c l e f a t p1m r n at i s s u e se x p r e s s i o nd e v e l o p m e n t a lc h a n g e si ns m b cs u g g e s t e dt h a t f a t p1m r n a e x p r e s s i o ni nd i f f e r e n tt i s s u e sh a so b v i o u s l yd e v e l o p m e n tc h a n g ei ns m b c f a t p lm r n a e x p r e s s i o ni nb r a i na n da d i p o s et i s s u e so f1 2w e e kw e r es i g n i f i c a n t l yh i g h e r t h a no t h e rw e e k s f a t p1m r n ae x p r e s s i o ni nl i v e ra n dh e a r to f2w e e ka n d1 2w e e kw e r e s i g n i f i c a n t l yh i g h e rt h a no t h e rw e e k s f a t p 1m r n a e x p r e s s i o ni nm u s c l eo f2w e e kw e r e s i g n i f i c a n t l yh i g h e rt h a no t h e rw e e k s f a t p 1m r n a e x p r e s s i o ni np e c t o r a lm u s c l ea n d h e a r to fs m b cw e r es i g n i f i c a n t l yh i g h e rt h a nt i b e t a na tb i r t h f a t p1m r n a e x p r e s s i o ni n p e c t o r a lm u s c l eo fd hw e r es i g n i f i c a n t l yh i g h e rt h a ns m b c a tb i r t h t h ec o r r e l a t i o na n a l y s i ss h o w e dt h a tf a t p1m r n ae x p r e s s i o ni nm u s c l ea n dl i v e r w e r ef o u n dt ob ep o s i t i v e l yc o r r e l a t e dw i t hi m f 俨 0 0 2 ，b u tn o tc o r r e l a t e dw i t h s a t w es u g g e s t e dt h a tf a t p1m r n a e x p r e s s i o nc o u l da f f e c ti m fs i g n i f i c a n t l yw h i l et h e s u b c u t a n e o u sf a tc h a n g e sl i t t l e k e yw o r d s ：c h i c k e n ，f a t p l ，e x p r e s s i o n ，i m f ，b i o i n f o r m a t i c 论文独创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行研究工作所取得的 成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，学位论文中不包含其他个 人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得四川农业大学或其它教育机 构的学位或证书所使用过的材料。与我- 同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己 在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名： 、罗软 碌么月刀日 关于论文使用授权的声明 本人完全了解四川农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅，可以 采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意四川农业大学可以用不 同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的伞部或部分内容 研究生签名： 导师签名： 罗缺 箬幺 力掰年乡月2 7 旦 年月日 1 文献综述 1 1 选题背景 1 1 1 家禽选育的研究现状 肉鸡业在世界范围内，尤其在中国等发展中国家具有良好的市场发展前景。需求 量的增大使肉鸡育种工作取得了巨大的成就，尤其是肉鸡的生长速度得到了前所未有 的提高，有报道称目前肉鸡的生长速度以1 1 5 【l 】的速度递增。然而，这种片面强 调选择生长速度的育种方式在肉鸡生产中形成日益突出的几大弊端，其一是鸡肉品质 的低劣，最明显的是风味的下降；其二是降低了胴体瘦肉对脂肪组织的比例，因而降 低了分割产肉量，使肉鸡养殖的利润下降；其三是一些没有商业价值的脂肪组织在鸡 体中的过多沉积，如嗉囊周围的脂肪和腹部脂肪。这些部位的脂肪往往被作为废弃物 处理，这不仅降低了肉鸡的屠体产量，而且也造成一定的环境污染。其四是人们出于 健康的考虑，担心因为摄入过多的动物脂肪和胆固醇而患上心血管疾病 2 刁】。因此， 选育低脂肉鸡品系是世界范围内肉鸡育种重要的奋斗目标之一。 肉鸡的生长速度和生理适合性状( p h y s i o l o g i c a lf i t n e s st r a i t ，p f t ) 呈负相判4 。5 】。 因此，仅仅依赖于表型选择同时改善p f t 及提高生产性状是非常困难的。分子标记 辅助选择( m a k e r - a s s i s t e ds e l e c t i o n ，m s ) 为解决这一问题提供了新的契机。分子标 记辅助选择就是通过选择与数量性状位点( q u a n t i t a t i v et r a i tl o c i ，q t l ) 相连锁的基 因或非基因标记，实现对基因型的直接选择。将传统的育种方法和现代的分子遗传学 方法结合起来的现代遗传育种学应用于家禽育种，这必将极大的提高选择效率及进一 步提高鸡的生产性能【叩。 我国土地资源广阔，拥有许多地方畜禽品种，而地方畜禽品种优异基因资源发掘 及其功能基因组研究是分子育种的基础。某些基因与繁殖性能、肉品品质等最受国际 关注、最具特色和国际竞争力的经济性状相关联，是我国畜牧业持续发展的坚实基础 和巨大的潜在优势。虽然我国对于分子遗传标在家禽育种的研究和应用方面起步较 晚，但同样取得了一些骄人的成绩。我国家禽育种专家在黄羽优质肉鸡的育种工作中 作出了突出贡献。现在已经利用石歧杂为父本育种基础群，选育出两个父本专门化品 系，再与以隐性白羽肉鸡为母本育种素材选育出的一个母系品系配套生产商品杂交 鸡，这种杂交鸡不仅继承了中国优质土鸡的血液，又不逊色与国外快大型白羽肉鸡的 生长速度【引。 1 1 1 2 禽类脂质代谢特点 禽类脂质代谢及其调控有其自身的特点。鸡的脂肪组织本身只能合成极少的脂肪 酸【9 】，而肝脏组织才是合成脂肪酸的主要部位1 0 1 ，另外肠道的吸收也是其来源的主要 途径【l l 】。肝脏合成和分泌的新脂质以极低密度脂蛋白( v e r yl o wd e n s i t yl i p o p r o t e i n ， v l d l ) 的形式进入血液。 禽类的淋巴系统不发达，脂肪吸收后以v l d l 的形式( 至少9 0 ) ，经门脉系统而 转运全身1 2 1 。当进入血液循环的脂蛋白甘油三酯被转运到脂肪组织中时，在脂肪细胞 表层被脂蛋白脂酶分解而以游离脂肪酸的形式进入脂肪细胞内。在脂肪组织中经过脂 肪酸酯化两个过程而生成甘油三酯，作为脂肪贮积下来。 对动物脂肪形成和沉积规律已有普遍的认识，总的趋势是随着生长发育过程的推 移，体脂量呈上升趋势，且体脂的合成与分解经常处于动态平衡状态。脂肪的合成和 分解能力在鸡品种间差异很大。动物脂类代谢的调控是一个极为复杂的系统，现代研 究理论认为，脂肪组织不仅有储存功能，而且具有调节脂类代谢功能。深入认识鸡体 脂肪形成与调控的生理机理是有效控制脂肪沉积的基础，为找到改善鸡肉品质的基因 做好理论研究o 1 1 3 脂肪的代谢 1 1 3 1 脂肪的合成 ( 1 ) 甘油一a 一磷酸的生物合成 合成脂肪所需的甘油一q 一磷酸可由糖酵解产生的二羟丙酮磷酸还原而成，亦可 由脂肪动员产生的甘油经脂肪组织外的甘油激酶催化与a t p 作用而成 1 3 】。 ( 2 ) 脂肪酸的从头合成 动物组织具有从糖类合成脂肪酸的能力。在体内合成脂肪酸的直接碳源是糖酵解 产生的乙酰辅酶a ，直接能源是a t p 和磷酸戊糖途径产生的n a p d h 。脂肪酸的氧化是 在细胞的线粒体中进行的，而脂肪酸的和成主要在胞浆中进行，在线粒体和“微粒体” 中也可以进行。 1 1 3 2 脂肪的运输 由于脂肪酸是疏水性物质，不能直接在血液中被转运，也不能直接进入组织细胞 中被利用。它们必须与血液中或细胞中的特殊蛋白质一起组成一个亲水性的分子基 团，才能在血液中被运输，进入组织细胞并在细胞中运输。 2 血液中游离的脂肪酸和脂类水解后释放到血液中的脂肪酸可以与血液中的白蛋 白结合形成脂肪酸蛋白复合物，从而将脂肪酸转运到组织细胞表面。几种膜相关蛋白 的脂肪运输蛋白，如脂肪酸转运蛋白( f a t t ya c i dt r a n s p o r tp r o t e i n ，f a t p ) 、脂肪酸转 运酶( f a t t ya c i dt r a n s p o r t e r ，f a t ) 、质膜f a b p 、胎球蛋白、脂肪分化相关蛋白( a d i p o s e d i f f e r e n t i a t i o n r e l a t e dp r o t e i n ，a d r p ) 、热激蛋白( h e a ts h o c kp r o t e i n ，h s p ) 、小凹 蛋白1 ( c a v e o l i n l ) 、谷胱甘肽s 一转移酶( g l u t a t h i o n es - t r a n f e r a s e ，g s t ) 和甾醇载 体蛋白2 ( s t e r 0 1 c a r r i e r p r o t e i n 2 ，s c p 2 ) 等对脂肪酸的跨膜运输起到极其重要的作用， 它们可以将脂肪酸从细胞外运输到膜内【1 4 , 1 5 】。 1 1 3 3 脂肪的沉积 鸡体脂主要沉积在腹部、皮下、肌胃、肌肉等组织。其中腹脂( 一般指肌胃周围 脂肪和腹部脂肪垫之和) 是蓄积脂肪的主要部位，约占体脂含量的2 2 t 1 6 1 ，颈部皮 下、嗉囊周围和肠系膜的脂肪含量也较高。 对鸡脂肪沉积的规律已经进行了较为广泛的研究。有研究指出【1 7 1 ，家禽脂肪细胞 增生可持续到1 2 1 4 周龄，但脂肪细胞容积增大随年龄和肥度增加显得更为突出。脂 肪沉积早期表现为细胞增多，后期表现为细胞容积增大，肉鸡生长初期细胞数量增长 较快，细胞容积在4 周龄后才会增加。不同部位脂肪沉积的时间也有所不同，其先后 顺序为：肌间脂肪、颈脂、肌胃脂、板油、肠脂。一般来说初生鸡没有可见的脂肪， 早期母鸡的体脂沉积能力也要比公鸡强【1 引。 1 1 3 4 脂肪的分解 ( 1 ) 外源途径 细胞以单酰甘油、脂肪酸的形式在小肠上皮吸收食物中的甘油三酯【1 9 】 ( t r i g l y c e r i d e ，t g ) ，然后形成乳糜微粒 2 0 】。乳糜微粒转运吸收的t g 到脂蛋白，脂 蛋白将其运送到脂肪组织。在脂肪组织，脂蛋白中的t g 在脂蛋白脂肪酶( 1 i p o p r o t e i n l i p a s e ，l p l ) 催化下酯解成脂肪酸。这些脂肪酸进入血液称为游离脂肪酸( f r e ef a t t y a c i d s ，f f a ) 。f f a 释放到血液中与血清白蛋白结合通过血液携带到身体各组织中去， 在肌肉细胞内被氧化产生能量；或被肝细胞摄取进行氧化、酯化或转变成酮体。 ( 2 ) 内源途径 肝脏中合成的脂肪，由带有载脂蛋1 兰t ( a p o p r o t e i n s ，a p o ) e ，c 1 1 , b l o o f l 勺极低密度脂 蛋白( v e r yl o wd e n s i t yl i p o p r o t e i n ，v l d l ) 携带进入血液，经脂蛋白脂肪酶分解，释放 出游离脂肪酸，然后被脂肪组织和肌肉组织摄取、利用。 3 1 2f a t p s 家族的概述 1 2 1f a t p 的发现与命名 s c h a f f e r 等人于1 9 9 4 通过克隆表达技术从3 t 3 l 1 细胞中筛选了小鼠脂肪组织的 c d n a 文库，得到了一段c d n a 序列。分析表明：该段c d n a 全长19 4 4 b p ，共有编码了 6 4 6 个氨基酸。并在脂肪组织、心脏和骨骼肌中检测到了表达，被命名为“脂肪酸转 运蛋白( f a t t ya c i dt r a n s p o r tp r o t e i n ) 2 0 】。 1 2 2f a t p s 家族成员 迄今为止，研究人员发现人和小鼠的脂肪酸转运蛋白家族基因都编码6 种不同的 转录因子，将最早发现的命名为f a t p l ，其余的分别为f a t p 2 、f a t p 3 、f a t p 4 、 f a t p 5 、f a t p 6 。 小鼠f a t p l 是最先发现的f a t p 家族的蛋白，其分子量为6 3 k d ，有研究显示：胰 岛素可诱导小鼠f a t p l 的染色体发生结构易位，进而促进细胞对长链脂肪酸的吸收 【2 l 】。对人f a t p m r n a 的研究显示其在脂肪组织、大脑、心脏和骨骼肌的表达较为 丰富；在肝脏、肾脏以及生殖器官的表达较少，人f a t p l 蛋白的分子量为7 1 k d a 2 2 1 。 在r o y 等【2 3 】对牛的研究发现：f a t pm r n a 在牛心脏的表达量最高，依次为睾丸、神 经组织和骨骼肌。在脂肪组织、肝脏和肾脏中的几乎没有表达。经过w e s t e r nb l o t 分析： 在心脏、皮下组织和脂肪组织中检测到了该基因蛋白的表达，而在睾丸、神经组织以 及肝脏中却没有检测到。 f a t p 4 是与f a t p l 最相近的蛋白，是该家族中唯一在小肠上皮细胞中表达的蛋白 2 4 1 ，而小肠是专门吸收食物中脂肪的部位。研究表明，f a t p 4 在小肠上皮细胞中的过 度表达，与长链脂肪酸的吸收有密切的联系【2 5 1 。f a t p 4 j 丕被证明在人和小鼠的脂肪组 织、皮肤、心脏以及大脑中均有表达 2 6 - 2 s 。 f a t p 2 、f a t p 3 、f a t p 5 、f a t p 6 与f a t p l 几乎没有功能上的联系。而且这几个蛋 自在脂肪组织和骨骼肌中也几乎检测不到表达。 研究发现御2 在几乎所有哺乳动物的肝脏、肾脏【2 明和细胞内质网中都有【3 0 】表 达。有研究指出：f a t p 2 在大鼠心脏中有较高的表达量，能够帮助其吸收长链脂肪酸。 而且在大鼠心脏的整个发育代谢过程中，该基因表达量的变化与脂肪酸转运酶在心脏 的表达密切相关【3 l 】。 f a t p 3 在人体中肺的表达量较高【3 2 】，由于长链脂肪酸的聚集形成了肺细胞表面的 4 活性剂和磷脂，且磷脂复合蛋白可以阻止因为液体表面张力减少而引起的气泡聚集。 肝硬化后f a t p 5 的表达显著的升高，而同时也会增加对脂肪酸的吸收【3 3 】。 f a t p 6 是该家族在心脏中表达最高的蛋白。对灵长类和鼠科动物的心脏进行了免 疫荧光显微技术，该研究的结果表明：该蛋白结合脂肪酸转运酶在血管的肌纤维膜上 有大量的表达1 3 引。现在除了哺乳动物以外，在无脊椎类动物果蝇和新秀丽线虫等也发 现了脂肪酸转运蛋白的存在【3 5 】。 表1 1 ：f a t p s 家族蛋白在人体中的表达与定位1 3 6 1 t a b l e 1 1m a j o rm e m b e r so f t h em e t a l l o p r o t e i n a s ef a m i l y 1 3f a t p l 基因的研究进展 1 3 1f a t p l 的结构 对于鼠f a t p l 的跨膜螺旋试验分析表明，该蛋白至少有一个跨膜区和多个结构域 3 7 - 3 8 】，但由于这个蛋白是疏水性的，因此其精确的跨膜区域迄今还无法得到。f a t p l 基因分别定位于人，小鼠，大鼠、牛的1 9 、8 、1 6 、7 号染色体上，编码6 4 6 个氨基酸， 人与小鼠、大鼠、牛的氨基酸同源性高达8 5 以上，其中保守序列区编码有3 1 1 个氨 基酸( 图1 1 ) 。其氨基酸的n 末端定位于细胞外，c 末端位于细胞质内。该蛋白第1 1 9 0 位氨基酸片段所产生的信号，具有调控细胞外膜的功能。第1 9 0 2 5 7 位氨基酸残基位 于细胞溶质，该区段能与a m p 结合，并与酰基辅酶a 协同调控。第2 5 8 - 4 7 5 位氨基酸 则具有调控细胞内膜的功能( 图1 2 ) 【3 9 】。 5 n i 一工二 二二二二二二工二二：二：二二一 工二二二二二二二二二二 = = = 二= 二二二二二 圈1 1 l 小皇f a t p i 蛋白的氰基瞳蚺柑 f 证l - it h e 曲啦岫o f f a t p i 1 ， n n c 岫 嘲i - 2 小f a t p l 詹膜的拓扑孕l 瞧蝽相 f i i a - 2 h 巾吐k m 唧h _ 即l a 群o f f a t p 1 3 2f a t p i 的生铂学功能 f a t p i 主要参与长链脂肪酸的踌膜运输研究表明。稳定转染f a t p i 的鼠3 1 3 - l l 脂肪前体细胞对油酸的转运遗廑是对腻蛆的4 _ 5 倍kg c m w 等【柏l 采用p c r - q 虻p 技 术研究了8 名健康的中年瑞：l ：人的f a t p i 基凼的多杏性，研究发现一在谈基因的第0 个内青子中有一个九日突变可分为a a 、a o g ，g 三种基因塑分析显示与普通纯 合体相比。杂音于的血浆甘油= 三确、糍低密度脂虽白- 时油二醣和胰岛蠢帕浓度显著 下降并且对餐后忖油t 醢浓度和撮低密度脂蛋白l 和2 浓度的比阜有显著影响 m 响h 镏 t 等h 1 埘1 1 4 4 名法同人的研，【得到了与前者相同的结论 另外e 皿l 崔腑肪瞳代谢调控过程中具有重墨的作，日囊j 恒等【”1 研究发现胰 岛秉抵抗的大鼠在i i 型糖联躺盼埘已f f i 现骨骼j l 儿f a t e - l 衰达增强，这可能o i 骨骼肌二 酰甘油含量的增加有关周晓荐”】等进一步发现共轭程油瞳可通过蠢话过氯化物酶体 增殖物活性受体y ( p c r o x i s o m ep r o l i f e r a t o r - a c t i v a t e dr e c e p t o r - y ，p p a ry ) 上调f a t p l 基因的表达，改善肥胖大鼠的胰岛素抵抗。 1 3 3f a t p i 的作用机制 f a t p 最重要的个功能就是参与长链脂肪酸的转运。众所周知，脂肪酸的跨膜 转运有被动扩散和蛋白介导两种方式。而在后者，最重要的蛋白包括了脂肪酸转运 蛋白，质膜脂肪酸结合蛋白( p l a s m am e m b r a n ef a t t ya c i db i n d i n gp r o t e i n ，m f a b p ) , 脂肪酸转移酶( f a t t ya c i dt r a n s l o c a s e ，f a t c d 3 6 ) 等。现在有很多证据都充分说明 了，只有在酶底物浓度较低的时候，蛋白介导机制才会启动( 4 5 蛔。 目前对于f a t p 转运长链脂肪酸的详尽机制还不十分明确。现有的研究表明， f a t c d 3 6 可能把长链脂肪酸传递给f a t p ，再由f a t p 转运进入细胞。进入细胞的长链 脂肪酸被f a t p 激活形成乙酰辅酶a ，然后再与细胞质的乙酰辅酶a 的结合蛋白 ( a c y l - c o e n z y m ea - b i n d i n gp r o t e i n ，a c b p ) 结合，参与甘油三酯的合成。其它长链脂 肪酸和质膜脂肪酸结合蛋白结合，转运至细胞内代谢需要的位点【4 刀。 1 3 4 调控f a t p i 的因素 。 营养素、激素以及细胞因子都能够调节f a t p l 的表达。有研究证实：兔在食用了 过量的高脂肪食物之后，f a t p l 在心脏的表达量增加 4 8 】。有很多的研究报告都指出在 小鼠的肝脏、和肿瘤细胞中过氧化物增殖酶体及其受体对f a t p l 起到一个了正调控的 作用4 9 巧1 1 。深入的研究已经发现了小鼠体内过氧化物增殖酶体与f a t p l 蛋白具体的结 合点就是该基因的启动子【5 2 1 。脂肪酸类物质及其衍生物如前列腺素等与过氧化物增殖 酶体相结合，能够加强细胞对脂肪酸的吸收，试验还证实了其对f a t p l 蛋白的表达起 正反馈作用【5 3 1 。有报道说，由于机体脂肪增多而产生的激素能够加强细胞对脂肪酸的 吸收，但是f a t p l 的表达量却下降 5 4 - 5 5 t ，奇怪的是，经过了一晚上胰岛素的刺激后， f a t p l 的表达量并没有显著的变化。肿瘤坏死因子( t u m o rn e c r o s i sf a c t o r - a ，t n f a ) 表达的增加能够降低肝脏和脂肪组织中f a t p lm r n a 的表达。在脂肪组织中，肿瘤 坏死因子和内毒素都对f a t p l 起负反馈的作用【铜。 1 4 荧光定量p o r 技术 实时荧光定量p c r 是近年来逐渐发展起来的一种快速、精确定量核酸的有效方 法，实现了对d n a r n a 模板的定量。目前，已广泛应用于分子生物学和医学研究等 领域【5 7 1 。 7 1 4 1 荧光定量p o r 定量原理 所谓实时荧光定量p c r ( r e a l t i m ef l u o r e s c e n c eq u a n t i t a t i v ep c rf q - p c r ) 技术， 是指在p c r 反应体系中加入荧光结合物质或荧光标记的探针，利用荧光信号积累实时 监测整个p c r 过程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方澍5 羽。在荧光定 量p c r 中，对整个p c r 反应扩增过程进行了实时的监测和连续地分析扩增相关的荧光 信号，随着反应时间的进行，监测到的荧光信号的变化可以绘制成一条曲线。在p c r 反应早期，产生荧光的水平不能与背景明显地区别，而后荧光的产生进入指数期、线 性期和最终的平台期，因此可以在p c r 反应处于指数期的某一点上来检i 9 1 , u p c r 产物的 量，并且由此来推断模板最初的含量【5 9 1 。 为了便于对所检测的样本进行比较，需要首先人为设定一个荧光阈值 ( t h r e s h o l d ) ，可设定在荧光信号指数扩增期的任意位置上。一般将p c r 反应前1 5 个 循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光阈值是p c r 第3 1 5 个循环荧光信号标准差的 1 0 倍【删。如果检测到的荧光信号超过阈值，将被认为是真正的信号，它可用于定义样 本的阈值循环数( c t ) 。c t 值的含义是指每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时 所经历的循环数。所设阈值都很低。c t 值分析实际上就是低浓度的荧光值分析。由于 浓度低，影响因素小，误差未被放大，具有良好的重现性。固定循环数后，荧光信号 与模板数成正比；周定荧光信号值后，模板数与循环数成反比。研究表明：每个模板 的c t 值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系【6 l 】。用已知浓度的标准品进行稀释 后制成标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表c t 值。因此，只要 获得未知样品的c t 值，便可通过标准曲线计算出待测样本的初始拷贝数，在同一台p c r 仪上对相同模板进行9 6 次扩增的扩增曲线得出在c t 值所在处重复性非常好【6 2 】。 1 4 2 荧光定量p c r 的特点 ( 1 ) 特异性好，使用特异性探针对定量分子进行识别，具有很高的准确性，同时， 靶序列由引物和探针双重控制，特异性好、假阳性低。 ( 2 ) 灵敏度高，荧光p c r 检测技术是综合了p c r 技术、荧光标记技术、激光技术、 数码显象技术为一体的技术，因此它的检测灵敏度很高。 ( 3 ) 线性关系好、线性范围宽。由于荧光信号的产生和每次扩增产物成一一对应 的关系，通过荧光信号的检测可以直接对产物进行定量，定量范围可在0 1 0 1 0 拷贝 毫升。 8 ( 4 ) 操作简单、安全、自动化程度高、防污染、扩埔和检测可在同一管内检测， 小需要开盖不易污染。同时扩增和检测一步完成，不需要后期处理，币 舞 要担心放 射性污染。 ( 5 ) 速度快、高墟最，可t t i 2 - 3 , j , 时内对9 6 个或更多样品进行定最检测。 1 4 3s y b rg r e e n i 荧光染料 目前实时荧光p c r 所使h 】的荧光化学方法t 要有五种，分别是：d n a 结合染色、 水解探针、分子信标、荧光标记引物和杂交探针它们又可分为扩增序列非特异性( 嵌 入荧光染料) 和特异性( 荧光探针) 的检澳l 两大类。探针类是利用与靶序列特异杂交 的探针柬指示扩增产物的增加。荧光染料是利用其它的一些理化特征指示扩增产物的 增加。前者困增加了探针的识别步骤嗣此特异性更高，但相应的是步骤复杂，化费 较高。鉴于本实验的实际情况，选择r 一种简单易行，价格相对低廉的方法s y b r g r e e ni 荧光染料法。 s y b rg r e e ni 是一种能够结合干所有双链d n ( d s d n a ) 双螵旋小沟区域的具有绿 色激发波妖的染料旧i 。s y b rg r e o ni 的最大吸收波长约蔓j 4 9 7 n m 发射波长最太约为 5 2 0 n m 在结合双链d n a 分于后荧光增强8 0 0 1 0 0 0 倍删。其t 作原理唧蜘圈卜4 所示， 在f c r 反应体系l i 加入过量s y b r 荧光染料s y b r 荧光染料与p c r 合成的双链d n a 结合 在激光照射下产生荧光。通过荧光强度的检测，可以实时监测p c r 扩增的产物量。 燕j 性 2 引物避虫 3 葺伸匣席 囝蕊 阿l - 4 ：s y b r g r e e n1 的工作坂理 f i g1 _ 4 t k m i r 州e o f s y b r q 1 s y b rg r e e ni 在核酸的实时检测方面有很多的优点。由于它与所有的双链d n a 相结合不必为模板不同而特别进行探针的设计，其通用性非常地好降低了检测的 成本而且检测方法简单易行。但是由于荧光染料能和任何d s d n a 结合。因此它也能与 非特性的d s d n n ( 如引物二：聚体) 结合使宴验容易产生假阳性信号，从而影响定量结果 9 的可靠性和重复性l 训。为了避免这个问题，需要对扩增产物进行融点曲线分析，并优 化p c r 反应条件以消除非特异性产物的影响【6 。 1 4 4 荧光定量p c r 的应用 定量分析包括绝对定量分析和相对定量分析。绝对定量是对未知样品的绝对量 ( 拷贝数) 进行测定的方法，主要应用于病毒病原菌定量检测、转基因拷贝数分析、 g m o 定量分析等领域；而相对定量可以对不同方式处理的两个样本中的基因表达水 平进行比较，主要应用于m r n a 表达量的解析。 实时荧光定量p c r 技术还能够用于检测基因点突变，进行单核苷酸多态性( s n p ) 的分析。基因突变的检测基于两条探针，一条探针横跨突变位点，另一条为锚定探针， 与无突变位点的靶序列杂交。两条探针用两种不同的发光基团标记。如靶序列中无突 变，探针杂交便完全配对，如有突变，则探针与靶序列不完全配对会降低杂交体的稳 定性，从而降低其熔解温度。利用单标记的荧光探针进行基因分型，而利用s y b r g r e e ni , f g 融解曲线，根据t m 值的大小，可分析基因小片断上的碱基突变【6 引。 1 5 生物信息学在新基因研究上的应用 人们获得各种核算和蛋白质序列的目的是了解这个序列在生物体中充当了怎样 的角色。虽然用实验的方法是多年以来解决这类问题的主要途径，但新的思路是利用 已有的对生物大分子结构和功能特性的认识，以计算机为其主要工具，对逐日增长的 d n a 和蛋白质序列和结构进行收集、整理、储存、发布、提取、加工、分析、研究。 我们将这门新兴的学科称之为“生物信息学 。以核酸和蛋白质的序列为基础来预测 其生物学结构是生物信息学的核心研究内容。由于生物信息学的特点，可以用较低的 成本和较快的时间过得具有较高参考价值的结果，近1 0 年来生物学序列信息的爆炸性 增长大大促进了各种预测技术的发展。生物信息学已经成为生物医学、农学、遗传学、 细胞生物学等学科发展的强大推动力1 6 9 。 1 5 1 针对基因序列的预测 所谓核酸序列的预测就是在核酸序列中寻找基因，找出基因的位置和功能为点的 位置，以及标记一致的序列模式等过程【7 0 1 。在此过程中，确认一段d n a 序列是一个 基因需要有多个证据的支持。一般而言，在重复片断频繁出现的区域里，基因编码区 和调控区不太可能出现；如果某段d n a 片断的假象产物与某个已知的蛋白或其他基 因的产物具有