（动物遗传育种与繁殖专业论文）大熊猫（Ailuropoda+melanoleuca）皮肤成纤维细胞系选育的初步研究.pdf

摘要 本试验研究了大熊猫皮肤组织细胞的分离，进行了大熊猫皮肤成纤维细胞体外培 养体系的设计，初步建立了大熊猫皮肤成纤维细胞系，并对培养的细胞进行了种属鉴 定和玲冻保存。研究结果表明： 1 大熊猫皮肤组织块在2 0 0 1 u m 1 胶原蛋白酶i 在4 下酶解4 8 7 2 h 的酶解效果最 好，活细胞的得率达到4 6 0 4 xl o g ，且胶原蛋白酶i 酶解得到的细胞以成纤维细胞 为主； 2 大熊猫皮肤组织块在：m 1 9 9 + 2 0 f b s + i o o i u m l 青链霉素州一p l a s m o l i n “5i l g m l + a m p h t e r i c i nb5 i ig m l + 2 t m o l ll _ g l u 中培养，幼仔皮肤组织块培养6 - 8 天， 成体皮肤组织块培养1 2 - 1 4 天后出现游离的成纤维细胞。 3 传代时连续3 个代次采用成纤维细胞与上皮细胞差速粘附特性进行成纤维细胞纯 化，其纯度可达到：9 9 8 4 0 5 6 3 ( n = 3 0 ) ； 4 在b c s s 四种培养体系中，测得在b c s 一3 培养体系中：细胞平均贴壁率为8 5 9 9 6 ， 在第4 代，染色体为二倍体的百分率为8 7 2 7 ，细胞生长较快，形态正常。通过细胞 贴壁率变化趋势表明，在b c s - 3 培养系统中，成纤维细胞在6 - 8 代，应该进行冷冻保 存。 5 在c s s 六种培养体系中，以在c s - 5 培养体系中：细胞生长速度最快；在第5 代。染 色体数目为二倍体的百分率为7 5 7 7 9 6 ；染色体众数为4 2 。通过染色体相对长度和着丝 粒指数分析表明：培养的细胞是大熊猫体细胞； 7 冷冻保存中：f m - i 的细胞毒性最小，冷冻保存细胞后细胞的复苏率( 9 3 2 5 8 ) 最 高。 研究认为：2 0 0 1 u m l 的胶原蛋白酶i 在4 下酶解大熊猫皮肤组织块，用c s - 5 培 养体系进行大熊猫皮肤成纤维细胞铺层培养，在第6 8 代时，用阱1 冷冻保存细胞 可以获得遗传稳定的大熊猫皮肤成纤维细胞系 关链词：大熊猫成纤维细胞系皮肤细胞培养染色体数目变异率 1 引言 细胞或组织培养( 体外培养) 技术是- - t 7 广泛应用于细胞生物学、分子生物学以及 迅速发展的生物工程的重要技术( f r s e h n e y ，r i ，1 9 8 3 ) 。细胞培养是建立细胞系的 基础。细胞体外培养历史悠久，最早进行组织培养的是德国r o u x ( 1 8 9 5 ) ，随后h a r r i s o n ( 1 9 0 7 ) 、c a r e e l ( 1 9 1 0 ) 创建了盖玻片悬滴培养法，建立了细胞体外培养的基本模式。 1 9 4 8 年s a n f o r d 等创立了分散的单细胞培养方法，建立了第一个单细胞克隆的细胞株； 1 9 5 0 年l o r g a n 等人提出了第一个人工合成的m 1 9 9 培养液配方；1 9 5 7 年d u l b e c c o 等 用胰蛋白酶消化处理组织，获得铺层细胞培养。细胞培养发展史上，这些具有开创性 的工作促进了细胞培养技术的发展。2 0 世纪5 0 年代之后，体外培养技术进入了蓬勃发 展的时期，各种细胞系不断建立。目前，全世界已有多个体外培养物冷冻保藏机构， 如：世界最大的美国典型培养物收藏中心( a t c c ) 保藏了近2 0 0 0 0 株细胞，中国典型 培养物保藏中心( c c t c c ) 保藏了4 0 0 0 多株细胞，这些细胞在全世界范围内交流，用 于科学研究和资源保存( 鄂征，1 9 9 5 ) 。 细胞在基因资源的保存上，主要有两种方式：对于濒危物种。保存体细胞、配子或 胚胎是基因资源保存简洁有效的方式( 刘爱华，1 9 9 5 ) ；另一种是基因资源以e d n a 文 库的方式进行保存。大熊猫是世界上濒危的大型哺乳动物，建立大熊猫细胞系，对其 进行基因资源保存和相关研究都具有重要意义。 1 1 细胞培养和细胞系选育研究的意义 细胞生命活动的主要方面可以在体外再现，细胞基因组资源可以体外扩大倍增，因 此，细胞体外培养技术几乎可以应用到生物、医学研究和基因资源保存等领域( c a 文 俊，1 9 9 7 t 王立新，2 0 0 0 ) 在细胞生物学研究中，细胞形态、细胞生理( g a b e l ，g ，1 9 9 6 ) 和细胞遗传与基因 表达( l i n ，c q ，1 9 8 6 ) 的研究，以及细胞分化、发育过程中细胞间的相互作用、细 胞内的控制机制、神经系统的作用等研究都离不开细胞培养技术 ( a u e r b a c h ，r ，7 9 7 5 ；c o x ，r p ，1 9 5 8 ：f i n b o w ，雎f ，1 9 8 1 ：b o r n s t e l n ，m 8 ，1 9 5 8 ：m i n n a ，j ，1 9 7 3 ) 通过对正常细胞与肿瘤细胞的差异比较，研究肿瘤细胞的的生物学特性， c o w d r y ( 1 9 5 5 ) 通过对培养细胞分裂时相研究，发现肿瘤细胞分裂时间缩短；e a s t y ( 1 9 7 6 ) 通过细胞培养和植块培养发现肿瘤细胞具有浸润性( 薛庆善，2 0 0 1 ) 。通过细胞培养中 添加致瘤物或致瘤细胞移植，研究肿瘤的发病机制，以及研究了肿瘤细胞的致瘤性和 射线对正常培养细胞的致畸作用( g e y ，1 9 5 4 ；s u s k i n d ，1 9 5 7 ；c o r i e l ，1 9 5 8 ，1 9 5 9 ) 。 目前，通过体外培养研究肿瘤细胞人工凋亡正成为新的热点( 陈昭烈，1 9 9 9 ) 细胞 2 培养在病毒学方面的应用极其广泛，可以为研究病毒亲细胞和亲组织提供方便，对进 一步研究病毒的致病机理、生物抗性和治疗药物具有重要意义。以细胞培养为基础的 细胞融合( 8 a r s k i ，g ，1 9 6 0 ；s o r i o u t ，s 。，1 9 6 1 ；l i f f l e f i e l d ，j 轷，1 9 6 4 ：h r r i s ，h ， 1 9 6 5 ) 、细胞克隆而发展起来的杂交瘤细胞生产单抗( k o h l e r ，g ，1 9 7 5 ) ，是细胞培养在 免疫学上的重大应用。在2 0 世纪5 0 年代，p o m e r a 、l e a k e 、l i v i n g o o d 等已开始用体 外细胞培养技术研究各种药物对细胞的毒副作用。通过细胞培养，可以进行药物的初 步筛选、细胞毒性鉴定、活性检测等方面的研究 ( f r e s h a e y ，r i ，1 9 7 5 ；w i l l e c k e ，k ，1 9 7 9 ；m a i n i n ，t 。i ，1 9 6 7 ) 。此外，细胞培养还可 以检测机体组织替用材料( 仿生材料) 的生物相容性和毒副作用( 粱卫东，1 9 9 9 ) 。通 过大规模培养哺乳动物细胞，是生产生物制品有效和廉价的方法。w e z e 霄( 1 9 6 7 ) 建立 了微载体培养系统，r i c h a r dk ( 1 9 7 2 ) 建立了中空纤维培养系统( 胡显文，1 9 9 8 ) ，l i m 等( 1 9 8 6 ) 提出了微囊固定技术，这些技术使细胞大规模培养成为可能( 林福玉，1 9 9 9 ) 。 细胞培养技术可用于医学上疾病诊断和治疗：通过细胞培养，分析细胞核型、 m f i s h f i s h 等方法，可检测出3 0 0 多种遗传疾病；透过细腮培养，分析病变组织细胞 的改变，可辅助疾病诊断( 武春园，1 9 9 7 ) 。细胞培养和组织培养可用于细胞或组织移 植，用来治疗血液类疾病、大面积烧伤植皮、部分遗传缺陷类疾病等( 刘哲丽，1 9 9 7 ： 兰丽，2 0 0 2z 刘斌，1 9 9 9 ；陈立新，1 9 9 9 ；王安喜，1 9 9 9 ) 。 细胞系是以细胞培养为基础进行的研究中，基础的、标准化的试验材料。臣前，纫 胞生物学家已经培养和建立了大量的细胞系：如具有特异药物敏感性或药物抗性的细 胞系株，用于药理研究；具有特异基因或基因缺失的细胞系，用于遗传研究；具有干 细胞特性的组织或器官原基细胞系，用于细胞移植或作为核供体。此外细胞系还是 建立细胞株的基础。 1 2 细胞培养和细胞系在濒危动物遗传资源保存上的应用 自然界创造的每一物种都有存在的价值，多样性是自然界稳定乃至人类生存的基 础。濒危动物的遗传资源有保存和研究价值。经过多年的研究，在绵羊、牛、兔、猪、 山羊和小鼠上获得细胞核移植成功( w i l l a d s e n ，1 9 8 6 ；c a m p l e l l ，1 9 9 6 ： p r a t h e r ，1 9 8 7 ：s t i c e ，1 9 8 9 ：张涌1 9 9 1 ；c h e o n g ，1 9 9 3 ：w i l m u t ，1 9 9 7 ) ，使克隆动物研究 获得重大进展，使通过体细胞培养建立的细胞系作为遗传资源保存有了意义。大熊猫 重构胚的研究( 陈大元，1 9 9 9 ) 。大熊猫卵母细胞的体外成熟( 张美佳，1 9 9 7 ) 和体外 受精( 侯蓉，1 9 9 7 ) 的研究，为濒危动物遗传资源的保存和利用开辟了新的方式。除 此之外，e s 细胞系保存也是一种较好的濒危物种保藏方式( 张学明，1 9 9 9 ：王杏利， 3 1 9 9 9 ：房秀，1 9 9 9 ；y e u n g ，w s 。1 9 9 2 ) 。细胞培养，细胞系的选育可以使濒危动物的 遗传资源扩大，通过细胞冷冻褥到长期保存，丽且可以向全世雾的研究者提供研究材 料，避免因为濒危动物研究材料的稀缺而造成研究不足。 1 3 大熊猫的生存危机和珍贵的遗传价值 大熊猫是我国特有的世界大型哺乳类珍贵动物，由于它繁殖力低下，栖息环境不断 缩小和割裂，遗传交流中断，遗传多样性逐渐丢失，人为干扰等原因，野生大熊猫的 数量急剧减少，已处于濒临灭绝的境地( 冯文和，1 9 9 1 ) 。大熊猫具有珍贵的遗传价值， 是人类共同的财富。 大熊猫3 2 0 万年煎从食肉类家族分化成熊科，2 1 5 万年前演化成素食动物 ( c o l b e r t 。e ，1 9 3 8 ；s t e p h e n ，1 9 8 4 ) 。在随后的漫长历史中，大熊猫作为熊科分化树上， 唯一没有再分化的大熊猫( 皿) 科一直到今天。这在动物进化史上是少见的现象( 牛靖， 1 9 8 3 ) 。大熊猫没有食草类哺乳动物那种典型胃肠变化，但它却能依靠完全是植物性质 的食物( 竹子) 而生存下去，表现出了超强的自然适应力。这在动物界也是少见的( d a v i s d d ，1 9 6 4 ：k l u z 。y ，1 9 8 5 ：k a m e t a k a ，m ，1 9 8 5 ；m a r ka ，1 9 9 7 ) 。d a v i s 通过对发情太熊 猫卵巢的研究发现，大熊猫的卵巢保留了部分两栖动物的特征( 冯文和，1 9 8 4 ) 。这些 现象都说明了大熊猫珍贵的遗传价值。 人类活动范围的扩大，逐渐缩小了适宜大熊猫栖息的环境，造成大熊猫栖息环境 的相互隔离。大熊猫目前主要分布在秦岭山系、岷山山系、邛崃山系、凉山山系和小 相岭山系在内的2 0 多个“生态岛”上，群体间遗传交流中断，高度近亲繁殖，导致基 因纯合( 胡锦矗，1 9 8 5 ，1 9 9 0 ) 。潘文石( 1 9 8 8 ，1 9 9 3 ，1 9 9 7 ) 通过研究认为，秦岭山 系的大熊猫群体已有1 3 的基因纯合，而且每代将以0 5 4 5 6 的近交率丧失多样性；张 黎明( 1 9 9 4 ) 通过研究推算出：岷山北部、岷山南部、邛崃山、凉山和相岭等五个地 区大熊猫种群每代将分别以0 3 1 8 5 、5 5 5 5 6 、0 6 0 2 4 、0 8 7 7 2 、和7 1 4 2 9 的近 交率减少其杂合度的理论估算值。基因的纯合导致繁殖力的下降和后代存活率的降低。 同时大熊猫生存环境的恶化，造成了大熊猫生存危机的加剧。 通过细胞培养，选育大熊猫遗传资源细胞系，建立大熊猫细胞库，可以与大熊猫 配子库、胚胎库一起，形成多层次、多角度、全方位的遗传资源保藏系统 ( g il m o r e ，j a ，1 9 9 8 ) 。通过细胞培养建立大熊猫个体细胞库( 个体细胞档案) ，更有 利于对大熊猫个体阋的亲缘关系和群体遗传结构进行研究，为大熊猫的保护措旅的制 定提供科学依据。细胞培养产生去分化细胞，用于核移植，甚至可以使灭绝动物的遗 传资源重新再现。细胞培养不仅可以使大熊猫的遗传资源扩大得到长期保存，而且可 4 以向全世界的研究者提供丰富的研究材料，避免因大熊猫研究材料的稀缺而造成研究 滞后，加强对大熊猫遗传资源的世界性开发和对大熊猫的世界性研究，更有利于开展 大熊猫保护的世界性联合研究。 1 4 细胞系建立的过程 细胞系的建立的过程是对组织细胞进行分离、纯化、培养和传代的过程，其中主要 是细胞培养的过程。 1 4 1 细胞的分离和纯化 组织块分散成单个细胞的方法主要有三种：机械离散、酶解离散和螯合剂离散。 用蛋白酶解离细胞是体外培养细胞分散最常用、最基本的方法。能用于体外解离组织 的蛋白酶有多种，如：胰蛋白酶、胶原蛋白酶( i 、i i 、v ) 、链酶蛋白酶、透明质酸酶、 粘蛋白酶、溶菌酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、中性蛋白酶和弹性纤维蛋白酶等，但最 常用的是胰蛋白酶和胶原蛋白酶( 鄂征，1 9 9 5 ；薛庆善，2 0 0 1 ) 。离散的细胞可以在传 代过程中逐渐分离纯化，如；采用差速粘附、反复植块；也可以离散后立即进行分离 纯化，如：密度梯度离心、速度沉降、细胞电泳、流式细胞分离、离心淘洗等方法。 除此之外，有丝分裂抑制、选择性培养基等，也可用于细胞分离。 1 4 2 细胞培养 细胞培养是细胞建系的主要工作。也是决定建系成功与否的决定性工作，不同动物 的细胞以及同一动物不同组织的细胞，在体外生长的能力差异很大( p i t o t ，h ，1 9 6 4 ) 。 作为遗传资源保存建立的细胞系，在能够保证细胞能够生长的前提下，如何最大限度 的保持细胞在体外环境下，遗传物质复制、分配、传递的稳定性是至关重要的，也是 衡量遗传资源细胞系建系成功与否的标准。细胞的培养液体系和培养方法直接决定细 胞培养或建系的成功与否。 1 4 2 1 细胞培养体系 细胞培养液一般由基础培养液添加血清、激素、细胞因子、抗生素和其他添加物等 组成。基础培养液可以分为天然培养液和人工合成培养液。天然培养液主要包括各种 动物的血清、血浆、水解乳蛋白、淋巴液、组织抽提液、胚胎浸出液等，是最早使用 的一类培养基( l o e b ，b ，1 8 9 7 ：h a r r i s o n ，1 9 0 7 ；b u r r o w s ，1 9 1 2 ；c a r r e l ，1 9 1 3 ) 。1 9 3 3 ( v o g e l a r r ，j r ) 配制了人工合成培养液，目前商品化的人工合成培养液有2 0 多种， 绝大多数可以培养多种细胞，其中m 1 9 9 、d m e m e a g l e ，s m e m 、d m e m 、h a m ，s f i o f 1 2 、 r p m i l 5 4 0 、m c d b 、m c c o y 5 a 是最常用的几种( 类) 培养液。 绝大部分动物细胞体外培养都需要使用血清。血清提供了细胞生存、生长和增殖所 5 必要的细胞生长因子( g r a n n e r ，d k ，1 9 6 8 ：d e r i d d e r , d k ，1 9 6 8 ) ，提供和补充基础培 养液中没有的营养成分( 寇全安，1 9 9 9 ) 。同对还有促进细胞贴壁、缓冲不良环境等作 用。血清在培养体系中的有无会影响细胞基因的表达( 柏邵春，1 9 9 9 ) 与细胞生命活 动的很多过程( m a t h e r ，j r ，1 9 7 9 ；c a m a r g o ，l s ，2 0 0 1 ) 。在有血清的培养基中进行细 胞培养，容易使细胞逐渐向去分化状态发展，可以延长细胞生命周期。血清中存在的 补体、生长抑制因子等复杂未知成分，以及血清效果的不稳定性也会对细胞的生长和 遗传稳定性造成影响( m u k t a ，m v ，1 9 8 4 ) 。 细胞因子和激素的添加，主要应用在非分泌型细胞的无血清培养体系，或者有血清 或无血清培养的分泌型细胞培养体系，以及培养过程中生长缓慢、难以培养的细胞的 培养体系中( b o t t e n s t e i n ，j e ，1 9 7 9 ；m a r t h a s1 9 8 4 ) 。可用的缎胞因子、激素和其 他辅助物较多，但最常见的有：e g f 、f g f 、i g f 、胰岛素、类胰岛索，其共同的作用都 是促进细胞的生长、分裂。 培养液中添加适量的抗生素，以抑制操作过程中引入的微生物和细胞内源性微生物 的生长是非常必要的。但反复使用大剂量抗生索，会造成微生物产生抗性，也会影响 细胞的正常生长。大多数抗生素有促进d n a 合成和抑制蛋白质合成的作用，增加了细 胞突变的可能性。部分抗生素在较低的浓度下，也表现出较强的细胞毒性。常见抗生 素的安全用量范围为：青霉素：l o - - - 1 0 0 0 i u m l ( 1 0 0 i u m 1 ) ；链霉索：l o - - 1 0 0 0 u g m l ( 1 0 0 u g m 1 ) ：庆大霉素：l o - - 2 0 0 u g m l ( 5 0 u g m 1 ) ；卡拉霉素：l o - - 1 0 0 0 u g m l ( 1 0 0 u g m 1 ) ：两性霉素：l 一5 0 u g m l ( 3 u g m 1 ) ；制霉菌素：1 - - 5 0 0 u g m l ( 2 5 u g m 1 ) 。 抗生素的用量需要考虑培养物可能的细菌污染程度，具体某种细胞的耐受性，血清浓 度等多种因素。 1 4 2 2 培养方式 根据培养细胞的组织状态和培养目的，细胞培养方式可以分为植块培养、铺层培 养、细胞悬浮培养和克隆化培养。 植块培养是h a r r i s o n ( 1 9 0 7 ) 、c a r r e l ( 1 9 1 2 ) 等首先发展建立的体外细胞培养方法。 植块培养在一定限度内保持了细胞原有的组织状态，有利于细胞平稳的适应体外培养 环境。能很好维持细胞的原有生物学特性，但细胞的生长、增殖缓慢。组织培养、器 官( 器官原基) 培养是植块培养的一种改进方式，常用来模拟研究机体内细胞、组织 的代谢、调控。 大多数细胞都是贴壁依赖型细胞，这类细胞的培养采用铺层培养。将细胞悬液接 种进用贴壁或铺展物预先处理或未处理的培养器皿内，细胞在贴壁因子诱导下自然的 6 贴附在器皿表面( d o u g l a s ，w n j ，1 9 7 6 ；g o s p o d a r o w c i z ，d ，1 9 8 0 ) 。目前灌流培养， 大规模体外培养中的中空纤维培养、微囊培养和微载体培养实质也是铺层培养的方式 ( k n a z e b ，r a ，1 9 7 2 ：g u l l i n o ，p m ，1 9 7 9 ) 。铺层培养适合大多数细胞的培养和建系。 铺层培养的细胞有原代和传代之分，原代细胞和传代细胞在形态、结构、功能和生长 特性等方面之间存在差异( 1 i l i c h a l o p o u l o s ，g ，1 9 7 5 ；钟瑜，1 9 9 8 ；w a i t e r ，i 。1 9 9 6 ) 。 适合细胞悬浮培养方式的细胞，在机体中一般以游离状态存在或细胞间连接很少、 缺乏细胞间质的肿瘤细胞。细胞悬浮培养由于细胞的增殖很快，密度高，对培养液环境 的控制要求严格( k r u s e ，p f ，1 9 7 0 ) 。在细胞悬浮培养中，可以通过搅拌、转瓶 ( w h i t t l e ，w l ，1 9 7 3 ) 等方式维持细胞的悬浮状态。 细胞克隆化培养的方法可分为：稀释铺板法、饲层克隆法、胶原膜板 ( m i c h a l o p o u l o s ，g ，1 9 7 5 ：b u r w e n ，s j ，1 9 8 0 ) 或血纤维膜板法、琼脂克隆法 ( l e i g h t o n ，j a ，1 9 5 1 ) 等。在饲层克隆法中，常用的饲层细胞有成纤维细胞、胸腺细 胞和巨噬细胞。用颗粒细胞、输卵管上皮细胞、胎儿成纤维细胞作饲层细胞的共培养 体系，常用于e s 细胞克隆和早期胚胎的培养( 曾卫，1 9 9 8 ；张学明，1 9 9 9 ；王杏利， 1 9 9 9 ：y e u n g ，w s ，1 9 9 2 ：a b e ，h ，1 9 9 7 ：l y n m ，m b ，1 9 9 6 ) 1 4 3 细胞培养的环境 细胞培养的环境以尽可能接近体内环境为佳。细胞培养环境通常采用3 7 o 5 c ， 5 c 0 2 和饱和湿度，培养液的p h 在7 2 7 4 之间，培养液的渗透压应在2 6 0 3 2 0 m o s m k g 范围内，理想的渗透压为2 9 0 m o s m k g 。特殊培养要求三气培养( 低氧培养) 。 细胞直接接触的培养液由于细胞的生长、代谢会发生环境的改变，培养过程中通过定 时换液来防止细胞氨中毒( 孙详明，2 0 0 1 ) 和氧自由基的增加( d e r i d d l e r ，l 。，1 9 7 8 ) ， 通过细胞传代来降低细胞的密度，来减少细胞的接触抑制、死亡和细胞的异质化。 培养得到的细胞应进行核型分析、同功酶分析或其他可用于细胞种属特异性和遗传 稳定性的检测，然后进行冷冻保存，并解冻复苏培养，对冷冻效果作出评价，能够生 长的细胞，可长期冷冻保藏。 7 2 材料与方法 2 1 试验材料 2 1 1 皮肤样本：意外死亡的大熊猫幼仔皮肤和麻醉的成体大熊猫皮肤 2 1 2 主要仪器设备 ( 1 ) 倒置相差显微镜，i x 7 0 ，o l y m p u s ，日本； ( 2 ) 离心机，c e n t u r i o n 6 0 0 0s e r i e s ，s e r i e sl i d u k ( 3 ) 倒置相差显微镜恒温箱，i x c b i b 2 0 0 ( 与i x 7 0 组合) ，o l y m p u s ，日本 ( 4 ) 显微照相系统，p m 一3 0 ( 与i x 7 0 组合) ，o l y m p u s ，日本； ( 5 ) c o , w a t e rj a c k e t e di n c u b a t o r ，f o r m as c i e n t i f i c ，u s a ： ( 6 ) 显微数字成像系统，b x 一5 1 ，d p 一1 2 ，o l y m p u s ，日本； ( 7 ) 超挣工作台，苏州净化设备厂，中国； ( 8 ) s l i d ew a r m e r ，m o d e7 7 ，f i s h e rs c i e n t i f i cc o ，u s a ： ( 9 ) 恒温水箱，d k b 一8 a ，上海精宏实验设备有限公司，中国； ( i o ) 电子天平，d e n v e rm 一1 2 0 ，d e n v e ri n s t r u m e n tc o ，d e n m a r k ； ( 11 ) 精密p h 计，d e n v e rm o d e l5 0 ，d e n v e ri n s t r u m e n tc o ，d e n m a r k ( 1 2 ) 普通生物显微镜。c h 一2 ，o l y m p u s 日本； ( 1 3 ) 程序冷冻仪，c r y o i c e ，f o r m as c i e n t i f i c ，u s a 。 2 1 3 试剂耗材 ( 1 ) 主要试剂 8 d m e ：h a m f l 2 s h 3 0 0 2 3 0 1a m e l 5 9 7 2h y c l o n e 牛血清白蛋白 a 7 9 0 69 8 h 1 4 4 8 g i b c ob r i 一 胰岛素 1 5 5 0 0 s i g m a m - p l a s m o c i n “a n t - m p p 2 4 1 0 3 一m p pi n v i v o g e n a m p h o t e r i c i nb a 4 8 8 81 7 1 3 7 5 0 4 1 4 s i g m a 胎牛血清( f b s ) s h 3 0 0 8 8 0 2a k b l l 4 2 0h y c l o n e g i b c o e d t a g i b c ob r l 秋水仙碱 c 9 7 5 43 1 k 1 5 3 4s i g m a 姬姆萨q g h s c l 0 9 2 9 3 9 6 11 0 1上海试剂三厂 l - g t u2 1 0 5 1 - 0 1 61 0 6 2 5 0 3 g i b c ob r l n a h c 0 3 8 5 h 1 4 11 0s i g m a 细胞培养瓶 细胞培养玻片 细胞培养管 细胞培养皿 3 5 3 0 1 4 3 5 4 1 1 2 3 5 2 0 9 6 3 5 3 8 0 2 f a l c o n “。 f a l c o 一。 f a l c o n ”， f a l c o n t m , b e c t o nd i c k i n s o n b e c t o nd i c k i n s o n b e ( 汀0 nd i c k i n s o n b e c t o nd i c k i n s o n 2 1 4 主要试剂配制 ( 1 ) 0 2 5 庸e 蛋白酶液，取胰蛋自酶( 1 ：2 5 0 ) 粉末2 5 0 m g ，先用5 m l 左右的h a n k s ( 无 c a ”、m g ”) 液调成糊状，在补足h a n k s 液至l o o m l ，混匀，4 c 下过夜，然后用0 2 1 i im 微孔滤膜过滤除菌，分装成5 m l ，- 2 0 ( 2 保存。 ( 2 ) g i m s a 原液，取1 5 9g i m s a 粉末，加入5 0 m l 甘油中，置于6 0 c 水浴锅中让其溶解， 约3 小时后，从恒温水浴锅取出加入5 0 m l 中性甲醇，即成原液，放于棕色瓶内室温下长 期保存。 ( 3 ) g i m s a 工作液，将g i m s a 原液与0 1 m o l l 的p b s 按1 ：9 混合，即得到工作液。p b s 液和工作液一般现配现用。 ( 4 ) l - g l u 贮存液( 1 0 0 x ) ，将2 9 2 2 克谷氨酰胺溶于l o o m l 三蒸水中，微孔过滤后 按0 5 m 1 分装，一2 0 c 冷冻保存。 9 ( 5 ) 卡诺固定液：初次固定液，甲醇冰醋酸按照3 ：i 混合，于棕色瓶内室温保存； 重固定液，甲醇冰醋酸按照1 ：l 混合后于棕色瓶内室温保存。 ( 6 ) 0 0 2 e d t a 溶液( v e r s e n e 液) ，e d t a - 4 n al o o m g ，用h a n k s ( 无c a ”，m 9 2 + ) 溶解 至5 0 0 m l ，然后用n a h c o 。或h c i 调节p h 值至7 3 。过滤灭菌后分装成5 m l 每瓶，4 保 存。 ( 7 ) 胰岛素贮存液，用0 o l m o l l 的h c l 作溶剂，以l m g m l 的浓度将胰岛素溶解后 0 2 1um 过滤后2 5 0 l a1 和l m l 两种规格分装。 ( 8 ) 封片脱水剂：脱水剂i ，按9 5 酒精：正丁醇= 2 ：1 的体积比配制。脱水剂， 按9 5 酒精：正丁醇= 2 ：l 的体积比配制。 2 。2 试验方法 2 2 1 _ 皮肤的采集 意外死亡或麻醉的大熊猫，股内侧剃毛、清洗消毒( 碘酒消毒后立即用7 5 的酒精 脱碘) 后，用9 一1 2 号针头挑起皮肤，再按与针尖垂直的方向切割挑起的皮层，每块皮 肤约2 - 3 m 2 ，然后迅速将其转移到含青霉素、链霉素各5 0 0 u m 1 的p b s 中，带回实 验室4 保存( 不超过7 2 小时) 或立即清洗进行培养。也可以将皮肤块转入b t m ( b i o p s y t r a n s p o r tm e d i u m ) 中，然后转入b t m - f r e e z i n gm e d i u m 进行冷冻保存。 2 2 2 皮肤植块的培养 2 2 2 1 皮肤植块的原代培养 ( 1 ) 配制好原代培养液；m 1 9 9 + 2 0 f b s + i o o i u m l 青链霉素+ m p l a s m o l i n ”5l l g m l + a m p h t e r i c i nb5 l ig m l + 2 m o l ll g l u ( 2 ) 皮肤清洗和剪碎：将采集的皮肤块用含青霉素、链霉素各2 0 0 1 u m l 的p b s 清洗6 次，尽量将皮肤块剪碎至皮肤浆。 ( 3 ) 用原代培养液湿润皮肤浆和培养瓶底壁，用吸管将皮肤浆粘入培养瓶底，均匀排 布。将培养瓶翻转让皮肤组织块悬空后加入1 5 m l 培养液( 针对5 0 m l 培养瓶) ，2 小时 后，轻轻将培养瓶翻转，让培养液浸没皮肤小块，注意切勿使皮肤小块漂浮。然后继 续在5 c 0 。、3 7 、饱和湿度下培养3 天，待组织贴壁后吸出i m l 培养液，加新鲜培养 液到5 m l ，以后每3 天更换2 3 的培养液。 2 2 2 2 皮肤植块的传代培养 ( 1 ) 传代培养液：m 1 9 9 + 1 0 f b s + 1 0 0 i u m 1 青链霉素+ m - p l a s m o l i n “5i i g m l + a m p h t e r i c i nb 5ug m l + 2 m m o l ll - g l u ( 2 ) 传代培养：待皮肤小块周围长出的细胞铺满培养瓶底9 0 区域时，吸出培养液， 1 0 用y e r s e n e 液清洗细胞后加入0 2 5 胰蛋白酶2 m l ( 5 0 m l 培养瓶) 在3 7 c 下酶解，待 大部分细胞变圆但未脱壁时( 一般3 - 5 m i n ) 立即加入2 m l 培养渡，用旋涡震荡器震荡 约3 0 秒，细胞脱壁后回收入离心管1 0 0 0 r m p 离心l o m i n ，去上清液，加2 m l 传代培 养液悬浮细胞，计数、稀释，按2 - 4 1 0 5 m l 的密度每瓶接种2 m l ，每3 天换2 3 培养 液，接种后第一次换液时培养液加至5 m l 。 2 2 3 皮肤细胞的分离 将皮肤块清洗、称重，然后分别用2 0 0 1 u m l 的胶原蛋白酶i 和0 2 5 胰蛋白酶分 别在4 c 和3 7 c 下对皮肤块进行酶解，即形成四种组合： 在酶解过程中，不同酶解方案按一定的时间间隔测定细胞密度和死细胞百分率。 皮肤细胞酶解分离后用含l o o i u m l 青链霉素的h a n k s 清洗3 次。然后加入5 - l o m l 原 代培养液后震荡。稍稍静置，见毛屑、絮状皮屑刚沉底时，轻轻吸取中层细胞悬液到 另一离心管待用。 2 2 4 皮肤细胞的铺层培养 在细胞的铺层培养中，先测试四种基础培养液对细胞的贴壁率、生长、遗传稳定 性和形态的影响，然后在四种基础培养液中选择较好的一种，添加不同水平的胰岛素 和e g f ，对胰岛素和e g f 的适宜浓度和对细胞的影响进行测试。 ( 1 ) 基础培养液组成的培养体系 原代培养采用2 0 f b s ，传代后f b s 降低到10 9 6 。四种基础培养液组成的培养体系 分别简计为；b c s - 1 、b c s - 2 、b c s - 3 、b c s 一4 。 b c s i ：1 9 9 e b b s + 2 0 f b s + 1 0 0 i u m l 青链霉素+ m p l a s m o l i n “5ug m l + h m p h t e r i c i nb5 i lg m l + 2 m o l ll - g i u , b c s 一2 ：阴e m + 2 0 9 6 f 8 s + 1 0 0 i u m 1 青链霉素+ m - p l a s m o li n t l 51 tg m 1 + a m p h t e r i c i n b5 | lg m l + 2 n n o l ll - g l u ： b c s 一3 ：d m e h a m s f l 2 1 ：i + 2 0 f b s + i o o i u m 1 青链霉素+ m - p l a s m o l i n “5ug m l + a m p h t e r i c i nb5i ig m l + 2 m m o l ll g l u ： b c s 一4 ：h a m ，s f 1 2 + 2 0 f b s + 1 0 0 i u m l 链霉素+ m - p l a s m o l i n “5ug m l + k m p h t e r i c i nb5 pg m + 2 m z n o l ll - 6 l u ； ( 2 ) 不同胰岛素和e 6 f 水平组成的d m e h a m s f l 2 培养体系 通过对四种基础培养体系测试，其中d m e , h a m s f l 2 基础培养液组成的培养优于其 他三种培养体系( 详见3 结果：3 4 ) 胰岛素设计了2 个水平，f j 3 f 设计了3 个水平，共组成了六种培养体系，分别简计 为：c s 一1 、c s 一2 、c s 一3 、c s 一4 、c s - 5 、c s 一6 ( 见下表) 。 ( 3 ) 细胞的传代 将原代细胞悬液计数，调整其密度在6 - 8 1 0 6 m l 每瓶接种2 m l ，每3 天换2 3 培养 液，第一次换液时培养液加至5 m l 。当细胞铺满瓶底9 0 时传代，传代消化采用0 2 5 胰 蛋白酶消化，接种密度按2 - 4 x1 0 5 m l ，接种量、换液同原代。 2 2 5 培养过程中皮肤成纤维细胞的纯化 皮肤成纤维细胞的纯化采用成纤维细胞和上皮细胞差速粘附进行分离。大熊猫皮肤 细胞分离后得到的主要是成纤维细胞和上皮细胞。在传代接种细胞时，成纤维细胞贴壁 比上皮细胞贴壁快。在前三次传代接种后6 0 9 0 r a i n 将培养瓶里的培养液吸出，然后重 新加入新的培养液。在细胞消化时，成纤维细胞消化脱壁比上皮细胞快，在前三代传代 酶消化2 - 3 m i n 后，待细胞刚变圆即震荡，只收集脱壁细胞。 2 2 6 细胞的贴壁特性、生长特性测试和形态观察 培养过程中，首先对b c s 培养体系培养的细胞进行了贴壁特性和第5 代细胞的生长 曲线进行了测试，对培养细胞的形态进行了观察，通过细胞染色体数目变异进行遗传稳 定性评估。然后在此基础上设计c s 培养体系试验，同时对c s 培养体系培养的细胞进行 生长曲线测试和遗传稳定性评估。 1 2 ( 1 ) b c s 培养体系中细胞的贴壁特性 以2 - 4 x1 0 m l 的密度接种细胞。分别对b c s - 1 、b c s 一2 、b c s 一3 和b c s 一4 培养系统 中。从原代到传代后第八代的各代细胞在接种后6 h 、1 2 h 、2 4 h 、4 8 h 、7 2 h 的细胞 贴壁率进行测试。贴壁与否根据细胞形态进行鉴别。 ( 2 ) b c s 培养体系中细胞的形态 在相差显微镜下观察b c s 培养体系下细胞的形态，并分别记录3 、5 、7 代细胞的形 态。 ( 3 ) 细胞的生长曲线 用b c s 一1 、b c s 一2 、b c , s 一3 、b c s 一4 和c s 一1 、c s 一2 、c s 一3 、c s 一4 、c s 一5 、c s 一6 培养体 系，分别按4 6 1 0 5 m l 和2 - - - 4 x1 0 5 m l 的密度范围接种细胞在1 2 孔板中进行培养，每 孔接种0 5 m l ，每2 天换一次培养液。接种后每隔1 2 小时，用0 2 5 胰蛋白酶消化每种 培养体系的成纤维细胞1 孔，测试其密度，最后绘制成纤维细胞的生长曲线。 2 2 7 培养细胞的核型制片 取b c s - 1 、b c s 一2 、b c s 一3 、b c s 一4 培养的第4 代成纤维细胞和c s - i 、c s - 2 、c s 一3 、 c s - 4 、c s - 5 、c s - 6 培养的第5 代成纤维细胞，当细胞处于对数生长期时，加入秋水仙素， 使其终浓度为0 2 5ug m l ，继续培养4 小时后，将铺层细胞消化、洗涤。然后用0 5 k c i 在3 7 c 下低渗处理3 0 r a i n ，分别用卡诺初次固定液和重固定液固定3 0 m i n 。事先预冷 载玻片后在8 0 c m 高度滴片，干燥后用姬姆萨工作液染色3 0 r a i n 。最后分别用封片脱水 剂i 、和正丁醇各脱水5 m i n ，干燥后用指甲油封片。在显微数字成像系统下成像处 理，进行染色体数目变异分析和核型分析。 2 2 8 细胞的冷冻保存 ( 1 ) 细胞冷冻保存液 采用两种细胞冷冻保存液和两种抗冻剂，组成四个组合，对细胞进行冷冻保存。冷 冻保存液的组合为： f m l ：p b s + o 4 b s a + o i m o l l 蔗糖+ i o d m s o f m 一2 ：p b s + o 4 b s a + o i m o l l 蔗糖+ 1 6 m o l l 乙二醇 f m 一3 ：d m e h a m s f l 2 + l o f b s + i o d m s o f m 一4 ：d m e h 鲫s f l 2 + l o f b s + i 6 m o l l 乙二醇 抗冻剂d m s o 和乙二醇在4 时添加。 ( 2 ) 抗冻剂细胞毒性检测 将细胞稀释在含抗冻剂的冷冻保存液中，在4 c 下平衡，在l h 、7 2 h 分别测试细 1 3 细胞的活率，衡量不同冷冻保存液细胞毒性。 ( 3 ) 细胞冷冻 将细胞密度用冷冻保存液调到1 0 7 数量级( 一般2 5 c m 培养瓶稀释到0 5 m 1 ) ，用细 管( 巾= 1 5 唧，l = 1 2 0 m m ，v = o 5 m i ) 抽吸细胞悬液，封口细管。然后在4 c 下平衡l 小 时，用程序冷冻仪制冻，最后投入液氮保存。 冷冻程序为：4 一- 2 5 x 2 ，i c 分钟；一2 5 一一8 0 ，1 0 c 分钟；一8 0 c 时直 接投入液氮。( 冷冻程序侯蓉老师提供) 2 2 9 冷冻细胞的复苏测试 ( 1 ) 细胞解冻 将细管在事先准备好的5 5 - 6 0 c 温水中快速解冻，待细管里冰刚融化时取出细管， 用酒精棉球擦拭细管表面，然后将细胞悬液吹入离心管中，迅速向离心管加入培养液， 用培养液浸洗细胞三次，每次2 m i n ，脱去细胞冷冻保存液中的抗冻剂。 ( 2 ) 测定细胞活率和细胞培养 用c s 一5 培养液调整细胞密度在1 0 6 数量级，吸取2 m l 细胞悬液到培养瓶中培养。 同时测定细胞活率。 2 2 1 0 细胞密度和活率测定方法 细胞密度测定采用血球计数板计数法：细胞的活率采用0 4 台盼蓝溶液l ：1 0 与 细胞悬液混合染色l o m i n 后，计数3 0 0 5 0 0 个细胞，未着色的细胞为活细胞。 2 2 1 1 数据处理 所有实验数据用s a s 6 1 2 和s p s s 进行统计分析，函数图象用e x c e l9 8 进行作图。 3 结粜分析 3 i 细胞分离效果 3 1 i 酶解过程中组织块的变化 在大熊猫皮肤组织酶解过程中，组织块逐渐松软，边缘发毛，消化液中出现絮状 沉淀，组织块逐渐由立体形态结构变成絮状、片层状或糜状无定形结构。组织块大小 约2 m m 3 时，方案i 酶解4 8 - 7 2 h ，方案酶解l o - 2 0 h ，组织块完全呈絮状；方案m 酶 解2 4 h ，方案酶解4 0 - 9 0 m i n ，组织完全呈糜状。当组织呈絮状或糜状时，继续酶 解，死细胞的百分率增加，成团细胞也难以分开。 3 i 2 不同酶解方法细胞得率与死细胞百分率分析 采用四种酶解方案，不同时间细胞的得率和死细胞百分率见表i ： 1 4 表1 ：不同酶解方法消化大熊猫皮肤块经过不同时间细胞得率和活率 t a b 1 ：c e l lg a i n i n gr a t i oa n dd e a t hp e r c e n tb yd i f f e r e n td i g e s t i n gt e s t sa td i f f e r e n tt i m e a b ，b c 表示同列内不同上标值差异显著( p 0 0 5