（动物遗传育种与繁殖专业论文）快和慢骨骼肌差异表达基因的研究.pdf

国家自然科学基金 1iilll l liii l ll illi l l li l l t11111 y 17 9 9 4 9 3 n a t i o n a ln a t u r a ls c i e n c ef o u n d a t i o no f p r c h i n a 国家高技术发展项目经费资助 s u p p o r t e db y t h en a t i o n a lh i g ht e c h n o l o g y d e v e l o p m e n tp r o j e c t 湖北省农业科技创新中心创新团队资助 s u p p o r t e db y t h e a g r i c u l t u r a l i n n o v a t i o n t e a mf u n do fh u b e i p r o v i n c e 学位论文 否 如需保密，解密时间年月日 是否保密 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已 经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位 或证书而使用过的材料，指导教师对此进行了审定。与我一同工作的同志对本研究 所做的任何贡献均已在论文中傲了明确的说明，并表示了谢意。 研究生签名= 舞芦而 帆2 。j 。年彳月多日 学位论文使用授权书 本人完全了解华中农业大学关于保存、使用学位论文的规定，即学生必须按照 学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印刷版和电 子版，并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、 汇编学位论文。本人同意华中农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学 位论文的全部或部分内容，同时本人保留在其他媒体发表论文的权力 注；保密学位论文( 即涉及技术秘密、商业秘密或申请专利等潜在需要提交保密的 论文) 在解密后适用于本授权书。 糊一始奄p 日 翮躲方鸭 签名日期：勾l o 年1 5 r 月6 日 签名日期：吣寸年l 口月0 日 快和慢骨骼肌差异表达基因的研究 目录 摘要i a b s t r a c t i i 英文缩略词表( a b b r e v i a t i o n ) i i i 第一章文献综述1 i 骨骼肌的肌纤维类型、结构及特征1 2 肌原纤维蛋白的分类2 2 1 肌球蛋白的分类2 2 2 肌原纤维中其它蛋白的分类4 3 快肌和慢肌的不同分布和相互转化6 4 肌纤维类型与肉质7 第二章本研究的目的和意义1 0 第三章材料和方法l l l 试验材料1 1 1 1 试验样品1 l 1 2 主要仪器和设备1 1 1 3 主要药品和试剂1 1 1 4 缓冲液和常用试剂的配制1 2 1 5 六张a f f y m e t r i xa f f 9 0 0 6 2 3 猪基因组芯片1 2 1 6 主要软件和数据库1 2 2 试验方法13 2 1 比目鱼肌和背最长肌组织的芯片杂交实验与数据分析1 3 2 2 猪肌肉组织总r n a 的提取、检测及c d n a 第一链的合成1 3 2 2 1 猪肌肉组织总r n a 的提取1 3 2 2 2 总r n a 浓度的测定和质量检测1 4 2 2 3c d n a 第一链的合成1 4 2 3 应用qr t - p c r 验证比目鱼肌和背最长肌中m l 玳a 的差异表达1 4 2 3 1qr t - p c r 引物设计1 4 2 3 2qr t - p c r 反应体系和扩增条件1 6 华中农业大学2 0 1 0 届硕士学位论文 2 3 3qr t - p c r 检测和验证和差异表达基因1 7 2 3 4 基因差异表达分析1 7 2 3 5qr t - p c r 结果和基因芯片结果的相关系数和显著性分析1 7 第四章结果与分析1 8 1 差异表达基因结果18 2 背最长肌和比目鱼肌m h c 亚型的表达分析1 8 3 qr t - p c r 和基因芯片两种结果的相关性分析1 9 4 差异表达基因生物信息学分析2 4 4 1 基因通路分析2 4 4 2 部分差异基因的转录因子分析。2 7 4 3 已筛选的基因通路中的基因进行相互关系分析2 9 4 4 差异表达基因g e n eo n t o l o g y ( g o ) 分析2 9 第五章讨论3 3 1 利用基因芯片检测差异表达基因的优势3 3 2 比目鱼肌和背最长肌肌纤维类型的差异3 3 3 不同类型差异基因的生物学功能分析3 4 3 1 代谢酶类基因3 4 3 2 收缩结构蛋白和细胞骨架蛋白基因3 5 3 3 转录因子g a t a 6 基因3 5 3 4 肌细胞增强因子2 c 和l i m 蛋白基因3 7 3 5 热激动蛋白基因3 8 3 6 转化生长因子p 1 和p 3 基因3 9 3 7 同源异型框蛋白a 1 0 基因4 0 4 下一步工作4 l ，j 、结。4 2 参考文献4 3 致 谢5 2 附i 蜀：5 3 快和慢骨骼肌差异表达基因的研究 摘要 骨骼肌分为快肌和慢肌2 种肌纤维类型，这2 种肌纤维类型在结构和功能上有 很大的差异。本试验利用a f f y m e t r i x 公司的编号为a f f 9 0 0 6 2 3 的猪基因组m r n a 表达谱芯片检测快肌( 背最长肌) 和慢肌( 比目鱼肌) 2 种极端类型肌肉中基因的 差异表达，希望以此来更深入的了解导致肌纤维类型差异的分子机制。a f f 9 0 0 6 2 3 芯片：包含2 3 9 3 7 个探针组，可以检测在猪中表达的2 0 2 0 1 个基因。分别取3 头5 月龄梅山母猪的背最长肌和比目鱼肌，即3 个生物学重复共6 个肌肉组织样品。分 别用3 个背最长肌和3 个比目鱼肌的总e d n a 与6 个芯片杂交，然后用g e n e s p r i n g 1 0 0 软件分析芯片杂交数据。结果显示：在背最长肌和比目鱼肌中差异表达倍数( f o l dc h a n g e ) 大于1 5 倍，p 0 0 5 的差异基因共有5 5 0 个。其中，在比目鱼中上调表 达的基因较多，共3 2 3 个，在背最长肌中上调表达的基因较少，共2 2 7 个。在背最 长肌和比目鱼肌中差异表达倍数( f o l dc h a n g e ) 大于2 倍，p 0 0 5 的差异基因共有 1 5 9 个。其中，在比目鱼中上调表达的基因共1 0 7 个，在背最长肌中上调表达的基 因共5 2 个。利用荧光实时定量p c r ( qr t - p c r ) 对其中的1 2 个基因( a - a c t i n 、a r t 3 。 五- ，f h l l c ，g a t a 6 ，h m o x l ，h s p ，m y b p h ，o c a 2 ，s l c l 2 a 4 ，t o f 矽i ，t g f 矽3 和t n x ) 进行了验证，证实1 2 个基因在芯片结果和qr t - p c r 结果中的表达趋势是 完全一致的，2 种结果的相关性是显著的，说明芯片的结果是可信的。利用m a s3 0 ， 对5 5 0 个差异表达基因进行了信号通路、g o 、基因相互关系和转录因子分析，这些 分析结果为以后的差异表达基因功能研究奠定了基础。 关键词：猪；快肌；慢肌；肌纤维类型；m r n a 差异表达；肉质 华中农业大学2 0 1 0 届硕士学位论文 a b s t r a c t s k e l e t a lm u s c l ec a nb ec a t e g o r i z e di n t ot w om u s c l ef i b e rt y p e s ：f a s tm u s c l ea n ds l o w m u s c l e ，w h i c hd i f f e rl a r g e l yi nt h e i rs t r u c t u r ea n df u n c t i o n i nt h i ss t u d y , d i f f e r e n t i a lg e n e e x p r e s s i o nb e t w e e nf a s tm u s c l e ( 1 0 n g i s s i m u sd o r s i ) a n ds l o wm u s c l e ( s o l e u s ) w a s d e t e c t e du s i n gp i gm r n a e x p r e s s i o np r o f i l ec h i po fa f f y 7 m e t r i xa f f 9 0 0 6 2 3 ，i no r d e r t o f u r t h e ru n d e r s t a n dt h em o l e c u l a rm e c h a n i s mu n d e r l y i n gt h ed i f f e r e n c eo ft w om u s c l e f i b e rt y p e s t h ep i gm i c r o a r r a yc o n t a i n s2 3 9 3 7p r o b es e t sr e p r e s e n t i n g2 0 2 0 1g e n e s t h e l o n g i s s i m u sd o r s ia n ds o l e u sw e r es a m p l e df r o mt h r e e5 - m o n t h o l dm e i s h a ng i l t s ， r e s p e c t i v e l y t o t a le d n ao ft h r e el o n g i s s i m u sd o r s ia n dt h r e es o l e u ss a m p l e sw a su s e dt o h y b r i d i z e 晰t hs i xg e n ec h i p s ，a n dt h ed a t aw e r ea n a l y z e du s i n gg e n e s p r i n g10 0 t h e r e s u l t ss h o w e dt h a t5 5 0d i f f e r e n t i a l e x p r e s s e dt r a n s c r i p t sw e r ei d e n t i f i e d b e t w e e n l o n g i s s i m u sd o r s ia n ds o l e u s 、析t hf o l dc h a n g eo fa tl e a s t1 5a n dp v a l u eo f 0 0 5 o f5 5 0 d i f f e r e n t i a l l ye x p r e s s e dt r a n s c r i p t s ，t h e3 2 3t r a n s c r i p t sw e r eu p r e g u l a t e de x p r e s s i o ni n s o l e u sa n d2 2 7u p r e g u l a t e di nl o n g i s s i m u sd o r s i t h ef o l dc h a n g e so f15 9t r a n s c r i p t sa r e g r e a t e rt h a n2 、析t ht h es i g n i f i c a n c e o f p 0 0 5 w i t h 10 7 u p r e g u l a t e d a n d5 2 d o w n - r e g u l a t e di ns o l e u s t w e l v eg e n e s ( a - a c t i n , a r t 3 ，f h l l eg a t a - 反h m o x l ，h s p , m y b p i - i , o c a 2 , s l c l 2 a 4 , t g f f l l ，t g f f l 3a n dt n x ) w e r es e l e c t e da n dv a l i d a t e du s i n g q u a n t i t a t i v er e a lt i m ep o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ( q r t - p c r ) t od e t e c tt h er e l i a b i l i t yo f t h e r e s u l t so fg e n ec h i p s t h em r n a e x p r e s s i o nt e n d e n c yo f12g e n e si nq r t - p c r a n dg e n e c h i p sw a ss a m ea n dt h e i rc o r r e l a t i o n sw e r es i g n i f i c a n t ，i n d i c a t i n gt h a tt h er e s u l t so fg e n e c h i p sa r ec r e d i b l e p a t h w a y , g e n eo n t o l o g y , g e n ec o r r e l a t i o na n dt r a n s c r i p t i o nf a c t o r a n a l y s i so f5 5 0d i f f e r e n t i a le x p r e s s e dg e n e sw e r ec o n d u c t e du s i n gm a s3 0a n dt h e s e r e s u l t sl a i dt h eb a s i sf o rt h es u b s e q u e n tf u n c t i o n a lr e s e a r c h e s k e y w o r d ：p i g ；f a s tm u s c l e ；s l o wm u s c l e ；m u s c l ef i b e rt y p e ；d i f f e r e n t i a lm r n a e x p r e s s i o n ；m e a tq u a l i t y 一一一 快和慢骨骼肌差异表达基l 太1 的研究 m h c p g c 1 a c c r l a a c t i n p f k t n x t n c h m o x l a r t 3 s l c l 2 a 4 t g f p i t g f i b 3 g a t a 6 f h l l c m y b p h o c a 2 h s p e g f v e g f a i t g l 3 3 ( c d 61 ) t n f r s f l a c o l 5 a l p 5 3 p c r qr t - p c r d e p c e b e d t a t r i s m y o s i nh e a v yc h a i n p e r o x i s o m ep r o l i f e r a t o ra c t i v a t e dr e c e p t o r ， g a m m a , c o a c t i v a t o rla c h e m o k i n e ( c cm o t i f ) r e c e p t o r1 a c t i na l p h a p h o s p h o f r u e t o k i n a s e t e n a s c i n x t e n a s c i n c h e m eo x y g e n a s el a d p r i b o s y l t r a n s f e r a s e3 s o l u t ec a r r i e rf a m i l y12 ( p o t a s s i u m c h l o r i d e t r a n s p o r t e r s ) ，m e m b e r4 t r a n s f o r m i n gg r o w t hf a c t o r ，b e t a1 t r a n s f o r m i n gg r o w t hf a c t o r ，b e t a3 t r a n s c r i p t i o nf a c t o rg a t a 一6 f o u ra n dah a l fl i md o m a i n s1p r o t e i n ， i s o f o m c m y o s i nb i n d i n gp r o t e i nh o c u l o c u t a n e o u sa l b i n i s m2 h e a ts h o c kp r o t e i n2 0 k d a e p i d e r m a lg r o w t hf a c t o r v a s c u l a re n d o t h e l i a lg r o w t hf a c t o r i n t e g r i n ，b e t a3 ( p l a t e l e tg l y c o p r o t e i ni l i a , a n t i g e nc d 6 1 ) p 5 5t n fr e c e p t o rs u p e r f a m i l y m e m b e rla c o l l a g e n ，t y p ev ，a l p h al p 5 3p r o t e i n p o l y m e r a s et r a i nr e a c t i o n f l u o r e s c e n c eq u a n t i t a t i v er e a lt i m ep o l y m e r a s e c h a i nr e a c t i o n d i e t h y lp y r o c a r b o n a t e e t h i d i u mb r o m i d e e t h y l e n e d i a m i n et e t r aa c e t i ca c i d t r i h y d r o x y m e t h y l a m i n o m e t h a n e 肌球蛋白重链 过氧化物酶体增生物激活受 体辅激活蛋白l a 趋化因子受体l a 肌动蛋白 果糖磷酸激酶 腱糖蛋白x 腱糖蛋白c 血红素氧化酶 a d p 核糖基转移酶 溶质载体转运蛋白 转化生长因子p l 转化生长因子p 3 转录因子g a t a 6 l i m 蛋白 肌球蛋白结合蛋白h 眼皮肤白化病蛋白 热激动蛋白 表皮生长因子 血管内皮生长因子 整联蛋白 p 5 5 肿瘤坏死因子受体超家族 胶原蛋白5 a l p 5 3 蛋白 聚合酶链式反应 荧光实时定量聚合酶链式反 应 焦碳酸二乙酯 溴化乙锭 乙二胺四乙酸 三羟甲基氨基甲烷 i i i 一一 一 快和慢骨骼肌差异表达基因的研究 第一章文献综述 1 骨骼肌的肌纤维类型、结构及特征 骨骼肌细胞也叫肌纤维，肌细胞膜内平行排列的肌原纤维和管道系统是与收缩 有关的结构。肌细胞先融合成肌管，再由肌管发育成多核细胞组成的肌纤维，它的 直径一般是1 0 1 0 0 9 i n ，长度一般是l m m 3 0 c m ，有的超过3 0 c m ( b e c h t e l ，1 9 8 6 ) 。 肌原纤维中含有若干肌小节，每个肌小节又由粗肌丝、细肌丝以及作为收缩蛋白附 着点，维持粗，细肌丝精确几何位置的细胞骨架构成。骨骼肌肌原纤维横纹的重复 周期大约是2 - 3 9 m ，肌小节至少包含2 8 种不同的蛋白( c r a i g 和p a d r o n ，2 0 0 3 ) 。 在1 6 7 3 年，l o r a n z i n i 就发现动物骨骼肌纤维有红、白两种颜色，且运动能力随 颜色的差异而不同，1 8 7 3 年r a n v i e r 提出将骨骼肌划分为红肌和白肌两种类型( 王 琴和徐胜春，2 0 0 5 ) 。肌纤维又可以根据收缩机能分为慢肌和快肌，分别与红肌和白 肌对应。b r o o k e 等( 1 9 7 0 ) 提出肌球蛋白a t p 酶组化分类法，根据肌球蛋白a t p 酶对酸碱稳定性的不同，分别将肌纤维分为i 、i i a 、i i b 三种类型。p e t e r 等( 1 9 7 2 ) 根据纤维收缩速度和代谢特征的不同，将其分为慢收缩氧化型、快收缩氧化酵解型 和快收缩酵解型，这与上述分型基本对应。近年来用抗肌球蛋白重链( m y o s i nh e a v y c h a i n ，m h c ) 单克隆抗体进行免疫组化实验，聚丙烯酰胺凝胶梯度电泳和基因克隆 等方法，发现了一些新的m h c 纤维类型。a n s v e d 等( 1 9 8 9 ) 发现了i i x 纤维，其 生理特性和肌球蛋白a t p 酶组化染色反应介于i i a 、i i b 之间，有中等收缩速度，是 大鼠快肌的主要纤维类型。 快肌和慢肌在功能、形态及神经支配上都有自己的特点。快肌又叫相位性纤维， 它们相对粗短，肌原纤维排列整齐，明暗带清晰可见，z 线是直线，微管系统广泛 存在，肌纤维中肌红蛋白含量少，颜色浅，因此又被称为白肌，快肌中的肌糖元和 乳酸脱氢酶含量高，适于糖酵解代谢，所以快肌适于快速收缩，但易疲劳。慢肌又 称为紧张性纤维，它们的肌原纤维束大小不一致，z 线呈锯齿状，微管系统不发达， 由于它们中肌红蛋白含量高，肌红蛋白能结合氧，颜色鲜红，因此又被称为红肌， 慢肌内磷酸化酶、细胞色素氧化酶、琥珀酸脱氢酶含量高，能够进行糖原有氧代谢， 因而慢肌适于缓慢的运动，不易疲劳。慢肌的作用在于维持姿势，即在动物的该部 分没有运动时，它们能够产生足够的张力以维持身体的姿势。机体的肌肉的绝大多 l 华中农业大学2 0 1 0 届硕士学位论文 数都是由快肌和慢肌混合组成，只有少数完全或主要由快肌或慢肌组成( 杨秀平， 2 0 0 2 ) 。 总的来说，慢肌和快肌主要在以下几个方面有所不同：糖原含量，肌间脂肪含 量，肉质和口感，肌纤维的大小，p s e 肉的发生率，抗疲劳能力，收缩强度，收缩 速度，对有氧或无氧运动的适合性，肌红蛋白含量，糖酵解酶的含量，氧化还原酶 含量，氧化能力，酵解能力，线粒体密度，毛细血管密度，神经元形状，主要储备 燃料。其中，慢肌具有高的肌间脂肪含量，毛细血管密度，氧化能力，氧化还原酶 含量，线粒体密度，肌红蛋白含量，抗疲劳能力，慢肌适应有氧运动，神经元小， 肉质和口感较好，主要储备燃料为甘油三酸脂。快肌具有高的糖原含量，糖酵解酶 的储量，酵解能力，收缩强度，收缩速度，p s e 肉的发生率，快肌适合无氧运动， 易疲劳，神经元较大，肉质和口感较差，主要燃料储备为肌酸和糖原。 2 肌原纤维蛋白的分类 2 1 肌球蛋白的分类 肌球蛋白的分子量约5 2 0 k d a ，是了解的最清楚的分子马达蛋白。它能通过自身 结构改变将化学能转化为机械能。肌球蛋白超家族被分成1 5 类，常规的肌球蛋白， 例如横纹肌肌球蛋白，被归为第二类( b o t t i n e l l i 和r e g g i a n i ，2 0 0 0 ：c l a r k z 等，2 0 0 2 ) 。 第二类肌球蛋白分子具有两个功能域：2 个球形的头部( 亚片段s 1 ) 和1 个a 螺旋 盘绕的杆状尾部( 图1 1 ) 。球状头部有大约9 0 0 个氨基酸组成，包含a t p 水解的催 化位点和肌动蛋白结合位点( r a y m e n t 等，1 9 9 3 ) 。杆状尾部大约1 5 0 n m 长，直径 2 n m ，大约由1 0 0 0 个氨基酸组成，是粗肌丝的骨干( l e v i t s k y ，2 0 0 4 ) 。骨骼肌的肌 球蛋白是由2 条肌球蛋白重链和4 条肌球蛋白轻链( m y o s i nl i # tc h a i n ) 组成的6 聚 物。每1 条肌球蛋白重链结合2 条不同的肌球蛋白轻链亚型，1 条叫碱性轻链也叫 基本轻链e l c ，另1 条叫调节轻链r l c ，它们能精细的调节肌球蛋白分子马达的活 性，也能增加它的动力学的多样性( r e g g i a n i 等，2 0 0 0 ) 。 在哺乳动物中，第二类肌球蛋白的m h c 至少存在八种不同的亚型，其中包括： 1 型或慢型，2 a ，2 b ，2 x ，胚胎，新生，a 和眼外型( e x t r a o c u l a ri s o f o r m ) ，它们分 别被8 种不同的基因编码，都在骨骼肌中表达( s c h i a f f i n o 和r e g g i a n i ，1 9 9 6 ：w e i s s 和l e i n w a n d ，1 9 9 6 ) 。在成年骨骼肌中，前4 种亚型( 1 ，2 a ，2 x 和2 b ) 是主要的 2 一一一 快和慢骨骼肌差异表达基因的研究 m h c 亚型( t a l m a d g e ，2 0 0 0 ) ，肌纤维的分类即是对照m h c 的分类得来的，分别 为i ，i i a ，i i x ，i i b 型。m h cl 在慢收缩骨骼肌纤维和心室肌中表达，3 种快收缩 亚型( 2 a ，2 x ，2 b ) 在快收缩骨骼肌纤维中表达。其它的m h c 亚型以种的特异性 或时间特异性表达。在骨骼肌中，新生型和胚胎型m h c 分别在新生期和胚胎期表 达。m h c0 【在心肌，咬肌和一些红肌中表达。眼外型m h c 是一种快型m h c ，仅仅 在眼外肌中表达( b o t f i n e l l i 和r e g g i a n i ，2 0 0 0 ；p e t t e 和s t a r o n ，2 0 0 0 ) 。 “h i n g e r e g i o n s l c 图1 - 1 ：骨骼肌的肌球蛋白分子。每个肌球蛋白分子由两个球状头部和一个杆状尾 部组成。用胰蛋白酶消化肌球蛋白，分解成两个片段：大片段为重型酶解肌球蛋白 ( h e a v ym e r o m y o s i n ，h m m ) ，小片段为轻型酶解肌球蛋白( 1 i g h tm e r o m y o s i n ， l m m ) 。h m m 能被进一步消化为亚片段s 1 和亚片段s 2 。引用自：l e v i t s k y ( 2 0 0 4 ) 。 f i g u r e1 1 ：t h em y o s i nm o l e c u l ei ns k e l e t a lm u s c l e e a c hm y o s i ni sf o r m e db yt w o g l o b u l a rh e a d s a n dar o d m y o s i ni sd i g e s t e dw i t ht r y p s i n , a n dt w om a j o rf r a g m e n t s a r ef o r m e d t h el a r g e s tf r a g m e n ti sh e a v ym e r o m y o s i n ( h m m ) a n dt h eo t h e r f r a g m e n ti sl i g h tm e r o m y o s i n ( l m m ) h m m c a nb ef u r t h e rd i g e s t e dt of o r mt h e s u b f r a g m e n t1 ( s 1 ) a n ds u b f r a g m e n t2 ( s 2 ) ，a sc i t e df r o ml e v i t s k y ( 2 0 0 4 ) 。 在成年哺乳动物中，骨骼肌包含三种基本轻链( e s s e n t i a ll i g h tc h a i n ，e l c ) 亚型， 包括一种慢基本轻链e l c ( i s ) 和两种快基本轻链e l c ( i f , 3 f ) 亚型，两种调节 轻链( r e g u l a t o r yl i g h tc h a i n ，r l c ) 亚型包括一种慢r l c ( 2 s ) 和一种快r l c ( 2 f ) 亚型( b o t t i n e l l i ，2 0 0 1 ) 。e l ci f 主要在发育中的胎儿的快肌中发达。而e l cl s 首 先在胎儿期的晚期被检测到，在慢肌中表达( b o t t i n e l l i 和r e g g i a n i ，2 0 0 0 ) 。 当前，鉴定某种单个肌纤维类型或判定某种肌肉的组分的最直接的方法就是电 华中农业大学2 0 1 0 届硕士学位论文 泳分离。一般而言，m h c 的亚型能根据它们的迁移速率来分离，快肌的m h c 有最 慢的迁移速率，慢肌的m h c 有最快的迁移速率。分离4 种m h c 亚型( 1 ，2 a ，2 x 和2 b ) 是比较困难的，但是在大鼠( b a r 和p e a e ，1 9 8 8 ) 和兔子( r e i s e r 和k l i n e ， 1 9 9 8 ) 中，它们能通过梯度凝胶电泳分离获得。在猪中，通过凝胶电泳，仅仅3 种 蛋白条带：l ，2 a ，2 x + 2 b 能被检测到( b e e 等，1 9 9 9 ) ，尽管猪肌肉中存在4 种成 年m h c 的m r n a ( 1 ，2 a ，2 x 和2 b ) ( k i m 等，2 0 0 8 ) 。然而，通过判定m h c 亚 型的核苷酸序列能够准确鉴定m h c 的亚型。 肌球蛋白亚型的不同能造成收缩速度，最大暴发力，最适收缩效率，相同条件 下的a t p 水解比率的很大不同( b o t t i n e l l i ，2 0 0 1 ) 。研究发现，肌肉的收缩速度不仅 在快肌和慢肌之间不同，而且在快肌之间也不相同( 2 a ，2 x 和2 b ) ，其中2 b 型收 缩最快( s c h i a f f i n o 和r e g g i a n i ，1 9 9 6 ) 。然而，不仅m h c 的亚型能影响分子马达的 性质，e l c 亚型也能影响分子马达的性质。特别地，肌动蛋白运动速度的增加与e l c 3 f 的数量有关( w a r s h a w ，1 9 9 6 ；r e g g i a n i 等，2 0 0 0 ) 。 在动物的发育期和成年期，m h c 和m l c 基因的表达受到若干因素的调控，包 括运动神经释放模式，负荷条件和激素( h a m a l a i n e n 和p e t t e ，1 9 9 7 ；r e g g i a n i 等， 2 0 0 0 ) 。一般而言，每个单肌纤维只表达一种m h c 与两种m l c ( t a l m a d g e ，2 0 0 0 ； s t e p h e n s o n ，2 0 0 1 ) 。例如：快m h c ( 2 a ，2 x 和2 b ) 与快m l c ( i f ，2 f 和3 f ) 一 起表达，慢m h c ( 1 ) 与慢m l c ( 1 s 和2 s ) 一起表达( b o r t o l o a o 等，2 0 0 0 ) 。 2 2 肌原纤维中其它蛋白的分类 肌钙蛋白的分子量大约8 0 k d a ，是由3 个亚基组成的协同复合体，包括：钙结 合亚基t n c ，抑制亚基t n i ，原肌球蛋白结合亚基t n t ，它的功能是在骨骼肌产生 力的时候调节肌球蛋白和肌动蛋白的互作( c l a r k 等，2 0 0 2 ) 。在不同的肌纤维类型 中，肌钙蛋白亚型的表达模式不同，因此它们促成骨骼肌的不同的收缩特性( w e s t f a l l 和m e t z g e r ，2 0 0 1 ) 。有两种t n c 亚型在骨骼肌中表达：快型t n c 和慢型 心脏型t n c ( b o t t i n e l l i 和r e g g i a n i ，2 0 0 0 ) 。快型t n c 具有两个高亲和性和两个低亲和性的钙 结合位点，而慢型t n c 具有两个高亲和性和一个低亲和性钙结合位点。因此，t n c 的调节功能来自于它的低亲和性钙结合位点( c o l l i n s ，1 9 9 1 ) 。 砌能结合肌动蛋白并且能抑制肌动球蛋白( a c t o m y o s i n ) a t p 酶的活性。在原 4 快和慢骨骼肌差异表达基因的研究 肌球蛋白存在时，这种抑制能被增强，并且在完整的肌钙蛋白复合体存在时，这种 抑制变成可逆的和钙敏感的。骨骼肌包含2 种t m 亚型：快型t n i 和慢型t n i ( s c h i a f f i n o 和r e g g i a n i ，1 9 9 6 ) 。t n t 与t n c 和t n i 结合，也与原肌球蛋白结合， 分别在两个不同的位点，两位点相距很近，与原肌球蛋白结合的位点是钙敏感的， 而与t n c 和t n i 结合的位点是钙不敏感的( b o t t i n e l l i 和r e g g i a n i ，2 0 0 0 ) 。 t i l t 的亚型种类是非常复杂的，在成年骨骼肌中，至少有6 种亚型，包含4 种 快型( i f , 2 f , 3 f 和4 f ) 和2 种慢型( 1 s ，2 s ) ( s c h i a f f i n o 和r e g g i a n i ，1 9 9 6 ) 。一 般来说，快型和慢型的亚型是与肌纤维的快收缩型和慢收缩型相匹配的，但是t n t 的各个亚型与m h c 的各个亚型却不是一一对应的，并且t n t 各个亚型的分布很少 呈现出离散性。然而在大鼠的单个肌纤维中，t n t 的各个亚型与m h c 的各个亚型 的分布却有一定的相关性，这些亚型共表达：慢型t n t ( 1 s 和2 s ) 和m h c1 ，t n t 2 f 和m h c2 b ，t n t3 f 和m h c2 a ，t n t 4 f 和m h c2 x ( g a l l e r 等，1 9 9 7 ) 。 原肌球蛋白( 6 5 k d a ) 是一种细长的蛋白多聚体，为两条a 螺旋链构成的双螺事“ 旋结构，缠绕着肌动蛋白丝并且部分的掩盖了肌动蛋白上肌球蛋白的结合位点。在 这种空间位置下，肌球蛋白头部只能与肌动蛋白微弱结合，不能产生一次有力的收淞 缩( p o w e rs t r o k e ) 。从原肌球蛋白丝的头部到它的尾部大约有3 5 个原肌球蛋白分子 二聚体组成，增加了细肌丝的刚性( k o j i m a 等，1 9 9 4 ) ，而且能调节肌球蛋白和肌 动蛋白的相互作用( g e e v e s 和l e h r e r ，1 9 9 4 ) 。在骨骼肌中，有3 种原肌球蛋白分子 坤 亚型被表达：a 慢型，伐快型和b 型，它们能组合成a a 和p p 同型二聚体或0 【p 异型 二聚体。一般而言，在快收缩型肌纤维中，原肌球蛋白a 亚型占有较高的比率 ( c u m m i n s 和p e r r y ，1 9 7 4 ) ，而在大多数骨骼肌中，原肌球蛋白p 亚型不是一种主 要被表达的类型( o e 等，2 0 0 7 ) 。 a 肌动蛋白包括4 种亚型，分别存在于骨骼肌、心肌、平滑肌和非肌肉组织中， 其中q a c t i n1 属于骨骼肌亚型。a 辅肌动蛋白( 0 【a c t i n i n ) 是细胞骨架中一种重要的 肌动蛋白交联蛋白，它通过与其相关蛋白包括整联蛋白( i n t e g r i n ) 、钙粘蛋白 ( c a d h e n n ) 以及细胞信号传导通路中的信号分子协同作用，也可以与粘附分子、细 胞骨架蛋白、磷酸肌醇、蛋白激酶等分子形成复杂的相互作用网络，在维持细胞形 态、稳定细胞粘附、调节细胞骨架和细胞形状及细胞运动中发挥着重要作用( 胡华 军等，2 0 0 5 ) 。 华中农业大学2 0 1 0 届硕士学位论文 慢和快收缩纤维显著的不同是在于它们的收缩特性，但是它们的收缩特性又是 依靠肌纤维装置对钙的敏感性( b o t t i n e l l i 和r e g g i a n i ，2 0 0 0 ) 。钙的敏感性主要被肌 钙蛋白和肌球蛋白这两种调节蛋白所决定( d a n i e l i 等，1 9 9 0 ) 。虽然钙的结合位点 仅在t n c 亚型上，但是原肌球蛋白亚型和t n t 亚型在钙的敏感性中起主要作用 ( s c h i a f f i n o 和r e g g i a n i ，1 9 9 6 ) 。例如，在快收缩肌纤维中，较高比率的t n t 2 f 和 原肌球蛋白a 快型与较高的钙敏感性值密切相关，且快收缩肌纤维中的钙敏感性值 高于慢收缩肌纤维中的钙敏感性值( 钙的敏感性值越高则对钙的敏感性越强) ( s c h a c h a t 等，1 9 8 7 ) 。 3 快肌和慢肌的不同分布和相互转化 肌肉的组织化学特征主要是遗传和环境作用的结果。许多研究发现性别的不同 与肌纤维的特征相关。肌纤维的数目和尺寸的不同主要受性激素的控制，并且激素 的作用能导致雄性和雌性的肌纤维数目不同。在肌纤维横切面的面积方面，未去势 的雄性比雌性和去势的雄性大。在猪中，也有部分报道：雌性的纤维面积和雄性的 类似，或者大于雄性。根据s t a r o n 等( 2 0 0 0 ) ，年轻男性的股外侧肌的所有肌纤维类 型都比年轻女性的要大。根据c h o i 等( 2 0 0 6 ) ，猪的背最长肌大约含8 0 - 9 0 的i i b 型纤维和大约5 1 5 的i 型纤维，在猪中，许多肌纤维有一种独特的分布：i 型纤维 聚集成束，i i a 型纤维紧紧的挨着它，而它们外面被l i b 型纤维包围。 快肌和慢肌的形成与其神经支配有关，而且可以相互转化。支配快肌的神经纤 维粗、传导速度快，每个肌纤维上只有一个运动终板，而且神经末梢含突触小泡多。 支配慢肌的神经纤维较细、传导速度慢，每个肌纤维上可能有多个运动终板，神经 末梢含突触小泡少。在成年动物中进行交叉神经移植，可以使快肌转化为慢肌，慢 肌转化为快肌。目前认为，神经冲动发放的形式可影响到肌纤维的性质，运动神经 元持续不断的发放冲动，促使肌纤维长时间处于紧张性收缩状态，因而形成了慢肌 的特点，运动神经元快速发放脉冲式冲动引起肌纤维快速收缩，就有可能形成了快 肌的结构和功能，神经元可能释放某些营养物质参与