（动物遗传育种与繁殖专业论文）鹅微粒体甘油三酯转运蛋白（MTP）的表达研究.pdf

摘要 本研究利用四川自鹅和朗德鹅作为实验对象，分析填饲对鹅体组成和j i n 浆参数的 影响和两品种鹅填饲效应的遗传差异；使用r t p c r 方法研究鹅微粒体甘油三酯转 运蛋白( m t p ) 基因的表达特性、不同生长期肝脏和小肠中m t p 基因的表达规律， 以及在肝脏与小肠中填饲对m t p 基因表达的影响。研究结果表明： 根据体重填饲相应的饲料量，填饲引起两晶种鹅的体重、肝重与肝脂率明显升高， 肝脏中水分含量大幅度下降；朗德鹅在体熏、肝重、肝重率、皮脂重、肝脂率显著或 极显著高于四川白鹅，肝脏中水分含量却极显著低于四川自鹅。填笛d 引起血浆中t g 、 v l d l 和i n s u l i n 浓度升高，且朗德鹅i n s u l i n 水平极显著低于四i i 白鹅，其值分别为： l o 2 8 0 3 1 m m o l l ，1 1 5 3 0 2 8 m m o l 1 ，t g 和v l d l 在两品种鹅间的差异显著。 填饲后，肝重与t g 和v l d l 问以及皮脂重、腹脂重与体重问的相关性，在朗德 鹅和四川i 白鹅间表现出一定差异：四川白鹅的肝重与t g 和v l d l 呈较强的j e 相关， 其相关系数分别为：r = 0 6 8 ，p 0 0 5 和r = 0 5 5 ，p 0 0 5 。而朗德鹅则表现出弱的正相 关和负相关，其相关系数分别为：r = 0 2 6 和r 一0 1 4 ；四川白鹅的皮脂重、腹脂重与 体重问中等强度的正相关，而在朗德鹅中皮脂重、腹脂重与体重间却不存在这种正相 关，说明与朗德鹅相比，四川白鹅腹脂和皮脂中脂肪的沉积能力较强。 鹅m t p 基因在肝脏和小肠中表达，在l o 周龄时检测到脑中有表达。鹅m t p 基 凶在不同生长期的表达规律：在7f = = 1 龄时，m t p 在肝脏巾不表达，而在小肠r | l 却有 一定程度的表达。m t p 在朗德鹅和四川白鹅小肠中的表达丰度分别为：0 7 2 和o 6 5 ； 从1 0 周龄到1 6 周龄，m t p 基因在肝脏与小肠中的表达量呈现出逐步卜- 升的趋势；1 周龄一1 3 周龄阶段，小肠中m t p 表达丰度高于肝脏，而1 4 周龄一1 6 周龄，m t p 在 小肠中的表达却低于肝脏。 鹅肝脏与小肠中，与对照组相比，填饲效应对m t p 基因表达的影响不同：填饲 引起肝组织m t p 基因表达水平降低，小肠组织m t p 基因表达水平升高。 关键词：鹅填饲微粒体甘油三酯转运蛋白( m t p )表达 t h e e x p r e s s i o n r e s e a r c ho fm i c r o s o m a l t r i g l y c e r i d et r a n s f e rp r o t e i no ng o o s e ( a n i m a lg e n e t i c sb r e e d i n ga n dr e p r o d u c t i o n ) y ej i a n q i a n g d i r e c t e db yp r o f w a n gj i - w e n a b s t r a c t s i c h u a n - w h i t eg e e s ea n dl a n d e sg e e s ew e r es t u d i e di nt h i se x p e r i m e n t ，t h ei n f l u e n c e o nt h ec o m p o s i t i o no fb o d ya n dp l a s m ap a r a m e t e r sb yf o r c e f e e d i n gw e r ea n a l i z e d ，a n d g e n e t i cd i f f e r e n c eb e t w e e nt h et w ob r e e dg e e s ew e r ea n a l y z e da sw e l l w i t hr t p c r m e t h o d t h ee x p r e s s i o nc h a r a c t e r i s t i co fm i c r o s o m a lt r i g l y c e r i d et r a n s f e rp r o t e i n ( m t p ) g e n ei ng e e s ew e r es t u d i e d t h ee x p r e s s i o np a t t e r no fm t pg e n ei ng e e s el i v e ra n ds m a l l i n t e s t i n ed u r i n gt h ed i f f e r e n tg r o w t hs t a g e sw e r ea n a l i z e d t h ei n f l u e n c eo ff o r c e f e e d i n g o nt h ee x p r e s s i o no fm t pg e n ei ng e e s el i v e ra n ds m a l li n t e s t i n ew e r es h o w e d t h e s e r e s u l t ss h o w e d ： t h er m o t u l to f f e e dw a sf e da c c o r d i n gt ot h eb o d yw e i g h t t h eb o d yw e i g h t ，t h el i v e r w e i g h ta n dt h ep e r c e n t a g eo fl i p i di nl i v e ro ft h eb r e e dg e e s es i g n i f i c a n t l yr a i s e du pa f t e r t h ef o r c e f e e d i n g b u tt h ep e r c e n t a g eo fw a t e ri nt h el i v e ro ft h eb r e e dg e e s es i g n i f i c a n t l y w e n td o w na f t e rt h ef o r c e f e e d i n g t h eb o d yw e i 曲t ，t h el i v e rw e i g h t ，t h ep e r c e n t a g eo ft h el i v e r w e i g h t ，t h e s u b c u t a n e o u sa d i p o s et i s s u ew e i g h ta n dt h ep e r c e n t a g eo fl i v e rl i p i do fl a n d e sg e e s ew e r e s i g n i f i c a n t l yo rv e r ys i g n i f i c a n t l yh i g h e rt h a nt h o s eo ft h es i c h u a n w h i t e sg e e s e ，w h i l et h e p e r c e n t a g e o fw a t e ri n l i v e rw a sl o w e rt h a nt h a to fs i c h u a n w h i t e sg e e s e t h e c o n c e n t r a t i o no ft g ，v l d la n di n s u l i nr a i s e da f t e rf o r c e - f e e d i n ga n dt h e c o n c e n t r a t i o no f i n s u l i no fl a n d e sg e e s ew a sv e r ys i g n i f i c a n t l yl o w e rt h a nt h a to fs i c h u a n w h i t eg e e s e t h e c o n c e n t r a t i o no fi n s u l i ni nl a n d e sg e e s ea n ds i c h u a n - w h i t e sg e e s ew e r e10 2 8 0 3 1 m m o l la n d l l 5 3 o 2 8 m m o l lr e s p e c t i v e l y 、a n dt h ed i f f e r e n c eb e t w e e nt h e s et w o b r e e dg e e s ew a ss i g n i f i c a n t ；i a f t e rt h ef o r c e f e e d i n g ，t h ec o r r e l a t i o nb e t w e e nt h el i v e rw e i g h ta n dt ga n d v l d l ， a n db e t w e e nt h es u b c u t a n e o u sa d i p o s et i s s u ew e i g h t ，t h ea b d o m i n a la d i p o s et i s s u ew e i g h t a n dt h eb o d yw e i g h ts h o w e dt h a tt h e r ew a st h ed i f f e r e n c eb e t w e e nl a n d e sg e e s ea n d s i c h u a n w h i t e sg e e s ea n dt h a tt h el i v e rw e i g h ta n dt h ec o n c e n l r a t i o no ft ga n dv l d lo f s i c h u a n w h i t e sg e e s ew e r eh i g h l yc o r r e l a t e da n dt h ec o e f f i c i e n tw a sr = 0 6 8 ，p 甘油= 酯( d g ) 磷脂酰胆碱( p c ) 。 同时他还发现当在t g 、c e 、d g 、p c 中减少一个酰基链时，m t p 介导的转运速率 降低了9 0 ，表明脂质分子的疏水性基团，在m t p 对脂质分子转运时起着重要的调 节作用1 4 6 1 。 研究还发现m t p 含有至少两种功能特异的与脂质分子结合的位点，即一个能快 速转运中性脂质及磷脂有关的快速位点，这个位点主要是转运中性脂质和磷脂；另外 。一个可能是与膜关联有关的慢速位点，它对磷脂具有选择性的特点1 4 7 】。m t p 脂质结 合位点的独特性在于它的疏水性上，但这些结合位点对于所结合和转移的脂质分子 没有严格的结构要求，快速结合位点是脂质转移所必需的。除了单酸甘油酯( m g ) 以外，m t p 能催化任何类型的脂质转移，但对非极性脂质有明显的优先选择性。 脂质分子的疏水核心在催化其与m t p 转运的相互作用中起关键作用口”。 m i 、p 的脂质转运活性在脂蛋白的组装和分泌中是必需的【4 2 l 这个观点已经在三个 研究中得以证实。n a r c i s i 【4 8 垮，s h o u d e r s 4 9 1 等和b o r e n 5 伽等通过研究发现在常染色体 隐性遗传病无b 脂蛋白血症( a b e t a l i p o p r o t e i n e m i a ，a b l ) 的息者中血浆里含a p o b 的 脂蛋白v l d l 和c m 缺失，t g 转移活性很低而且m t p 大亚基缺失，因此说明m t p 大亚基的缺陷是导致a b l 的主要原因，从而反映出m t p 基因的突变可以导致脂质 转运活性的缺乏。当a p o b 和m t p 在不能组装脂蛋白的非肝细胞和非肠细胞中协嗣 表达时，可以导致v l d l 分泌【5 l 】d 2 i 5 3 1 。m t p 的抑制因子可以减少体外脂转运活性， 从而降低v l d l 的分泌【5 4 1 s s l 5 6 1 。 1 3 2 2 m t p 与a p o b 结合和与a p o b 结合的功能区域 a p o b 和m t p 之间的相互作用已经被三个不同的实验得以证实州。首先w u 等、 p a t e l i s 9 1 等和m a n n t 6 0 l 等使用了协同免疫沉淀技术证明了a p o b 和m t p 之问互作。 h u s s a i n 等1 6 1 1 发展了一种固态液态相间结合实验研究这些蛋白质之间的蛋白质一蛋 白质的相互作用。实验中用不断提高浓度的低密度脂蛋白( 1 0 wd e n s i t yl i p o p r o t e i n l d i 。) 来温浴固定的m t p ，然后用酶联免疫技术量化与a p o b 结合的i 。d l 。这些研究 表明人的l d i 能够高亲和力地与固定的m t p 结合。b a k i l l a h 等6 2 1 为确定在这些反应 中参与蛋白质一蛋白质互作的关键性氨基残基，对l d l 进行了一些化学修饰，结果 发现用氨基己酸甲基脂来修饰的氨基酸残基，对a p o b 和m t p 结合没有影响；而用 乙酰乙酰辅酶a 修饰的a r g 残婆可彻底消除与m t p 的结合：更重要的是；若是使修 饰过的l y s 和a r g 残基恢复则可以全部恢复与m t p 的结合，这些研究表明a p o b 中 l y s 和a r g 残基对与m t p 中的酸性残基的互作是十分重要的。另外，m a n n 等f 6 ( | 1 在 a p o b 与m t p 结合位点的研究中发现在a p o b 的b ：l 1 5 2 ，b ：3 4 9 5 8 3 和b ：5 1 2 - 7 2 l 三三个位罱都可以与m t p 结合，这说明n 端b ：1 - 7 7 1 ( b 1 7 ) 中包含有高亲和力的结 合伉点。 m t p 与e r 内腔一侧的a p o b 的n 一末端结合，这就是m t p 与a p o b 的结合或者 叫做分子伴侣，这种结合可以通过二：个方面来促进脂蛋白的组装。首先，它可能使 e rl ：l 】膜上新生的a p o b 释放， 当新生的a p o b 从e r 内膜中释放后，新生的a p o b 中 的疏水性脂质结合区域将变得更易脂化；第二，m t p 与a p o b 结合可以使脂质分子特 异的转运到新生的a p o b 上，而不是在膜之间的无效转运。当a p o b 大量脂化时，可 能会导致一个中问状态的脂蛋白颗粒的形成，而这种中问状态的脂蛋白颗粒仍然与 m t p 缔合在一起。当中间状态的脂蛋白颗粒发展到一定程度时，m t p 将会与其分离， 从而引起原始的脂蛋白颗粒形成。所以当a p o b 与m t p 结合受到抑制时，将会导致 a p o b 分泌减少i 3 饥。 1 3 2 3 m t p 的膜缔合功能区域和膜缔合作用 m t p 的膜缔合功能区域可能参与脂滴的形成和稳定，对脂质的运送方式可能涉 及到脂蛋白组装的成熟。另外，与脂滴缔合的m t p 可能对原始脂蛋白颗粒的生物合 成是重要的。研究发现与脂质缔合的m t p 对a p o b 具有较高的亲和力【6 3 1 。当脂质缔 合的m t p 和新生a p o b 结合时，可能使那些对新生a p o b 的来说可利用的脂质分子包 裹在新生a p o b 外，从而使脂质原始颗粒仅一步就能形成，而避免了脂质分子在新生 a p o b 上连续地添加，这种方式在提高脂质的可利用率上被认为占主导地位。m ，i 、p 膜 缔合功能区域的抑制将降低内质网内膜中脂漓的形成和减少脂质原始颗粒的扩m j 。 1 3 3m t p 的表达与调控 6 出于m t p 的脂质转运功能是在膜之间发生，因此m t p 转运活性的调节与它接触 膜的组成有直接的关系。当受体和供体的含量一定时，如果受体膜的构成上有一定的 改变，这种改变可以提高与m t p 的亲和力，然而这种亲和力的提高对受体膜来说却 成了种抑$ , j l 蛋t - 它的结果是降低了脂质的转运能力。其原因足：当m t p 的亲和 力提高以后，m t p 在受体与受体之间的转运就更加容易，因此如果这种亲和力很高 的话，那么m t p 将不能和受体分离，其转运能力受到抑制。相反，如果膜与m t p 的亲和力降低了，那么从供体到受体膜之间的脂质的转运反应也将被抑制，因为脂质 的转运将主要集中在供体与供体之间。由此可见，m t p 、供体、受体三者间的平衡反 应决定了m t p 最佳的脂质转运活性f 4 2 1 。研究表明，如果在供体膜上提高带有负电荷 的磷脂的浓度( 如双磷脂酰甘油) 则可以降低脂质从供体膜向受体膜的转运速率，而 带负电荷的磷脂增加则导致了m t p 与膜之间的亲和力降低1 。因此体内的膜组成发 生变化时，将直接影响m t p 介导的脂质转运能力以及m t p 在脂蛋白组装过程中的作 用。w e t t e r a u 等 4 2 1 认为m t p 对e r 内膜亲和力的调节是由于e r 内膜中游离脂肪酸 的浓度发生了变化，肝细胞中游离脂肪酸的流入可以促进脂蛋白生成，其原因在于游 离脂肪酸可以调节m t p 与供体或受体问的亲和力，从而达至口提高脂蛋白的的分泌。 除此以外，m t p 的表达在体内还受到其它因素的控制。l i n 等【6 5 1 第一次在体内对 m i p 的调控进行研究。他们克隆了颊鼠的m t p 的大亚基，并分析了在不同的饲喂条 件下，大颊鼠m 1 1 p 火亚基的表达情况，结果发现：在高脂肪食物和高蔗糖食物组巾， 肝细胞内的m t p 的大亚基的m r n a 水平比控制组高5 5 ，而高脂组内小肠m t p 人 亚基的m r n a 水平比控制组高1 2 6 ，其中通过w e s t e r nb l o t 分析发现小肠中m t p 大亚基的蛋白质水平比对照组高4 0 。高脂组内在饲喂后的2 4 小时内观察到小肠中 m 1 1 p m r n a 的显著上调，相反，肝脏中的反应就相对慢些。当葡萄糖浓度大于3 0 m m 时，m t p 大亚基的m r n a 水平明显降低，表明葡萄糖对m t pm r n a 的影响仅发生 在非常严重的糖尿病患者当中。s h a r p 等p 9 j 通过研究表明补充游离胆固醇对i e p g 2 分泌a p o b 无影响，而2 5 2 一羟胆固醇使f g 、c e 和a p o b 分别增加1 4 、3 2 、2 5 倍。 同时m t pm r n a 水平和甘油三酯水平之间呈正相关关系。小肠的快反应与肠细胞的 快速更新相联系，对应- 丁各种饮食变化引起的m t p 的活性波动。肝脏的调节较缓慢， 这是对饮食长期变化的适应【吲。b e n n e t t 等吲在大颊鼠中研究胆固醇对m t p 表达的 影响，结果显示饲喂含胆固醇j 物的大颊鼠增加了它们的肝m t pm r n a 水平，而且 与血浆v l d l 浓度升高相关。 7 在人和仓鼠m t p 基因的研究中发现：m t p 基因5 端转录起始点上游2 0 0 b p 约 7 0 的序列具有高度保守性，说明近启动子区域有重要的调节元件。基因表达研究显 示一1 2 3 - 8 5 b p 区域对于表达是关键的，含有肝细胞特异因子h n f 2 1 、h n f 2 4 和活化 蛋白a p 2 1 的识别序列【6 8 】。同时，d e b o r a h 等【删还发现存m t p 基因的启动子中含有 一个胆固醇正反应元件( s r e ) ，位于人、仓鼠肝细胞。1 8 0 b p - - 1 6 0 b p 区域；一个胰 岛素负反应元件( i r e ) ，位于人肝细胞1 2 3b p - - 8 5b p 区域，仓鼠肝细胞11 7b p - - 7 9b p 区域，胆固醇和胰岛素可据此调节m t p 的活性，并发现i r e 似乎在离体和在 体中都较活跃。l i n 等脚j 在h e l ：l g 2 细胞中也证实了胰岛素可以降低m t pm r n a 水平 的表达，从而使v i ，d t 。的分泌降低，当胰岛紊浓度为1 m 时，m t p 启动子活性被抑 制8 0 。另外，g u y 等【6 9 】在对鹅的填饲研究中发现：对填饲敏感的朗德鹅，其血浆 中的胰岛素水平高于波兰鹅，而且肝脏中胰岛素受体也高于波兰鹅。n a r c i s i 等f 4 b l 在 用胰岛索治疗人的l 型糖尿病患者中，血浆v l d l 水平降低，而使用胰岛索抗体治 疗的2 型糖尿病患者其血浆v l d l 水平增加。w e t t e r a u 等【4 2 】在用连霉素处理后的大鼠 中，发现肝m t p m r n a 水平升高6 5 ，而小肠中来改变，当注入胰岛素时，此效应 被削弱。b a r r e l s 7 0 】在肥胖型糖尿病小鼠中 研究揭示出肝m t pm r n a 表达增加4 5 ( 高胰岛素高血糖的糖尿病o b o b 小鼠) 而且同时肝分泌t g 和m t p 活性升高。 l i n 等【7 1 】发现新鲜大蒜抑制人肝和小肠细胞及大鼠小肠中的m t p 表达，但是大 蒜所诱导的m t p 表达改变的分子机制尚不清楚，而且其活性成分也未鉴定出。 t a g h i b i g l o u 等在个新的金色叙利亚鼠模型中，证实了果糖饲喂与野生的高血糖 的a p o b v l d l 过量产生及m t p 表达增强是相联系的。c h a n s o n 等f _ 乃1 对肝胰岛索抵抗 改善后发现m t p 表达f 常化，而且促进了v l d l 的分泌。在进餐后血浆脂质失调和 糖尿病兔的研究巾，p h i l l i p s 等1 7 4 】发现，当小肠组织中m t p 表达和活性升高，从而观 察到的乳糜微粒颗粒显著增多，而在肝中的未观察到变化。l i n 等【7 5 j 在h e p g 2 细胞和 大鼠中发现乙醇可以降低肝和小肠m t p 的表达。n a v a s a 等【7 6 】在研究内毒索和细胞活 性索对m t p 表达的调控时，结果也观察到了相似的效应。但与乙醇处理不相同的是， 细胞活性素孵育时间延长却不改变h e p g 2 细胞分泌a p o b ，这表明m t pm r n a 的改 变不显著地促使由细胞活性紊所诱导的脂蛋白分泌效应。c a r d o z o 等【7 7 】在大鼠肝瘤细 胞中发现，m t p 活性的抑制，促使a p o b 的蛋白酶与非蛋白酶的降解，从而减少了含 有脂蛋白的a p o b 的分泌。b r e m m e r i t s 在大鼠中研究，发现m t p 活性降低有助于激发 酒精性肝脂肪变性。p e r l e m u t e r 等m 1 对肝炎病毒c 引起的肝脂肪变性的研究，表明肝 8 炎病毒c 抑制了m t p 的活性和降低了v l d l 的分泌。l i a o l 8 0 1 在小鼠中发现在野生型 c 5 7 b l 6 和l d l 受体缺失的小鼠中，阻断m t p 功能显著地降低了t g 、胆固醇和v l d l 的衄浆水平，而在微粒体内腔的伴侣蛋白质( 如蛋白质二硫键异构酶p d i 、葡萄糖调 节蛋白g r p 7 8 、g r p 9 4 、h s p 6 0 、h s p 7 0 、h s p 9 0 ) 都不受抑制的影响。近年来，p h i i i p p e 等【8 1 】在儿种药物所诱导小鼠的肝脂肪变性中发现，肝脂肪变性是山于这些药物抑制。t m t p 的活性所致。 1 4 本研究的目的和意义 由于m t p 基因与血浆中v l d l 的组装和分泌过程有着重要关系，目前关于m i p 基因的研究主要集中在人和小鼠上，其目的是研究人类肝脂肪变性以及一些相关疾病 发生的机制，而在禽类脂肪代谢研究中更是缺乏对m t p 在体外与体内的表达分析， 也缺乏对不同生长阶段中肝脏与小肠中m t p 表达的研究。m t p 基因的表达调控的研 究仅见于g u y 等【6 9 】对朗德鹅和波兰鹅进行填饲后，发现血浆中胰岛素水平存在着差 异，但是并没有进一步研究m t p 的组织表达情况，因此，对鹅m t p 基因的组织表达 与调控等方面的研究尚属空白。因此，本试验以四川白鹅和朗德鹅作为试验材料，研 究微粒体甘油三酯转运蛋l 皇i ( m t p ) 在强制填饲前后的组织表达规律，以及与体脂 肪组织性状、m 液生化指标间的关系，探讨不同品种( 系) 间、甚至种内个体问由填 饲所诱发的鹅肥肝易感性差异的遗传原因，对肥肝专门化肉鹅品系的培育和肥肝生产 实践具有重要的理论意义，同时也可以鹅为实验动物为人类的一些肝病、糖尿病以及 心血管疾病等的研究提供基础性参考。 9 2 实验材料与方法 2 1 实验动物和实验动物的饲养 鹅的品种及数量：朗德鹅( a r i s e ，a n s e r ) 来自四) l l s “安朗德鹅有限公司，四j i l f i 鹅( a n s e rc v g n o i d e s ) 来自四川农业大学家禽育种实验场。同批孵化，每个品种分别 选留1 6 5 只健壮公鹅。 饲养管理：o 1 3 周，群养；填饲期间单笼饲养，整个饲养期间自由饮水。0 - 4 周： 自由采食雏鹅料( m e = 2 9 5 0 k e a l k g 、c p = 2 0 5 ) ，适当添加优质膏饲料。4 - 1 3 周：饲 喂生长鹅饲料( m e = 2 6 0 0 k c a l ，c p = 1 3 8 ) ，自由采食青饲料。根据鹅各阶段的营 养标准、结合饲料的营养成份及青饲料干物质中蛋白质和能量的大致比例，确定4 1 3 周龄配合饲料的添加量：4 - 5 周龄朗德鹅1 5 0 9 只f 1 、四川自鹅1 2 5 9 只1 = = l ： 5 - 8 周 朗德鹅1 6 5 9 只同、四川自鹅1 0 0 9 只日；8 - 1 3 周朗德鹅1 2 0 9 只、四川自鹅，8 5 9 只h 。1 3 周龄丌始预填，饲喂生长鹅饲料，预填7 天，在预填期，不供给青草，并n 精料的供给量是逐渐由限饲过渡到自由采食，到预填结束时，朗德鹅与四川自鹅每只 的h 采食量分别达4 0 0 9 与3 3 0 9 。预填结束时，称体重。 1 4 周开始填饲，每n 机器填饲5 次，填饲期2 周；填饲期的饲料配合：煮黄玉米、 3 的鹅油和1 5 食盐等。由于朗德鹅与四川白鹅在体重与最大的摄食能力两方面存 在差异，为了在这两种鹅的脂代谢中进行正确的比较，因此，在填饲期间，填饲量与 体重呈一致的比例，如两种鹅都以每k g 体重填饲5 0 0 9 饲料。因四川白鹅食道较朗德鹅 小，而对所填饲料的消化又较朗德鹅弱，因此，本实验以对四川白鹅能填的最大量作 为计算两种鹅每k g 体重所能填饲料量的基准，从而根据朗德鹅与四川白鹅的体重确定 相应的填饲量。 2 2 样品的采集 分别采集1 周龄和l o 周龄两r 最种各5 只，预填i i l s 希l 预填后( 即填饲| j f ) 各1 5 只，填 饲后朗德鹅】7 只、四川自鹅2 3 只血液、肝脏组织、小肠、皮脂、腹脂等组织样品。在 各生长阶段时，对所采样的鹅先称重，后放于另一单独的鹅舍中，整夜禁食，自由饮 水。第二天清早，翅静脉采血5 m l ，于4 c 下3 0 0 0 璃心l o 分钟分离出血浆，把血 浆冻于一- 2 0 。c 冰柜中，备分析血浆中葡萄糖、t g 和v l d l 浓度。此次采血后，让鹅只 休息半小时后饲p _ ) , 2 0 0g 的精料。l 小时后，从另侧翅静脉采集2 m l 的血液，同样于 1 0 4 cf 3 0 0 0 x 鹂心1 0 分钟分离出血浆并把衄浆立即置于一7 0 低温冰柜备测定血 浆胰岛素浓度。每次采血时，都事先于冻存管中加入抗凝剂e d t a ( 0 8g 1 ) 和抑 菌剂叠氮化钠( 0 1 9 1 ) 。 于第二次采血后，颈动脉放血致死。后立即剖腹取出肝脏称重，并于肝右叶尖部 割取约6 0 克立即置于液氮中备分析肝中水分、腊质含量和肝组织总r n a 的抽提；同 时迅速取出小肠剪一段，割开，用d e p c 处理水配制而成的生理赫水洗净，快速投入 液氮中速冻以备小肠总r n a 的抽提，进行屠宰测定。 2 3 实验仪器和试剂 2 - 3 1 使用的仪器 1 p c r 扩增仪：p t c 1 0 0 t mp r o g r a m a b l et h e r m a lc o n t r o l l e r ，m jr e s e a r c h ， n c p c re x p r e s s ，t h e r m oh y b a i d ，i n e 2 自动灭菌锅：a u t o c l a v es s 3 2 5 ，t o m y ，i n c 3 凝胶成像系统：b t s 一2 0 m ，u v i t e c 。i n c 4 电泳槽：垂直：p r o t e a n t m 型，b i o r a d ， i n c 水平：d y y - i i i 型水平电泳槽，北京六一仪器厂 5 电泳仪：m o d e l1 0 0 0 5 0 0p o w e rs u p p l y ，b i o r a d ， i n c 。 d y y - 2 c 型，北京六一仪器厂上海 6 低速离心机：m i n i s p i n ，e p p e n d o r f ，i n e 7 恒温培养箱：g e n e r a lp u r p o s ei n c u b a t o r s ，s h e l d o nm a n u f a c t u r i n g ，i n c 8 高速冷冻离心机：c e n t d f u g e 5 4 1 5 ，5 8 0 4 r ，m i n i s p i n ( 均为e p p e n d o r f ，i n c ) 1 0 循环水控制系统：m o d e le 4 8 6 0r e f r i g e r a t e dr e c i r c u t a t o r 。b i o r a d ，i n c u 普通家用微波炉：光波型，青岛海尔公司 1 3 f 1 动双重蒸馏水器：上海玻璃仪器一厂 1 4 电子天平：0 0 0 0 1 9 ，b p 2 11 d ；o o l g ，b l 6 1 0 ，s a r t o r i a s ，i n c 1 5 t h e r m o m i x e rc o m f o r t ( e p p e n d o r f ) 1 6 漩涡混合仪：g 5 6 0 ev o r t e x 一2 ，s c i e n t i f i ci n d u s 缸i e s ，i n c 1 7 鼓风干燥箱：1 0 1 a 型数显鼓风干燥箱，上海实验仪器总厂 1 8 s n 6 9 5 b 智能放免7 测量仪( 上海核所日环光电仪器公司) 1 9 b a s i c 半自动生化仪v 1 1 8 ( 法国) 2 0 电热恒温水浴锅( 北京) 2 1 分光光度计：7 2 1 型分光光度计，i ：海第三分析仪器厂 2 4 填饲机：9 t f l 一1 0 0 型，1 9 8 4 年北京农业大学研制 2 5 超低温冰箱：一8 0 ，h a r r i s ，i n c 2 6 f 氐温冰箱：- - 2 0 ，s a n y o ，i n c 2 3 2 使用的试剂 免疫活性胰岛素放免试剂k i t ( 华西医大) 、甘油- - j 旨( t g ) k i t ( 北京中生) 、葡萄糖 g o p p a p 测定k i t ( g y l 迈克) 、n a c l 、乙醚、氯仿、甲醇、b e y o z o l 一总r n a 抽提试剂、 异丙醇、液氮、d e p c 、无水乙醇、 i r i s 碱、硼酸、溴乙锭、e d t a 、a m vf i r s ts t r a n d c d n a s y n t h e s i sk i t 、t a q 酶，d n a m a r k e rd l 2 0 0 0 ，琼脂糖，电泳b u f f e r ，引物。 2 ：3 3 所用缓冲液的配制 d e p c 处理水：用将高温烘烤的玻璃瓶( 1 8 0 2 小时) 装1 0 0 0 m l 去离子水，然 后加入1m l 的d e p c ( 体积体积) ，剧烈震荡混匀，3 76 c 处理过夜，高压灭菌后， 取部分分装成小份( 1 m l 管) ，一2 0 保存，其余用于配制试剂； 7 5 乙醇：( 用d e p c 处理水配制7 5 乙醇) 7 5 0 m l 无水乙醇中加入2 5 0 m 1d e p c 处理水，然后装入高温烘烤的玻璃瓶中，存放于低温冰箱； 5 x t b e 电泳缓冲液：5 4 8t r i s 碱，2 7 5 硼酸，2 0 m lo 5 m o l le d t a ( p h 8 0 ) ，定 容到1 1 。，常温保存； l r i s c i 贮存液( 1 m ，p h8 o ) ：1 2 1 1 4 9t r i s 碱溶于8 0 0 m l 去离子水中，用h c l 调节p h 值至8 0 ( 约需浓h c l4 2 m 1 ) ，定容到l l ，高温高压灭菌，4 。c 保存； e d t a 贮存液( 0 5 m ，p h8 o ) ：1 8 6 1 9e d t a - n a 2 2 i - 1 2 0 加入8 0 0 m l 去离子水 中，剧烈搅拌，用n a o h 调节p h 至8 0 ( 约需2 0 8n a o t t 颗粒) ，定容到1 i 。，高温高 压灭菌，4 。c 保存； 溴化乙锭贮存液( 1 0 m g m 1 ) ：在1 0 0 m l 去离子水中加入l g 溴化乙锭，溶解后4 棕色瓶保存； 6 x 凝胶加样缓冲液：0 2 5 溴酚蓝，0 2 5 - - - 甲苯青f f ，4 0 ( w v ) 蔗糖水溶 液，常温保存； 2 4 实验操作步骤 2 4 1 血浆生化指标的测定 1 2 血浆中血糖测定：使用葡萄糖g o d - p a p 法检测试剂盒( g l u c o s e ( g l u ) a s s a yk i tb y g o d p a pm e t h o d ； 血浆中甘油i 酯( t g ) 测定：使用酶比色法( g p o p a p ) 甘油三酯试剂盒 ( t r i g l y c e r i d e sk i t ) ； 血浆中极低低密度脂蛋白( v l d l ，) 测定：利用沉淀法与酶促法相结合的方法计算 法： m l 浆中胰岛素水平的测定：采用免疫活性胰岛素放免试剂盒。利用放射免疫法测 定； 2 4 2 肝组织中水份与总脂质含量的测定 ( 1 ) 取一称量瓶，瓶内装有一滤纸包，烘至恒重，于干燥m l e p 冷却，置电子天平 中称重调零。 ( 2 ) 取约1 克冻存的肝组织，在冰冷的生理盐水中漂洗一次，用滤纸拭干，臂于 一烘干的研钵中，用眼科剪剪碎。 ( 3 ) 取剪碎的肝组织簧于滤纸包内，记录初始重量，记为a 。 ( 4 ) 取小称量瓶，于烘箱中1 0 5 。c 下加热至恒重后称重，记为b 。 ( 5 ) 取出滤纸包置于装有乙醚的索氏抽提器中抽脂，至恒重，记为c 。 ( 6 ) 在氮气中蒸发掉乙醚，收集所抽出的总脂。 ( 7 ) 计算水分与总脂质的含量：水( ) = ( a b ) a 1 0 0 总脂质( ) = ( b c ) a 1 0 0 2 4 3 组织总r n a 的提取 本实验研究中需抽提总r n a 的组织有：所分析的各生长阶段中两基因型鹅的肝、 小肠；和l o 周龄时两种鹅的胸肌、腿肌、皮脂、腹脂、脑与心脏。以肝组织总r n a 的提取为例，说明组织总r n a 的提取的具体操作过程。 2 4 3 1 肝组织总r n a 的提取步骤 借浆g l i s i n 8 2 l l l r i c hi 8 引、s t r o l m a a n 8 4 】和m a c d o n a l d t s s l 的强烈变性剂提取总r n a ， 作一定的修改； ( 1 ) 从- - 7 0 c 冰箱中取出冻存组织，用眼科( 经1 8 04 c 烘烤4 小时) 剪取8 0 1 0 0 m g 组织，予一用d e p c 处理过的研钵中，迅速剪碎，加入液氮，磨成粉末； ( 2 ) 取一支无r n a 酶的1 5m l 的离心管于4 预冷，用无r n a 酶的10 0 0 肛1 的 1 3 枪头吸取4 预冷过的l m lb e y o z o l 液加入其中，称量此时离心管的重量，记为a ； 迅速用小药匙盛取肝组织粉术，加入其中。后称量其重量，记为b ，则所取的b ：组织 样的重量为：b - - a ；对研磨中所剩的肝组织粉末，装入无r n a 酶的且4 c 预冷过的 1 5m l 的离心管中，于7 0 保存： ( 3 ) 剧烈振荡5 m i n ： ( 4 ) 1 2 ，0 0 0 r p m4 v 离心1 0 分钟，然后吸取澄清的b e y o z o l 裂解产物至一新的 无r n a 酶的1 5m l 离心管中。室温放景5 分钟，使样品充分裂解； ( 5 ) 用2 m l 一次性注射器( d e p c 处理，6 号针头) 抽吸两次以剪切基因组d n a ， 并转移到一新的无r n a 酶的l ，5m l 离心管中； ( 6 ) 用无r n a 酶的2 0 0 r t l 的枪头吸取0 2 m l 氯仿，加入离心管中，v o r t e x 剧烈振 荡混匀1 5 秒( 如发现未完全溶解，延长振荡时间) ，室温放置3 分钟； ( 7 ) 1 2 ，0 0 0r p m4 c 离心1 5 分钟，然后用无r n a 酶的1 0 0 0 1 x l 的枪头吸取含总 r n a 的上层水相至一新的无r n a 酶的1 5m l 的离心管中； ( 8 ) 用无r n a 酶的1 0 0 0 山的枪头加入o 5 m l 异丙醇，颠倒数次混匀，室温沉淀 l o 分钟； ( 9 ) 1 2 ，0 0 0r p m4 。c 离心1 0 分钟，在管底可见胶状r n a 沉淀，弃上清； ( 1 0 ) 加入冰冷的l m l 7 5 ，乙醇( 经d e p c 处理过) ，v o r t e x 混匀，7 5 0 0r p m 44 c 离 心5 分钟，弃上清；重复该步骤一次； ( 1 i ) 倾斜离心管( 使剩余的乙醇流出而沉淀物不流出的情况下) ，用枪头吸去管 壁的液体，后自然干燥。待r n a 略干后，加入3 0 1 x l ( 或适量的) d e p c 水溶解分 装于2 个无r n a 酶的2 0 0 l x l 的离心管中，一7 0 。c 冻存； 2 1 4 1 3 2 所肝组织总r n a 的质量和浓度检测 分别采用1 0 普通琼脂糖凝胶电泳和分光光度计检测所抽提的r n a 的质量，及 测定其浓度。 ( 1 ) 用d e p c 水清洗电泳槽、梳予与倒胶板； ( 2 ) 取5 x t b e 缓冲液2 0 m l 加水至1 0 0 m l ，配制成1 t b e 稀释缓冲液： ( 3 ) 称取1 0 9 普通琼脂糖，置于2 0 0 m l 锥形瓶中，加入1 0 0 m ll x t b e 稀释缓冲 液，放入微波炉里加热至琼脂糖全部熔化，取出摇匀； ( 4 ) 待琼脂糖胶液冷却至5 0 6 0 。c 时，在凝胶中加入胁至终浓度o 0 7 5 u g m l ，摇 匀，倒胶； 1 4 ( 5 ) 点样：取一个2 0 0 u l 的无r n a 酶的离心管，加入2 u 1 6 载样液与2 i tj 溶 解后的r n a 原液，点于凝胶孑l 中。 ( 6 ) 加完样后，合e 电泳槽盏，立即接通电源，观察正负两极是否有气泡出现， 如负极气泡比正极多，则表示电泳槽已经接通电源，2 5 0 v 电压下电泳1 5 分钟。 ( 7 ) 观察和照像：于凝胶成像仪中照像，保存图像。观察是否出现两条完整的条 带：2 8 s 和1 8 s ，其中2 8 s 的条带亮度大致是1 8 s 条带亮度的2 倍。 ( 8 ) 针对具有两条完整条带( 即未降解) 所对应的r n a ，驭其原液2h 1 ，加入8 h 1 的d e p c 水，混匀。 ( 9 ) 在分光光度仪中测定2 8 0 n m 和2 6 0 n m 处的0 d 值，分析r n a 的纯度与计算其 浓度。 ( 1 0 ) 根据所测定的浓度，取未降解的r n a 原液8i tl ，加入适量的d e p c 水把 样品稀释成浓度为l u g u l ，保存于7 0 冰箱中。 2 4 。4 混合总r n a 的制备 针对各组织，按发育阶段来划分，每个品种的各发育阶段上的相应的个体的已稀 释了的总r n a ( 1 u g u 1 ) ，取等量混合，构成混合总r n a 。即每个品种鹅有，肝组织： l 、1 0 、1 3 、1 4 和1 6 周